TCNICAS CITOGENTICAS

Flvia Scapin
Cromossomos so estruturas filamentares presentes no interior do ncleo celular que consistem, cada qual, de uma molcula de DNA supercondensada, juntamente com protenas histonas e no-histonas. At 1956 no se sabia exatamente o nmero de cromossomos da espcie humana. O desenvolvimento de tcnicas adequadas, juntamente com o auxlio do microscpio, possibilitou a identificao de cada um deles, bem como a visualizao adequada do seu conjunto. atribuda a Tjio e Levan (da Sucia) e Ford e Hamerton (da Inglaterra) a descoberta de que o genoma humano constitudo por 46 cromossomos (ou 23 pares), sendo 44 autossmicos e 2 sexuais. A partir de ento, a citogentica tem-se desenvolvido enormemente, trazendo grande contribuio no s para o estudo das doenas humanas, como tambm para estudos das populaes normais, sua origem e evoluo. Os cromossomos no se apresentam uniformes ao longo de todo o seu comprimento; cada cromossomo apresenta uma constrio primria denominada centrmero. O centrmero divide o cromossomo em dois braos: o brao curto, designado por p (do francs petit) e o brao longo, em analogia, por q. Morfologicamente os cromossomos so classificados de acordo com a posio do centrmero. Se este estiver localizado centralmente, o cromossomo denominado metacntrico; se prximo extremidade, acrocntrico; se o estiver em uma posio intermediria, o cromossomo submetacntrico. Mas os cromossomos no diferem somente pela posio dos centrmeros ou pelo seu tamanho, mas tambm por apresentarem um padro caracterstico de bandas. Por meio de tcnicas de colorao especial, que coram seletivamente o DNA, cada par cromossmico individualmente identificado; isto ocorre por apenas um breve perodo, durante a mitose, na metfase, quando esto condensados ao mximo e quando os genes no podem ser transcritos.

Bandas Q
As primeiras bandas foram observadas quando lminas contendo material cromossmico foram tratadas com quinacrina mostarda, uma substncia fluorescente. Os cromossomos submetidos a esse tratamento apresentavam faixas com diferentes intensidades de fluorescncia, com um padro de bandas brilhantes e opacas caracterstico para cada par. Tais bandas foram designadas de bandas Q (de quinacrina). A anlise deste material deve ser feita em microscpio de fluorescncia, sendo que as regies cromossmicas fluorescentes (brilhantes) so ricas em AT (adenina e timina). Esta tcnica apresenta uma vantagem especfica na identificao do cromossomo Y, que se cora intensamente com quinacrina, mesmo quando a clula est em intrfase.

Alm desta, novas tcnicas de colorao foram desenvolvidas, melhorando sensivelmente a capacidade de identificao dos cromossomos. So as seguintes as principais tcnicas disponveis: bandas G, R, C, T, NOR, bandeamento de alta resoluo e FISH (fluorescence in situ hybridization).

Bandas G
Esta tcnica a mais utilizada por ser simples e dispensar o uso de microscpio de fluorescncia. Os cromossomos so submetidos ao de uma enzima a tripsina que desnatura as protenas cromossmicas, sendo corados posteriormente com Giemsa (de onde deriva o nome de bandas G). Por esta tcnica, so observadas aproximadamente 350 a 550 bandas por genoma haplide; cada banda representa alguns genes ou at centenas deles (cerca de 5 a 10 x 106 pares de bases). Os cromossomos mostram um padro de bandas claras e escuras, no qual as faixas escuras correspondem s bandas Q brilhantes e contm DNA rico em bases AT e poucos genes ativos; as bandas G claras tm DNA rico em bases GC (guanina e citosina) e apresentam muitos genes ativos. Tal padro nico para cada cromossomo humano e possibilita a definio inequvoca dos cromossomos normais. A maioria dos pontos de quebra e dos rearranjos cromossmicos parece ocorrer nas bandas claras.

Bandas R
Na obteno destas bandas, os cromossomos so tratados com soluo salina e calor para uma desnaturao controlada e depois so corados com Giemsa. O resultado de bandas claras e escuras tpico de cada cromossomo e representa o inverso daquele produzido pelos bandeamentos Q e G (de onde deriva sua designao de bandas reversas). As bandas escuras so regies ricas em GC, enquanto as claras contm muito mais AT.

Bandas C
Aps o tratamento com uma soluo de hidrxido de brio, a colorao aqui tambm feita com Giemsa. Com este mtodo, so coradas regies especficas: aquelas em que o cromossomo apresenta DNA altamente repetitivo, como nas regies dos centrmeros e em outras regies cromossmicas (ex: brao longo do Y), correspondendo heterocromatina constitutiva, motivo de sua denominao.

Bandas T
Marcam as regies telomricas dos cromossomos (o que d origem a esta denominao). OBS: Telmero a ponta ou a extremidade terminal de cada cromossomo. Tem a funo de manter a estabilidade e a integridade cromossmicas.

Bandas NOR
Coram especificamente as regies organizadoras dos nuclolos, ou seja, as constries secundrias dos cromossomos com satlites. OBS: Satlites so apndices de forma pedunculada presentes nas extremidades dos braos curtos de cromossomos acrocntricos, responsveis pela formao dos nuclolos no perodo de intrfase celular, contendo mltiplas cpias repetidas dos genes para RNA ribossmico.

Bandeamento de Alta Resoluo

Atualmente tm sido desenvolvidas tcnicas que permitem um exame mais detalhado dos cromossomos, em estgios mitticos de prfase ou pr-metfase, quando esto menos condensados, permitindo a visualizao de mais de 800 bandas por genoma haplide. Esta tcnica pode ser utilizada para as bandas Q, G ou R e detecta alteraes cromossmicas estruturais menores.

FISH
O progresso mais importante em citogentica nos ltimos anos foi o desenvolvimento da tecnologia da hibridizao in situ por fluorescncia FISH (do ingls fluorescence in situ hibridization). A hibridizao in situ tornou possvel detectar seqncias especficas de cidos nuclicos em morfologicamente preservados cromossomos, clulas e tecidos. Essa tecnologia baseada na formao duplex, sob condies bem definidas, de um fragmento de cido nuclico de fita simples modificado (sonda ou probe) e sua seqncia complementar (seqncia alvo) em um espcime biolgico fixado. Trata-se de uma tcnica de DNA recombinante que no necessita de istopos radioativos, o que a torna realizvel em qualquer laboratrio padro de citogentica. FISH toma o lugar das bandas para identificar alteraes alm da resoluo visual (como nas microdelees) ou quando um rearranjo cromossmico envolve uma regio camuflada na leitura pela banda (rearranjo crtico) ou de difcil interpretao (como rearranjos dentro do cromossomo). Essa tcnica usada para estudar os cromossomos de clulas em metfase, mas seu principal uso nas clulas em interfase, quando anormalidades numricas e algumas estruturais podem ser detectadas. Essa propriedade de grande valor em estudos sobre cncer, j que um grande nmero de clulas pode ser verificado quanto a anormalidades clonais especficas que podem estar presentes somente em poucas clulas. A citogentica em interfase tambm possui enorme potencial para diagnstico pr-natal, sendo tambm um instrumento valioso para o mapeamento gnico . A tcnica FISH envolve a preparao de sondas especficas de DNA, marcadas pela incorporao de nucleotdeos quimicamente modificados que so diretamente fluorescentes (mtodo direto) ou podem ser detectados pela ligao a uma molcula fluorescente (mtodo indireto), visualizados sob luz ultra-violeta. Tais sondas de cadeias simples de DNA so hibridizadas com os cromossomos metafsicos como nas tcnicas habituais de citogentica, mas tambm diretamente com os cromossomos de clulas interfsicas. Aps a hibridizao in situ, as lminas formadas podem ser vizualizadas em microscpio de fluorescncia, e as alteraes cromossmicas, se presentes, identificadas. (ver etapas do processo adiante) Atualmente h sondas viveis para todos os cromossomos, DNAs satlites e muitos locos especficos envolvidos em doenas, que podem ser obtidas em Kits pelos laboratrios de citogentica. Existem vrios tipos de sondas para uso na tcnica: A) Sondas centromricas Consistem de seqncias de DNA repetitivo situadas no centrmero e na regio pericentromrica de um cromossomo especfico. Adequadas para um diagnstico rpido das sndromes aneuplides mais comuns (trissomias 13, 18 e 21) e como estudo de clulas interfsicas obtidas de vilosidades corinicas, no diagnstico pr-natal.

B) Sondas de seqncia nica especficas para o cromossomo Essas sondas so especficas para um determinado loco nico, sendo teis para identificar delees e duplicaes submicroscpicas, que constituem as sndromes de microdelees. C) Sondas para cromossomo inteiro (pintura cromossmica) Consistem de um coquetel de sondas obtidas de diferentes regies de um dado cromossomo. Quando esse coquetel utilizado em uma nica hibridizao, todo o cromossomo fica fluorescente (pintado). Muito til para caracterizar rearranjos complexos com algumas pequenas translocaes e para identificar a origem de material cromossmico adicional, como os cromossomos em anel. Uma parte do material cromossmico no identificado usada como uma pintura para hibridizar com os cromossomos metafsicos normais. A origem do segmento cromossmico no identificado , ento, revelada quando se identifica o(s) cromossomo(s) com o qual(is) esse segmento hibridiza. Tal sonda denominada pintura reversa. D) Cariotipagem por espectro multicolorido Utiliza um conjunto de sondas de pintura cromossmica de todos os cromossomos humanos, a fim de preparar um caritipo humano multicolorido, em que cada par de cromossomos homlogos pode ser identificado na base de sua colorao nica. Cada sonda preparada de tal modo que apresenta uma cor diferente quando ligada a um marcador fluorescente e analisada por computador. Tal procedimento pode ser extremamente til para a deteco de pequenos rearranjos cromossmicos, tanto constitucionais (como em pacientes que mostram anormalidades do desenvolvimento) quanto adquiridas (como no cncer). Nesse procedimento, para aumentar a capacidade de identificar as cores dos alvos, um mtodo de ligao combinatrio foi desenvolvido. A multiplicidade dada por 2n 1, em que n o nmero de cores. A tabela 1 e a figura 1 ilustra esse mtodo. Hapteno ou Cor Fluor escen te AMCA Fluorescena Rodamina Probe no fluorocromo 1 Biotina + 2 Digoxigenina + 3 Fluorescena + 4 Biotina/Digoxigenina + + 5 Biotina/Fluorescena + + 6 Fluorescena/Digoxigenina + + 7 Biotina/Fluorescena/Digoxigenina + + + Fig. 1 Princpio do FISH combinatorial de sete cores

Fig. 1 FISH 7 cores para cromossomos humanos (masculino) em metfase de linfcitos com sete sondas satlites para cromossomos 1 (rodamina, fluorescena e cumarina marcadas; branco), 6 (rodamina marcada; vermelho), 7 (fluorescena marcada; verde), 15 (rodamina e cumarina marcadas; roxo), 17 (fluorescena e cumarina marcadas; azul claro), 18 (rodamina e fluorescena marcadas; amarelo) e X (cumarina marcada; azul escuro). As sondas foram detectadas com rodamina e fluorescena no modo direto e biotina (via avidina-AMCA) no modo indireto.

Etapas do FISH
Preparao dos Cromossomos O ndice mittico e o grau de condensao cromossmica so influenciados pela adio de colcemide, um inibidor mittico que segura a clula em metfase. Longa exposio a essa substncia resulta em maior nmero de divises em metfase s custas do alongamento dos cromossomos (que so preferveis para o mapeamento gnico). As boas preparaes so as que contm ao menos trs divises em metfase por campo em um aumento total de 100x. Isso pode ser obtido por repetidas fixaes e lavagens, se necessrias, e diluio apropriada da suspenso. Produo de Lminas Resultados timos so normalmente obtidos de lminas com trs dias do procedimento realizado, embora as de trs semanas tambm possam ser usadas. As lminas (slides) ou as suspenses devem ser estocadas a 20 C. Algum sucesso pode ser alcanado com lminas estocadas a 70 C. As lminas tm sua idade determinada antes da hibridizao por

desidratao com etanol (sries de 70%, 80%, 90% e 100%), que pode ser precedida por pequena incubao em 2XSSC ou soluo de tampo-fosfato (phosphate-buffered solution PBS) com o objetivo de limpar os slides e estabilizar o pH e deixar os cromossomos menos suscetveis desnaturao. Preparao das Sondas So geralmente preparadas por translao nick com um anlogo de nucleotdeo trifosfato biotinilado ou ligado digoxigenina, embora o PCR tambm pode ser usado efetivamente. Tendo sido determinada a concentrao apropriada de DNAse, o procedimento de translao nick d sonda o tamanho desejado, que deve ser de 150 a 300 nucleotdeos. Uma grande variedade de sondas de cidos nuclicos pode ser usada no FISH, de pequenos oligonucleotdeos sintticos (20 pb) a grandes fragmentos genmicos clonados em cromossomo artificial de levedura (YACs, yeast artificial chromosomes). Essas sondas podem ou no ter seqncias repetidas (como as repeties Alu e Kpn), sendo consideradas como de alta ou baixa complexidade, respectivamente. Ento, uma pr-hibridizao deve ser feita para bloquear as repeties, deixando livres as seqncias especficas para hibridizar ao seu cromossomo alvo. Na pr-hibridizao, em soluo, o DNA competidor no-ligado (DNA humano total ou frao) permitido hibridizar com a sonda de DNA para as seqncias repetidas se tornarem dupla fita, enquanto as seqncias nicas na sonda permanecem em fita simples para poderem se ligar s suas seqncias-alvo complementares no passo seguinte da hibridizao in situ. Algumas sondas so ligadas diretamente com fluorocromo, e outras com molcula sinalizadora (biotina, digoxigenina...) que ento se conjuga com outra molcula ligada ao fluorocromo (ex: avidina ou anticorpo). As ligadas diretamente simplificam o procedimento, mas a sensibilidade pode ser comprometida. As ligadas ao anticorpo permitem maior amplificao, mas pode haver background ligao no-especfica ao citoplasma e restos celulares. Aps, as sondas so colocadas em microtubos e estocadas de -15 a -25 C e devem ser descongeladas e pr-aquecidas em 37 a 42 C antes da hibridizao. Desnaturao de Cromossomos O DNA desnaturado em 65 a 85 C em soluo de formamida a 70% em 2XSSC. O processo termina colocando-se as lminas em etanol resfriado. As lminas podem, ento, ser desidratadas atravs de sries de etanol. Hibridizao A sonda pr-aquecida colocada sobre a lmina para cobrir as reas onde a suspenso celular foi dividida, e uma lamnula colocada sobre ela. A sonda est agora em contato com o material cromossmico desnaturado, e assim deixado geralmente por uma noite, em uma caixa mida, a 37 ou 42 C no escuro. Lavagem Ps-Hibridizao Esse passo remove toda a sonda em excesso e perdida. importante no lavar toda sonda do cromossomo alvo e remover toda sonda perdida para os outros cromossomos, citoplasma e restos celulares.

A primeira lavagem deve ser em formamida ou mistura formamida/SSC, seguida por lavagem em concentrao apropriada de SSC para se obter a adstringncia requerida. Geralmente, sondas de seqncia nica requerem menor adstringncia que as sondas com seqncias repetidas ou de pinturas de cromossomos inteiros. A lavagem final em detergente misturado com SSC ou soluo tampo de fosfato, possivelmente com um agente bloqueador como albumina srica bovina. A mistura de detergente pode ser usada como uma soluo fixadora. Deteco de Sondas O procedimento de deteco consiste na aplicao de solues de deteco requeridas lmina, coberta com uma lamnula e selada com soluo de entellan. As solues de deteco so misturas apropriadas de reagentes de ligao sinalizadores conjugados a fluorocromo em soluo bloqueadora. Para procedimentos duplos ou multicoloridos, alguns sistemas permitem que reagentes de deteco sejam misturados para aplicao simultnea, mas sempre h a possibilidade que os anticorpos tenham reao cruzada. Fluorocromos usados: fluorescena tiocianato FITC (verde), rodamina e Texas red (vermelhos), Cy3 (laranja), Cy3.5 (escarlate), etc. Sistemas de molculas sinalizadoras: biotina/avidina, digoxigenina/anticorpo antidigoxigenina, etc. Para sua deteco devem ser conjugados com F-CRBM apropriado. Amplificao de Sinal Pode ser combinada com o procedimento de deteco ou realizada em estgio mais tardio se o sinal no est forte o suficiente aps exame no microscpio. Pode consistir em um passo (o anticorpo dirigido contra o F-CRBM e conjugado com mais fluorocromo; ex: biotina - avidina/fluorocromo anti-avidina/fluorocromo) ou dois passos (o anticorpo contra o F-CRBM conjugado com outras molculas sinalizadoras s quais se conjuga mais F-CRBM; ex: biotina - avidina/fluorocromo - anti-avidina biotinilada - avidina/fluorocromo). Em algumas ocasies, para procedimentos duplos e multicoloridos, os reagentes de amplificao podem ser misturados para aplicao simultnea. Contagem Colorida (Counterstaining) Fase de colorir o resto do material cromossmico. As pinturas mais usadas so DAPI (azul) e propidium iodide (vermelho) e devem ser diferentes da cor do fluorocromo com o qual vai ser usada. As lminas cobertas com a lamnula so colocadas diretamente na soluo tinta/antifade e seladas com soluo entellan. Agora, j podem ser visualizados no microscpio de fluorescncia. Se o sinal muito fraco, o procedimento de amplificao pode ser realizado; se o sinal muito forte, as lavagens devem ser repetidas. Microscpio Um microscpio epifluorecente requerido com uma lmpada de alta presso de mercrio (100 W) que deve estar ajustada corretamente. As objetivas mnimas requeridas so de 10 e 20X (para scanning) e 100X com imerso em leo.

Os filtros so desenhados para fluorocromos especficos e devem ser escolhidos de acordo com os sinais a serem detectados. A visualizao simultnea de diferentes cores pode ser obtida com filtros multi-bandas. As imagens podem ser colecionadas com alta resoluo em filmes coloridos de alta velocidade ou em memria do computador via cmeras estticas CCD (charge coupled device) ou via scanner a laser.

Hibridizao Genmica Comparativa (CGH)

Trata-se de um mtodo citogentico molecular com o potencial de detectar desarranjos cromossmicos previamente inacessveis, j que somente o DNA requerido para o procedimento. possvel estudar pequenas quantidades de DNA preparados de poucas clulas com as tcnicas da reao em cadeia da polimerase (PCR). Pode ser considerado um avano na estratgia denominada pintura reversa usada e m gentica do cncer, na deteco de genes supressores tumorais e proto-oncogenes. Esse procedimento baseia-se na marcao com cores diferentes para o DNA teste ou tumoral (verde) e para o DNA normal usado como controle (vermelho). As duas amostras so misturadas e hibridizadas com cromossomos metafsicos normais. Se a amostra-teste contm mais DNA de uma regio cromossmica particular do que a amostra-controle, essa regio identificada por um aumento na fluorescncia do verde em relao ao vermelho, caracterizando uma amplificao gnica. Similarmente, uma deleo na amostra testada identificada como uma reduo na fluorescncia do verde em relao ao vermelho. Os pobres resultados da hibridizao devem-se principalmente presena de restos celulares nos slides e s sondas de DNA contaminadas com grande quantidade de protenas ou de tamanho inapropriado.

TCNICAS DE CULTURA TECIDUAL

SANGUE: Vrios so os tecidos usados para a preparao de cromossomos. Podem ser usados linfcitos (linfoblastos), sangue e medula ssea, entre outros. Sangue o tecido mais freqentemente usado para diagnstico citogentico de uma variedade de casos clnicos. Sangue perifrico facilmente obtido de pacientes de todas as idades, incluindo neonatos, e o tecido de escolha para o diagnstico de caritipos constitucionais. A cultura do sangue realizada pela introduo de linfcitos na forma de linfcitos ricos em plasma ou frao isolada de linfcitos (cultura de linfcitos ou macrocultura), ou como sangue total (cultura de sangue total ou microcultura), colocados dentro do meio de cultura.

Cultura de Linfcitos ou Macrocultura

Protocolo 1: Separao do Linfcito Procedimento: 1. Obter 5 a 10 ml de sangue em um tubo (contendo heparina) e misturar suavemente para evitar a coagulao. Se o sangue for recebido numa seringa, deve ser transferido para um tubo e misturado. 2. Permanecer em temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Os corpsculos das clulas vermelhas sedimentam mais rpido do que os linfcitos e se depositam em direo metade mais baixa do tubo, deixando uma soluo turva de linfcitos ricos em plasma no topo. 3. Coletar a poro do topo que possui plasma rico com linfcitos (livre de corpsculos) e fazer uma suspenso uniforme. 4. Pegar um volume pequeno de linfcitos ricos em plasma para determinar a densidade celular, se necessrio, e proceder de acordo com o protocolo seguinte. Protocolo 2: Isolamento do Linfcito Solues: 1.RPMI 1640-HEPES sem soro. um meio de cultura. 2.Ficoll-paque ou Histopaque, densidade 1077. Ficoll-paque e Histopaque so solues que contem polissacarose e diatrizoato sdico ajustado para a densidade especfica. Procedimento: 1. Preparar tubos de Histopaque, assepticamente, pela colocao de 3 ml de Histopaque em cada tubo de centrifugao (capacidade de 15 ml). Para um volume de 10 ml de sangue no diludo, preparar 2 tubos de centrifugao. Deixar o Histopaque alcanar a temperatura ambiente. 2. Suavemente adicionar 3 ml de sangue total em cada tubo de centrifugao para cobrir o Histopaque. 3. Centrifugar os tubos a 2000 rpm por 30 minutos. As clulas vermelhas do sangue e os granulcitos formam sedimento no fundo do tubo abaixo do Histopaque, e os linfcitos,

juntamente com as clulas mononucleares, permanecem na interface do plasma com Histopaque. 4. Descartar a camada superior de plasma sem perturbar a camada celular e coletar as clulas nucleadas usando uma pipeta de Pasteur. 5. Lavar as clulas pela sua suspenso em 10 ml de RPMI 1640 sem soro em um tubo de centrifugao. Centrifugar a 1000 rpm por 10 minutos para coletar as clulas como uma bola. 6. Descartar o sobrenadante e lavar as clulas novamente, repetindo o passo 5 seguido pela centrifugao. 7. Suspender as clulas em um meio apropriado conforme exigido. Protocolo 3: Tcnica de Cultura Solues: 1. Meio de crescimento: RPMI 1640: 100 ml Soro bovino fetal: 25 ml Penicilina e estreptomicina: 1,3 ml (10.000 U/ml e 10 mg/ml respectivamente) L-glutamina (200 mM ou 29,2 mg/ml): 1,3 ml RPMI 1640 pode ser substiudo por outros meios, por exemplo, MEM com aminocidos no-essenciais, TC 199, McCoy 5A, ou RPMI 1630. Um bom ndice mittico e a preparao dos cromossomos so obtidos com qualquer um desses meios. Eles devem ser estocados em 2 a 5C e usados dentro de 2 a 3 semanas. 2. Fitohemaglutinina (PHA) Fitohemaglutinina liofilizada, como suprimento, deve ser dissolvida em uma quantidade apropriada de gua destilada esterilizada. Pode ser estocada na forma liofilizada em 2 a 5C por muitos meses. A soluo estocada congelada, e pode ser usada por poucas semanas, se a esterilidade mantida. Procedimento: 1. Preparar os tubos de cultura (15 ml) ou frascos (T25), colocando 10 ml de meio de crescimento e 0,2 ml de PHA em cada. Para as espcies da rotina clnica, sugerido que culturas triplas sejam iniciadas para cada amostra. As culturas em frascos podem ser tratadas como culturas abertas, enquanto aquelas em tubos de centrifugao esterilizadas so tratadas como culturas fechadas. Para culturas fechadas, o meio ajustado para um pH levemente alcalino, entre 7,4 e 7,6. 2. Preparar a cultura de linfcitos pela adio de 3 a 5 gotas, usando uma pipeta, ou 0,3 a 0,5 ml de linfcitos ricos em plasma em cada cultura. Alternativamente, um pode estimar a densidade celular e adicionar uma quantidade adequada a fim de adquirir uma densidade final de aproximadamente 1x106 clulas nucleadas/ml no meio de cultura. 3. Misturar suavemente os contedos de cada tubo de cultura. Incubar as culturas por 3 dias a 37C em uma posio inclinada. Frascos T25 so incubados em um incubador com CO2, frouxamente encobertos. Os tubos de cultura so incubados em um incubador ou em um quarto aquecido, numa posio inclinada e firmemente fechados. A posio inclinada cria uma

superfcie maior entre a fase lquida e a fase gasosa, e, alm disso, permite que as clulas se estabeleam em uma rea mais larga do tubo de cultura, o qual fornece condies ideais de cultura para as clulas crescerem e proliferarem. 4. Colher a cultura no terceiro dia (68 a 76 horas a partir do tempo de incio), seguindo o protocolo 5 (colheita de linfcitos no-estimulados em 24 ou 48 horas).

Cultura de Sangue Total ou Microcultura

Protocolo 4: Cultura de Sangue Total ou Tcnica de Microcultura Solues: 1. Meio de crescimento: RPMI 1640: 100 ml Soro bovino fetal: 25 ml Penicilina e estreptomicina: 1,3 ml (10.000 U/ml e 10 mg/ml respectivamente) L-glutamina (200 mM ou 29,2 mg/ml): 1,3 ml 2. Fitohemaglutinina (PHA) Fitohemaglutinina liofilizada, como suprimento, deve ser dissolvida em uma quantidade apropriada de gua destilada esterilizada. Procedimento: 1. Preparar os tubos de cultura como descrito no protocolo 2 (passo 1). 2. Obter uma pequena quantidade de sangue perifrico em uma seringa heparinizada ou tubo (contendo heparina) e colocar 5 a 10 gotas em cada tubo de cultura. 3. Incubar os tubos de cultura numa posio inclinada a 37C. 4. Colher a cultura no terceiro dia. 5. Os mtodos de colheita e preparao de lminas so iguais aos da macrocultura, descritos no protocolo 5. Protocolo 5: Colheita e Preparao de Lminas Solues: 1. Soluo de colcemide (colchicina) (soluo ou liofilizada) 10g/ml Diluda com a quantidade sugerida de gua destilada Pode ser estocada de 2 a 5C por muitos meses 2. Soluo hipotnica Cloreto de Potssio 5,6g gua destilada 1L Estocado em quantidades pequenas. Pode ser estocado por poucos meses se esterilizado. 3. Fixador Metanol-absoluto (3 partes) 75 ml cido actico (1 parte) 25 ml

Preparar fixador fresco antes de cada uso. Procedimento: 1. Adicionar 0,02 ml de colcemide para cada tubo de cultura contendo 10 ml de meio, sacudindo suavemente o tubo para misturar. Ento incubar as culturas por 45 a 60 minutos a 37C. 2. Seguindo o tratamento com colcemide, transferir o contedo de cada frasco T25 para um tubo de centrfuga. Centrifugar os tubos a 800 rpm por 8 minutos. Se houver qualquer agregao celular que no pode ser dissociada, eles devem ser removidos antes da centrifugao. 3. Descartar o sobrenadante por pipetagem, deixando tanto meio quanto for possvel. 4. Suspender as clulas em 5 ml de soluo hipotnica (0,075 M KCl) e incubar 10 a 15 minutos em gua a 37C. A soluo hipotnica pode ser pr-aquecida a 37C antes do uso ou soluo estocada em temperatura ambiente pode ser usada diretamente para suspender as clulas. Ambos os caminhos so essncias para estabelecer um protocolo padro e segui-lo. 5. Adicionar 5 gotas do fixador para cada tubo e misturar muito suavemente pela inverso dos tubos 1 ou 2 vezes. Centrifugar a 800 rpm por 8 minutos. 6. Descartar o sobrenadante. Agitar completamente as bolas formadas atravs de tapas no tubo. Ressuspender as bolas em 5 ml de fixador (evitar pipetagem). Deixar em temperatura ambiente por cerca de 10 minutos. 7. Centrifugar novamente os tubos, descartar o sobrenadante, e suspender as clulas no fixador. Repetir esse passo 3 vezes. 8. Depois da centrifugao final, suspender as clulas em um volume pequeno de fixador (aproximadamente 0,5 a 1 ml) para dar uma suspenso levemente opaca. 9. Pingar 3 a 4 gotas uniformemente em uma lmina mida e deixar secar. Depois que a lmina estiver completamente seca, examinar com aumento de 10x ou 16x para verificar a densidade celular e a distribuio dos cromossomos metafsicos. Se a densidade celular estiver muito alta, adicionar algumas gotas a mais de fixador para a suspenso celular. Se a densidade celular estiver baixa, centrifugar a suspenso e ressuspender as bolas em uma quantidade menor de fixador. MEDULA SSEA: Com o estabelecimento de uma relao entre malignidade e alteraes cromossmicas, estudos citogenticos tem sido importantes em um grande nmero de distrbios hematolgicos. Esses estudos tem ajudado em reas como diagnstico, prognstico e terapia.

Preparao Cromossmica Direta

Protocolo 6: Colheita Direta Solues: 1. Meio sem soro: RPMI 1640

100 ml

Penicilina e estreptomicina L-glutamina 2. Meio de crescimento : RPMI 1640 Soro bovino fetal Penicilina e estreptomicina L-glutamina

1,0 ml 1,0 ml 100 ml 25 ml 1,3 ml 1,3 ml

Procedimento: 1. Obter 1 a 2 ml de medula ssea em uma seringa heparinizada. 2. Adicionar 5 a 10 gotas de medula a 10 ml do meio pr-aquecido sem soro em um tubo de centrifugao 15-ml e suspender as clulas. 3. Centrifugar a suspenso por 8 minutos a 800 rpm e ressuspender em um meio no suplementado. Repetir a centrifugao e finalmente suspender em 10 ml de meio de crescimento. Lavar as clulas melhora a qualidade da preparao cromossmica pela extrao de glicoprotenas da superfcie celular que podem estar presentes na membrana celular. 4. Expor as clulas a colcemide, colher as culturas e preparar as lminas seguindo o protocolo 5.

Referncias 1. VERMA RS, BABU A. Human Chromosomes Principles and Techniques. New York. McGraw-Hill, Inc, 2a edio, 1995. 2. BORGES-OSRIO MR, ROBINSON WM. Gentica Humana. Porto Alegre. Editora Artmed, 2 edio, 2002. 3. ROONEY DE, CZEPULKOWSKI BH. Human Chromosome Preparation- Essential Diagnoses. Reino Unido. Editora Wiley, 1997.