DNA BARCODING

RESUME BIOINFORMATIKA

NAMA : PINGKY IMELDA APRILINA

NIM : 191810401067

JURUSAN BIOLOGI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM

UNIVERSITAS JEMBER

2021
 DNA BARCODING

1) DNA Barcoding I
ZSM merupakan institusi yang terletak di bawah naungan Lembaga Eropa.
ZSM merupakan institusi yang memiliki tujuan yakni mengkonservasikan secara
fisik maupun molekuler. ZSM memiliki fokus konservasi pada dunia hewan, yaitu
dimulai dari hewan invertebrata hingga hewan vertebrata. ZSM juga dapat
digunakan sebagai barcoding sebagai alat taksonomi. ZSM terdiri dari DNA
working dan Collection. DNA working terdiri dari ekstraksi DNA, PCR,
elektroforesis, sequencing, dan barcoding. Sedangkan collection terdiri dari
arthropoda, pisces, aves, mammalia, reptile, porifera, dan coelenterata.
Organisme yang tidak teridentifikasi memiliki presentase lebih banyak
dibandingkan dengan organisme yang teridentifikasi. Diversitas memiliki
keuntungan dalam memunculkan ilmu baru. Carolus Linnaeus berhasil
mencetuskan nama binomial nomen clature. Pada tahun 2003, Paul Hebert dengan
kolegannya menyarankan tentang pendekatan molekuler yakni markah molekuler.
Markah molekuler yaitu satu single region of a gene dan digunakan untuk
mengidentifikasi organisme. Wilayah 658 bp dari sub unit sitokrom oksidase 1
diusulkan sebagai penanda bagi hewan untuk pengidentifikasian spesies. Untuk
identifikasi hewan disarankan gen CO1 menggunakan DNA mitokondria. Alasan
menggunakan wilayah 658 bp, karena di dalam mitokondria gen CO1 memiliki
banyak Salinan di dalam sel, sehingga amplifikasi berjalan dengan mudah.
Kemudian wilayah 658 bp juga sangat bervariasi jika digunakan sebagai proses
penyelidikan hubungan antar spesifik dan intra spesifik. Fragmen standar 658 bp
dari CO1 menghasilkan database yang besar. Dengan asumsi, bahwa setiap
spesies memiliki urutan penandanya kurang lebih dari variasi intra spesifik.
Semakin baik database yang digunakan, maka semakin baik pula hasil yang
didapatkan. Penanda semakin valid jika yang menggunakan satu buah penanda
yang akan digunakan satu single region of a gene.
Aplikasi barcoding dapat digunakan dalam beberapa hal yaitu :
1) Untuk mengidentifikasi larva serangga. Dengan cara melihat susunan
sisik dan susunan sayap. Susunan sisik dan sayap digunakan dalam
proses pengidentifikasian serangga di tahap dewasa.
 2) Untuk menjaga kualitas makanan, yaitu untuk mengetahui adanya
kontaminasi dari bahan makanan non halal dan dari organisme yang
terkena kontaminasi.
3) Untuk melihat kemungkinan dari organisme yang terdampak
kepunahan.
4) Untuk menelusuri jejak kejahatan (forensik), yang dapat dibuktikan
melalui beberapa sampel yaitu air liur, bercak darah, cairan urin,
cairan keringat, dan lain sebagainya.

Barcoding merupakan sebuah data yang memiliki bentuk seperti barcode

dengan warna sebanyak 4 macam. 4 warna tersebut menunjukkan Adenin,
Guanin, Citosin, dan Timin. Gen CO1 pada tumbuhan dikatakan tidak valid
karena tidak terlalu berkembang pada daerah barcode. Untuk itu sampel tumbuhan
disarankan menggunakan DNA dari kloroplas seperti ITS, rbcL, dan matK. Fungi
dari inti sel, tumbuhan dari kloroplas, dan hewan dari mitokondria sesuai
ketetapan konsorsium.

Proses pemilahan serangga dapat dilakukan dengan beberapa cara yaitu

pengurutan (Proses Sorting) pada serangga harus diletakkan alkohol atau formalin
di dalam botol. Di setiap sekat diisi dengan serangga yang memiliki ciri morfologi
yang sama, untuk memudahkan dalam pengelompokan serangga yang memiliki
morfologi sama. Botol lain yang steril digunakan untuk menyimpan serangga
yang sudah di seleksi.

Proses persiapan serangga juga dimulai dari proses menjepit (pinning). Proses
pinning dapat dilakukan dengan mengawetkan serangga dengan proses osmosis
yaitu dengan merendam spesimen dari serangga di larutan observasi untuk
mengeluarkan cairan dari tubuh serangga sehingga serangga tersebut lebih awet
dan tidak terserang oleh jamur. Kemudian dilakukan pemberian label pada letak
lokasi yang spesifik, untuk memudahkan peneliti dalam mencari posisi dari
masing-masing spesies. Proses pensejajaran di dalam pengoleksian serangga
harus disamakan genusnya yaitu di dalam satu basis yang sama. Setiap kompleks
berisi satu genus serangga yang sama. Contohnya dekat dengan genus atau family
yang sama. Preparat segar menghasilkan markah yang tidak terlalu panjang.
 Percent identity merupakan proses pensejajaran yang sederhana dan mudah
untuk dimengerti. Percent identity lebih diutamakan karena digunakan sebagai
pembuktian suatu identitas. Pembuktian identitas di dalam percent identity
diperlukan proses blasting sebanyak 3 kali. DNA yang terkandung di dalam fosil
dapat digunakan sebagai proses identifikasi organisme melalui barcoding.

2) DNA Barcoding II
DNA barcode diperlukan karena :
a. Laju kerusakan hutan yang sangat cepat terjadi di daerah tropis
menjadi kantong keanekaragaman hayati yang tinggi.
b. Dampak dari global warming, yaitu mengungkapkan kepunahan dari
keanekaragaman hayati di dunia.
c. Semakin menurunnya jumlah ahli taksonomi di seluruh dunia,
membawa keterlibatan yakni semakin melambatnya pengungkapan
keanekaragaman spesies hayati di dunia.
d. Sangat sulit menciptakan ahli taksonomi dalam jangka waktu yang
singkat.
e. Keterbatasan ahli taksonomi yang hanya dapat mengidentifikasi
spesimen dalam bentuk utuh dan keadaan dewasa, menyebabkan
berbagai persoalan dalam pengungkapan keanekaragaman hayati
yang semakin panjang.
f. Untuk menggantikan persoalan diatas dapat digantikan dengan
metode DNA barcode yang lebih cepat dan akurat.
g. Metode DNA barcode perlu dikembangkan karena metode ini tidak
dapat mengetahui nama spesies dan identitas spesies tanpa bantuan
dari ahli taksonomi.
h. Ditemukan adanya mesin PCR dan sequencing berguna dalam proses
pengidentifikasian organisme dalam jangka waktu yang sangat
singkat.

Organisme yang diperjualbelikan akan otomatis terdaftar akibat adanya DNA

barcoding. Pengkoleksian organisme dapat dilakukan dengan mengkoleksi materi
genetik berupa DNA untuk mengetahui jejak dari organisme jika terjadi
kepunahan. Pembuktian dari halal dan haram dapat dilakukan dengan sekuensing
DNA barcoding untuk melacak adanya kandungan haram dan membuktikan halal.
Serta juga dapat mendeteksi terkandungnya zat-zat berbahaya.

Tidak semua gen dapat dijadikan sebagai barcoding. Gen yang dapat
dijadikan barcoding harus memiliki persyaratan sebagai berikut :

a. Harus bersifat konservatif di dalam variasi spesies daripada antar-

spesies karena digunakan untuk membedakan antar semua spesies.
b. Harus bersifat standar, untuk memudahkan daerah DNA yang sama
dalam penggunaan taksa yang berbeda.
c. Daerah DNA target harus mempunyai informasi filogeni untuk
memudahkan taksa dalam pengelompokan seperti marga, family, dan
lain sebagainya.
d. Memiliki tingkat amplifikasi yang tinggi.
e. Gen harus memiliki ukuran yang pendek untuk menguji DNA yang
rusak.

Gen mitokondria CO1 merupakan salah satu gen yang sekuennya digunakan
di dalam barcode. Gen CO1 memiliki kelebihan yaitu sebagai berikut :

a. Panjang seluruh gen relatif lebih pendek, yaitu sekitar 648 bp.
b. Gen CO1 relatif lebih stabil jika dibandingkan dengan gen
mitokondria yang sama karena tidak mudah mengalami perubahan.
c. Gen CO1 memiliki variabilitas yang rendah sekitar 1-2%. Sehingga
gen CO1 cocok digunakan untuk menentukan identitas sebuah spesies
yang memiliki kekerabatan sangat dekat dengan beberapa perbedaan
dari segi tingkat persen saja.
d. Gen mitochondrial CO1 sangat mudah diamplifikasi karena memiliki
jumlah copy yang banyak.

Gen CO1 juga memiliki kelemahan sehingga tidak dapat digunakan dalam
kelompok tertentu, antara lain :
 a. Gen CO1 tidak memiliki variasi di beberapa kelompok takson
tertentu.
b. Ge CO1 tidak mampu menyelesaikan perbedaan pada tingkat spesies
di semua sub kelompok takson.

Selain gen di dalam mitokondria pada tanaman, gen kloroplas pada tanaman
juga memiliki laju evolusi yang sangat rendah dalam menghasilkan variasi.
Sehingga ahli botani memiliki strategi untuk menggunakan gen kloroplas untuk
barcode dari kelompok tumbuhan (sirkular). Gen kloroplas terdiri dari trnH-psbA
region, matK, dan rbcL. Para mycologist menggunakan gen inti yaitu ITS dari 18S
- 5,8s-26s ribosomal cistron inti untuk barcode kelompok fungi (linear). Gen CO1
dimiliki semua organisme karena digunakan untuk mensintesis enzim sitokrom
oksidase.

Tahapan kerja DNA barcode meliputi :

a. Sampling
b. Ekstraksi DNA
c. PCR (Penggandaan DNA)
d. Sequencing
e. Analisis
f. Mengkontruksi tahap filogenetik

Teknik pengambilan dan pengawetan DNA terdiri dari :

a. Darah
• Cara mekanis
• Dilakukan secara langsung
• Menggunakan kendang jepit
• Menggunakan perangkap khusus

• Cara kimiawi
• Menggunakan obat bius
• Dilakukan oleh dokter hewan
 • Pengawetan dan preservasi darah
• Menggunakan kertas FTA Cards, kertas ini digunakan
supaya darah tidak rusak.
• Cara ini digunakan untuk memudahkan sampling
darah pada hewan yang berbahaya.
• Pengambilan darah diambil pada lokasi tertentu untuk
memperoleh hasil yang maksimal dan darah diambil
dengan cara yang aman. Alasan memilih lokasi
tertentu karena dapat memberikan kemudahan dalam
pengambilan darah dan mengurangi resiko kerusakan,
serta mengurangi rasa sakit pada hewan.
• Pengambilan darah disesuaikan dengan kebutuhan
yang diambil dan ukuran tubuh, karena memiliki
pengukuran yang berbeda-beda.
b. Jaringan
Beberapa contoh jaringan yang dapat diambil sebagai material DNA
yakni jaringan otot hati, jantung, mukosa, saliva, dan alat pencernaan.
Teknik pengambilan sampel jaringan yaitu :
• Teknik biopsi, merupakan teknik yang mengambil sedikit
sampel untuk kepentingan analisis genetik. Contohnya
mengambil sampel jaringan kulit,
• Teknik koleksi sel epitel, dilakukan dengan cara mengusap
permukaan rongga mulut dengan alat usap yang steril dengan
bentukan seperti cotton bud.
• Beberapa jaringan seperti otot, kulit, hati, dan jantung dapat
diawetkan dengan larutan NaCLl, EDTA, atau DMSO.

c. Rambut
Teknik koleksi sampel DNA diambil dari akar rambut hewan pada
mamamalia dilakukan dengan cara :
• Akar rambut dicabut dengan pinset dan dipastikan sampel
ditarik sampai akarnya.
 • Akar rambut dibersihkan dan dicelupkan dalam larutan
alkohol 96%.
• Rambut dipotong sepanjang 0,5 cm diatas akar rambut dan
dimasukkan ke dalam eppendorf.
• Jumlah akar rambut yang diperlukan untuk setiap ekstraksi
berkisar 10 sampai 20 helai.

d. Bulu
Teknik koleksi sampel DNA bulu burung dilakukan dengan cara :
• Mencabut atau menarik bulu yang masih muda dengan bagian
kalamusnya.
• Dikerik dengan mata pisau steril bagaian kalamus burung.
• Hasil kerik bagian kalamus ditampung di dalam tabung
eppendorf.

e. Gigi dan tulang

Teknik koleksi sampel DNA dari gigi dan tulang dilakukan dengan
cara :
• Gigi atau tulang dibersihkan dengan 3% hidrogen peroksida.
• Kemudian direndam dalam alkohol 96% selama 30 menit.
• Sampel direndam dalam dH20 selama 30 menit.
• Sampel disimpan ditempat steril dan diekstraksi DNAnya.

f. Serangga
Teknik koleksi serangga dapat dilakukan dengan cara :
• Jaring ayun
• Surber net
• Aspirator
• Perangkap serangga
- Perangkap layar (light sheet traps)
- Perangkap lampu (light trap)
- Perangkap malaise (malaise trap)
 - Perangkap mangkok (yellow pan trap)
- Perangkap sumuran (pit fall trap)
- Perangkap metyl eugenol untuk lalat buah.

Estraksi DNA terdiri dari :

• Ekstraksi organik (fenol / kloroform)

• Ekstraksi chelex (dilakukan di laboratorium forensik)
• Ekstraksi DNA dengan metode salting out
• Ekstraksi DNA dengan metode freeze-thaw
• Ekstraksi DNA dengan metode CTAB
• Ekstraksi DNA dengan menggunakan kit (Dneasy Tissue Kit).

Analisis PCR untuk amplifikasi gen CO1 memiliki tujuan menghasilkan

Salinan dalam jumlah besar untuk wilayah DNA yang ditargetkan. Bahan-bahan
yang digunakan meliputi DNA template, air, penyangga yang menyediakan
lingkungan kimia yang sesuai untuk hasil yang optimal dan stabilitas DNA
polymerase, dNTPs (elemen dasar untuk merakit untaian baru, seperti dATP,
dCTP, dGTP, dan dTTP), MgCl2 (dapat mempengaruhi aktivitas enzim), primer
(sekuens pendek yang mengikat untai DNA (maju atau mundur)), dan Taq
polymerase (enzim yang memandu kumpulan untai baru). Langkah-langkah
dalam menganalisis PCR untuk amplifikasi gen CO1 yaitu :

• Denaturasi (± 95° C)
Suhu yang tinggi mengakibatkan pembentukan molekul DNA untai
tunggal.

• Annelaing (± 50-65° C)
Primer yang maju dan mundur mengikat DNA untai tunggal yang
mengakibatkan taq polymerase memperbaiki kompleks dan akan
mulai proses sintesis DNA.

• Elongasi (± 70° C)
 Suhu optimal akan mencapai aktivitas Taq polymerase dengan dNTP
untuk membentuk untaian baru.

Sekuensing DNA bergerak dari kutub negatif ke kutub positif. Tujuan

sekuensing DNA yaitu menghasilkan banyak untaian dengan panjang yang
berbeda dengan nukleotida terakhir yang berfluoresensi untuk mengambil
kromatogram untuk mewakili urutan yang ditargetkan. Bahan-bahan yang
diperlukan dalam proses sekuensing DNA yaitu produk PCR bersih (produk PCR
bebas buffer dan primer), air, sekuensing buffer, satu primer dengan urutan
pendek yang mengikat untai DNA, terminator bigdye (campuran yang
mengandung ddNTPs dilengkapi dengan fluorescent), DNA polymerase, dan
MgCl2. Setelah proses sekuensing siklus, fragmen DNA berbeda dipisahkan
menggunakan gel poliakrilamida (gel yang digunakan saat sekuensing) dan
fluorescent yang dideteksi dengan laser. Panjang fragmen memiliki pengaruh
yakni, jika semakin pendek fragmen akan bermigrasi lebih cepat. Sedangkan
fluorescent memiliki panjang gelombang yang berbeda untuk mengidentifikasi
nukleotida yaitu adenin, timin, citosin, dan guanin.