TUGAS TERSTRUKTUR BIOTEKNOLOGI PERTANIAN

RESTRICTION FRAGMENT LEGTH POLYMORPHISM (RFLP)

Oleh: Dina Fahrina Nitta Hita Pawitra Ahmad Alaudin Muhammad Ainur R A1L008077 A1L008084 A1L008088 A1L008...

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS PERTANIAN PURWOKERTO 2010

I. PENDAHULUAN Marka molekuler RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) merupakan marka molekuler yang menggunakan enzim restriksi dalam mengidentifikasi sekuensi-sekuensi DNA pada genom tanaman. Enzim restriksi ini berperan memotong rangkaian DNA genom tanaman menjadi potonganpotongan yang berbeda-beda ukurannya dan menjadi sumber informasi genetik spesifik dalam mendeteksi variasi sekuensi DNA yang dimiliki suatu tanaman. Analisis RFLP adalah teknik profiling DNA pertama untuk melihat aplikasi yang luas. Selain sidik jari genetik, RFLP merupakan alat yang penting dalam pemetaan genom, lokalisasi gen untuk gangguan genetik, penentuan risiko penyakit, dan uji DNA. Pada prinsipnya, RFLP merupakan semua mutasi yang
menghilangkan atau menciptakan sekuen rekognisi baru bagi enzim restriksi. Penyisipan (insersi), penghilangan (delesi), maupun subtitusi nukleotida yang terjadi pada daerah rekognisi suatu enzim restriksi menyebabkan tidak lagi dikenalinya situs pemotongan enzim restriksi dan terjadinya perbedaan pola pemotongan DNA (Lewin, 1994).

RFLP dapat berfungsi sebagai penduga variasi DNA. Variasi dideteksi dalam bentuk pemotongan rangkaian panjang polimorfik (ganda) yang mana waktu penilaian dari rangkaian variasi memungkinkan dari data fragmen itu sendiri, rangkaian variasi yang panjang dalam suatu bagian dapat dinilai dari subtitusi nukleotida. Berbagai keunggulan penerapan marker RFLP antara lain: 1. menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis. 2. Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah. 3. Memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter. 4. Memisah komponen genetik dari karakter kuantitatif. 5. Menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik. 6. Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas. 7. Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies, populasi. Enzim Restriksi

Tahun 1960-an, telah ditemukan sekelompok enzim tertentu yang dapat mendegradasi DNA dan menghambat (restrict) proses terjadinya infeksi dari bakterifage penginfeksi bakteri. Kelompok enzim ini, yang kemudian dikenal sebagai enzim restriksi (Restriction Enzyme), terbukti berperan sangat penting dalam penerapan teknologi DNA rekombinan di abad modern ini untuk memanipulasi DNA. Enzim restriksi ini mampu memotong DNA pada situs pengenal dengan sekuensi DNA yang sangat spesifik (Recognition site). Dengan demikian enzim ini mampu memproses DNA menjadi potongan-potongan yang lebih pendek asal DNA tersebut memiliki situs pengenal untuk enzim restrisi tertentu. Oleh enzim restriksi ini, DNA genomik tanaman yang relatif kompleks organisasi DNA-nya dapat dipotong-dipotong menjadi populasi potongan DNA dengan berbagai ukuran. Sampai dengan tahun 1988an, telah diketahui hampir 475 macam enzim restriksi yang berasal dari berbagai organisme. Enzim restriksi yang biasa dipakai untuk melakukan analisis RFLP biasanya mempunyai situs pengenal dengan sekuensi DNA 46 pasangan basa (pb). dengan mengetahui situs pengenalnya, frekwensi terjadinya pemotongan atau ada tidaknya situs pengenal akan dapat diduga. Dengan menasumsikan bahwa sekuensi nukleotida dalam DNA tersebar acak (random) dan dalam jumlah yang sama, maka enzim restriksi yang situs pengenalnya 6 pb kemungkinan akan memotong DNA satu kali (frekwensi situs pengenal = 1) untuk setiap sekuensi DNA sepanjang 46 atau 4096 pb. Dengan kata lain, untuk setiap DNA yang panjangnya 4096 pb diduga akan terdapat satu situs pengenal untuk enzim tersebut. Dengan demikian, enzim yang situs pengenalnya terdiri dari 4 pb kemungkinan akan ada satu satu situs pengenal untuk setiap 256 pb (44 ) sekuensi DNA.

Pelacak DNA (DNA Probe)

Jika DNA genome tanaman dipotong oleh enzim restriksi, beratus-ratus atau beribu-ribu potongan DNA akan dihasilkan dari pemotongan ini. Untuk mempelajari pola pemotongan DNA yang berasal adri lokus tertentu dalam kromosom, maka ratusan atau ribuan potongan tersebut harus dipisah-pisahkan berdasarkan ukurannya dengan elektroforesis gel agarose dan, potongan DNA tertentu yang diinginkan harus dapat dibedakan dari populasi potongan DNA dengan ukuran yang sama dengan melakukan hibridisasi menggunakan pelacak DNA (DNA probe). Pelaksanaan analisis RFLP memerlukan penggunaan bahan radioaktif atau bahan nonradioaktif tertentu untuk memberi label pada pelacak DNA. Bahan ini harganya masih relatif mahal. Selain itu, bahan radioaktif juga merupakan polutan yang berbahaya bagi lingkungan. Sebaliknya, bahan non-radioaktif walaupun tidak berbahaya, tetapi kemampuan dan sensitifitasnya untuk mendeteksi sekuensi DNA kopi tunggal masih belum efisien. pemberian label pada pelacak DNA dilakukan DNA dengan teknik nick diputus translation atau diberbagai titik dengan dengan teknik random menggunakan priming DNA labelling. Dengan teknik nick translation, salah satu untaian dari yang akan dilabel enzim DnaseI. Untaian DNA yang baru akan disintesis kembali oleh enzim polimerase I dari titik tempat terjadinya pemutusan tersebut. Ketika proses sintesis DNA yang baru terjadi, nukleotida yang telah diberi label ikut bergabung dalam untaian DNA baru yang disintesis. Pelacak DNA yang dipakai dalam penelitian RFLP dapat berupa DNA yang berasal dari sekerabat dengan spesies tanaman yang diteliti (pelacak homolog) atau berasal dari tanaman yang tidak sekerabat (pelacak heterolog). Pelacak heterolog biasanya lebih sulit dalam pemakaiannya karena biasanya ada homologi sekuensi pelacak DNA dengan DNA tanaman relatif kecil. Akibatnya, penggunaan pelacak DNA heterolog akan memberikan komplementasi yang kurang stabil antara DNA tanaman dan pelacak DNA. Pelacak heterologous dari DNA yang bersifat sangat konservatif (selalu sama untuk berbagai spesies tanaman) misalnya bagian gen small sub unit dari RUBISCO (Ribulosa Bifosfat Karboksilasi), gen major klorofil a/b binding protein atau gen RNA ribosomal.

Hibridisasi DNA - Pelacak DNA DNA genom yang telah dipotong dengan enzim restriksi harus dilakukan hibridisasi dengan pelacak DNA yang sudah diklon terlebih dahulu. Prinsip dari hibridisasi ini adalah setiap untaian tunggal DNA dapat berpasangan dengan untaian DNA komplementernya. DNA genom yang telah dipotong dan dipisahpisahkan dengan ukuran berbeda-beda dipindahkan dari gel agarose ke membran untuk proses blotting menggunakan pelacak DNA. Jika potongan DNA genom telah terhibridisasi dengan pelacak DNA, maka akan mengurangi ribuan potongan DNA genom yang tidak diperlukan atau potongan DNA yang semir pada gel agarose tidak akan terlihat. PCR (Polymerase Chain Reaction)-RFLP Seiring dengan kemajuan dalam teknologi DNA, analisis RFLP dapat dilakukan tanpa menggunakan pelacak DNA dan proses hibridisasi DNA. Penemuan program PCR (Polymerase Chain Reaction) dapat membantu mendapatkan sekuensi-sekuensi DNA tertentu dari genom DNA, kemudian dilakukan pemotongan dengan enzim restriksi, atau dengan kata lain analisis RFLP dapat dilakukan terhadap sekuensi-sekuensi DNA spesifik yang telah diisolasi dengan menggunakan primer spesifik dalam program PCR. Dalam analisis PCR, harus menggunakan primer spesifik yang mampu mengklon sekuensi DNA tertentu yang dapat digunakan sebagai pengganti pelacak DNA dalam analisis RFLP. Selanjutnya sekuensi DNA yang sudah diisolasi dipotong dengan berbagai enzim restriksi, guna melihat variasi/keragaman keberadaan recognition site memberikan ukuran potongan DNA yang berbeda-beda.Potongan DNA dengan ukuran berbeda beda ini merupakan gambaran adanya keragaman genetik berdasarkan sekuen DNA yang diisolasi pada berbagai jenis tanaman yang dianalisis. Sebagai ilustrasi singkat mengenai analisis RFLP dapat dilihat pada Gambar.

Gambar 1. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Markah RFLP memiliki keterbatasan jika digunakan sebagai alat bantu seleksi. Hal ini disebabkan oleh beberapa faktor, diantaranya: pada beberapa spesies tingkat polimorfisme DNA-nya sangat rendah, menyita banyak tenaga dan waktu, kuantitas dan kualitas DNA yang diperlukan sangat tinggi, prosedur hibridisasinya rumit, sehingga menyulitkan otomatisasi, dan memerlukan pustaka probe untuk spesies tanaman yang belum pernah dieksplorasi sebelumnya.

II. METODE KERJA Langkah-langkah kerja untuk mendeteksi RFLP di laboratorium meliputi : 1. Isolasi DNA

Isolasi DNA merupakan tahap pertama dari berbagai teknologi analisis DNA. DNA dapat ditemukan baik pada kromosom inti maupun pada organel yaitu pada mitokondria dan kloroplas. Untuk mengekstrak DNA diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk memecah dinding sel dan membran inti, dan dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai komponen sel yang lain. Proses pengeluaran DNA dari tempatnya berada (ekstraksi atau lisis) biasanya dilakukan dengan homogenasi dan penambahan buffer ekstraksi untuk mencegah DNA rusak. Pemisahan DNA dari komponen sel yang lain, termasuk dibris sel, dilakukan dengan sentrifugasi. 2. Pemotongan dengan enzim restriksi dan elektroforesis gel DNA hasil isolasi kemudian dipotong dengan menggunakan enzim restriksi tertentu yang dipilh dengan hati-hati. Setiap enzim restriksi pada kondisi yang sesuai akan mengenali dan memotong DNA sehingga dihasilkan fragmen-fragmen DNA. Fragmen-fragmen tersebut selanjutnya di elektroforesis pada gel agarosa. Karena fragmen-fragmen tersebut tidak akan terlihat sebagai smear berkesinambungan bila diwarnai eteridium bromide, maka pewarnaan saja umumnya tidak dapat mendeteksi adanya polimorfisme, dengan demikian perlu dilakukan hibridasi dan visualisasi dilakukan dengan Southern blotting. Elektroforesis merupakan proses bergeraknya molekul bermuatan pada suatu medan listrik. Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer. Elektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks penyangga untuk mencegah terjadinya difusi karena timbulnya panas dari arus listrik yang digunakan. 3. Transfer DNA dengan Sothern blotting. 4. Hibridisasi DNA.

Penggunaan Marka RFLP Dalam Program Pemulian Tanaman 1. Penerapan RFLP menggunakan pelacak DNA Kualitas produk akhir daripada gandum (Triticum sp) sangat dipengaruhi oleh GPC (Grain Protein Consentration) dan komposisinya. Protein biji yang tinggi sangat diharapkan pada berbagai produk roti dan pasta. Karena sangat penting sebagai kategori kualitas produk akhir dan nutrisi manusia, salah satu pendekatan untuk meningkatkan protein biji dalam gandum adalah penggunaan gen-gen protein tinggi yang berasal dari kerabat liar. Wild emmer (Triticum turgidum L. var.dicoccoides) merupakan progenitor intermediate pada gandum yang potensial sebagai sumber gen-gen protein tinggi.Berdasarkan penemuan tiga galur gandum hard red spring yang diperoleh dari wild emmer mewariskan kandungan protein biji menjadi lebih meningkat (Asfaw, et al., 1999). Studi ini dilakukan dengan menggunakan marker RFLP bertujuan (i) untuk mengindentifikasi region-region genom yang berasosiasi dengan konsentrasi protein biji yang tinggi, (ii) menguji efek background genetik dan lingkungan pada gen-gennya, (iii) menentukan ukuran genetik segmen kromosom yang terintrogresi ke dalam genotipe gandum hard red spring. Analisis RFLP pada tanaman gandum ini menggunakan 96 klon DNA copy rendah dari genom gandum, cDNA barley, DNA genom barley dan pustaka cDNA out serta menggunakan 5 macam enzim restriksi. Empat genotipe parental telah disurvey untuk polimorphisnya sebanyak 96 klon dengan DNA copy rendah berlokasi pada kromosom 5 dan 6. Satu single region yang berasosiasi dengan GPC tinggi dideteksi dengan 5 marker RFLP yang berlokasi dekat sentromer pada kromosom 6B. Marker ini menjelaskan 21 - 35 % variasi fenotipe dalam GPC pada 3 populasi. DNA marker dalam region mungkin digunakan untuk introgasiintrogasi gen GPC tinggi dengan cepat ke dalam plasma nutfah gandum lainnya (Asfaw, et al., 1999)

2. Penerapan RFLP Tanpa Menggunakan Pelacak DNA (PCR-RFLP)

Kacang Pigeon (Cajanus cajan, L. Millsp) adalah salah satu tanaman legum biji utama tropis dan sub tropis. Secara umum tanaman ini merupakan tanaman budidaya tahunan. Kultivar tradisionil dan landrace tanaman ini yang merupakan tanaman berumur panjang, juga tumbuh sebagai intercrop yang berumur pendek. Pusat origin tanaman ini yaitu india atau Afrika. Berdasarkan jumlah kromosom dan morfologi bunga menurut Van der Maesen (1980), tanaman kacang pigeon adalah asli India dengan Afrika sebagai pusat keragaman kedua. Tanaman kacang pegeon mempunyai beberapa type liar sampai enam genera (Van der Maesen,1980) Beberapa spesies liar Cajanus dan Rhynchosia digunakan para pemulia tanaman dalam hibridisasi interspesifik untuk transfer gen yang dimungkinkan kedalam tanaman budidaya. Walaupun demikian, studi tentang hubungan genetik didalam antar lima genera rumpun Cajaninae ini sangatlah terbatas. Penggunaan teknik molekuler untuk mempelajari pilogenetik (asal usul), pola evolusi anhubungan kekerabatan Cajanus kurang menjadi perhatian. Baru-baru ini region gen chloroplas ditemukan mempunyai kegunaan yang luas dalam mempelajari pilogenitik sejumlah tanaman. Tingkat evolusi yang rendah pada gen ini sebagai pembanding gen inti, membuatnya sangat cocok dalam mempelajari pilogenetik (asal usul) sejumlah tanaman. Tingkat evolusi yang rendah pada gen ini sebagai pembanding gen inti,membuatnya sangat cocok dalam mempelajari variasi pada tingkat yang lebih tinggi dari spesies (Palmer, 1988). Karena tersedianya program PCR dan primer spesifik untuk amplifikasi region gen kloroplas, studi ini menjadi lebih mudah dan lebih efektif dari segi biaya, serta hasilnya dapat dipercaya dan diulang kembali. PCR-RFLP memiliki empat region gen khloroplas yaitu rbcL, trnSpsbC,trnL-UAA dan 16S dari 28 spesies dianalisis menggunakan primer spesifik untuk tiap gen yang diamplifikasi dengan program PCR. Ukuran amplifikasi rbcL yaitu 1,4 kb; trnS-psbC 1,6 kb; trnL-UAA 0,59 kb untuk semua genera kecuali Dunbaria dengan ukuran amplifikasi 0,47 kb dan 16S yaitu 1,3 kb. Tidak ada

ukuran yang berbeda dari fragmen amplifikasi semua spesies yang dianalisis (Mukkamala , et al., 2000). Analisis intergenerik menunjukkan bahwa lima genera Cajanus, Rhynchosia, Dumbaria, Paracalyx dan Flemingia memberikan profil amplifikasi region gen rbcL yang sama dan subsekuen gen tersebut dipotong dengan enzim restriksi yang berbeda. Pemotongan dengan PstI menunjukkan Paracalyx profil dan yang sama pada Cajanus, Paracalyx sedangkan, Rhyncosia,

Flemingia menunjukkan profil yang sama pula (Mukkamala, et al., 2000).

DAFTAR PUSTAKA Asfaw, R.C Fronhberg and J. A Aderson., 1999. RFLP Marker Associated with High Grain Protein from Triticum turgidum L. var dicoccoides Introgressed into Hard Red Spring. J. Crop. Sci. 39 ; 508 - 513

Grodziker T, J. William, P. Sharp and J. sambrook. 1974. Physical Mapping of Temperature sensitive mutation of adenovirus. Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 39 : 439 - 446. Mukkamala L, P. Senthilkumar, M. Parani, M.N. Jithesh and A. K. Parida. 2000. PCR-RFLP Analysis of Chloroplast Gene Regions in Cajanus (Leguminose) and alliged Genera. Euphytica 116 : 243 250. Netherlands. Palmer, J.D., R. K. Jansen, M.W. Chase & J.R. Manhart., 1988. Chloroplast DNA Variation and Plant Phylogeny. Annal Missou Bot Gar 75 : 1180 1206. Van der Maesen, L.J.G., 1980. India is the Native Home of Pigeonpea, In; J.C. Arends, G. Boelema, C.T. de Groot & A.J.M. Leeuwenberg (Eds), Libergratulatorius in honorem H.C.D de wit, pp. 256 -262. Landebouwhogeschool Miscellaneous Paper No.19, Wageningen, Netherlands ; H. Veenman and B.V.Zonen