PENGARUH EKSTRAK DAUN KELOR TERHADAP

KONSENTRASI PDGF ALPHA DAN EKSPRESI GEN

(Studi In Vivo Tikus Photoaging Akibat Paparan UV-B)

Tesis
untuk memenuhi sebagian persyaratan mencapai derajat
Sarjana S2

HALAMAN JUDULbc

Magister Biomedik

Rima Arvina Lubis

MBK. 2016010211

PROGRAM STUDI MAGISTER BIOMEDIK

FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS ISLAM SULTAN AGUNG
SEMARANG
2022
 TESIS

PENGARUH EKSTRAK DAUN KELOR TERHADAP KONSENTRASI

PDGF ALPHA DAN EKSPRESI GEN
(Studi In Vivo Tikus Photoaging Akibat Paparan UV-B)
HALAMAN PENGESAHAN

Diajukan oleh :

Rima Arvina Lubis

MBK. 2016010211

Telah disetujui oleh :

Pembimbing I, Pembimbing II,

Dr. Ir. Titik Sumarawati, M.Kes Assoc. Prof.Dr. dr. Agung Putra, M.Si.Med

NIK. 220198045 NIK.210199050

Mengetahui,

Ketua Progarm Studi magister Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Unissula

Assoc. Prof.Dr. dr. Agung Putra, M.Si.Med

NIK. 210199050
 PERNYATAAN

Dengan ini saya menyatakan bahwa tesis ini adalah hasil pekerjaan saya sendiri dan

didalamnya tidak terdapat karya yang pernah diajukan untuk memperoleh gelar

kesarjanaan di suatu perguruan tinggi dan lembaga pendidikan lainnya.

Pengetahuan yang diperoleh dari hasil penerbitan maupun yang belum / tidak

diterbitkan, sumbernya dijelaskan di dalam tulisan dan daftar pustaka

Semarang, Februari 2022

(Rima Arvina Lubis)

 RIWAYAT HIDUP

A. Identitas

Nama : Rima Arvina Lubis

Tempat / tanggal lahir : Medan / 21 Juli 1983

Agama : Islam

Jenis Kelamin : Perempuan

B. Riwayat Pendidikan

1. TK :lulus tahun 1989

2. SD :lulus tahun 1995

3. SMP :lulus tahun 1998

4. SMA :lulus tahun 2001

5. S1 :lulus tahun 2005

6. Profesi Dokter USU :lulus tahun 2009

7. S2 Ilmu Biomedik UNISSULA Semarang :(2020-sekarang)

C. Riwayat Keluarga

1. Nama Orang Tua

Ayah : H. Amir Syarifuddin Lubis, M.BA.

Ibu : Hj. Nur ‘Ainun Rangkuti

2. Nama Suami : KBP Kobul Syahrin Ritonga, S.IK., M.Si.

3. Nama Anak : Syahira Arvisyahwika Ritonga

Muhammad Alsyahreza Ritonga
Syahlika Nabilah Ritonga
 KATA PENGANTAR

Puji syukur ke hadirat Tuhan Yang Mahaesa, sehingga tesis penulis berjudul,
“Pengaruh Ekstrak Daun Kelor Terhadap Konsentrasi Pdgf Alpha Dan
Ekspresi Gen (Studi In Vivo Tikus Photoaging Akibat Paparan UV-B)” ini
dapat terselesaikan.
Proposal tesis ini disusun sebagai salah satu syarat untuk mencapai gelar
magister bidang Ilmu Biomedik Kedokteran di Fakultas Kedokteran Universitas
Islam Sultan Agung Semarang. Penulis ingin menyampaikan terima kasih sebesar-
besarnya kepada:

1. Dr. dr. Setyo Trisnadi, S.H., Sp.KF selaku Dekan Fakultas Kedokteran
Masgister Ilmu Biomedik Universitas Islam Sultan Agung Semarang.
2. Assoc.Prof.Dr.dr.Agung Putra, M.Si. Med selaku Ketua Program Studi
Magister Ilmu Biomedik Universitas Islam Sultan Agung Semarang.
3. Dr. Ir. Titik Sumarawati, M.Kes. selaku dosen pembimbing I dan
Assoc.Prof.Dr.dr.Agung Putra, M.Si. Med. selaku dosen pembimbing II
yang bersedia meluangkan waktu dan pikiran untuk membimbing penulis
selama proses penulisan proposal tesis.
4. Seluruh tenaga pendidik di Magister Ilmu Biomedik Fakultas Kedokteran
Universitas Islam Sultan Agung Semarang yang telah memberikan banyak
dukungan selama proses penyusunan thesis.
5. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu persatu yang telah
memberikan bantuan dalam penyusunan tesis ini, terimakasih atas
dukungannya.
Penulis menyadari bahwa masih banyak kekurangan dalam penyusunan
penelitian ini. Oleh karena itu, saran-saran yang membangun dari beberapa
pihak akan diterima dengan terbuka. Harapan penulis semoga penelitian ini
bermanfaat untuk ilmu kedokteran dan masyarakat.

Semarang, 16 Maret 2022

(dr. Rima Arvina Lubis)

ABSTRAK
 DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL................................................................................................ i

HALAMAN PENGESAHAN ................................................................................. ii

RIWAYAT HIDUP ................................................................................................ iv

KATA PENGANTAR ........................................................................................... iv

DAFTAR ISI ......................................................................................................... vii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................. ix

DAFTAR TABEL ................................................................................................... x

BAB I PENDAHULUAN ....................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang Masalah ........................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 3
1.3 Tujuan Penelitian ...................................................................................... 3
1.4 Originalitas Penelitian .............................................................................. 4
1.5 Manfaat penelitian .................................................................................... 5
BAB II TINJAUAN PUSTAKA ............................................................................. 6

2.1 Platelet Derived Growth Factor (PDGF) .................................................. 6

2.2 Ekspresi Gen ..............................................Error! Bookmark not defined.
2.3 Ekstrak Daun Kelor .................................Error! Bookmark not defined.
BAB III KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, HIPOTESIS .............. 13

3.1 Kerangka Teori ....................................................................................... 13

3.2 Kerangka Konsep ................................................................................... 14
3.3 Hipotesis ................................................................................................. 15
BAB IV ................................................................................................................. 16

METODE PENELITIAN ...................................................................................... 16

4.1 Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian............................................. 16

4.2 Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ........................................ 17
4.3 Subyek Penelitian dan Sampel Penelitian .............................................. 18
 4.4 Alat dan Bahan ....................................................................................... 19
4.5 Cara Penelitian........................................................................................ 20
4.6 Tempat dan Waktu Peneltian.................................................................. 24
4.7 Analisa Data ........................................................................................... 24
4.8 Alur Penelitian ........................................................................................ 25
DAFTAR PUSTAKA ........................................................................................... 26
 DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Ilustrasi skematis ekspresi dan lokalisasi kolagen individu di kulit

................................................................................ Error! Bookmark not defined.
Gambar 2 Alur Rancangan Renelitian .................................................................. 16
 DAFTAR TABEL

Tabel 1. Originalitas Penelitian ............................................................................... 4

Tabel 2. Definisi Operasional ............................................................................... 17
 BAB I

!PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang Masalah

Sinar Ultraviolet B (UVB) sebagai salah satu sinar UV yang diemisikan oleh

matahari memiliki panjang gelombang 280-315nm (Sarkar and Gaddameedhi,

2018). Penelitian terdahulu melaporkan bahwa dari ketiga jenis sinar UV, paparan

berkepanjangan dari UVB dapat menyebabkan photoaging (Jallad, 2017). Hal ini

disebabkan oleh peningkatan spesies oksigen reaktif (ROS) pada kulit, berakibat

penuaan sel, aktivasi inflamasi, inhibisi produksi growth factor pro-kolagen seperti

Transforming Growth Factor β (TGF-β) yang berujung pada penghambatan sintesis

kolagen (Lee and Liu, 2021). Penghambatan sintesis kolagen berdampak pada

berkurangnya kekenyalan kulit, timbulnya keriput yang berujung pada

berkurangnya kecantikan seseorang. Pemberian antioksidan menurut penelitian

terdahulu dapat menurunkan kadar ROS sehingga dapat menghentikan inflamasi

yang berujung pada inisiasi sintesis kolagen (Roh et al., 2017). Daun Kelor

(Moringa oleifera) diketahui memiliki kandungan senyawa antioksidan yang

mampu mengurangi kadar ROS (Nair et al., 2015; Fitrilia et al., 2020; Wongthai et

al., 2021), namun demikian belum belum ada penelitian yang mengkaji pengaruh

Daun Kelor terhadap kadar kolagen dan TGF-β pada kulit photoaging akibat

paparan sinar UVB.

Photoaging adalah kelainan kulit kronis yang disebabkan oleh paparan

sinar UV. Sehubungan dengan mekanisme photoaging, penetrasi UVB pada

epidermis menghasilkan pembentukan ROS yang secara langsung

menginduksi kerusakan DNA dan memicu sekresi interleukin (IL)-6, yang

mengakibatkan overekspresi MMP (Mori et al., 2019). Enzim MMP adalah

kolagenase yang bergantung pada seng yang terakumulasi pada kulit yang

menua, dan ekspresinya juga diaktifkan oleh faktor transkripsi protein-1 (AP-

1) yang diaktifkan, yang terdiri dari c-Fos dan c-Jun. Di antara MMP yang

dilaporkan, degradasi kolagen diprakarsai oleh MMP-1 dan dilanjutkan oleh

MMP-3. Kolagen memainkan peran utama dalam mempertahankan elastisitas

kulit (Freitas-Rodríguez, Folgueras and López-Otín, 2017). Kolagen tipe 1

adalah protein struktural utama ECM dermal dan sintesis kolagen tipe 1

diinisiasi oleh TGF-β1 melalui aktivasi kompleks smad2 dan smad3 yang

berujung pada sintesis prokolagen 1 sebagai prekursor kolagen tipe 1.

Daun Kelor diketahui mengandung beberapa zat aktif seperti

Antosianin yang berperan sebagai antioksidan dan anti-inflamasi. Penelitian

terdahulu menyebutkan bahwa Antosianin dapat menghambat produksi ROS

pada kulit akibat paparan UVB sehingga dapat mencegah terjadinya

degradasi kolagen. Selain itu penghambatan ROS juga mampu menurunkan

produksi molekul-molekul inflamasi dan memicu proses polarisasi M1

menjadi M2 yang mampu mensekresikan TGF-β1. Sekresi faktor

pertumbuhan ini dapat mengaktivasi kompleks smad2/3 yang beperan dalam

produksi kolagen. Namun hingga saat ini peran ekstrak Daun Kelor pada

photoaging belum dikaji, sehingga dalam penelitian ini ingin menginvestigasi

peran ekstrak Daun Kelor pada photoaging yang dilihat dari kadar PDGF dan

ekspresi Alpha SMA pada tikus model photoaging yang terpapar UVB.
1.2 Rumusan Masalah

Berdasarkan uraian dalam latar belakang masalah di atas, dapat

dirumuskan pertanyaan “Apakah terdapat pengaruh pemberian ekstrak Daun

Kelor terhadap kadar PDGF dan Ekspresi Gen Alpha SMA pada tikus model

photoaging?”

1.3 Tujuan Penelitian

1.3.1 Tujuan Umum

Tujuan umum penelitian ini adalah untuk mengetahui pengaruh

pemberian ekstrak Daun Kelor terhadap kadar PDGF dan ekspresi gen

Alpha SMA pada tikus model photoaging.

1.3.2 Tujuan Khusus

1. Mengetahui peningkatan kadar PDGF dan ekspresi Alpha SMA

pada tikus model photoaging setelah diberi gel ekstrak Daun

Kelor secara topikal dibandingkan kontrol

2. Mengetahui peningkatan kadar PDGF dan ekspresi Alpha SMA

pada tikus model photoaging setelah diberi ekstrak Daun Kelor

secara oral dibandingkan kontrol

1.4 Originalitas Penelitian

Tabel 1. Originalitas Penelitian

No Peneliti, Judul Variabel Variabel Hasil

tahun Bebas Tergantung
1 (Saritani Clitoria Cream MMP-1 dan Terjadi penurunan
et al., ternatea L. Daun Kelor Kolagen MMP-1 dan
2021) extract cream Peningkatan
5% inhibits the Kolagen
increase of
MMP-1 levels
and decrease of
collagen
amount in
Wistar rats
(Rattus
norvegicus)
dermic skin
exposed to
ultraviolet B
2

Berdasarkan Tabel 1 dapat diketahui bahwa belum terdapat kajian yang

menginvestigasi pengaruh ekstrak Daun Kelor terhadap kadar PDGF dan

ekspresi Alpha SMA pada tikus model photoaging akibat paparan UVB, oleh

karena itu penelitian yang akan dilakukan ini masih tergoling original dan

layak untuk dilanjutkan.

1.5 Manfaat penelitian

1.5.1 Manfaat Teoretis

Manfaat penelitian ini secara teori adalah memberikan ilmu

pengetahuan tentang pengaruh pemberian ekstrak Daun Kelor

terhadap ekspresi Alpha SMA dan kadar PDGF pada tikus model

photoaging.

1.5.2 Manfaat Praktis

Manfaat secara praktis dari penelitian ini antara lain adalah

1. Memberikan sumber informasi pada ilmu kedokteran dan

masyarakat tentang pengaruh Ekstrak Daun Kelor terhadap kadar

PDGF dan ekspresi gen Alpha SMA pada tikus galur wistar model

photoaging.

2. Penelitian lebih lanjut diharapkan dapat diaplikasikan pada ilmu

kedokteran.
 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Platelet Derived Growth Factor ( PDGF)

2.1.1. Definisi

Platelet Derived Growth Factor (PDGF) adalah faktor pertumbuhan

yang berasal dari pemecahan trombosit atau platelet dan disimpan di

dalam alfa granule platelet kemudian dilepaskan ke lokasi luka ketika

ada cedera (Chen et al, 2014). PDGF berperan penting dalam proses

penyembuhan luka dengan merangsang proliferasi fibroblast.

Fibroblast tersebut akan mensekresi matriks metalloproteinase (MMP)

(Pratama, 2015). Selain itu, fibroblast mampu mensintesis matriks

ekstraseluler baru (fibronektin dan fibrinogen) serta mensintesis

myofibroblast yang aktivasinya distimulasi oleh TGF- β (Pierce et al,

2015). Selain itu, TGF- β juga meningkatkan aktivitas enzim TIMP

(tissue inhibitor metalloproteinase). TIMP tersebut akan menghambat

MMP-1 (matriks metalloproteinase 1) sehingga terjadi sintesis kolagen.

Kadar PDGF mengalami pengingkatan pada minggu awal dan

mengalami penurunan sejalan dengan fase penyembuhan luka ( Putra et

al, 2018).

2.1.2. Reseptor PDGF

PDGF terdiri dari lima isoform yaitu empat homodimer (PDGF-AA,

PDGF-BB, PDGF-CC, PDGF-DD) dan satu heterodimer (PDGF-AB).

Kelima isoform PDGF tersebut mampu berikatan pada reseptor PDGF

 (PDGF-R). Dari kelima isoform PDGF, PDGF-BB adalah isoform yang

paling kuat untuk merangsang proliferasi fibroblast. (Lee et al, 2016).

Ketika PDGF-BB berikatan dengan reseptornya (PDGF-R) maka akan

terjadi penarikan molekul sinyal ke daerah luka sperti fosfolipase-C dan

fosfatidilynositol-3 kinase. Aktivasi molekul sinyal tersebut

menyebabkan aktivasi protein tirosin kinase. Aktivase protein tirosin

kinase ini akan menyebabkan aktivasi MAPK (mitogen activated

protein kinase) sehingga memicu migrasi sel fibroblast (Pierce et al,

2015). Sel fibroblast sendiri berkembang dari sel mesenkim yang belum

berdiferensiasi atau dari sel fibrosit. Sel fibrosit merupakan sel yang

terdapat dalam jaringan ikat dan dalam keadaan tidak aktif, apabila sel

fibrosit tersebut aktif, maka disebut dengan sel fibroblast (Tritarelli et

al, 2008).

2.1. α-Smooth Muscle Actin (α-SMA)

2.1.1. Definisi dan Fungsi α-Smooth Muscle Actin (α-SMA)

Alpha-Smooth Muscle Actin (α -SMA) adalah isoform aktin yang

mendominasi dalam sel pembuluh darah smooth-muscle dan

memainkan peran penting dalam fibrogenesis dengan berat molekul 42

kD (Cherng et al., 2008; Kawasaki et al., 2008; Nielsen et al., 2019).

Alpha-SMA diekspresikan oleh myofibroblast dan ekspresi alpha-SMA

berkorelasi dengan aktivasi myofibroblast (Nakatani et al., 2008;

Nielsen et al., 2019). Myofibroblast merupakan bentuk sel fibroblas

yang telah berdiferensiasi sebagian menuju fenotipe smooth-muscle

termasuk ke dalam fibroblas metabolik, dan memiliki morfologis yang

 khas (Elberg et al., 2008). Myofibroblast yang teraktivasi akan berhenti

berproliferasi dan memulai proses sintesis komponen protein

extracellular matrix (ECM), termasuk kolagen dalam jumlah yang

banyak (Cherng et al., 2008; Aziz et al., 2016; Nielsen et al., 2019).

Alpha-SMA yang diekspresikan oleh myofibroblast merupakan sumber

utama kolagen fibrillar, yaitu kolagen tipe I, II, III, V, dan XI yang

sangat penting untuk tensile strength dan mechanical properties kulit,

sehingga photoaging tidak terjadi (Quan and Fisher, 2015).

2.1.2. Aktivasi dan Mekanisme Seluler α-SMA dalam Sintesis Kolagen

Paparan UV dapat mengubah regulasi homeostasis kolagen oleh

fibroblast sehingga tidak adanya keseimbangan antara sintesis dan

degradasi kolagen (Cole et al., 2018). Kolagen merupakan ECM paling

penting di dermis kulit, sehingga hilangnya kolagen secara langsung

dapat menyebabkan kulit kendur, menua, dan menurunnya elastisitas

(Poon et al., 2015; Petruk et al., 2018). Paparan UV juga dapat

menginduksi penghentian siklus sel pada fase G0/G1 dan menyebabkan

kerusakan ireversibel dengan perubahan fungsi sel yang disebut dengan

photoaging (Nakyai et al., 2017). Photoaging merupakan perubahan

karakteristik pada kulit akibat paparan UVA dan UVB yang dapat

menginduksi radikal bebas dan peroksidasi lipid dalam sel dan merusak

serat kolagen dan serat elastis di jaringan dermal (Geng et al., 2021).

Untuk berinteraksi dengan serat kolagen, fibroblast mengekspresikan

reseptor adhesi permukaan sel yang mempromosikan hubungan antara

molekul adhesi ekstraseluler, seperti fibronectin, dan protein

sitoskeletal intraseluler, seperti α-SMA (Tracy et al., 2016). α-SMA

adalah stress fibers yang terlibat dalam aktivitas kontraktil fibroblas

dan reorganisasi kolagen (Hinz et al., 2001; Nakyai et al., 2017).

Myofibroblast yang mengekspresikan α-SMA diregulasi oleh

sitokin transforming growth factor beta (TGF-β) (Satish et al., 2011).

TGF-β1 yang diaktifkan akan berikatan dengan kompleks TGF-β

receptor (TGF-βR) yang menstimulasi pensinyalan intraseluler yang

mendorong produksi α-SMA. Transduksi mekanis ECM ke-sel melalui

jalur focal adhesion (FA) mengaktifkan RhoA yang mengarah pada

produksi stress fibers α-SMA. Selain itu, extra-domain A containing

fibronectin (EDA-FN) yang diaktifkan TGF-β1 meningkatkan protein

EDA-FN dalam ECM dan kontraksi sel yang dilakukan oleh stress

fibers α-SMA mengubah konformasi latency associated peptide (LAP)

melalui interaksi integrin/LAP yang melepaskan TGF-β1 dari LAP.

Perakitan G-aktin (monomer α-SMA) menjadi F-aktin (stress fibers)

memungkinkan keluarnya myocardin-related transcription factor

(MRTF) dari sekuestrasi G-aktin di sitosol dan translokasi nuklirnya

serta aktivasi serum response factor (SRF), yang pada gilirannya

menyebarkan α-SMA dan produksi stress fibers (Zent and Guo, 2018).

Produksi α-SMA yang meningkat menyebabkan terjadinya sintesis

kolagen dan dapat memodulasi remodeling kolagen (Hinz et al., 2012;

Cáceres et al., 2014).

2.1. Ektrak Bunga Talang

2.1.1. Definisi Daun Kelor

Daun Kelor (Moringa oleifera) atau Blue Pea Flower

merupakan tumbuhan yang termasuk dalam familli Fabaceae yang

tumbuh secara merambat hingga mencapai 6 meter, dengan ranting

halus, dan memiliki daun majemuk (Zussiva dkk., 2012). Tumbuhan

ini berasal dari Amerika Selatan yang menyebar ke daerah tropik sejak

abad 19 termasuk Indonesia. Tanaman ini tidak hanya mampu tumbuh

dengan paparan sinar matahari penuh, tetapi juga dapat tumbuh di

bawah naungan seperti di perkebunan karet dan kelapa.

Daun Kelor mengandung asam lemak yang meliputi asam

palmitat, stearat, oleat linoleat dan linolenat. Selain itu Daun Kelor

juga memiliki kandungan tanin, flobatanin, karbohidrat, saponin,

triterpenoid, fenol flavonoid, flavanol glikosida, protein, alkaloid,

antrakuinon, stigmasit 4-ena-3,6 dion, minyak volatil, steroid dan

flavonoid. Flavonoid adalah sekelompok besar senyawa polifenol

yang dihasilkan dari tanaman dan terdiri dari berbagai kelas seperti

anthocyanin, apigenin, kaemferol flavonol, flaveur, flavanon, dan

isoflavones, yang telah dilaporkan memiliki aktivitas anti-inflamasi.

2.1.2. Manfaat Daun Kelor dalam Menekan Inflamasi

Kandungan Antosianin dalam Daun Kelor diketahui dapat

menghambat peradangan dan hipersensitivitas dalam aktivitas asma

dengan menghambat aktivasi NF-kB dalam monosit dan mengurangi

konsentrasi plasma mediator pro-inflamasi (7,8). Turunan flavon pada

Daun Kelor memiliki kemampuan dalam menekan produksi TNFα

dari makrofag yang teraktivasi melalui penghambatan jalur

pensinyalan AP-1 dan Nrf-2. Selain itu Apigenin memiliki

kemampuan dalam menekan pelepasan dan ekspresi gen MCP-1 yang

merupakan salah satu mediator pro-inflamasi dalam makrofag.

Kaempferol dan quercetin juga dilaporkan mampu menekan produksi

berbagai mediator pro-inflamasi dari makrofag, endotel, epitel, atau

sel hati dengan menghambat faktor sinyal yang terlibat dalam jalur

TLR4. Beberapa turunan kaempferol antara lain kaempferol 3-(2-

Grhamnosylrutinoside), kaempferol 3-neohesperidoside, kaempferol

3-(2″-rhamnosyl-6″-malonyl) glucoside, kaempferol 3rutinoside, dan

kaempferol 3-glucoside dan turunan quercetin seperti quercetin 3-

(2G). -rhamnosylrutinoside), quercetin 3-neohesperidoside, quercetin

3-(2-rhamnosyl-6- malonyl) glucoside, quercetin 3-rutinoside, dan

quercetin 3-glucoside telah terbukti memiliki efek penghambatan pada

enzim COX-2 aktivitas yang berperan penting dalam pelepasan

mediator pro-inflamasi seperti PGE2 dan PGD2.

2.1.3. Manfaat Daun Kelor pada Photoaging

Paparan UVB diketahui dapat meningkatkan produksi radikal

bebas dan faktor inflamasi yang dapat berujung pada photoaging

akibat dari peningkatan enzim matrix metalloproteinase MMP dan

penurunan Transforming Growth Factor β (TGF-β) (Kammeyer and

Luiten, 2015). Peningkatan enzim MMP akan mendegradasi kolagen

pada kulit sehingga menyebabkan hilangnya kekenyalan kulit serta

timbulnya kerutan pada kulit. Faktor pertumbuhan TGF-β merupakan

faktor kunci dalam aktivasi sel fibroblas untuk memproduksi kolagen,

sehingga penurunan TGF-β berujung pada penurunan ekspresi Alpha

SMA

Kandungan beberapa jenis flavonoid dalam Daun Kelor

diketahui mampu menghambat jalur NF-kB, berujung pada penekanan

faktor inflamasi termasuk TNF alpa yang berperan dalam peningkatan

enzim MMP. Penelitian terbaru menyebutkan bahwa pemberian

antosianin mampu meningkatkan ekspresi Alpha SMA pada kulit

yang terpapar UVB (Nanashima et al., 2018) (Saritani, 2021).

.
 BAB III
KERANGKA TEORI, KERANGKA KONSEP, HIPOTESIS

3.1. Kerangka Teori

3.2.Penuaan dini adalah kelainan kulit kronis yang disebabkan oleh paparan

sinar UV. Sehubungan dengan mekanisme Penuaan dini , penetrasi UVB

pada epidermis menghasilkan pembentukan ROS meningkatkan

peningkatan ekspresi protein kinase yang memicu transkripsi faktor protein-

1 (AP-1) dan memicu pembentukan enzim MMP-3.

3.3. Daun Kelor diketahui mengandung beberapa zat aktif seperti Antosianin

yang berperan sebagai antioksidan dan anti-inflamasi. Penelitian terdahulu

menyebutkan bahwa Antosianin dapat menghambat produksi ROS pada

kulit akibat paparan UVB sehingga dapat mencegah aktivasi NF-kB dan

produksi sitokin proinflamasi seperti TNF alpha. Selain itu Antosianin juga

diketahui dapat mengaktifkan nuclear factor erythroid 2–related factor 2

(Nrf2) yang dapat memblok jalur TNF alpha. Pemblokakkan TNF alpha

oleh Nrf2 dapat mencegah terjadinya sekreti sitokin inflamasi. Penurunan

sitokin inflamasi memicu polarisasi makrofag tipe 1 menjadi macrofag tipe

2 yang bersifat antiinflamasi serta mampu mensekresi TGF-beta yang dapat

mengaktivasi fibroblas menjadi myofibroblas yang ditandai ekspresi Alpha-

SMA. Ringkasan kerangka teori dijelaskan pada Gambar 3.1.

 Paparan Kadar Kadar Daun
UV-B ROS Antocianin Kelor

MAPK

Ekspresi Ekspresi Ekspresi

AP-1 NF-kB Nrf2

Kadar Tnf-α, Jumlah Macrofag

Kadar Tipe 2- Anti
MMP-1 IL-6, IL-1
Inflamasi

Kadar Jumlah
MMP-3 Neutrophil
Kadar Kadar
TGF-β1 PDGF
Degradasi
Kolagen Populasi Sel
Fibroblas

Tingkat Ekspresi Populasi Sel

Photoaging Alpha Myofibroblas
SMA

Gambar 3.1. Kerangka Teori

3.4. Kerangka Konsep

PDGF
Ekstrak Daun
Kelor
Alpha SMA

Gambar 3.2. Kerangka konsep

3.5. Hipotesis

Hipotesis penelitian ini antara lain adalah terdapat pengaruh pemberian

gel ekstrak Daun Kelor terhadap kadar PDGF dan Ekspresi alpha SMA pada

kulit tikus model photoaging akibat paparan UVB.

 BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis Penelitian dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini menggunakan design penelitian berupa post test only

control group dengan metode acak lengkap. subyek penelitian adalah tikus

jantan galur wistar dengan bobot badan 200-250 gr. Perlakuan terdiri dari:

1. Kontrol Sehat (Tikus sehat tanpa paparan UVB),

2. Kontrol Negatif (Tikus mengalami Photoaging tanpa pemberian

perlakuan),

3. Perlakuan 1 (Tikus dengan Photoaging dengan perlakuan ekstrak Daun

Kelor secara topikal dosis 1 ).

4. Perlakuan 2 (Tikus dengan Photoaging dengan perlakuan ekstrak Daun

Kelor secara oral)

UV-B (-) KS O1

KN O2

S R UV-B (+) V R P1 O4

P2 O4

Gambar 1 Alur Rancangan Renelitian

4.2. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

4.2.1. Variabel Peneltian

4.2.1.1. Variabel bebas

Variabel bebas:

1. Gel Ekstrak Daun Kelor dosis 5% secara topikal

4.2.1.2. Variabel Terikat

Variabel terikat : Kadar PDGF, ekspresi Alpha SMA

4.2.2. Defenisi Operasional

Tabel 2. Definisi Operasional

No Variable Deskripsi Unit Skala

adalah ekstrak dari Daun Kelor
Ekstrak (Moringa oleifera) menggunakan
1 Daun mg Rasio
pelarut etanol yang dibuat sediaan gel
Kelor
(dosis 5%)
Adalah faktor pertumbuhan, atau
protein yang mengatur pertumbuhan
dan pembelahan sel dihitung dari
2 PDGF pg/mL Rasio
sampel serum menggunakan metode
ELISA dengan panjang gelombang
450 nm,
Alpha-Smooth Muscle Actin (α -SMA)
adalah isoform aktin yang
Alpha mendominasi dalam sel pembuluh
3
SMA darah smooth-muscle dan memainkan
peran penting dalam fibrogenesis
dengan berat molekul 42 kD.
4.3. Subyek Penelitian dan Sampel Penelitian

4.3.1. Subyek Penelitian

Subyek pada penelitian ini adalah tikus jantan galur Wistar berusia 2-

3 bulan dengan bobot badan 200-250 gram yang dinyatakan sehat dan

layak digunakan untuk penelitian oleh dokter hewan dari Animal

House Integrated Biomedical Laoratory, Fakultas Kedokteran

Universitas Sultan Agung Semarang yang dipapar sinar UVB 302 nm

dengan MED 390 mJ/cm2 6 kali seminggu selama 6 minggu dan

timbul gejala photoaging.

4.3.2. Sampel Penelitian

4.3.2.1. Kriteria Inklusi

Kriteria inklusi pada penelitian ini adalah sebagai berikut

1. Tikus putih jantan galur dengan photoaging akibat

paparan UVB

2. Umur 2-3 bulan.

3. Kondisi sehat.

4. Berat badan 200-250 gram.

4.3.2.2. Kriteria Eksklusi

Tikus putih jantan galur Wistar dengan kriteria:

1. Memiliki kelainan anatomis.

2. Sudah pernah digunakan untuk penelitian sebelumnya.

4.3.2.3. Kriteria Drop Out

Tikus mati atau infeksi selama penelitian

 4.3.3. Cara Pengambilan Sampel Penelitian

Pengambilan sampel pada penelitian ini dengan menggunakan

cara Randomized Sampling. Tikus putih jantan galur Wistar dibagi

menjadi 4 kelompok yaitu kelompok Sham (tikus sehat tanpa

photoaging akibat paparan UVB), Kontrol Negatif (tikus model

photoaging yang tidak diberi perlakuan), Kontrol Positif (tikus model

photoaging yang diberi base gel), Perlakuan 1 (tikus model

photoaging yang diberi gel ekstrak Daun Kelor secara topikal) dan

Perlakuan 2 (tikus model photoaging yang diberi ekstrak Daun Kelor

secara oral).

4.3.4. Besar Sampel

Sampel minimal dihitung dengan menggunakan kriteria WHO

sebanyak 5 ekor sampel per jenis perlakuan dikali dengan jumlah

waktu pengambilan sampel. Pengambilan sampel pada penelitian ini

dilakukan satu kali pada hari ke 25 setelah pemberain pertama

perlakuan, sehingga jumlah sampel minimal pada penelitian ini adalah

25 ekor tikus wistar

4.4. Alat dan Bahan

4.4.1. Alat

Pelitian ini menggunakan beberapa peralatan untuk membuat

hewan model antara lain berupa UV light (broadband dengan peak

emission pada 302 nm) dengan energi 390 mL/cm2, pisau cukur,

kandang paparan, kandang pemeliharan, tempat air minum tikus dan

pemotong rambut. Alat yang digunakan untuk pengumpulan data

 adalah vacutainer, tabung hematokrit, pot 5 mL, 6 mm biopsy punch,

sentrifus, mikropipet, 1000 uL micropipet tip, dan vial tube 1,5 mL.

Alat yang digunakan untuk analisis data antara lain microplate reader,

mikroskop, staining jar, coated desk glass, cover glass, dan laptop.

4.4.2. Bahan

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini terdiri dari bahan

untuk perlakuan seperti water base gel, ketamin, xylazine, etanol,

akuades, pakan tikus, dan chloroform.

4.5. Cara Penelitian

4.5.1. Perolehan Ethical Clearance

Ethical clearence penelitian diajukan Fakultas Kedokteran

Universitas Islam Sultan Agung Semarang.

4.5.2. Cara Pembuatan Ekstrak Daun Kelor

Daun Kelor ±600 gram dipotong menjadi bagian kecil,

dikeringkan pada suhu 50 – 60o C dan dihaluskan menjadi bubuk

kering. Kemudian bubuk kering diekstraksi melalui proses maserasi

menggunakan etanol 95% kemudian disaring dan filtrat tersebut

ditampung, residu kemudian dimaserasi kembali dengan metode yang

sama. Kangungan etanol diuapkan menggunakan rotary evaporator

untuk mendapatkan ekstrak kental. Ekstrak kental yang diperoleh

kemudian disimpan dalam suhu 2-8oC. Proses ekstraksi ini

menghasilkan 10% ekstrak dari Daun Kelor segar. Konsentrasi ekstrak

tersebut dilarutkan dalam aqudes sebelum diberikan ke hewan coba

(Rao & Bizuneh, 2010).

4.5.3. Penetapan Dosis

Sebelum dilakukan penelitian, terlebih dahulu ditentukan dosis

yang akan digunakan untuk penelitian. Penelitian sebelumnya

menggunakan dosis ekstrak Daun Kelor sebanyak 5% untuk

penggunaan secara topikal (Saritani et al., 2021). Penggunaan Daun

Kelor dilakukan setiap hari sebanyak 10 mg/tikus sehingga dosis

ekstra Daun Kelor yang digunakan adalah 0,5 mg/tikus.

Dosis yang akan digunakan pada Perlakuan 2 adalah 400

mg/kgBB/hari seperti yang dilakukan pada penelitian sebelumnya

(Singh et al., 2018). Tikus yang digunakan dalam penelitian ini

berkisar antara 200-250 g, sehingga dosis ekstrak Daun Kelor yang

diberikan secara oral adalah 80-100 mg/tikus/hari.

4.5.4. Pembuatan Hiperpigmentasi dan Pemberian Perlakuan pada

Subjek Percobaan

1. Tikus yang sudah diadaptasi selama 1 minggu dibius dengan

campuran ketamine (60mg/kgbb) dan xylasine (20mg/kgbb).

2. Rambut pada bagian punggung tikus potong hingga bersih.

3. Punggung tikus dipapar dengan UV light (broadband dengan peak

emission 302 nm) dengan minimal erythema dose (MED) 390

mJ/cm2 sebanyak 6 kali seminggu selama 6 minggu (Fan et al.,

2015).

4. Tikus Perlakuan 1 kemudian diberi perlakuan secara topikal

menggunakan gel ekstrak Daun Kelor yang diberikan satu kali sehari
 selama 24 hari. Tikus pada Perlakuan 2 diberi perlakuan secara oral

menggunakan gel ekstrak Daun Kelor yang diberikan satu kali sehari

selama 24 hari

4.5.5. Pengambilan Sampel Plasma Darah

Pengambilan serum dilakukan pada hari ke 25 setelah hari

pertama pemberian perlakuan. Sampel darah diambil dari tikus

melalui vena orbital menggunakan tabung hematokrit sebanyak 3 mL

tanpa pembiusan. Sampel darah tabung darah yang berisi EDTA.

Sampel darah kemudian disentrifus pada kecepatan 2000 rpm selama

10 menit. Plasma yang terbentuk dimasukkan ke dalam tabung vial

1,5 mL dan disimpan pada suhu -80 untuk hingga analisis dilakukan.

4.5.6. Perhitungan Kadar PDGF

Analisis TGF-β dilakukan menggunakan sampel plasma yang

telah disimpan dalam suhu -80oC. Plasma dicairkan dalam suhu ruang

dan divorteks untuk homogenisasi sebelum proses analisis. Analisis

TGF-β dilakukan dengan metode Enzyme Linked Immunoabsorbance

Assay menggunakan kit dari Finetest ® (Wuhanm, China). Langkah-

langkah analisis kadar PDGF mengikuti prosedur sesuai dengan

petunjuk penggunaan reagen yang telah ada. Pembacaan dilakukan

dengan menggunakan microplate reader dengan panjang gelombang

450 nm.

4.5.7. Pengambilan Sampel Jaringan

Pengambilan serum dilakukan pada hari ke 25 setelah hari

pertama pemberian perlakuan. Seluruh tikus dimatikan terlebih

 dahulu dengan cara servikal dislokasi sebelum jaringan diambil.

Jaringan diambil menggunakan biopsi punch 6 mm di bagian kulit

yang terpapar UVB. Sampel jaringan difiksasi dengan direndam

dalam formalin 10% selama 24 jam. Setelah 24 jam perendaman,

jaringan disimpan pada tabung yang berisi alkohol 70% dan disimpan

di suhu ruang sampai proses pembuatan preparat parafin.

4.5.8. Pembuatan Blok Parafin.

1. Dehidrasi

Masukan potongan jaringan dalam alcohol bertingkat dari

30%, 40%, 60%, 50%, 70%, 80%, 90%, 96% (bertingkat) untuk

mengeluarkan cairan dari dalam jaringan. Masukan jaringan ke

dalam larutan alcohol-xylol selama 1 jam kemudian masukan

jaringan pada larutan xylol murni selama 2 x 2 jam.

2. Parafinisasi dan Embedding

Masukan jaringan dalam parafin cair selama 2 x 2 jam.

Tunggu hingga parafin memadat, potong jaringan dalam parafin

setebal 4 mikron dengan mikrotom. Hasil dari potongan jaringan

ditempelkan pada object glass yang sebelumnya telah diolesi

polilisin sebagai perekat. Masukan jaringan pada kaca obyek

deparafinasi dalam inkubator dan dipanaskan dengan suhu 56-

58oC hingga parafin mencair.

4.5.9. Pengecatan Kolagen

Pengecatan kolagen dilakukan dengan menggunakan protokol

pengecatan Masson Trichome dengan tahapan sebagai berikut :

 1. Deparafinisasi slide jaringan

2. Panaskan Cairan Bouin ke 54-64ºC

3. Inkubasi slide dalam Bouin's Fluid yang dipanaskan selama 60

menit dan dinginkan selama 10 menit

4. Bilas dengan air mengalir

5. Inkubasi slide di Hematigoksin Besi Weigert selama 5 menit

6. Bilas dengan air

7. Inkubasi slide dalam larutan Biebrich Scarlet / Acid Fuchsin selama

15 menit

8. Bilas dengan air

9. Inkubasi dalam larutan asam fosfomolibdat / fosfotungstat selama

10-15 menit

10. Inkubasi slide dalam larutan Aniline Blue selama 5-10 menit

11. Bilas dengan air

12. Inkubasi slide dalam larutan asam asetat selama 3-5 menit

13. Dehidrasi, dan pasang desk glass

4.6. Tempat dan Waktu Peneltian

Penelitian dilakukan di Unit Pengelola Hewan Laboratorium (UPHL) –

Fakultas Kedokteran Hewan Institut Pertanian Bogor, Bogor, Jawa Barat.

Penelitian rencana akan dilakukan pada April-Mei 2022.

4.7. Analisa Data

Data yang diperoleh kemudian diproses, disunting, dan ditabulasi, untuk

dilakukan uji deskriptif yang dilanjutkan dengan normalitas data dengan uji

Shapiro Wilk dan uji homogenitas data dengan uji Levene. Apabila data yang
 dihasilkan normal dan homogen, maka akan dilakukan uji beda uji One Way

Anova dan dilanjutkan dengan uji Post Hoc LSD dan Duncan untuk

mengetahui perbedaan masing-masing kelompok. Bila terdapat sebaran data

tidak normal dan varian tidak sama, maka dilakukan uji Kruskal Wallis dan

dilanjutkan dengan uji Mann Whitney untuk mengetahui perbedaan masing-

masing kelompok. Pengolahan analisis data dilakukan dengan menggunakan

SPSS 22.0.

4.8. Alur Penelitian

Tikus putih jantan galur Wistar 25 ekor Daun kelor

Randomisasi dan adaptasi selama 5 hari

Maserasi

Dibagi menjadi 2 kelompok

Evaporasi

Tikus Sehat Tikus Penyinaran UVB

Ektrak Daun Kelor

Kontrol Kontrol Perlakuan 1 Perlakuan 2

Sehat Negatif (Topikal) (Oral)

Perlakuan

Pemberian pakan standar sampai hari ke-24

Pengambilan serum dan jaringan luka padahari ke-25

Pemeriksaan Kadar PDGF dan Ekspresi Alpha

Pengolahan dan analisa data

Gambar 4.1. Alur penelitian

 DAFTAR PUSTAKA

Fan, Y. et al. (2015) ‘An Experimental Model Design for Photoaging’, Journal of
Craniofacial Surgery. doi: 10.1097/SCS.0000000000001902.
Fitrilia, T. et al. (2020) ‘The POTENTIAL OF BUTTERFLY PEA FLOWER
METHANOL EXTRACT AS AN ANTIOXIDANT BY IN SILICO’,
Indonesian Journal of Applied Research (IJAR). doi: 10.30997/ijar.v1i3.64.
Freitas-Rodríguez, S., Folgueras, A. R. and López-Otín, C. (2017) ‘The role of
matrix metalloproteinases in aging: Tissue remodeling and beyond’,
Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. doi:
10.1016/j.bbamcr.2017.05.007.
Gallo-Oller, G. et al. (2020) ‘Transforming growth factor beta (TGF-β) activity in
immuno-oncology studies’, in Methods in Enzymology. doi:
10.1016/bs.mie.2019.06.008.
Genné-Bacon, E. A. (2014) ‘Thinking evolutionarily about obesity’, Yale Journal
of Biology and Medicine.
Jallad, K. N. (2017) ‘Chemical characterization of sunscreens composition and its
related potential adverse health effects’, Journal of Cosmetic Dermatology.
doi: 10.1111/jocd.12282.
Kammeyer, A. and Luiten, R. M. (2015) ‘Oxidation events and skin aging’, Ageing
Research Reviews. doi: 10.1016/j.arr.2015.01.001.
Kubiczkova, L. et al. (2012) ‘TGF-β - an excellent servant but a bad master’,
Journal of Translational Medicine. doi: 10.1186/1479-5876-10-183.
Lee, L. Y. and Liu, S. X. (2021) ‘Pathogenesis of Photoaging in Human Dermal
Fibroblasts’, International Journal of Dermatology and Venereology. doi:
10.1097/JD9.0000000000000068.
Mander, L. and Liu, H. W. (2010) Comprehensive Natural Products II: Chemistry
and Biology, Comprehensive Natural Products II: Chemistry and Biology.
doi: 10.1016/C2009-1-28362-6.
Mori, K. et al. (2019) ‘A mitochondrial ROS pathway controls matrix
metalloproteinase 9 levels and invasive properties in RAS-activated cancer
cells’, FEBS Journal. doi: 10.1111/febs.14671.
Nair, V. et al. (2015) ‘Protective Role of Ternatin Anthocyanins and Quercetin
Glycosides from Butterfly Pea (Clitoria ternatea Leguminosae) Blue Flower
Petals against Lipopolysaccharide (LPS)-Induced Inflammation in
Macrophage Cells’, Journal of Agricultural and Food Chemistry. doi:
10.1021/acs.jafc.5b00928.
Nanashima, N. et al. (2018) ‘Blackcurrant anthocyanins increase the levels of
collagen, elastin, and hyaluronic acid in human skin fibroblasts and
 ovariectomized rats’, Nutrients. doi: 10.3390/nu10040495.
Nyström, A. (2016) ‘Collagens in wound healing’, Wound Healing Biomaterials,
2, pp. 171–201. doi: 10.1016/B978-1-78242-456-7.00009-X.
Ricard-Blum, S. (2011) ‘The Collagen Family’, Cold Spring Harbor Perspectives
in Biology. doi: 10.1101/cshperspect.a004978.
Roh, E. et al. (2017) ‘Molecular mechanisms of green tea polyphenols with
protective effects against skin photoaging’, Critical Reviews in Food Science
and Nutrition. doi: 10.1080/10408398.2014.1003365.
Saritani, A. T. B. et al. (2021) ‘litoria ternatea L. extract cream 5% inhibits the
increase of MMP-1 levels and decrease of collagen amount in Wistar rats
(Rattus norvegicus) dermic skin exposed to ultraviolet B’, Neurologico
Spinale Medico Chirurgico, 4(4), pp. 109–113.
Sarkar, S. and Gaddameedhi, S. (2018) ‘UV-B-Induced Erythema in Human Skin:
The Circadian Clock Is Ticking’, Journal of Investigative Dermatology. doi:
10.1016/j.jid.2017.09.002.
Singh, N. K. et al. (2018) ‘Anti-allergy and anti-tussive activity of Clitoria ternatea
L. in experimental animals’, Journal of Ethnopharmacology. doi:
10.1016/j.jep.2018.05.026.
Sorushanova, A. et al. (2017) ‘2.15 Collagen: Materials analysis and implant uses’,
in Comprehensive Biomaterials II. doi: 10.1016/B978-0-12-803581-8.10155-
9.
Wilson, S. E. (2021) ‘TGF beta −1, −2 and −3 in the modulation of fibrosis in the
cornea and other organs’, Experimental Eye Research. doi:
10.1016/j.exer.2021.108594.
Wongthai, N. et al. (2021) ‘Characteristics and antioxidant activity of royal lotus
pollen, butterfly pea flower, and oolong tea kombucha beverages’, Asia-
Pacific Journal of Science and Technology. doi: 10.14456/apst.2021.47.