UNIVERSIDAD DE CHILE

FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS

CICLO BASICO
BIOQUMICA





B
BBI
IIO
OOS
SS
N
NNT
TTE
EES
SSI
IIS
SS
D
DDE
EE L
LLA
AAS
SS
M
MMO
OOL
LLE
EEC
CCU
UUL
LLA
AAS
SS
D
DDE
EE L
LLA
AA V
VVI
IID
DDA
AA




ALEJANDRO RIQUELME






2001

2

SINTESIS O DUPLICACIN DEL ADN



Molcula de la vida.

El ADN es la molcula de la herencia en todos los organismos
vivos (procariontes y eucariontes). Sin embargo, en el caso de los
virus, el material gentico puede ser ADN o ARN.

Todos los ADN estn formados por dos muy largas cadenas
helicoidales de bases nitrogenadas, que son:

A : adenina
G : guanina
T : timina
C : citosina


Estas bases se encuentran enrolladas a lo largo de un eje comn.
Las dos hebras de la doble hlice estn dispuestas en direcciones
opuestas, es decir, mientras una tiene direccin 5 3 la otra
tiene direccin 3 5.

Ejemplo de una molcula de ADN: 5 ACTCGGAATGC 3
3 TGAGCCTTACG 5

Las dos cadenas permanecen juntas por enlaces de hidrgeno
entre los pares de bases:

- Adenina siempre se aparea con Timina (unidas por dos
enlaces de hidrgeno)
- Guanina est siempre apareada con Citosina (unidas por
tres enlaces de hidrgeno).

De esto se desprende que una de las hebras de la molcula de
ADN es la complementaria de la otra.

Toda la informacin gentica o de la herencia es codificada por
una secuencia precisa de bases a lo largo de la hebra de ADN.


Purinas
Pirimidinas
3

La mayora de las molculas de ADN tienen la caracterstica de ser
circulares.

Adems el eje de la doble hlice de un ADN circular puede girar en
s mismo, formndose una superhlice. Esta estructura recibe el
nombre de ADN sobreenrrollado, que es una forma ms compacta
que una molcula relajada (sin giro sobre su propio eje).








ADN relajado ADN sobrenrollado



Durante el proceso de duplicacin de la molcula de ADN, lo
primero que debe ocurrir es el desenrollamiento del ADN
sobrenrollado y luego las dos hebras del ADN son separadas para
que se pueda sintetizar una nueva molcula de ADN. Cada hebra
padre acta como patrn para la formacin de la nueva hebra
complementaria.



Experimento para probar que el ADN es el material gentico.

Meselson y Stahl, en 1958, comprobaron que la duplicacin del
ADN es semi-conservativa, esto quiere decir, que cada molcula
hija recibe una de las hebras del ADN padre.

Los investigadores crecieron bacterias en un medio que contena
N-15 (nitrgeno 15; un istopo de nitrgeno) y luego las bacterias
fueron transferidas a un medio con N-14 (nitrgeno 14; el istopo
normal de nitrgeno), despus ellos analizaron el ADN extrado en
cada generacin obtenida (es decir, extrajeron el ADN despus de
los ciclo reproductivo). Los resultados indicaron que el ADN de las
bacterias crecidas con N-15 estaban marcadas con N-15. En la
generacin siguiente, despus de ser transferidas al medio que
contena N-14, ellos obtuvieron un ADN hbrido, marcado tanto
4
con N-14 como con N-15. Y en la siguiente generacin
encontraron una mezcla de dos tipos de ADN; una molcula de
ADN marcada con N-14 y la otra molcula correspondi a un ADN
hbrido (mezcla de N-14 y N-15)




Si tenemos que N-15 = y N-14 =


Generaciones

0 1 2



+ + + +



doble hebra de ADN 2 ADN marcado con 2 ADN marcados con N-14 y N-15
marcada con N-15 N-14 y N-15 2 ADN con N-14


Figura 1. Esquema del experimento de Meselson y Stahl
demostrando que la duplicacin es semi-conservativa.



Requerimientos para la duplicacin del ADN.

En todos los organismos los requerimientos generales para la
sntesis de ADN son los mismos:

- una hebra de ADN como molde, en otras palabras una
seccin de ADN que ser copiado.

- la enzima encargada de copiar el ADN, llamada ADN
polimerasa.




5

El proceso de sntesis puede ser resumido como sigue:

Mg
+2
d (NMP)
n
+ d NTP d (NMP)
n+1
+ PPi

ADN polimerasa



donde d NTP es el deoxirribonuclesido trifosfato y d (NMP)n se
refiere a un polmero de n deoxirribonucleotidos. El pirofosfato (PPi)
generado por la reaccin anterior es hidrolizado a fosfato inorgnico
conduciendo la reaccin hacia la derecha ( PPi 2Pi) .


Enzimas que participan en la duplicacin.

En procariontes.-
La duplicacin es un proceso complejo en la que participan
muchas protenas. En bacterias, como E.coli, existen 3
polimerasas (Tabla I) y una ADN ligasa.


- ADN polimerasa I.

Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la sntesis
de ADN.
Posee una sola cadena polipetdica de 109 kDa.
Contiene un tomo de zinc como cofactor.
Esta enzima sintetiza en la direccin 5-->3 ( ver fig. 2).





Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa;
esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra
simple, removiendo deoxirribonucleotidos terminales desde el
extremo 3 (actividad exonucleasa 3 5) o desde el extremo 5
(actividad exonucleasa 5 3).


6

- ADN polimerasa II

Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I,
pero no tiene actividad exonucleasa 5 3.


-ADN polimerasa III

La enzima esta compuesta por lo menos por 10 subunidades.
Todas las subunidades son requeridas para que la enzima exprese
su actividad total. Esta enzima es la responsable de la sntesis de
ADN en E.coli.


Tabla I. ADN polimerasas de E. coli.


Polimerasa




Mr (kDa)




Molculas
por clula


Base
sintetizada
por
segundo


Direccin
a) polimer.
b) exonucl.


I

109




400

16-20

a) 5 3
b) 3 5
y 5 3

II

120



17-100

2-5

a) 5 3
b) 3 5

III

180




10

250-1000

a) 5 3
b) 3 5
y 5 3







7

Origen de duplicacin.

La sntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo
punto, llamado sitio ori C, una regin de 245 pares de bases.


oriC








Enzimas que participan en la sntesis de ADN en Eucariontes.

Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son
conocidas como alfa , beta , gamma , delta y psilon. Todos
ellas tienen mecanismos de accin similares a las enzimas en
procariontes (E.coli).
- Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de
la duplicacin del ADN cromosomal.
- La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena
polipeptdica es la responsable de la reparacin del ADN.
- La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias
y es responsable de la duplicacin del ADN mitocondrial.
- La ADN polimerasa psilon, enzima recientemente
descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.




Proceso General de Sntesis de ADN (Fig. 2).

Las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va
en direccin 3 5 es copiada directamente por la enzima ADN
polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5 3) es llamada
HEBRA PRINCIPAL o ADELANTADA.

La otra hebra del ADN padre que tiene la direccin opuesta, 5 3,
no puede ser copiada directamente, debido que no es sustrato para
la enzima y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte
8
del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama
HEBRA RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua.

Esta sntesis discontinua resulta de la formacin de cortas
secciones de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 nucletidos
que reciben el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas
secciones son unidas por la accin de la enzima ADN ligasa
produciendo una hebra de ADN continua, que algunas veces se
conoce como ADN
+
.






ADN girasa (reduce los giros)


Helicasas
(desdobla ADN)





Topoisomerasa
(relaja tensin)








Figura 2. Proceso de sntesis de ADN.



Previo a la sntesis.

Previo al proceso de sntesis del ADN propiamente tal, el ADN
padre de doble hebra debe desenrollarse, para lo cual se requiere
la accin de la protena REP o HELICASA que necesita energa
Primosoma (hace el primer)
Primer
Hebra
Adelantada
Holopolimerasa III
(agrega dNTPs)
Proteinas SSB (cubren ADN de
una hebra)
Hebra
Retrasada
Pol I
Ligasa
El primer es
removido y
llenado el
espacio
9
proveniente del ATP. Adems en este proceso de desenrollamiento
participa la enzima ADN girasa, que acta dando giros negativos
al ADN padre cuando este se encuentra sobre enrollado.


Etapa inicial de la sntesis.

Para comenzar la sntesis de ADN se requiere la presencia de
doble hebra como patrn-cebador. La segunda hebra
corresponde a una hebra de ARN, llamada PRIMER o
PARTIDOR y es sintetizada por una enzima llamada PRIMASA. La
forma activa de esta enzima requiere una serie de protenas. Entre
estas protenas se encuentra la PROTEINA N o dnaB, que
selecciona el sitio en que la primasa actuar. El complejo formado
entre la primasa y las protenas auxiliares recibe el nombre de
PRIMOSOMA.


Regla para la Sntesis.

La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que
cataliza la formacin de un enlace fosfodiester solamente si la base
entrante es complementaria al nucletido de la hebra padre. En
otras palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la
hebra patrn o padre.


Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III
poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad
de la duplicacin o replicacin del ADN, removiendo los nucletidos
que fueron puestos erradamente.



Proceso de Sntesis en procariontes

Una vez desenrollado la doble hebra de ADN, la enzima primasa
coloca el ARN partidor y de ah comienza la sntesis de la hebra
hija por la accin de la enzima ADN polimerasa III. Recordemos
que esta enzima es la responsable de la duplicacin, mientras que
la ADN polimerasa I acta como enzima auxiliar sacando la hebra
de ARN partidor y luego sintetizando el trozo faltante, adems ella
tambin participa en la reparacin del ADN.
10


Durante el proceso de duplicacin del ADN circular (E.coli) se
produce una estructura caracterstica, formada por dos horquillas (o
frentes) de duplicacin.




La velocidad de sntesis en E.coli , es de 800 bases por segundo.





Otras protenas del proceso de sntesis.

A continuacin describiremos otras protenas que participan en el
proceso de duplicacin del ADN:


- HELICASA: son enzimas requeridas para desdoblar y abrir
la molcula de ADN padre debido que esto no ocurre
espontneamente. Las helicasas requieren ATP como
cofactor.
Dos diferentes helicasas han sido descritas, una de ellas se
mueve en direccin 3 5 del ADN padre y recibe el
nombre de REP o HELICASA II o COPOL III ( subunidad
beta de la ADN polimerasa III) y las otras se mueve en
direccin 5 3, llamadas HELICASA I y III.



- PROTEINAS QUE SE UNEN A HEBRA SIMPLE (SSB):
Las hebras simples de ADN generadas por las helicasas
son mantenidas separadas por la unin de las protenas
SSB a la hebra de ADN. (ver figura 3 y Tabla II)



- ADN LIGASA es una enzima que cataliza la formacin de
enlaces fosfodiester entre polinucletidos preformados. La
ADN ligasa esta involucrada en la sntesis de ADN
Direccin de
la replicacin
11
discontinua, uniendo los fragmentos de OKASAKI una vez
que se ha reemplazado el partidor de RNA. Ellas tambin
estn involucradas en los mecanismos de reparacin del
ADN daado. Existe un solo tipo de ADN ligasa en
procariontes y dos en eucariontes; ambas funcionan en el
ncleo.








Tabla II. Principales protenas de la duplicacin de E.coli.

Protenas Funciones

Protena N o dnaB


Capacita a la primasa para comenzar la
duplicacin
Primasa

Sintetiza el ARN partidor.
Helicasas

Desdobla la doble hlice.
Protenas SSB

Estabiliza regiones de hebra simple.
ADN girasa

Introduce giros a la superhlice.
ADN polimerasa III

Sintetiza el ADN.
ADN polimerasa I

Saca la hebra partidora y completa los
espacios.
ADN topoisomerasa I

Corta una hebra de ADN.
ADN topoisomerasa II

Corta ambas hebras de ADN.
ADN ligasa Une los extremos de los polinucleotidos
preformados.





12

Duplicacin del ADN en Eucariontes.

El mecanismo de sntesis del ADN en eucariontes es
probablemente similar al proceso en procariontes.
La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor
que en procariontes. Para compensar esto, las clulas eucarioticas
contienen ms de 20.000 molculas de enzimas. Adems, las
clulas eucarioticas tienen un gran nmero de horquillas de
duplicacin y fragmentos de Okasaki mas pequeos de 40 - 300
bases. De esta forma la velocidad de duplicacin del ADN es
mayor en eucariontes.

La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra
principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El
ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la
duplicacin involucra dos pasos extras;
- Primero el ADN se debe disociar de las histonas para
comenzar la duplicacin.
- La sntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la
sntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo
ADN.



Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que
tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de
usar como hebra molde la molcula de ARN.
















13


5 3



3

3





3 5 3 5

Hebra Hebra
adelantada retrasada


Figura 3. Esquema que muestra el loop que se forma en la hebra
retrasada para que la ADN polimerasa III tenga la misma
posibilidad de actuar en ambas hebras.





















Procariontes
3'
Primasa
Helicasa
PCNA
Pol o
Pol o
5'
5'
14
Figura 4. Sntesis de ADN en eucariontes.


Mutaciones

Las mutaciones son causadas por cambios en la secuencia de
bases de ADN. Los principales tipos son sustitucin, supresin
e insercin. La sustitucin de un par de bases por otra es la ms
comn mutacin. Una transicin es el reemplazo de una purina
por otra purina ( lo mismo ocurre con las pirimidinas). Una
transversin es el reemplazo de una purina por una pirimidina o
viceversa.
Muchos potenciales cancergenos pueden ser detectados por su
accin mutagnica en bacteras.



Gen Salvaje 5'- CGACTGT-3'
3'- GCTGACA-5'


Transicin ( cambio del par A-T por G-C)

5'- CGGCTGT-3'
3'- GCCGACA-5'



Transversin (cambio del par A-T por T-A)

5'- CGTCTGT-3'
3'- GCAGACA-5'

Insercin (colocar un par extra ej: G-C)

5'- CGAGCTGT-3'
3'- GCTCGACA-5'

Supresin (suprimir el par A-T)

5'- CGCTGT-3'
3'- GCGACA-5'

15



TRANSCRIPCIN DE ADN SINTESIS DE ARN




El flujo de la informacin gentica en las clulas normalmente es:

ADN ARN Protena


La sntesis de ARN usando un ADN patrn es llamada
transcripcin, mientras que la sntesis de protena a partir de un
ARN patrn es llamado traduccin.


Clases de ARN.

Existen tres clases de ARN:

- ARN mensajero (mARN)
- ARN de transferencia (tARN)
- ARN ribosomal (rARN)

En general, todos estos ARN son de hebra simple, pero el ARN de
transferencia y ARN ribosomal contienen extensas regiones de
doble hlice (la cadena de nucletidos se dobla formando una
horquilla o loop).

Los ARN ms pequeos son los tARNs, que contienen alrededor de
75 nucletidos, mientras que el ms grande esta entre los mARN,
que pueden tener ms de 5.000 nucletidos.


Enzima de la sntesis

Todos los ARN celulares son sintetizados por la ARN polimerasa
de acuerdo a las instrucciones dadas por un ADN-patrn (o molde),
empleando ribonuclesido-5-trifosfatos como sustrato. La
direccin de la sntesis de ARN es 53, similar a la sntesis de
ADN.
16

La actividad de la ARN polimerasa es diferente a la actividad de la
ADN polimerasa porque no necesita una secuencia partidora o
primer y no posee una actividad nucleasa. Otra diferencia es que
el ADN patrn es totalmente conservado despus de la sntesis de
ARN.


La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es
llamado UNIDAD DE TRANSCRIPCIN y el producto de la
sntesis (ARN) es el TRANSCRIPTO PRIMARIO.



La ARN polimerasa de E. coli (procariontes) esta formada por sub-
unidades o
2
||o y un peso molecular cercano al medio milln de
dalton (450 kDa).

El corazn de la enzima consiste de o
2
|| (enzima ncleo).
La sub-unidad sigma ( o ) aumenta la velocidad y especificidad de
la transcripcin, debido que ayuda a la ARN polimerasa a
reconocer la seal de inicio en el ADN-patrn. La sub-unidad
sigma estara reconociendo una regin particular del ADN, que se
encuentra a 35 bases antes del sitio de inicio de la transcripcin.
Esta regin del ADN recibe el nombre de regin PROMOTORA y
adems de esta regin, en E. coli existe otra regin promotora a 10
bases antes del inicio de la transcripcin y est regin del ADN
esta relacionada con el lugar donde se une la enzima ncleo.



Regin Promotora (E.coli)

-35 -10 +1
(ADN) ------- TTGACA ------- TATAAT ----------------------------
Inicio de la
transcripcin




El signo negativo indica que las bases se encuentran antes
del sitio de inicio de la transcripcin
17



Proceso de sntesis

La unin de la ARN polimerasa a estas regiones promotoras
permiten un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la
molcula de ADN - patrn (llamada burbuja de transcripcin). La
sntesis de ARN siempre comienzan con GTP ATP, es decir, con
una base purina. La sub-unidad sigma se disocia desde la
holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una
vez suelta puede unirse a otra enzima ncleo, permitiendo el inicio
de una nueva sntesis.





ARN polimerasa

+ 1 punto de inicio

-35 -10
3 5
ADN
5 3



Enzima ncleo
Subunidad
(a) Sigma













(b)

-35
+1 punto de inicio
-10
ppp
5'
3'
18






















(c)



Figura 5. Inicio y elongacin de la cadena de ARN (transcripcin).
(a) Unin de la holoenzima a la regin promotora (complejo
cerrado)
(b) Separacin de la doble hebra (complejo abierto)
(c) Elongacin en direccin 5' 3' , a los 12 nucletidos transcritos
la subunidad sigma se disocia.



Las regiones promotoras afectan la frecuencia de inicio de la
transcripcin. Lo anterior es reflejado en los siguientes ejemplos:
en cada clula de E. coli contiene solamente 12 molculas de
represor lac y su gen es transcrito una vez cada 30 minutos.
Por otro lado, el gen de ARN ribosomal es transcrito una vez por
segundo aproximadamente.



5'
p
p
p
ppp NTP
-35 -10
ARN en
crecimiento
Subunidad sigma
disociada
19




Terminacin de la Transcripcin.

La terminacin de la transcripcin es tan controlado como su
iniciacin. El ADN-patrn contiene seales de detencin para la
transcripcin. Existen dos mecanismos de terminacin en E. coli:
uno es dependiente de una protena auxiliar llamada factor rho y
otro independiente de este factor.

Terminacin independiente del factor rho. Esto es distinguido
por la presencia de una secuencia rica GC en el ADN seguido por
cinco o seis adeninas. EL ARN transcriptos lgicamente tambin
posee esta regin rica en GC, regin que es capaz de formar un
loop o estructura de horquilla como resultado de interaccin entre
bases complementarias. Adems seguido de esta regin rica en
GC, en el extremo 3 del ARN aparece una secuencia rica en
uracilo. Se ha observado que la unin Uracilo con Adenina de la
hebra de ADN molde es menos estable y as el ARN es capaz de
disociarse ( ver fig. 6 ). Por consiguiente el duplex ADN-ARN se
suelta y se libera el ARN sintetizado.
C
U C

U C
G -- C
A -- U
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
G --- C
3'
5' U - A - A - U - C - C - C - A - C - A - G A - U - U - U - U -
OH


Figura 6. Estructura secundaria del ARN sintetizado (seal de
termino).

20

Terminacin dependiente del factor rho. Tambin requiere la
presencia de la estructura de horquilla (regin rica en GC). Sin
embargo, la secuencia rica en U est ausente. El factor rho, es una
protena compuesta por seis sub-unidades idnticas de 46 KDa y
tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al
ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energa liberada es capaz de
mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se
esta sintetizando en direccin de la burbuja de transcripcin.
Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el hbrido ADN-
ARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al
citoplasma (ver fig. 7).


ARN polimerasa








ADP + Pi
5' ATP + H
2
O


Figura 7. Terminacin dependiente de rho








La transcripcin puede ser bloqueada por inhibidores especficos,
llamados comnmente antibiticos. Por ejemplo, el antibitico
rifampicina inhibe la iniciacin de la sntesis de ARN, mientras
que la actinomicina D bloquea la elongacin del ARN.







Factor rho
21


Transcripcin en eucariotes

La maquinaria transcripcional de eucariontes es lejos ms complejo
que en procariontes. Una importante consideracin es que en
eucariontes superiores solamente una pequea proporcin del
genoma es expresada a ARN (cerca de 10% como mximo). Una
considerable proporcin del genoma de eucariontes existe
permanentemente como cromatina (ADN cromosomal) altamente
condensada y es transcripcionalmente inerte. Adicionalmente,
hay protenas accesorias especficas llamadas FACTORES DE
TRANSCRIPCIN y son requeridos para una transcripcin
eficiente de todos los genes de eucariontes.


Diferente al factor bacterial sigma (o), los factores de transcripcin
no se unen a la polimerasa directamente. Ellos forman complejos
con la cromatina (ADN cromosomal) antes del inicio de la
transcripcin y acta como un regulador positivo de la transcripcin.


Enzimas de la trancripcin en eucariontes.

El ncleo de eucariontes contiene tres tipos de ARN polimerasas:

- ARN polimerasa I (localizada en el nuclolo) transcribe los genes
de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a
un pre-rARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para
transformarse en una rARN maduro.

-ARN polimerasa II (se encuentra en el nucleoplasma) transcribe
los genes que codifican para protena y el transcrito primario
corresponde a un ARN nuclear heterogneo (hnARN), que son los
precursores del ARN mensajeros citoplasmtico.

-ARN polimerasa III (nucleoplasmtica) transcribe el rARN 5S
(ARN ribosomico) y los tARNs (ARN de transferencia).



22
La reaccin catalizada por todas las polimerasas en eucariontes es
bioqumicamente la misma que la reaccin de las enzimas de E.
coli (procariontes).


Todas las polimerasas eucarionticas son grandes molculas con
masas que exceden los 500 kDa. Ellas contienen dos sub-
unidades con masas superiores a 100 kDa, cada una de las
cuales es una polimerasa especfica y adems poseen 12 sub-
unidades menores, algunas de las cuales son comunes a los tres
tipos de polimerasas. La precisa funcin de cada sub-unidad es
an desconocida.


Regin promotora para la actividad de ARN polimerasa I

Para el caso particular de la ARN polimerasa I que sintetiza el ARN
ribosomal. En el gen (ADN) para el rARN presenta una regin
promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posicin -142 y
+6.
Sin embargo, existen copias imperfectas del largo total del
promotor en posiciones -1200 y -2300 pares desde el sitio de inicio
de la transcripcin y entre estas regiones hay mltiples copias de
60 81 pares de bases de la regin promotora ( ver Fig. 8).

Las copias 60/81 estimulan la transcripcin del verdadero promotor
y puede estar involucrado en la unin de un factor presente en
cantidades limitadas. Las copias totales de los promotores pero
imperfectos son capaces de iniciar la sntesis de ARN, pero este
efecto termina antes de alcanzar la verdadera regin promotora.



Punto de inicio


repeticiones Promotor
gen Promotor de 60/81 bp del gen Gen
28S rARN espaciador 18S rARN




-4000 -2000 +1


23
Figura 8. Regin promotora del gen de rARN, con una regin
promotora verdadera ( ) y con copias imperfectas de ella ( . ).



Regin promotora para la ARN polimerasa II.

Los genes transcritos por la polimarasa II producen los ARN
mensajeros. Estos incluyen los genes que codifican a las
protenas que son expresadas constitutivamente (que siempre
son expresadas) en todos los tejidos y aquellos genes que
solamente son expresados en un tejido particular de un organismo
multicelular o que esta regulado por la presencia o ausencia de un
sustrato particular, hormona o estmulo ambiental.

Los promotores para la ARN polimerasa II estn localizados en el
lado 5 del sitio de inicio de la transcripcin.



-80 -25
inicio
--CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA--------



Estas secuencias tienen la funcin de unir los factores de
transcripcin especficos en vez de dirigir los puntos de contacto
con la ARN polimerasa II, como ocurre en procariontes. Varios
promotores que estn relativamente cercanos al punto de inicio de
la transcripcin, son necesarios pero normalmente insuficientes
para que se realice una eficiente expresin de los genes por la
enzima ARN polimerasa II.





Adems existen otros tipos de secuencias en el ADN molde
llamadas ENHANCER que no tienen actividad promotora por si
mismas, pero que pueden estimular la transcripcin y pueden
actuar sobre considerables distancias de varios kilobases del sitio
de inicio de la transcripcin. Una caracterstica de los enhancer es
24
que realizan su accin independiente de la orientacin que ellos
tengan (Fig. 9)






-8,000 +1

Enhancer Promotor
Sitio de inicio

Figura 9. Esquema de la posicin del Enhancer con respecto al
promotor.



El transcrito primario de la ARN polimerasa II, son conocidas
colectivamente como ARNs nucleares heterogneos. Ellas pueden
llegar a ser grandes molculas (sobre 10 kilobases) debido que
contiene an los intrones (secuencia que no son traducidas a
protena) en la secuencia de ARN, pero ellas no estarn presente
en el ARN maduro.




SINTESIS DE ARN MENSAJEROS

La sntesis de un mARN en eucariontes (ver fig. 10):
- (1) Comienza la transcripcin de un ADN cuando una ARN
polimerasa se encuentra a 20 o 30 nucletidos despus de la
secuencia TATA.
- (2) Cuando el transcrito ( ARN) ha alcanzado 30 nucletidos de
largo, en su extremo 5 es colocado una guanosina unido a un
grupo trifosfato que adems es metilado.
- (3) La ARN polimerasa se nueve a lo largo del ADN
transcribiendo tanto exones como intrones. Hasta que se
transcribe la secuencia AAUAAA, despus de cerca de 20
nuclotidos de esta secuencia, el transcrito es cortado; la
reaccin probablemente involucra una pequea
ribonucleoprotena nuclear (snRNP) que contiene una
molcula de ARN ( U1 ARN) rico en uracilo.
25
- (4) Una enzima adiciona una secuencia de 150 a 200 adeninas
en el extremo 3 de la hebra de ARN naciente.
- (5) El transcrito es procesado y son cortados los intrones,
probablemente con la ayuda de otras snRNPs; y nuevamente
U1 ARN se une a una secuencia complementaria (que incluye
GU) en el comienzo del intron, tambin en este proceso
participan otras 6 molculas de ARN (denominadas U2,U3,...U7)
- (6) Los intrones son doblados y cortados
- (7) Los exones son unidos para formar finalmente el ARN
mensajero maduro


La mayora de los genes en eucariontes superiores son
discontnuos. Las secuencias que se codificaran en estos genes
(exones) son separadas por secuencias que no son traducidas
(intrones), que son removidos en la conversin del transcripto
primario a mARN maduro.





(1)










(2)





Transcrito primario

Enzima


TATA
ARN Polimerasa II
ADN
TATA
G -P-P-P
+CH
3

26





(3)













(4)







CH
3

! AAUAAA
G - P-P-P AAAA...



(5)





CH
3

!
G - P-P-P AAAA...


AAUAA
A
A
G -P-P-P
CH
3

snRNP
U1 ARN
Enzima Poli (A)
GU GU
snRNP
U1 ARN
27








(6)


CH
3

!
G - P-P-P AAAA...





(7)

CH
3

!
G - P-P-P AAAA...



Figura 10. Transcripcin de un mARN en Eucariontes (las
explicaciones se encuentran en el texto).




ARN Polimerasa III

Los genes transcritos por la ARN polimerasa III ( rARN 5S, tARN
y varios ARNs nucleares y citoplasmticos pequeos) usualmente
contiene menos de 300 nuclotidos. Genes de rARN 5S no
contienen intrones mientras que muchos genes de tARN poseen
pequeos intrones.


Regin Promotora para la accin ARN polimerasa III.

G
U

G
U

G
U

G
U

28
El control de transcripcin mejor estudiada es del gen rARN 5S,
que inesperadamente tiene una secuencia promotora dentro de su
secuencia transcrita. Se ha determinado que la regin interna
promotora esta entre las posiciones + 50 y + 84, que mostr ser
esencial para la transcripcin de los genes rARN 5S (fig. 11). En
la regulacin de las sntesis de rARN 5S existen factores llamados :
TFIIIA, TFIIIC, que son requeridos para una transcripcin eficiente.



Gen 5S rARN
Regin
Promotora



5' 3'

5S rARN


-80 -40 0 +40 +80 +100

Figura 11. Localizacin de la regin promotora del gen 5S rARN de
X. laevis.



Modificaciones Post Transcripcionales

Muchos ARNs son modificados qumicamente (Ej. metilados) y
escindidos o cortados despus de la transcripcin. Los mARNs son
modificados por acoplamiento de una larga cadena de poli-A a su
extremo 3. Los rARNs se generan a partir de una larga cadena
precursora que finalmente es escindida para rendir los ARNs
maduros.









29






CDIGO GENTICO


La secuencia de bases de un gen es colineal con la secuencia
aminoacdica de su producto polipeptdico. El cdigo gentico es
la relacin entre la secuencia de bases en el ADN (o su ARN
transcrito) y la secuencia de aminocidos en una protena.

Los aminocidos son codificados por un grupo de tres bases
(llamadas codones) comenzando de un punto determinado (ver
fig. 12).


Se pueden definir cuatro caractersticas generales del cdigo
gentico:

1) El cdigo no requiere de puntuacin ni seal alguna para indicar
el final de un triplete y el comienzo del siguiente, es decir el
cdigo gentico no tiene comas. nicamente requiere de una
molcula de mARN que este ubicada correctamente para su
lectura (53) adems de contar con el codn de inicio, AUG
(en procariontes codifica la incorporacin de N-formilmetionina y
en eucariontes metionina).

2) 61 de 64 codones especifican algn aminocido en particular.
De esta forma, para la mayora de los aminocidos hay ms de
un triplete (o codn). En otras palabras, el cdigo es
DEGENERADO. Codones que especifican el mismo aminocido
son llamados sinnimos. La mayora de los sinnimos difieren
solamente en la ltima base del triplete. Esto presenta una
ventaja, debido a que la mayora de las mutaciones conducen a
la formacin de tripletes sinnimos no provocando un cambio en
la secuencia peptdica.

3) La tercera base de los tripletes es menos especifica que las dos
primeras. La degeneracin implica solamente la tercera base en
30
la mayora de los casos (excepto para Arginina, Leucina y
Serina).

4) 3 de los 64 tripletes no codifican para aminocido alguno y estos
son UAG, UAA y UGA llamados originalmente codones sin
sentido que constituyen las seales de termino de la sntesis de
la cadena polipeptdica.


SEGUNDA LETRA


U


C

A

G


U
UUU Phe
UUC Phe

UUA Leu
UUG Leu
UCU Ser
UCC Ser

UCA Ser
UCG Ser
UAU Tyr
UAC Tyr

UAA Stop
UAG Stop
UGU Cys
UGC Cys

UGA Stop
UGG Trp


C
CUU Leu
CUC Leu

CUA Leu
CUG Leu
CCU Pro
CCC Pro

CCA Pro
CCG Pro
CAU His
CAC His

CAA Gln
CAG Gln
CGU Arg
CGC Arg

CGA Arg
CGG Arg


A
AUU Ile
AUC Ile

AUA Ile
AUG Met
ACU Thr
ACC Thr

ACA Thr
ACG Thr
AAU Asn
AAC Asn

AAA Lys
AAG Lys
AGU Ser
AGC Ser

AGA Arg
AGG Arg


G
GUU Val
GUC Val

GUA Val
GUG Val
GCU Ala
GCC Ala

GCA Ala
GCG Ala
GAU Asp
GAC Asp

GAA Glu
GAG Glu
GGU Gly
GGC Gly

GGA Gly
GGG Gly



Figura 12. Cdigo gentico.





P
R
I
M
E
R
A


L
E
T
R
A

31






SNTESIS DE PROTENAS



La sntesis de protenas tienen lugar en la superficie de los
ribosomas. Dicha sntesis requiere que los aminocidos sean
activados en el citoplasma por la accin de aminoacil- tARN-
sintetasas, que catalizan la formacin de steres de aminocidos
de tARN homlogos (unin de un aminocido con su tRNA
respectivo) y en forma conjunta en el proceso de activacin se
hidroliza ATP produciendo AMP y pirofosfato. Las aminoacil-
tARN-sintetasas son altamente especficas tanto para el
aminocido como para su correspondiente tARN.




Aminoacido + ATP aminoacil AMP + PPi
Aminoacil- AMP + tARN aminoacil-tARN + AMP


Aminoacido + ATP + tARN aminoacil tARN + AMP + PPi





El aminocido se une al extremo 3 del tARN que posee la
secuencia CCA, mientras que el anticodn esta a 80 de
distancia en el otro extremo (ver fig. 13).







32









3
A
C
5 C



Loop DHU Loop T+C






anticodn

Figura 13. Estructura de hoja de trbol caracterstica de un tARN


El ARN mensajero reconoce el anticodn de un tARN en vez de
reconocer el aminocido. Un codn en mARN se aparea con el
anticodn en el tARN. Algunos tARNs reconocen ms de un codn
porque la tercera base que se aparea de un codn es menos
especifica que las otras dos ( ver cdigo gentico).


Los Ribosomas.

La sntesis de protena tiene lugar en los ribosomas, que estn
formados por una subunidad mayor y una menor, cada una de las
cuales estn compuestas de dos tercios de ARNs y un tercio de
protenas. En E. coli, por ejemplo, el ribosoma 70 S ( 2.500
kdal) est formado por una sub-unidad de 30 S y una de 50 S. En
Sitio de unin
al aminocido
33
cambio en eucariontes el ribosoma es de 80 S, formado por uno de
40 S y uno de 60 S.






Hay tres fases en la sntesis de protena: inicio, elongacin y
termino.







5'
3'

INICIO
ELONGACION
TERMINO









Figura 14. Ciclo de la sntesis de protena.




Inicio.

En procariontes el ARN mensajero, la formilmetionina- tARN y la
sub-unidad ribosomal 30 S, forman el complejo iniciacin de la
sntesis (en cambio para eucariontes este complejo est formado
por mARN, metionina-tARN y la sub-unidad 40 S, ver fig. 14).
40 S
60 S
40 S 60 S
40 S
CADENA NASCIENTE
I
N
I
C
I
O

S
T
O
P

- El coeficiente de sedimentacin de macromolculas biolgicas
son expresadas en unidades Svedberg (abreviada como S).
1 S = 10
-13
seg.
60S
34
La seal de inicio en el mARN es AUG y esta precedida por una
secuencia rica en purina que puede aparearse con el rARN 16 S
de la sub-unidad 30 S del ribosoma. La subunidad mayor ribosomal
de 50 S se une a este complejo para formar un complejo de
iniciacin de 70 S, (ver fig. 15) que esta listo para la siguiente
fase (elongacin). En el proceso de iniciacin estn participando
una serie de factores protecos que son descritos en la Tabla IV.



mARN




fMet.tARN
Met

30S
IF-1 IF-3 IF-1 IF-3
IF-2 GTP


IF-2GTPfMet-tARN
Met
GDP +Pi

IF1
IF2



50 S




30 S


Complejo de inicio 70 S


Figura 15. Fase de inicio de la sntesis de protena en baterias
(procariontes). 30S y 50 S son la subunidad menor y mayor del
ribosoma respectivamente. IF, son factores proteicos de inicio.


35

Elongacin.

El ciclo de elongacin consiste en (ver fig. 16) :
1) La unin de aminoacil-tARN (reconocimiento del codn).
2) Formacin del enlace peptdico.
3) Transposicin.
Tambin durante la elongacin se requiere la presencia de factores
proteicos que son descritos en la Tabla V.


La direccin de lectura del mARN es de 5 3y el crecimiento de
la cadena polipeptidica es hecho desde el extremo amino al
extremo carboxilo.













AUG- CGA- GCU------------3 ----------------AUG.CGA
-















Sitio A
f- Met
Sitio E
Sitio P
f-Met Arg
f- Met
|
Arg
|
f- Met
|
Arg
|
Translocacin
GDP GTP
+
Pi
Sitio A
vaci
Formacin del
enlace peptdico
catalizado por la
peptidil transferasa
Ingreso del
aminoacil-
tARN al sitio A
GTP GDP
+
Pi

Inicio de un
nuevo ciclo
36

-AUG-CGA-GCU------ ----------------- AUG-CGA-
GCU




Figura 16. Fase de elongacin de la cadena peptdica: unin del
aminoacil-tARN, formacin del enlace peptdico y translocacin.




Termino.

La sntesis de protena es terminada por factores de liberacin,
que reconocen los codones de terminacin UAA, UGA y UAG
provocando la hidrlisis entre el polipeptido y el tARN (Tabla VI).


La energa requerida tanto en la formacin del complejo de
iniciacin son 70 S como en la unin del aminoacil- tARN al
ribosoma, y en la transposicin son obtenidos de la hidrlisis del
GTP ( ver Tabla VII ).



Varios pasos en la sntesis de protena son especficamente
inhibida por toxinas y antibiticos. Por ejemplo, puromicina inhibe
la sntesis de la cadena peptdica por su interaccin con el peptidil
- tARN en la ribosoma, formando peptidil- puromicina que libera el
complejo ribosomal ( ver Tabla VIII).

Por otro lado, los polirribosomas, tambin denominados
polisomas, consisten en molculas de mARN a las que estn
adheridos muchos ribosomas, cada uno de los cuales, leen el
mARN independientemente y construyen una cadena polipeptdica.
En las clulas eucariticas, la sntesis proteca puede tener lugares
en ribosomas libres, o bin, en los ribosomas unidos al retculo
endoplasmtico.


37
Tambin existe sntesis proteca en las mitocondrias y en los
cloroplastos, los cuales poseen mARNs, tARNs especficos,
aminoacil- tARN-sintetasas y ribosomas.














Anexo 1.



TABLA IV. FACTORES DE INICIACIN DE PROCARIONTES Y
EUCARIONTES


FACTOR FACTOR FUNCIN
BACTERIAL EUCARIONTES


IF- 1 elF - 1 Los roles no estn claros
IF- 2 elF - 2 Une Met- tARN (o fMet - tARN ) a los
ribosomas en el complejo con GTP.

IF- 3 elF -3 Impide la reasociacin de las sub-unidades
ribosomales.

elF -4A Un grupo de factores liberados respon-
elF -4B sables de la unin al extremo bloqueado
elF -4E del mARN y desdoblar alguna estructura
elF -4F secundaria para capacitar a los ribosomas
en el reconocimiento del codn de inicio.

elF -5 Libera elF-2 y elF-3 del ribosoma y
permite la unin de la sub-unidad 60 S

elF -6 Involucrada en la disociacin del ribosoma
en sus sub-unidades.

GEF (Factor de intercambio de la guanina:
recicla elF-2 mediado por intercambio de
GDP por ATP en un proceso anlogo que
para reciclar EF.Ts)





38















TABLA V. FACTORES DE ELONGACIN


FACTOR FACTOR FUNCIN
BACTERIAL EUCARIOTICO


ED-Tu EF - 1o Unir aminoacil- tARN al sitio A del
(43 kDa) (53 kDa ) ribosoma como por ejemplo, complejo
(EF-1 GTP, aminoacil-tARN).




EF - Ts EF - 1| Reciclar EF -Tu o EF - 1o respectivamente
( 30 kDa) (50/38 kDa)

EF - G EF -2 Involucrado en los pasos de translocacin
de los ciclos de elongacin.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------




TABLA VI. FACTORES DE TERMINACIN (O LIBERACIN)


BACTERIA ( E. coli ) EUCARIOTES


RF -1 ( Para UAA o UAG) eRF ( con los tres
codones de termino)

RF-2 ( Para UAA o UGA )

RF-3 (estimula RF-1 y RF-2)



39














TABLA VII. REQUERIMIENTOS ENERGETICOS PARA LA TRADUCCION:
LA ORGANIZACION REQUIERE EL INGRESO DE ENERGIA LIBRE DESDE
LA HIDROLISIS DEL ATP O GTP



PROCARIONTES EUCARIONTES


Aminoacilacin ATP AMP + PPi ATP AMP + PPi
del tARN (e.i. 2 enlaces de alta energa por aminocido)


Iniciacin GTP GDO + Pi, GTP GDP + Pi,
asociado con IF-2 asociado con elF-2

ATP ADP + Pi,
asociado con el extremo
de guanina y el
desdoblamiento del
mARN. (no esta claro
cuantos ATPs son
usados)


Elongacin GTP GDP + Pi, GTP GDP + Pi,
asociado con EF-Tu asociado con EF-1

GTP GDP + Pi, GTP GDP + Pi
asociado con EF-G asociado con EF-2


Terminacin Probablemente no GTP GDP + Pi
requiere energa


40
















TABLA VIII. INHIBIDORES DE TRADUCCIN


INHIBIDOR SELECTIVIDAD ACCIN
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
Cloramfenicol Procariontes Elongacin: inhile peptidil
transferasa.

Cicloheximida Eucariontes Elongacin: mecanismo
incierto.

Eritromicina Procariontes Elongacin: inhibe
transpeptidacin

cido Fusidico Ambos Elongacin: bloquea la
liberacin del complejo
EF-G o EF-2 GDP.

Kanamicina Ambos Elongacin:causa error en la
lectura.

Neomicina Ambos Iniciacin y elongacin:
causa error de lectura del
mARN.

Puromicina Ambos Elongacin: causa
prematura
terminacin.

Sparsamicina Ambos Elongacin: inhibe peptidil-
transferasa.

Spectinomicina Procariontes Elongacin: inhibe transpep-
tidacin.


Treptomicina Procariontes Elongacin: se une a la sub-
unidad 30 S e interfiere con
41
la interaccin codn-antico-
dn causando error de lectu-
del mARN.

Tetramicina Procariontes Elongacin: bloquea la unin
de aa- tARN al sitio A.









Anexo 2.
EJERCICIOS


1.- Escribir la secuencia complementaria en direccin 5 3

a) 5- GATCAA- 3
b) 3- ACTGGCCTAA -5
c) 5- ACCTAGGGTA -5
d) 3- CCTGGATTAAG -5

2.- Compare la ADN polimerasa I y la ARN polimerasa de E.coli
en cuanto a:

a) estructura de subunidades.
b) precursores activados
c) direccin de elongacin de la cadena
d) actividad exonucleasae) conservacin del
ADN molde
f) necesidad de una hebra particular.
d) energtica de la reaccin de elongacin

3.- Escribir las secuencias de los mARN sintetizados de los
siguientes ADNs

a) 3- ATTGCCATGCTA-5
b) 5- AGCTACTTAACG-3
c) 3-GGACCTACGTT.5

Adems indique cuales son los codones sin sentido presentes.

42
4.- Cuantos aminocidos pueden ser codificados de las siguiente
secuencia de mARN.

a) Asumiendo que comienza la lectura en el extremo 5
inmediatamente.
b) Comenzando en forma normal establecida por el cdigo
gentico.

4. 1- 5- UUGCCUAUGGAUUGGAUG-3
4. 2- 3-AUGUAGGUAAAGGUAGGCC-5
4. 3- 3- AGCGCCAGUGACCAUGUA-5




5.- Que secuencia es formado por la adicin de un poli (UUAC) a
un sistema de sntesis de protenas.

6.- El ARN transcrito de una regin del ADN del fago G4
conteniendo la siguiente secuencia ( este tipo de ADN tiene una
traduccin superpuesta)

5 - TCCTCATTT - 3

Esta regin codifica para diferentes protenas. cuales son sus
secuencias.