PAPER VAGINAL SMEAR

OLEH

NAMA : DESWANDI W S BERRI S.K.H

NIM : 2009020007

PROGRAM STUDI PROFESI DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS NUSA CENDANA
2021
Diagnosis siklus seksual dengan cara metode apusan vagina pada chinchilla (Chinchilla
lanigera)

A. Ringkasan
Sebuah penelitian dilakukan, apakah siklus seksual dan kebuntingan dapat
ditentukan dengan cara apusan vagina pada chinchilla. Penelitian ini merupakan
percobaan pertama untuk mencatat perubahan yang terjadi pada pola sel terkelupas
pada apusan vagina chinchilla selama anestrus, proestrus, estrus, metestrus dan
kebuntingan pada15 ekor chinchilla betina berumur 8 bulan sampai 3 tahun yang
dikembangbiakkan dengan metode harem breeding. Perubahan utama selama
proestrus adalah peningkatan proporsi sel supersial, dengan penurunan yang sesuai
pada sel lain. Sel goblet diamati dalam apusan yang disiapkan dengan aspirasi kuat
selama siklus ini. Neutrofil, intermediet kecil dan besar dan sel parabasal tidak
ditemukan pada apusan selama estrus dan apusan hanya terdiri dari sel supersial.
Dalam proporsi neutrofil, intermediet kecil dan besar dan sel parabasal meningkat
selama metestrus. Selain itu pada metestrum juga ditemukan sel busa. Dalam anestrus
terdapat sel supercial dan parabasal dalam jumlah kecil juga ada sel-sel menengah
kecil dan besar serta neutrofil. Selama kebuntingan, terdapat neutrofil, parabasal: sel
menengah kecil dan besar pada kepadatan rendah atau sedang, dan sel supersial hanya
ada dalam jumlah sedikit. Selama kebuntingan neutrofil umumnya dengan kepadatan
sedang hadir, parabasal: sel menengah kecil dan besar hadir pada kepadatan rendah
atau sedang, dan sel supersial hanya ada dalam jumlah sedikit.

B. Latar Belakang
Chinchilla merupakan hewan yang suka tidur di siang hari dan aktif di malam
hari, chinchilla adalah hewan pengerat herbivora dari Amerika Selatan subordo
Hystricomorpha dan famili Chinchilidae (Bingami & Beach 1968). Spesies ini paling
dikenal sebagai hewan berbulu yang disukai di seluruh dunia karena bulunya yang
sangat lembut. Chinchilla juga dipelihara di rumah sebagai hewan peliharaan dan
digunakan sebagai hewan percobaan di laboratorium. Ada tiga spesies berbeda dari
Chinchilla yaitu C. Lanigera, C. costina dan C. brevicaudata. sebagai hewan berbulu
(Weir 1970, 1976, CË alõs;kaner 1993). Meskipun memiliki umur 20 tahun, kinerja
reproduksi mereka berlanjut selama 9 sampai 10 tahun. Chinchilla dibiakkan melalui
metode pemuliaan harem, dengan pejantan dicocokkan dengan empat betina dalam
sistem pemuliaan yang ideal. Perkawinan berlangsung hanya dalam waktu singkat dan
biasanya terjadi pada malam hari. Kehadiran sumbat kopulasi dan kumpulan rambut
yang jatuh pada jerami merupakan indikasi perkawinan yang berhasil. Sumbat
kopulasi awalnya berwarna putih dan lunak tetapi kemudian menjadi lebih keras dan
berwarna kuning transparan (Weir 1970, 1976, Puzder & Novikmec 1992, Thiede
1994 ). Masa kehamilan chilla biasanya antara 105-115 hari dan periode 111 hari pada
C. lanigera (Bendung 1966, 1970, 1976, Kuroiwa & Imamichi 1977, Neira dkk).
 Chinchilla betina mencapai pubertas pada usia 4 hingga 5 bulan tetapi mereka
mencapai kematangan kawin pada usia 8 hingga 9 bulan.
Chinchilla bersifat poliestrus musiman dan aktivitas seksualnya meningkat
pada awal November hingga akhir Mei. Selama musim panas dan awal musim gugur
anestrus terjadi (Weir 1970, Kuroiwa & Imamichi 1977, Jakubow dkk . 1984, Puzder
& Novikmec 1992, Thiede 1994). Durasi siklus estrus biasanya berlangsung 28-5 hari
Masa estrus berlangsung selama 3 sampai 4 hari. Vulva ditutup oleh selaput dara
(Weir 1966, 1969, 1970, 1973, Kuroiwa & Imamichi 1977, Puzder & Novikmec
1992, Thiede 1994) Sedikit yang diketahui tentang diagnosis siklus seksual dan
kebuntingan pada chinchilla. Kriteria ion perforasi vagina umumnya digunakan
sebagai indikasi utama estrus. Ultrasonografi dan radiografi, dan pengamatan palpasi
perut atau peningkatan berat badan hidup, telah dilaporkan digunakan untuk
mendiagnosis kebuntingan pada chinchilla betina. Diagnosis dengan ultrasonografi
melibatkan mencukur rambut, sehingga dapat mengurangi kualitas bulu. Selain itu,
beberapa tes semacam itu tidak selalu memberikan hasil yang akurat, karena
peningkatan bobot hidup hanya terlihat setelah 50 hingga 60 hari kebuntingan (Weir
1970, Puzder & Novikmec 1992 ). Selain itu, metode radiografi mahal dan dapat
menyebabkan kematian embrio dini atau malformasi janin selama perkembangan.
Chinchilla betina akan menerima jantan dalam siklus estrus hanya jika dia
menyukainya. Betina bisa menjadi agresif dan menyerang pejantan jika betina
menolak kawin dan pejantan bersikeras. Perkelahian antara jantan dan betina dapat
mengakibatkan kematian pejantan. (Bingami & Pantai 1968, CË alõs;kaner 1993).
Oleh karena itu penentuan siklus seksual sangat penting dan biasanya dilakukan
melalui pengukuran estrus. Penelitian ini dirancang karena sitologi vagina merupakan
metode yang efektif untuk menentukan siklus seksual dan kebuntingan (tanpa
mempengaruhi kualitas bulu). Chinchilla secara ekonomi penting dan pembiakannya
semakin meningkat di Turki.

C. Bahan Dan Metode

Hewan
15 ekor C. Lanigera betina berusia antara 8 bulan sampai 3 tahun (300-500 g)
digunakan dalam penelitian ini. Jantan ditempatkan di unit penangkaran harem
dengan empat betina. Pengaturan ini memungkinkan pejantan untuk bepergian sesuka
hati di antara betina-betina yang ditempatkan secara individu. Betina berkerah untuk
mencegah masuknya mereka ke landasan umum jantan, sehingga menghindari akses
mereka ke kandang betina lainnya. Betina ditempatkan secara individual di kandang
stainless steel. Kandang berukuran 51x51x30 cm.. Chinchilla diberi makan pelet
chinchilla grain. Air bersih diberikan setiap hari dalam botol kaca. Vitamin kompleks
ditambahkan dua kali seminggu ke dalam air. Chinchilla disimpan di lingkungan yang
berventilasi baik dengan suhu antara 10-180C. Mereka akan merasa panas jika terkena
sinar matahari langsung, tetapi disimpan di ruangan yang diterangi selama 12 hari dan
gelap selama 12 hari.
Penanganan
Chinchilla diambil dari kandang dengan memegang ekornya. Untuk
pemeriksaan vagina, hewan dipegang dengan ekor dan kaki depan diletakkan di dada
pengamat.

Koleksi sampel vagina

Sampel apusan vagina dikumpulkan dengan teknik aspirasi selama 2 tahun
dengan interval 15 hari selama periode aktivitas seksual (antara November dan Mei)
dan selama musim panas (anestrus). Sebuah kolom kecil saline steril (kirakira 1 ml)
dimasukkan ke dalam pipet Pasteur dan panjang penuhnya dimasukkan ke dalam
caudal vagina, berhati-hatilah agar bola lampu tidak terjepit. Bola lampu itu kemudian
diperas dengan cepat dan lembut beberapa kali, untuk membuat kolom cairan mencuci
dengan cepat bolak-balik dan dengan demikian mengambil sel. Setetes kecil cairan
ditempatkan pada slide mikroskopis di dekat ujung berlabel. Slide kemudian
dimiringkan secara vertikal untuk memungkinkan tetesan mengalir di sepanjang slide.
Kelebihan cairan itu dihapus dari ujung slide sebelum berdiri tegak untuk udara
kering.

Teknik pewarnaan
Sampel-sampel tersebut diwarnai dengan hematoxylin & eosin (Bourne 1990)
dan dengan teknik AyoubShklar yang dimodifikasi untuk teknik pewarnaan prekeratin
dan keratin (Luna 1968), dan diperiksa di bawah mikroskop cahaya. Teknik
pewarnaan AyoubShklar dikombinasikan dengan pewarnaan hematoxylin Harris dan
Weigert.

Teknik Hematoxylin dan eosin

Solusi:
(1)Harris’haematoxylin
Haematoxylin 5 g
Ethylalcohol 50 ml
Potassiumorammonium 100 g
Air sulingan 950 ml
Mercuricoxide 2.5 g
Glacialaceticacid 40 ml
Larutkan hematoxyl dalam alkohol mlmenggunakan api kecil (menggunakan
oven atau air 560C) dan larutkan tawas dalam air suling menggunakan Bunsen dengan
sering diaduk. Sementara larutan tawas berair masih panas, tambahkan larutan
hematoksilin alkohol dan didihkan sambil sering diaduk. Matikan Bunsen sebelum
menambahkan oksida merkuri, karena buih yang dihasilkan dapat menyebabkan
tumpahan. Dinginkan dengan cepat dengan mencelupkan wadah ke dalam air dingin,
tambahkan asam asetat dan filter. Solusinya siap untuk segera digunakan tetapi perlu
penyaringan ulang.
(2) asam klorida 1% dalam alkohol 70% alkohol 70% 100 ml konsentrasi asam
klorida 1 ml
(3) 3,2% natrium bikarbonat berair Natrium bikarbonat (berair) 2 g Air suling 100 ml
(4) 0,5% eosin berair
Eosin (berair) 0,5 g Air sulingan 100 ml

Tenik
 Apusan alkohol dicuci dengan baik dalam air.
 Noda dengan hematoxyl Harris selama satu menit.
 Cuci dalam air dan diferensiasi dalam asam-alkohol sampai inti berwarna biru
tajam dan latar belakang relatif tidak ternoda.
 Waktu diferensiasi rata-rata adalah 2-6 detik.
 Cuci dalam air dan birukan dalam larutan bikarbonat selama 10-20 detik.
 Cuci dengan baik dalam air. Pewarnaan dengan eosin selama 10-20 detik.
 Cuci dalam air, dehidrasi dengan alkohol 96% dan alkohol absolut dan bersihkan
dalam xilena, masing-masing dua perubahan.
 Pasang dengan Entellan.

Teknik pewarnaan Ayoub shklar untuk prekreatin dan kreatin

Solusi untuk hematoxylin Harris (1), (2), & (3) disiapkan seperti di atas.
Solusi untuk hematoksilin besi Weigert
(1) Hematoksilin besi Weigert: Ini biasanya disimpan sebagai dua larutan terpisah
Solusi a
Haematoxylin 1 g
Ethyl alcohol 100 ml
Dilarutkan
Solusi b
30% besi klorida berair 4 ml
Conc. asam klorida 1 ml
Air suling
Tambahkan volume A dan B yang sama sebelum digunakan, dan ®saring sebelum
digunakan
(2) Metil karbonat
Air sulingan 125 ml
metanol 125 ml
Sodium karbonat 0.5 g
5% larutan asam fuchsin*
Asam fuchsin 5.0 g
Air sulingan 100,0 ml
Larutan anilin biru Oranye G solusi
Anilin biru larut dalam air 0,5 g
Orange G 2.0 g
Phosphotungsti cacid 1.0 g
Air suingan 100 ml
Untuk hasil pewarnaan yang konsisten gunakan larutan segar.

Prosedur pewarnaan
 Apusan dapat ditahan setelah pengeringan udara dan tanpa fixksasi untuk waktu
yang tidak terbatas.
 Sampel dapat difiksasi dengan menempatkan dalam 96% etil alkohol selama 3
menit.
 Apusan alkohol dicuci dengan baik dalam air.
 Pewarnaan dengan besi Weigert's hematoxylin selama 5 menit atau Harris'
haematoxyl selama satu menit.
 Setelah pewarnaan dengan hematoksilin besi Weigert: Cuci dalam air selama 5
menit dan diferensiasi dalam metil karbonat selama satu menit dan kemudian cuci
dalam air selama 5 menit

Setelah pewarnaan dengan hematoksilin Harris: Cuci dalam air dan

diferensiasi dalam alkohol asam sampai inti berwarna biru tajam dan latar
belakang relatif tidak diwarnai. Cuci dalam air dan biru dalam larutan bikarbonat
10-20 detik.

 Cuci dengan air suling. Pewarnaan dengan larutan asam fuchsin selama 3 menit.
 Pindahkan slide langsung ke larutan anilin blue-orange G selama 45 menit.
 Pindahkan slide langsung ke alkohol 96% untuk tiga perubahan.
 Dehidrasi dengan alkohol absolut dan bersihkan dalam xilena, masing-masing dua
perubahan.
 Pasang dengan Entellan.
Klasifikasi sel
Jenis sel yang ditemukan pada apusan vagina diklasifikasikan sebagai
parabasal, intermediet kecil dan besar, supersial (sel sebagian dan seluruhnya
cornifiksi), sel busa, sel metestrum dan neutrofil, sesuai dengan karakteristik
morfologinya.

Parabasalcells: Adalah sel epitel vagina yang terkecil dan merupakan sel ovoid kecil
dengan rasio nuklir-to-sitoplasma besar.
Sel menengah kecil: Sel-sel ini sangat bervariasi dalam ukuran dan merupakan sel-
sel transisional yang sedang tumbuh antara sel-sel parabasal sferis dan sel-sel gepeng
yang lebih besar, lebih matang, tempat mereka berkembang saat mereka bergerak
lebih jauh dari lapisan basal. Bentuknya bervariasi dari hampir bulat hingga oval; dan
kebanyakan berbentuk elips. Garis sel sangat teratur. Seperti sel parabasal,
nukleusnya besar dan vesikular, tetapi kurang basofilik.
Sel perantara besar: Sel-sel ini dicirikan oleh bentuk dan tampilan inti daripada
ukurannya mewakili tahap transisi antara yang lebih besar dari sel-sel menengah kecil
berbentuk biasa, berukuran bervariasi, dan sel-sel supersial berbentuk tidak beraturan,
skuamosa. Sel-sel tersebut berbentuk skuamosa dengan inti aktif, bulat, berukuran
normal.
Sel superfisial: Sel ini besar dan datar memiliki inti sangat redup atau piknotik.
Intensitas pewarnaan sitoplasma juga dapat bervariasi, tergantung pada derajat
kornifikasi dan atau degenerasi. Sel-sel ini memiliki keratin yang dimasukkan ke
dalam sitoplasma. Dalam kategori sel superfisial terkorosi sebagian, menyertakan sel
dengan inti piknotik yang jelas dan gelap atau dengan inti pewarnaan samar. Dalam
kategori sel superfisial yang terkorosi penuh memasukkan sel tanpa inti atau dengan
inti yang tidak jelas dan padat. Sel supersial sangat bersudut, terlipat, dan bentuknya
tidak beraturan.
Sel metestrus : Sel perantara kecil atau sel parabasal dengan neutrofil di sitoplasma
disebut `sel metestrum
Sel busa : Sel perantara kecil atau sel parabasal dengan banyak vakuola sitoplasma
bening disebut 'sel busa'.
Kepadatan sel-sel ini dalam sampel apusan dipertimbangkan dalam penentuan
siklus seksual. Kepadatan jenis sel yang ditemukan pada apusan vagina dievaluasi
sebagai jejak (+/-) kecil (+) medium (++) atau padat (+++).Dalam studi tersebut,
penghitungan sel tidak dilakukan untuk diagnosis siklus seksual pada chinchilla.
Namun 1-5 sel ditentukan sebagai jejak, 10-15 sedikit, sekitar 40-50 sel sebagai
medium, dan bila dominan dalam apusan, sebagai 'padat'. Kepadatan neutrofil
ditangani secara terpisah.

Pengamatan klinis
Weir (1973) menyatakan bahwa perforasi vagina merupakan indikasi yang
dapat diandalkan dari estrus pada hewan pengerat. Dalam penelitian ini, kriteria
 perforasi vagina digunakan sebagai indikasi utama estrus. Secara klinis, perilaku
kawin pada semua hewan, temuan palpasi perut, dan tanggal kelahiran juga dicatat.
Munculnya sumbat ion kopulasi di kandang dan rambut rontok digunakan sebagai
indikasi perkawinan yang berhasil.

D. Hasil
Semua sitoplasma sel berwarna merah muda, inti ungu, dan tipe sel supersial
dengan warna yang sama pada semua apusan yang diwarnai dengan hematoksilin &
eosin. Namun, dengan metode pewarnaan Ayoub-Shklar yang dimodifikasi, intensitas
pewarnaan sitoplasma sel supersial bervariasi tergantung pada tingkat kornifikasi dan
atau degenerasi, dalam warna mulai dari biru dan merah tua hingga oranye, dan ini
khususnya lebih khas selama estrus. Ketika metode pewarnaan Ayoub-Shklar
dikombinasikan dengan hematoksilin Harris, ditemukan bahwa inti neutrofil terwarnai
lebih pucat, tetapi ketika dikombinasikan dengan hematoksilin Weigert, baik neutrofil
dan sel metoestrum diwarnai secara khas. Dalam kedua kombinasi hematoksilin,
sitoplasma sel perantara kecil dan besar diwarnai biru pucat dan intinya oranye.

Proetrus
Pada awal proestrus, kepadatan neutrofil, parabasal dan sel-sel
menengah l kecil meningkat dari kecil ke sedang, dan Supefisial dan sel menengah
besar ditemukan dalam jumlah jejak. Pada tahap siklus ini, sel goblet diamati pada
apusan yang disiapkan dengan aspirasi kuat (Gambar 1). Selama pertengahan
proestrus, penurunan jumlah sel antara parabasal dan kecil, dan peningkatan yang
kurang cepat pada sel perantara besar dan pada tingkat yang lebih tinggi pada sel
supersial, diamati (Gambar 2). Pada proestrus akhir, intermediet kecil dan besar
menghilang (sel intermediet besar kadang-kadang hadir dalam jumlah sedikit),
terdapat beberapa neutrofil. Sel supersial sebagian atau seluruhnya terkorosi hadir
dengan kepadatan sedang (Gambar 3).

Gambar 1. Sel goblet (g) pada awal proestrus 40x

Gambar 2. Selama pertengahan proestrus, sebagian (S) dan sepenuhnya (Sc) cornized
superfisial, sel antara besar (L) dan neutrofil (n) 20x

Estrus
Dalam sampel apusan yang diperoleh selama periode ini, jenis sel supersial
dominan, tetapi semua jenis sel lain muncul (Gambar 4). Pada permulaan metestrus,
sel-sel parabasal dan intermediet serta neutrofil mulai muncul kembali dan mereka
ada di antara sel-sel supersial hanya dalam beberapa kasus.

Metestrus
Selama pertengahan metoestrus, dimulai dengan munculnya kembali
Eneutrofil, sel parabasal dan intermediet, diamati bahwa sel intermediet besar dan
neutrofil padat, namun sel parabasal dan intermediet kecil berada pada kepadatan
sedang dan hanya ada beberapa sel supersial ( Gambar 5). Selain itu, pada tahap ini,
ditemukan sel metoestrum dan sel busa (Gambar 6).

Gambar 3. Selama proestrus akhir, sel superfisial (Sc), sel menengah(L) besar
dan neutrofil (n), 20x
Gambar 4. Pada saat estrus, sebagian (S) dan sepenuhnya (Sc) sel superfisial terkorosi, 40x

Gambar 5. Pada metestrus,parabasal(p),kecil(i) dan besar(L)menengah,

superfisial(Sc),metoestrum(m)dan neutrofil (n), 40x

Gambar 6. Pada metoestrus, metoestrum (m), busa (f) sel dan butiran intracytoplasmic
(panah), 100x
Gamb7. Anoestrus,parabasal(p),kecil menengah(i),sebagian(S)dan sepenuhnya(Sc)sel
superfisial cornied dan neutrofil(n), 20x

Anestrus
Selama fase siklus ini, sel supercial dan parabasal terjadi dan sedikitsel menengah
besar dan neutrofil hadir dalam kepadatan rendah (Gambar 7). Sel busa dan
metoestrum jarang ditemukan.
Kebuntingan
Selama kebuntingan neutrofil umumnya kepadatan sedang tetapi kadang-kadang
tingkat ini bervariasi dari sedikit ke padat. Parabasal dan sel menengah kecil dan besar
hadir pada kepadatan rendah atau sedang, dan sel supersial hadir dalam jumlah sedikit
atau sedikit (Gambar 8). Perubahan apusan vagina chinchilla terkait dengan fase
siklus seksual dan kebuntingan ditunjukkan pada Tabel 1.

Pada kebuntingan, parabasal(p),kecil(i) dan besar(L)menengah(i), sebagian besar sel

superfisial(S)dan neutrofil(n), 20x
 Tabel 1 Perubahan untuk semua fase siklus seksual dan kebuntingan pada apusan
vagina Chinchilla laniger

E. Pembahasan
Hormon gonad (progesteron dan khususnya, estrogen) memainkan peran
penting dalam pengaturan siklus seksual dan pemeliharaan kebuntingan. Estrogen
menyebabkan perubahan histologis pada epitel vagina. Sebelum pubertas dan selama
anestrus pada hewan dewasa, epitel vagina hanya setebal beberapa lapis sel. Dengan
ion stimulasi estrogen, mukosa vagina menjadi epitel skuamosa berlapis yang terdiri
dari banyak lapisan sel (Bell dkk . 1973, Concannon & Digregorio 1986, Vrcic dkk .
1991). Estrogen mempengaruhi epitel vagina dalam tiga cara, dengan proliferasi, ion
maturasi dan pengelupasan (Montes & Lugue 1988). Cornification vagina telah
digunakan sebagai indikator aktivitas biologis di banyak spesies hewan (Fowler dkk .
1971). Pap vagina mencerminkan fitur histologis epitel vagina. Sitologi vagina
merupakan bantuan penting untuk diagnosis siklus seksual dan kebuntingan dan
gangguan reproduksi (Wright 1990). Tidak ada penelitian tentang klasifikasi siklus
pada chinchilla telah dilaporkan dalam literatur. Dalam penelitian ini, siklus seksual
chinchilla dibagi menjadi empat periode yang disebut sebagai proestrus, estrus,
metoestrus, dan anoestrus, dan temuan apusan vagina dievaluasi sesuai. Dalam
penelitian ini, temuan apusan vagina yang diperoleh selama siklus proestrus pada
chinchilla mirip dengan pada anjing (Fowler dll. 1971, Bell dkk . 1973, Roszel 1977,
Concannon & Digregorio 1986, Wright 1990 ), kucing dan tikus (Vrcic dkk . 1991 ),
dalam hal karakteristik umum chinchilla berbeda dari anjing dengan tidak adanya
eritrosit, seperti halnya pada hewan pengerat lainnya. Kehadiran sel goblet yang
diamati pada apusan chinchilla pada awal proestrus menunjukkan bahwa ada
transformasi mucinous dari dua atau tiga lapisan super, yang merupakan fitur unik
dari siklus estrus hewan pengerat (Vrcic dkk . 1991).
Fase estrus dari siklus seksual ditandai dengan kornikasi superfisial dari epitel
skuamosa. Tidak ada neutrofil dan sel supersial dominan pada apusan yang diperoleh
selama estrus pada anjing kucing dan tikus. Insiden dari sel perantara dalam apusan
vagina kucing selama estrus dilaporkan sebesar 17% (UÈ nal dkk . 1997). Dalam
sampel apusan yang dikumpulkan selama estrus pada chinchilla, temuannya
sebanding dengan anjing (Fowler dkk . 1971, Bell dkk . 1973, Roszel 1977,
Concannon & Digregorio 1986, Wright 1990), tikus (Montes & Lugue 1988, Oba
1988 ) dan kucing (Vrcic dkk . 1991) yang diamati. Selain itu, siklus estrus terlihat
jelas pada sebagian besar sampel apusan yang diperoleh dari chinchilla jika mereka
memiliki lubang vagina. Oleh karena itu, adanya lubang vagina merupakan penentu
estrus pada chinchilla (seperti yang dilaporkan oleh Weir 1970, Kuroiwa & Imamichi
1977, Puzder & Novikmec 1992 ). Dalam penelitian ini, perubahan metoestrus yang
diamati sebanding dengan yang ada pada spesies hewan lain (Fowler dkk . 1971, Bell
dkk . 1973, Concannon & Digregorio 1986, Montes & Lugue 1988, Wright 1990).
Namun, metoestrum dan sel busa, yang dilaporkan ada pada anjing (Christie dkk .
1972, Concannon & Digregorio 1986 ) diamati selama metoestrus pada chinchilla.
Juga telah dinyatakan bahwa beberapa sel perantara pada anjing mengandung butiran
sitoplasma (Holst 1986). Di dalam penelitian ditemukan butiran bulat berwarna ungu
dengan ukuran berbeda di beberapa sel perantara. Meskipun temuan smear yang
diperoleh dari chinchilla selama periode anoestrus serupa dengan yang dilaporkan
pada anjing dan kucing (UÈ nal dkk . 1997). Umumnya jumlah sel berkurang,
dibandingkan dengan periode siklus lainnya. Juga, selama periode ini metoestrum dan
sel busa, yang dilaporkan ada pada anjing, diamati dalam jumlah sedikit (Christie
dkk . 1972, Concannon & Digregorio 1986).
Studi tersebut mengungkapkan bahwa sampel smear dari chinchilla bunting
memiliki karakteristik yang mirip dengan yang diamati pada spesies hewan lain. Pada
anjing, kebuntingan memiliki karakteristik yang sama seperti yang dilaporkan pada
metoestrus dan oleh karena itu dapat dibingungkan dengan tahap ini. Juga, disarankan
bahwa perubahan yang diamati pada apusan yang diperoleh selama bulan pertama
kebuntingan pada domba jelas tetapi tingkat anoestrus tidak berbeda selama bulan-
bulan berikutnya (DogÆaneli dkk . 1979). Dimungkinkan untuk membedakan antara
kebuntingan dan metoestrus dengan munculnya metoestrum dan sel busa. Metode
pewarnaan trichrome memiliki tempat penting dalam sitologi endokrin. Ketika sel-sel
epitel vagina merespons estrogen, dalam siklus seksual sitoplasma berubah dari biru
menjadi jingga karena perkembangan prekursor keratin. Sifat tinctorial ini
menekankan periode efek estrogenik maksimum. Akibatnya, estrus mudah dikenali
pada apusan yang mengandung hampir secara eksklusif sel epitel besar dengan
sitoplasma oranye (Roszel 1977, Bourne1990). Penerapan metode pewarnaan
trichrome lain dalam sitologi vagina juga diteliti. Metode pewarnaan yang digunakan
oleh metode Ayoub-Shklar untuk demonstrasi prekeratin dan keratin (Luna 1968)
diterapkan pada apusan dengan tiga cara berbeda. Pada metode pertama, ketika
diterapkan tanpa mengubah prosedur, terlihat bahwa inti neutrofil dan sel parabasal
tidak diwarnai dan sulit untuk membedakan satu dari yang lain; Hematoksilin Harris
dan Weigert digunakan sebagai pewarnaan nukleus pada metode kedua dan ketiga.
Hasil yang berhasil dicapai pada kedua pewarnaan, tetapi ditentukan bahwa inti sel
lebih gelap pada apusan dengan pewarnaan hematoksilin Weigert. Diamati bahwa
distribusi prekeratin dan keratin dalam sel supercial dapat ditunjukkan secara jelas
dengan metode pewarnaan Ayoub-Shklar, dan keberhasilan yang lebih besar dicapai
dalam membedakan antara sel epitel cornifikasi sebagian dan seluruhnya, yang
merupakan subtipe dari superfisial sel-sel. Telah diamati bahwa metode ini memiliki
banyak keuntungan: ekonomis dan mudah diterapkan di setiap laboratorium. Jika
apusan dibiarkan kering, berbagai artefak tidak terjadi. Ini menghasilkan hasil yang
sangat baik bahkan dengan noda yang telah dikeringkan dan disimpan untuk waktu
yang lama. Metode tersebut juga memiliki periode pewarnaan pendek dan beberapa
langkah; persiapan noda mudah dan cepat dan penggunaan jenis noda terbatas. Dalam
penelitian ini, estrus dikonfirmasi sebagai hasil dari evaluasi bersama temuan klinis
dan apusan vagina, dan disimpulkan bahwa metode apusan vagina adalah metode
yang andal dan praktis untuk mendiagnosis siklus seksual pada chinchilla. Selain itu,
teknik pewarnaan Ayoub-Shklar (metode pewarnaan trichrome) digunakan untuk
pertama kalinya dalam penelitian ini dan telah dibuktikan bahwa teknik ini layak
dalam evaluasi sitologi vagina dan metode ini dapat digunakan sebagai alternatif
metode pewarnaan dalam sitologi vagina.
DAFTAR PUSTAKA
 PAPER EVALUATION SEMEN

OLEH

NAMA : DESWANDI W S BERRI S.K.H

NIM : 2009020007

PROGRAM STUDI PROFESI DOKTER HEWAN

FAKULTAS KEDOKTERAN HEWAN
UNIVERSITAS NUSA CENDANA
2021
 KARAKTERISASI DAN PENYIMPANAN SEMEN DARI ULAR JAGUNG
(ELAPHE GUTTATA)

A. Ringkasan
Ordo filogenetik Squamata memiliki banyak perwakilan yang dapat
mengambil manfaat dari penggunaan pengawetan semen sebagai alat untuk
membantu konservasi. Sampai saat ini, beberapa penelitian telah dilakukan untuk
mengevaluasi potensi pengumpulan dan pengawetan semen dari ular. Penelitian ini
bertujuan untuk mengkarakterisasi parameter semen ular jagung (Elaphe guttata),
meliputi kenampakan, volume, konsentrasi, motilitas sperma, dan morfologi sperma,
serta untuk menentukan umur panjang motilitas sperma ular jagung yang disimpan
pada suhu 40C. Sampel semen tunggal dikumpulkan dari 22 ekor ular jagung dewasa.
Penampilan semen ular jagung umumnya keruh, dan warnanya putih sampai
kecokelatan. Spermatozoa ular jagung awalnya menunjukkan motilitas rata-rata
92,5%. Ular jagung ditemukan menghasilkan ejakulasi volume kecil (median 0,01
ml). Namun, konsentrasi keseluruhan ejakulasi ular tinggi (x = 852x106/585x106
spermatozoa/ml). Secara morfologi, rata-rata 75,7/9.3% sel sperma dalam ejakulasi
adalah normal. Ular ejakulasi dengan semen berwarna putih memiliki konsentrasi
sperma yang jauh lebih tinggi yaitu (x =1,859 x 10 6/1.008 x 106 sel sperma/ml; F =
15.74, P = 0,001) konsentrasi tersebut lebih tinggi daripada ejakulasi berwarna cokelat
(x 601 x 106 / 439 106 sel sperma/ml). Motilitas sperma menurun secara signifikan
pada sampel yang disimpan pada suhu 40C selama lebih dari 48 jam di lemari es atau
Equitainer. Ini adalah studi pertama untuk mengkarakterisasi volume, penampilan,
dan konsentrasi semen; motilitas sperma; dan morfologi sperma pada ular jagung
penangkaran. Informasi yang diperoleh dari penelitian ini dapat digunakan untuk
mengembangkan model pengumpulan, penyimpanan berpendingin, dan program
pengiriman semen dari ular penangkaran dan ular liar yang terancam punah.

B. Latar Belakang
Penyimpanan spermatozoa merupakan alat bantu reproduksi penting yang
digunakan dalam program konservasi untuk meningkatkan keragaman genetik spesies
terancam dan hampir punah. Meskipun secara rutin digunakan untuk mengelola
program konservasi untuk vertebrata tingkat tinggi, tidak ada upaya yang dilakukan
untuk membuat program bantuan reproduksi untuk reptil. Ordo filogenetik Squamata
memiliki banyak perwakilan yang dapat mengambil manfaat dari penggunaan
pengawetan semen sebagai alat untuk membantu konservasi. Saat ini, ular Pulau
Maria ( Liophus ornatus ) dan ular garter San Francisco ( Thamnophis sirtalis
tetrataenia ) terdaftar sebagai spesies yang terancam punah, sedangkan ular derik
Pulau Aruba ( Crotalus unicolor ), ular air Copperbelly ( Nerodia erythrogaster
mengabaikan ), dan banyak spesies ular lainnya terdaftar sebagai terancam punah.
Kelangsungan hidup jangka panjang spesies ini dapat bergantung pada pengembangan
program reproduksi bantuan yang berhasil, yang dapat mencakup inseminasi buatan
dengan spermatozoa yang didinginkan atau diawetkan dengan kriopreservasi.

Biologi reproduksi ular telah tertulis. Namun beberapa penelitian

menggambarkan koleksi dan karakterisasi semen ular. Laporan pertama
mengevaluasi semen ular menggambarkan metode pengumpulan semen secara
manual tetapi tidak menggambarkan karakteristik semen. Sebuah studi selanjutnya
 menggambarkan metode pengumpulan semen manual dan mengkarakterisasi
penampilan dan volume semen serta motilitas, konsentrasi, dan morfologi sperma
untuk delapan spesies ular. Metode pengumpulan semen manual ini juga telah
dimodifikasi dan digunakan untuk mempelajari ular derik Brasil ( Crotalus durissus
terrificus ). Pada penelitian tersebut dideskripsikan penampakan, volume, dan
konsentrasi semen yang dikumpulkan serta motilitas spermatozoa. Quinn dkk
mengumpulkan semen dari ular garter dengan elektroejakulasi dan melaporkan
volume dan konsentrasi semen dan motilitas sperma. Variabilitas dalam sampel
semen di antara 10 spesies ular ini menunjukkan bahwa nilai referensi individu
diperlukan untuk sebagian besar spesies. Sampai saat ini, belum ada penelitian yang
dipublikasikan tentang koleksi dan karakterisasi spermatozoa dari ular jagung
( Elaphe guttata ). Hanya satu penelitian yang mengevaluasi efek penyimpanan dingin
pada spermatozoa ular. Para penulis berhasil menyimpan semen ular yang diencerkan
pada 50C atau dalam penangas es hingga 96 jam, tetapi persen motilitas tidak
dilaporkan. Penyimpanan semen ular encer yang didinginkan dengan sukses membuat
upaya kooperatif untuk membuat memungkinkan inseminasi ular betina di seluruh
Amerika Serikat. Pengembangan protokol pengumpulan, evaluasi, dan penyimpanan
semen yang aman dan konsisten diperlukan untuk menetapkan program bantuan
reproduksi ular.
Tujuan langsung dari penelitian ini adalah untuk mengkarakterisasi parameter
semen ular jagung, meliputi penampilan semen, volume, dan konsentrasi serta
motilitas dan morfologi sperma dan untuk menentukan umur panjang motilitas
spermatozoa ular jagung yang disimpan pada suhu 4 0C. Proyek ini menggunakan
teknik ini untuk mengembangkan program pengumpulan, penyimpanan dingin, dan
pengiriman untuk ular yang ditangkap dan liar. Saat ini, keragaman genetik ular yang
dipelihara di lembaga zoologi AS terbatas. Teknik yang dikembangkan dalam
penelitian ini dapat digunakan untuk mengumpulkan dan menyimpan sperma dari ular
liar yang terancam atau hampir punah. Materi genetik ini kemudian dapat diangkut ke
seluruh dunia dengan metode pengiriman yang didinginkan dan digunakan untuk
membuahi ular betina secara artifisial.

C. Bahan dan Metode

Dua puluh dua ular jagung jantan dewasa dengan rentang usia 3 sampai 10
tahun diperoleh untuk pengumpulan semen dari kolektor reptil swasta yang berlokasi
di Louisiana. Sampel diambil antara bulan Mei dan Juni 2005. Semua ular yang
digunakan dalam penelitian ini telah berhasil direproduksi pada tahun 2004. Ular
ditempatkan dalam wadah plastik (58x43x13 cm; 23x17x5 inci). Suhu lingkungan dan
kelembaban dipertahankan antara 260C dan 270C dan 50% dan 60%, masing-masing.
Ular-ular itu diberikan mangsa tikus utuh setiap minggu dan memiliki akses ke air
keran yang diklorinasi dalam mangkuk.
Pengambilan sampel
Pemeriksaan fisik menyeluruh dilakukan pada hewan untuk memastikan
bahwa dalam keadaan sehat. Kotoran di sekitar kloaka dibuang secara manual untuk
meminimalkan kontaminasi. Kloaka dibilas dengan salin fisiologis sebelum
pengambilan sampel. Semen dikumpulkan dengan pijatan digital craniocaudal lembut
sepertiga caudoventral ular. Semen yang dikeluarkan dikumpulkan dengan jarum
suntik tuberkulin. Sampel semen tunggal dikumpulkan dari setiap ular.
Evaluasi semen
Ejakulasi semen dari masing-masing ular segera dievaluasi penampilan,
volume, konsentrasi, motilitas sperma, dan morfologi sperma. Volume sampel semen
diperkirakan mendekati 0,005 ml. Setiap sampel semen segar dievaluasi untuk
penampilan dan kemudian diperluas dengan menambahkan 1 ml modifikasi Ham's
F10 dengan albumin (Irvine Scientific, Santa Ana, California 92705, USA) ke sampel
terlepas dari volume sampel awal. Ketajaman spermatozoa dalam semen yang
diperpanjang diperkirakan dengan menempatkan semen encer pada slide di bawah
kaca penutup pada suhu kamar (26-270C) dan memperkirakan persentase sel sperma
yang bergerak secara progresif hingga 5% terdekat dalam lima mikroskop yang
berbeda. bidang di bawah 400 perbesaran kation. Untuk menentukan konsentrasi,
sebagian dari semen yang diperpanjang lebih lanjut diencerkan 1:10 dalam saline
formol-buffered, dan sel-sel sperma dihitung di kedua ruang hemasitometer di bawah
mikroskop fase kontras (400). Konsentrasi sampel semen dihitung dengan jumlah sel
sperma hemasitometer dan faktor konversi, dengan mempertimbangkan kedua
pengenceran. Morfologi dievaluasi dengan mengamati 100 sel sperma di bawah
mikroskop fase kontras pada 1.000 nifikasi; persentase dari setiap jenis morfologi
yang berbeda ditentukan untuk setiap sampel.
Semen yang dikumpulkan dari 11 ular disiapkan untuk penyimpanan
berpendingin. Semen yang diencerkan ditahan pada suhu kamar selama kurang lebih
10 menit sementara evaluasi semen awal dilakukan. Semen yang telah diperpanjang
kemudian diencerkan 1:1 dengan Refrigeration Test Yolk Buffer (Irvine Scientific,
Santa Ana, California 92705, USA) pada suhu kamar. Dua alikuot 0,3 ml dari sampel
yang diencerkan dipipet ke dalam cryotube 2 ml yang terpisah (Nunc, Rochester, New
York 14625, USA). Motilitas sperma (0 jam) kemudian diperkirakan sebelum
pendinginan. Salah satu vial ditempatkan di rak styrofoam suhu kamar dan
ditempatkan di lemari es standar (40C), dan vial lainnya ditempatkan di ruang bergaya
cangkir dari transporter semen berpendingin Equitainer I untuk penyimpanan
(Hamilton Research Inc., South Hamilton , Massachusetts 01982, AS) Untuk
penyimpanan di Equitainer I, hanya satu set dua paket es yang digunakan di dalam
wadah mulai dari 0 jam untuk mensimulasikan proses pengiriman, di mana paket es
tidak akan diganti. Pengangkut semen pendingin Equitainer I dengan dua bungkus es
ditentukan oleh pabrik untuk menjaga agar semen tetap dingin hingga 70 jam. Untuk
menentukan umur panjang sperma, motilitas diperkirakan setiap 24 jam sampai
motilitas turun menjadi 0%. Distribusi umur ular, volume ejakulasi, motilitas, dan
konsentrasi spermatozoa dievaluasi secara terpisah dengan statistik uji Shapiro-Wilk.
Untuk nilai terdistribusi normal, mean, standar deviasi, interval kepercayaan 95%
(CI), dan minimum dan maksimum (min/maks) dihitung. Untuk nilai terdistribusi
tidak normal, median, 25-75% kuartil, dan min/max dihitung. Uji Levene untuk
kesetaraan varians digunakan untuk menentukan apakah data homogen.
Analisis varians satu arah (ANOVA) digunakan untuk menilai perbedaan
antara kelompok untuk volume ejakulasi, motilitas dan konsentrasi spermatozoa
berdasarkan usia, dan penampilan ejakulasi untuk data yang terdistribusi normal.
Untuk data yang tidak terdistribusi normal, ANOVA satu arah Kruskal-Wallis
digunakan untuk menilai perbedaan antara dan di dalam kelompok, masing-masing.
Motilitas dalam dua metode pendinginan yang berbeda dievaluasi dari waktu ke
waktu dengan menggunakan analisis nonparametrik Friedman dari data berulang.
 Dimana perbedaan yang jelas, metode Rhyne dan Steele untuk perbandingan sampel
terkait dengan waktu kontrol (0 jam) digunakan. berpasangan T -tes digunakan untuk
menilai perbedaan motilitas spermatozoa antara dua metode pendinginan pada 24, 28,
72, 96, dan 120 jam. Nilai dari P 0,05 dianggap mencerminkan perbedaan statistik.
Analisis statistik dilakukan dengan SPSS 8.0 (SPSS Inc., Chicago, Illinois 60606,
USA).

Tabel 1. Temuan morfologi abnormal pada semen ular jagung ( n = 22).

D. Hasil
Usia rata-rata ular dalam penelitian ini adalah 5 tahun (25-75% kuartil 4-6
tahun; min/maks 3/10 tahun). Usia tidak berpengaruh signifikan terhadap volume
semen ( F 0,3, P 0,6), konsentrasi ( F 0,3, P 0.9), atau motilitas ( F 0,002, P 0.9).
Waktu rata-rata untuk merangsang ular berejakulasi adalah 9.1 atau kurang lebih 2.9
menit (95% 7,7-10,4 menit; menit/maks 4/15 menit). Penampilan semen umumnya
keruh, dan warnanya putih sampai coklat. Volume ejakulasi ( F 0.6, P 0,5) dan
motilitas sperma ( F 1.7, P 0.2) tidak dipengaruhi secara signifikan oleh penampilan
semen. Spermatozoa awalnya menunjukkan persentase median motilitas progresif
92,5% (25-75% kuartil 83,0-96,3%; min/max 43/99%). Ular jagung ditemukan
menghasilkan ejakulasi dengan volume rata-rata 0,01 ml (25-75% kuartil
0,0050,010ml; min/maks 0,005/0,030 ml). Konsentrasi rata-rata ejakulasi ular jagung
adalah 852x106 atau kurang lebih 585x10 6sel sperma/ml (95% CI 578– 1.126 sel/ml;
min/maks 33/2.161 sel/ml). Ejakulasi yang memiliki penampilan putih memiliki
konsentrasi sperma yang jauh lebih tinggi ( x = 1,859 x10 6 atau kurang lebih 1,008 x
106) dibandingkan dengan yang berpenampilan cokelat ( x = 601x 10 6 atau kurang
lebih 439 106 sel sperma/ml). Morfologi Secara umum, 75,7% (95% CI 71,6–79,9%;
min/ maks 60/89%) sel sperma dalam ejakulasi normal, sedangkan sekitar 24,3%
(95% CI 20,1– 28,4%; min/max 11.0/40.0%) dari spermatozoa menunjukkan ekor
terlipat dan morfologi abnormal lainnya (Tabel 1). Rata-rata motilitas spermatozoa
yang disimpan pada suhu 40C baik di lemari es standar atau Equitainer I lebih besar
dari 50% pada 48 jam, tetapi motilitas spermatozoa dari semua ular di lemari es dan
Equitainer I turun menjadi 0% pada 120 jam Motilitas spermatozoa yang disimpan di
 lemari es atau Equitainer I antara 0 dan 24 jam tidak berbeda nyata. Motilitas tidak
berkurang secara signifikan pada 48, 72, 96, dan 120 jam dibandingkan dengan 0 dan
24 jam untuk sampel yang disimpan di lemari es atau Equitainer I. Motilitas
spermatozoa pada sampel yang didinginkan di lemari es secara signifikan lebih tinggi
daripada yang disimpan di Equitainer I pada 72 jam ( P 0,02; kulkas 38.1 atau kurang
lebih 6,8%, Equitainer I 14,5 atau kurang lebih 5,9%) dan 96 jam ( P 0,003; kulkas
11.7/3.0%, Equitainer I 0.2/0,2%). Motilitas spermatozoa antara sampel didinginkan
atau Equitainer I pada 24 jam ( P 0.9), 48 jam ( P 0.3), atau 120 jam ( P 0.9) tidak
signifikan sangat berbeda.

E. Pembahasan
Penelitian ini adalah studi pertama untuk mengkarakterisasi penampilan
semen, volume, dan konsentrasi dan motilitas dan morfologi sperma pada ular jagung
penangkaran. Dalam penelitian ini, semen ular jagung memiliki penampilan keruh,
putih hingga cokelat. Sebagai perbandingan semen yang dikumpulkan secara manual
dari ular derik Brasil memiliki penampilan putih seperti susu. Ejakulasi ular jagung
yang memiliki penampilan putih secara signifikan lebih tinggi jumlahnya sperma
daripada ejakulasi cokelat. Semen yang lebih pekat mungkin tampak memiliki
penampilan yang lebih putih daripada semen yang kurang pekat karena peningkatan
jumlah sel sperma, sebagaimana dibuktikan oleh opasitas yang lebih besar dari sampel
semen yang lebih pekat pada vertebrata lain. Individu yang mengumpulkan sampel
semen dari ular jagung mungkin dapat memprediksi nilai potensial sampel tertentu
berdasarkan penampilannya. Apakah perbedaan ini terjadi pada spesies ular lain
belum diuji tetapi harus diupayakan.
Spermatozoa ular jagung awalnya menunjukkan motilitas yang sebanding
dengan mamalia domestik. Namun dibandingkan dengan mamalia domestik, ular
jagung ditemukan menghasilkan ejakulasi dengan volume rendah dan sangat
terkonsentrasi. Volume rendah dan konsentrasi tinggi semen ular mungkin karena
mekanisme transportasi sperma dari jantan ke betina. Selama kopulasi, hemipenis
mengevaginasi ke dalam kloaka betina yang reseptif. Sperma dibawa oleh saluran
Wolffian ke dasar hemipenis dan kemudian berjalan oleh sulkus spermatikus di luar
hemipenis ke betina. Konsentrasi sperma yang lebih tinggi mungkin diharapkan pada
ular karena jarak yang harus ditempuh sperma. Meskipun mungkin diharapkan bahwa
volume cairan yang lebih tinggi juga akan dikaitkan dengan ejakulasi untuk alasan
yang sama, ular tidak memiliki organ aksesori yang ditemukan pada mamalia dan
oleh karena itu mungkin harus bergantung pada konsentrasi sperma yang lebih tinggi.
Saluran reproduksi ular jantan terdiri dari otot polos. Karena volume ejakulasi yang
kecil, ular mungkin lebih mengandalkan kontraksi otot untuk mendorong semen
melalui saluran reproduksi daripada pada tekanan hidrostatik.
Semen dikumpulkan secara manual dari python Angola ( Python anchietae )
dan ular piton Timor ( Python timoriensis ) memiliki volume 0,1-0,4 ml dan
konsentrasi sekitar 1.500x106 sperma sel/ml, sedangkan semen yang dikumpulkan
secara manual dari ular brasil memiliki volume, motilitas, dan konsentrasi 0,015
ml,/70%, dan 1,522 x106 sel sperma/ml. Semen ular garter kotak-kotak yang
dikumpulkan melalui elektroejakulasi ditemukan memiliki kisaran volume 0,05-0,10
ml dan motilitas awal 50-70%.7 Dalam penelitian ini, volume semen yang dihasilkan
oleh ular jagung mirip dengan ular garter dan ular derik, tetapi lebih rendah dari ular
sanca. Volume semen yang lebih rendah diamati pada ular jagung, garter, dan ular
derik mungkin terkait dengan ukuran tubuh yang lebih kecil dari ular ini bila
dibandingkan dengan ular piton. Konsentrasi sperma yang lebih rendah di ular jagung
dapat dikaitkan dengan perilaku reproduksi ular ini. Ular jagung akan bersanggama
dengan banyak betina pada musim reproduksi tertentu. Sementara banyak ular
memiliki masa reproduksi yang relatif pendek yaitu 2-3 bulan, musim kawin ular
jagung dapat berlangsung selama 6-7 bulan (Maret–September) dalam kondisi yang
sesuai. Sebuah jendela reproduksi diperpanjang dikombinasikan dengan motilitas
spermatozoa tinggi (92,5%) akan memungkinkan ular jagung untuk menyebarkan
materi genetik mereka sambil mempertahankan konsentrasi semen keseluruhan yang
lebih rendah. Secara morfologis, 75% sel sperma ular jagung dalam ejakulasi normal.
Persen morfologi normal pada ular ini sebanding dengan domba jantan, banteng, babi
hutan, kuda jantan, dan pejantan. Pada mamalia, sejumlah kecil kelainan morfologi
dianggap normal pada hewan yang sehat. Dari parameter semen yang umum diukur,
kelainan morfologi memiliki korelasi negatif terbesar terhadap kesuburan hewan
ternak, dan cekaman panas merupakan penyebab utama kelainan sperma pada hewan
tersebut. Pengaruh stres panas pada spermatozoa reptil belum dievaluasi. Reptil
adalah ektoterm dan bergantung pada suhu lingkungan mereka untuk mengatur suhu
inti mereka. Tidak terduga jika ular jagung memiliki 2,7–5,50C (10–15 F) perbedaan
suhu tubuh pada hari tertentu. Meski belum dievaluasi, diperkirakan produksi semen
akan berkurang dan kelainan sperma akan meningkat pada ular yang mengalami
penurunan suhu tubuh yang besar. Genetika dan obat-obatan eksogen juga telah
dikaitkan dengan kelainan sel sperma pada vertebrata yang lebih tinggi. Sampai saat
ini, belum ada penelitian yang mengevaluasi morfologi abnormal sperma ular
dibandingkan dengan mamalia.
Mengden dkk.berspekulasi bahwa kelainan morfologi semen ular bisa menjadi
indikasi baik kondisi donor atau masalah dalam teknik pengumpulan dan
penyimpanan. Ekor terlipat adalah kelainan yang paling umum diamati dalam
penelitian ini, dan juga kelainan yang paling umum diamati pada semen banteng. Ekor
yang terlipat, juga dikenal sebagai refleks bagian tengah distal, dapat diinduksi secara
in vivo atau in vitro. In vivo, refleks bagian tengah distal terjadi selama perjalanan
epididimis dan dikenali secara mikroskopis dengan mengamati bahan tetesan
sitoplasma yang terperangkap di tikungan ekor. Malfungsi epididimis sapi yang
terkait dengan refleks midpiece distal dapat diinduksi oleh testosteron rendah karena
berbagai rangsangan yang merugikan, seperti pengobatan estradiol, aktivitas tiroid
yang rendah, demam singkat, dan isolasi skrotum. In vitro dapat dilihat pada paparan
spermatozoa sapi ke larutan hipotonik atau pendinginan cepat dalam fosfat buffer atau
salin fisiologis dapat menyebabkan refleks bagian tengah distal, yang dikenali dengan
pengamatan ekor yang terlipat tanpa bahan tetesan sitoplasma yang terperangkap di
tikungan. PH dan suhu sampel tidak dapat diuji dalam penelitian ini karena ukuran
ejakulasi yang kecil. PH pengencer yang digunakan dalam penelitian ini adalah 7,2-
7,4, kisaran fisiologis untuk semen sebagian besar vertebrata yang lebih tinggi.
Karena suhu ejakulasi diduga sama dengan suhu tubuh ular (suhu lingkungan) dan
karena pengencer disimpan pada suhu kamar, makan tidak mengharapkan fluktuasi
suhu ejakulasi yang besar terjadi dalam penelitian ini. Namun, karena penyebab
refleks bagian tengah distal in vivo yang diketahui pada sapi tidak mungkin
mempengaruhi ular dan karena tidak ada bahan tetesan sitoplasma yang diamati di
sebagian besar belokan ekor sperma ular, ekor yang terlipat kemungkinan besar
diinduksi secara iatrogenik. Tetesan proksimal dan kepala yang terlepas juga diamati
pada spermatozoa ular jagung. Pada sapi, tetesan proksimal adalah tanda
spermiogenesis abnormal dan umumnya terkait dengan berbagai cacat sperma
lainnya. Sejumlah besar kepala yang terlepas dikaitkan dengan hipoplasia testis pada
sapi jantan. Pada ular, kepala yang terlepas dapat menunjukkan bahwa ular donor
berada di bawah tekanan dan tetesan proksimal di sepanjang kepala dan ekor
merupakan indikator sel sperma yang belum matang. Kedua perubahan ini jarang
terjadi pada populasi ular ini
Motilitas sperma ular jagung menurun secara signifikan pada sampel yang
didinginkan selama lebih dari 48 jam. Namun, spermatozoa ular jagung
mempertahankan motilitas lebih besar dari 50% setelah penyimpanan dingin hingga
48 jam. Pada jam 72 dan 96, sampel yang disimpan di Equitainer I memiliki motilitas
yang jauh lebih rendah daripada yang disimpan di lemari es. Seperti yang dilaporkan
oleh pabrikan, transporter semen berpendingin Equitainer I dirancang untuk
mendinginkan dan mempertahankan semen hingga 70 jam. Pada 72 jam, Equitainer I
diperkirakan akan kehilangan kemampuannya untuk mendinginkan dan
mempertahankan motilitas sperma. Meskipun motilitas sperma yang didinginkan
secara signifikan lebih tinggi daripada yang ditemukan di Equitainer I, itu tidak
dianggap cukup untuk bantuan reproduksi. Pada mamalia domestik, motilitas 50%
umumnya tidak dianggap memuaskan untuk digunakan dalam teknik reproduksi
berbantuan, seperti inseminasi buatan. Namun pada ular garter kotak, pembuahan
dihasilkan dari inseminasi buatan 0,05 ml semen dengan motilitas 50%. Ini adalah
nilai minimum untuk volume dan motilitas yang dicatat untuk ular-ular ini dan, oleh
karena itu, mungkin bukan nilai minimum mutlak yang diperlukan untuk keberhasilan
pembuahan. Karena semen ular jagung lebih besar dari Motilitas 50% pada 48 jam
bila disimpan pada suhu 40C di lemari es dan Equitainer I, tampaknya layak untuk
menyimpan sampel pada suhu 40C hingga 48 jam untuk digunakan dalam inseminasi
buatan dan teknik bantuan reproduksi lainnya. Sampel semen yang didinginkan dapat
dikirim dalam wadah Equitainer I selama 48 jam ke lokasi manapun di mana
inseminasi buatan akan dilakukan. Sampel juga dapat disimpan secara lokal di lemari
es standar hingga 48 jam sampai sampel dapat digunakan untuk inseminasi buatan.
Untuk kasus di mana 48 jam tidak cukup, kriopreservasi semen dapat dicoba. Sebuah
laporan tunggal mengklaim beberapa keberhasilan dalam cryopreserving sperma ular.
Namun, tidak dapat mereproduksi hasil dengan semen ular jagung dengan metode
yang sama. Penelitian lebih lanjut harus dilakukan untuk menentukan kelayakan
kriopreservasi semen ular dalam jangka panjang. Informasi yang diperoleh dari
penelitian ini dapat digunakan untuk mengembangkan model pengumpulan,
penyimpanan berpendingin, dan program pengiriman semen dari ular penangkaran
dan ular liar yang terancam punah atau terancam punah.
DAFTAR PUSTAKA