MAKALAH ANALISIS INSTRUMEN

”HPLC (HIGH-PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY)”

OLEH :

KELOMPOK 5

Bertha Karunia Okthafiani Duppa (F1F113048)

Sri Ayu Ulandari (F1F113050)

Wais Al-Qurni (F1F113056)

Hasniar (D1B121375)

Nurul Afifi Hakman (D1B121352)

JURUSAN FARMASI

FAKULTAS FARMASI

UNIVERSITAS MEGAREZKY MAKASSAR

2022
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kami panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan

rahmat serta karunia-Nya kepada kami sehingga penyusun berhasil menyelesaikan

Makalah ini yang berjudul HPLC (High Performance Liquid Chromatography).

Makalah ini berisikan tentang informasi mengenai apa dan bagaimana HPLC

khususnya dalam bidang farmasi.

Penyususun menyadari bahwa makalah ini masih jauh dari sempurna, oleh

karena itu kritik dan saran dari semua pihak yang bersifat membangun selalu kami

harapkan demi kesempurnaan makalah ini.

Akhir kata, penyusun sampaikan terima kasih kepada semua pihak yang telah

berperan serta dalam penyusunan makalah ini dari awal sampai akhir.Semoga Allah

SWT senantiasa meridhai segala usaha kita. Aamiin.

Penyusun

Kelompok 5
 BAB I

PENDAHULUAN

A. Latar Belakang

Kromatografi adalah suatu teknik pemisahan campuran berdasarkan

perbedaan kecepatan perambatan komponen dalam medium tertentu.Pada

kromatografi, komponen – komponennya akan dipisahkan antara dua buah fase

yaitu fase diam dan fase gerak. Fase diam akan menahan komponen campuran

sedangkan fase gerak aka nmelarutkan zat komponen campuran. Komponen yang

mudah tertahan pada fase diam akan tertinggal. Sedangkan komponen yang mudah

larut dalam fase gerak akan bergerak lebih cepat.

Sekarang ini, kromatografi sangat diperlukan dalam memisahkan suatu

campuran senyawa.  HPLC didefinisikan sebagai kromatografi cair yang dilakukan

dengan memakai fase diam yang terikat secara kimia pada penyangga halus yang

distribusi ukuranya sempit( kolom ) dan fasegerak yang dipaksa mengalir dengan
 laju alir yang terkendali dengan memakai tekanan tinggi sehingga menghasilkan

pemisahan dengan resolusi tinggi dan waktu yang relative singkat.

HPLC atau KCKT merupakan teknik pemisahan yang diterima secara luas

untuk analisis dan pemurnian senyawa tertentu dalam suatu sampel pada sejumlah

bidang, antara lain:farmasi; lingkungan; bioteknologi; polimer; dan industri-

industry imakanan.

B. Rumusan Masalah

1. Apa definisi dari HPLC?

2. Bagaimana Prinsip kerja dari HPLC?

3. Bagaimana Gambar dari HPLC?

4. Apa saja bagian-bagian dari HPLC?

5. Apa kelebihan dan kekurangan dari HPLC?

6. Apa sampel yang cocok untuk instrumen HPLC?

C. Tujuan

1. Mengetahui definisi dari HPLC

2. Mengetahui prinsip kerja HPLC

3. Mengetahui gambar HPLC

4. Mengetahui bagian-bagian dari HPLC

5. Mengetahui kelebihan dan kekurangan HPLC

6. Mengetahui sampel yang cocok untuk instrumen HPLC

 BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

A. Definisi HPLC

Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak

destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif. KCKT

paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa tertentu seperti

asam-asam amino, asam-asam nukleat, dan protein-protein dalam cairan fisiologis;

menetukan kadar senyawa-senyawa aktif obat, produk hasil samping proses

sintesis, atau produk-produk degradasi dalam sediaan farmasi.Pada HPLC terdapat

kolom terbuka yaitu : Low pressure (tekananrendah), dan High pressure (tekanan

tinggi 76 bar biasanya memakaisatuan kpa/kilo paskal). Pada HPLC terdapat oven

untuk pemanas karena pada partikel kecil, cairan ditekan terjadi gesekan maka

digunakan pendingin dan tekanan tinggi (cairan ditekan menggunakan pompa

kemudian didorong, jika ditarik cairan masuk). Tekanan harus 76 bar,antara fase
 diam dan fase gerak terjadi gesekan sehingga temperatur meningkat maka harus

diturunkan (dengan pendingin liebig/ ion exchange)karena ikatannya bisa lepas dan

bisa juga terjadi bleeding. Temperatur pada HPLC digunakan untuk menjaga

temperatur dalam kolom konstan sehingga KD tetap.

Umumnya metode kromatografi seperti adsorpsi, partisi, dan penukar ion

adalah contoh-contoh dari kromatografi kolom. Pada metode kromatografi cair ini

digunakan kolom tabung gelas dengan bermacam diameter. Partikel dengan

dimensi yang bervariasi digunakan sebagai penunjang stasioner. Banyaknya cairan

pada kolom jumlahnya sedemikian rupa sehingga hanya cukup menghasilkan

sedikit tekanan untuk memelihara aliran fase bergerak yang seragam.

B. Prinsip Kerja HPLC

Dengan bantuan pompa fasa gerak air dialirkan melalui kolom ke detektor.

Cuplikan dimasukkan kedalam aliran fasa gerak dengan cara penyuntikan. Di dalam

kolom terjadi pemisahan komponen-komponen campuran. Karena perbedaan

kekuatan interaksi antara solut-solut terhadap fasa diam. Solut-solut yang kurang

kuat interaksinya dengan fasa diam akan keluar dari kolom lebih dulu. Sebaliknya,

solut-solut yang kuat berinteraksi dengan fasa diam maka solut-solut tersebut akan

keluar dari kolom lebih lama. Setiap komponen campuran yang keluar kolom

dideteksi oleh detektor kemudian direkam dalam bentuk kromatogram.

C. Gambar HPLC
 Gambar : Diagram Blok KCKT

D. Bagian-Bagian HPLC

1. Pompa (Pump)
Fase gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui

kolom. Ada dua tipe pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant

pressure) dan pemindahan konstan (constant displacement). Pemindahan

konstan dapat dibagi menjadi dua, yaitu: pompa reciprocating dan pompa

syringe. Pompa reciprocating menghasilkan suatu aliran yang berdenyut teratur

(pulsating),oleh karena itu membutuhkan peredam pulsa atau peredam

elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base line) detektor yang stabil, bila

detektor sensitif terhadapan aliran. Keuntungan utamanya ialah ukuran

reservoir tidak terbatas. Pompa syringe memberikan aliran yang tidak

berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.

2. Injektor (injector)

Sampel yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan

disturbansi yang minimum dari material kolom. Ada tiga tipe dasar injektor

yang dapat digunakan :

1) Stop-Flow yaitu aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir,

sistem tertutup, dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan

karena difusi di dalam cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi

2) Septum, septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang

digunakan pada Kromtografi Gas. Injektor ini dapat digunakan pada

kinerja sampai 60 - 70 atmosfir. Tetapi septum ini tidak tahan dengan

 semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil dari septum yang

terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan penyumbatan.

3) Loop Valve, tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi

volume lebih besar dari 10 µ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan

menggunakan adaptor yang sesuai, volume yang lebih kecil dapat

diinjeksifan secara manual). Pada posisi LOAD, sampel diisi kedalam loop

pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan, maka sampel akan

masuK ke dalam kolom.

3. Kolom (Column)
Kolom adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu

analisis tergantung pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai.

Kolom dapat dibagi menjadi dua kelompok :

1) Kolom analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada

jenis material pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang

digunakan adalah 50 -100 cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -

30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.

2) Kolom preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan

panjang kolom 25 -100 cm. Kolom umumnya dibuat dari stainlesteel dan

biasanya dioperasikan pada temperatur kamar, tetapi bisa juga digunakan

temperatur lebih tinggi, terutama untuk kromatografi penukar ion dan

kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung pada model KCKT

yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid

Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution

Chromatography, EC)

4. Detektor (Detector)
 Suatu detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen

sampel di dalam kolom (analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis

kuantitatif).Detektor yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan

(noise) yang rendah, kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk

semua tipe senyawa. Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi

temperatur sangat diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh. Detektor

KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang

gelombang dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range

yang lebih luas. Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama

pada kromatografi eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan

dengan detektor UV. Detektor-detektor lainnya antara lain: detektor

fluorometer, detektor spektrofotometer massa, detektor ionisasi nyala, detektor

refraksi indeks, detektor elektrokimia, dan detektor reaksi kimia.

5. Elusi Gradien
Elusi Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak

selama analisis kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah

mempersingkat waktu retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada

kolom. Dasar-dasar elusi gradien dijelaskan oleh Snyder. Elusi Gradien

menawarkan beberapa keuntungan :

1) Total waktu analisis dapat direduksi

2) Resolusi persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah

3) Ketajaman Peak bertambah (menghilangkan tailing)

4) Efek sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak Gradien

dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan.

6. Pengolahan Data (Data Handling)

 Hasil dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam

bentuk kromatogram pada rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat

pada gambar berikut ini :

Gambar : kromatogram dari senyawa 5’ Nukleotida

waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa

digunakan untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila

kondisi kerja dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau

proporsional dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil

secara kuantitatif.

7. Fase Gerak
Di dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak

adalah salah satu dari variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat

variasi yang sangat luas pada solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada

beberapa sifat umum yang sangat disukai, yaitu rasa gerak harus :

1. Murni, tidak terdapat kontaminan

2. Tdak bereaksi dengan wadah (packing)

3. Sesuai dengan defektor

4. Melarutkan sampel

5. Memiliki visikositas rendah

6. Bila diperlukan, memudahkan "sample recovery"

7. Diperdagangan dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)

 Umumnya, semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang

karena prosedur pemumiannya kembali sangat membosankan dan mahal

biayanya. Dari semua persyaratan di atas, persyaratan 1) s/d 4) merupakan

yang sangat penting.

E. Kelebihan dan Kekurangan HPLC

a. Kelebihan

1. HPLC dapat digunakan untuk isolasi zat yang tidak mudah menguap dan zat

yang tidak stabil

2. HPLC memiliki detektor dengan kepekaan yang tinggi

3. Teknik ini memiliki daya memisah yang tinggi

4. Dapat menganalisis sampel yang kecil kuantitasnya

5. Dalam HPLC dapat memberikan beberapa ribu lempeng teoritis hanya dalam

beberapa cm sehingga memungkinkan analisis kolom yang sangat kecil (sedikit

fase gerak yang dikonsumsi)

6. Biaya pelarut jauh lebih rendah dibandingkan LC kuno, sehingga dapat

menurunkan biaya karyawan

7. Teknik HPLC dapat dilakukan pada suhu kamar

b. Kekurangan

1. Masih dibutuhkan detektor yang terandalkan dan tidak mahal yang dapat

memantau senyawa-senyawa yang tidak memiliki kromofor.

2. Obat-obat harus diekstraksi dari formulasi sebelum dianalisis.

3. Terbentuknya buangan pelarut organik dalam jumlah besar, yang mahal jika

dibuang.
F. Sampel yang Cocok digunakan Pada Metode HPLC

Gugus fungsional Reagen untuk dapat Reagen untuk dapat

dideteksi dengan UV-Vis dideteksi dengan fluoresen

Asam-asam karboksilat; p-nitrobenzil-N,N’- 4-bromometil-7-

asam-asam lemak;asam- diisopropilisourea asetoksikumarin; 4-
asam fosfat (PNBDI); 3,5- bromometil-7-
dinitrobenzil-N,N’- metoksikumarin
diisopropilisourea
(DNBDI); p-bromofenasil
bromida (PBPB)

Alkohol 3,5-dinitrobenzil klorida

(DNBC); 4-
dimetilaminiazobenzen-4-
sulfinil (Dabsyl-Cl)

Aldehid; keton P-nitrobenziloksiamin Dansil hidrazin

hidroklorida (PNBA); 3,5-
dinitrobnziloksiamin
hidroklorida (DNBA)

Amin primer Fluoresamin o-ftalaldehid

(OPA)

Asam-asam amino 4-dimetilaminiazobenzen- Fluoresamin o-ftalaldehid

(peptida) 4sulfinil (Dabsil-Cl) (OPA)-7-kloro-4-
nitrobenzo-2oksa-1,3-
diazol (NBD-F)
 BAB III

PENUTUP

A. Kesimpulan

1. Kromatografi Cair Tenaga Tinggi (KCKT) atau biasa juga disebut dengan High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) merupakan metode yang tidak
destruktif dan dapat digunakan baik untuk analisis kualitatif dan kuantitatif.

2. Prinsip kerja HPLC adalah pemisahan analit-analit berdasarkan kepolarannya.

Alatnya terdiri dari kolom (sebagai fasa diam) dan larutan tertentu sebagai fasa
geraknya.

3. Bagian-bagian dari HPLC yaitu pompa, injeksi, coloum, detector, elusi gradient,
pengolahan data, dan fase gerak.

B. Saran

Penulis berharap para pembaca memberikan kritik dan saran yang

membangun kepada penyusun demi sempurnanya makalah ini.Semoga makalah ini

berguna bagi penulis pada khususnya juga para pembaca.

 DAFTAR PUSTAKA

Gritter,Roy J, dkk.1991. Pengantar Kromatografi Edisi Kedua. Bandung:ITB

Watson. David., 2009, Analisis Farmasi, Edisi 2., EGC, Jakarta.

Gandjar I, G., Abdul R, 2007, Kimia Analisis Farmasi, Pustaka Belajar, Yogyakarta.

Putra E, D., 2004, Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi, Digital

Library, Artikel.