I.

TUJUAN
Mampu menganalisis terhadap transformasi bakteri dan dapat mendeteksi apakah
terdapat resistensi bakteri pada media.
II. PENDAHULUAN
Transformasi bakteri mula-mula diperkenalkan oleh Frederick Griffith pada tahun
1982, berdasarkan kenyataan bahwa sel bakteri yang satu dapat melepaskan fragmen
DNA nya ke dalarn suatu medium yang kemudian akan masuk ke dalam sel bakteri lain
dalarn kultur tersebut. Di alam, fragmen DNA tersebut biasanya dilepaskan oleh sel
bakteri yang mati atau mengalami autolisis. Namun, terdapat sel lain yang ternyata
memang melepaskan fragmen DNA pada saat pertumbuhan karena adanya gena tra
Transformasi adalah memindahkan materi genetik berupa fragmen DNA baik yang
berasal dari DNA kromosom maupun DNA plasmid.
Untuk proses transformasi secara artifisial (seperti yang akan dilakukan pada
percobaan) harus dilakukan pada saat kondisi kompeten, suatu kondisi sel dimana mereka
memiliki kemampuan untuk melakukan transformasi sel. Jika tidak, maka sel resipien
tidak dapat menyerap gen yang akan ditransformasikan. Kondisi kompeten ini biasanya
terjadi pada saat pertumbuhan. Namun, untuk transformasi artifisial secara in vitro,
kondisi kompeten dapat dibuat yaitu dengan memaparkan sel resipien pada konsentrasi
tinggi senyawa berkation divalent.
Transformasi memiliki arti penting dalarn perkembangan biologi molekuler.
Transformasi menyediakan sarana yang dapat digunakan untuk memurnikan DNA dan
mengubah serta memasukkan kembali ke dalarn sel bakteri untuk memastikan pengaruh
pengubahan secara invitro. Transformasi juga menyediakan teknik untuk produksi batas-
batas genetika yang tak terhingga (sel yang mempunyai DNA yang berasal pada berbagai
tipe sel) dan dengan begitu merupakan sarana yang penting dalarn bidang rekayasa
genetika.

III. Tujuan

Isolasi DNA merupakan langkah awal dari berbagai percobaan Plasmid

merupakan vector esensial dan memegang peran penting dalam kloning, sekuensing, dan
ekspresi gen. Oleh karena itu isolasi dan pemurnian plasmid DNA menjadi penting untuk
kepentingan penelitian biologi molekuler
Plasmid adalah replikon bakteri yang non-obligat, sirkuler, ekstrakromosomal
Isolasi plasmid DNA membutuhkan pemisahan antara DNA plasmid dari DNA
kromosom pada sel bakteri, selain itu juga dari polisakarida, lemak, protein yang terdapat
pada sel.
Kebanyakan metode isolasi DNA didasarkan pada pemecahan sel menggunakan
denaturan yang kuat, salah satunya adalah dengan lisis kimia menggunakan alkali kuat.
Denaturan penting untuk menginaktifkan nuklease eksogen dan endogen yang dapat
mendegradasi DNA.
 Bakteri => Sel bakteri mempunyai dinding sel berlapis dan membran sel. Struktur
ini dapat dipecah dengan lisosim dan detergen natrium dedosil sulfat (SDS). Akibat
perlakuan ini isi sel keluar. RNA dihilangkan dengan enzim Rnase, protein dipisahkan
dengan ekstraksi menggunakan fenol. Akhirnya DNA diperoleh melalui pengendapan
dengan etanol.
Sel manusia => Rasio DNA terhadap protein sangat rendah, maka jika DNA
dipisahkan langsung seperti pada sel bakteri, DNA banyak yang hilang. Untuk mengatasi
masalah ini dengan menaikkan rasio tersebut dan juga menghindari kontaminasi DNA
dari mitokondria. Inti dipecah dengan berbagai cara, RNA dan protein dihilangkan
dengan penambahan enzim dan kemudian DNA diendapkan. Pada praktikum ini akan
diperlihatkan contoh pengerjaan isolasi plasmid DNA menggunakan metode Alkali. Pada
dasarnya ada tiga tahap proses isolasi, yaitu: lisis sel, pemurnian dan pengendapan.
Plasmid biasanya diisolasi dari kultur cair dengan jalan inokulasi sejumlah
medium LB cair dengan koloni tunggal bakteri yang diambil dari medium agar padat
Pada umumnya plasmid komersial memiliki high copy number, mereka dapat replikasi
100-300 copy tiap sel sehingga pada pemurnian kultur dapat dihasilkan dalam jumlah
yang banyak.
Penyimpanan bakteri
Bakteri (pada media padat) dapat disimpan pada suhu 40 °C selama beberapa
bulan Beberapa strain colt disimpan pada suhu hingga -70 C sebagai gliserol stok.
Metode ini adalah yang paling aman dan reliable

Prosedur
Dalam pembuatan media, faktor yang terpenting adalah sterilitas. Salah satu cara
sterilisasi yang banyak digunakan adalah sterilisasi dengan autoclave Autoclaving
terhadap larutan-larutan yang diperlukan untuk membuat media dilakukan dengan cara
sbb:
 Tuangkan larutan tersebut pada botol/wadah lain yang sesuai (tutup botol/wadah
dilonggarkan).
 Dimasukkan dalarn autoclave pada suhu 121 "C, selama 20 menit.
 Saat suhu larutan sudah turun hingga 50 °C, wadah dapat ditutup dan disimpan pada
temperatur kamar
Sterilitas juga dapat diperoleh dengan melakukan pekerjaan pada laminar air flow
(LAF), sebuah sistem ruangan dengan satu arah aliran udara sehingga kontaminan dapat
diminimalisasi terkena pada alat dan bahan kita.

Cara menumbuhkan bakteri:

 Ambil I koloni bakteri atau 150-200 μl overnight bakteri
 Masukkan dalam 5-10 ml media LB cair
 Diinkubasi dengan alat shaker semalam pada suhu 37 "C
Catatan Jika yang ditumbuhkan adalah bakteri E.coli yang mengandung plasmid resisten
antibiotic, maka pada media yang digunakan untuk menumbuhkan diberi Ampicillin
dengan aturan 1 ml LB-I ul Ampicillin, Ampicillin stock 100 ug/ml

Cara Kerja Isolasi Plasmid DNA dengan Metode Alkali

Reagen yang diperlukan

1. Medium LB (Luria-Bertan) (per Liter
10g Bacto-tryptone
5 g Bacto-yeast extract
3g NaCi
Sesuaikan pH sampai 7.5 dengan NaOH 2N kemudian neoclave, Tambahkan antibiotik
ke dalarn larutan tersebut yang telah didinginkan sampai suhunya kurang dari 50°C.

2. Buffer TE
10 mM Tris-HCl, pH 8,0
1 mM EDTA 3. Buffersis

3. Buffer Lisis
25 mM Tris-HCI, pH 8,0
10 mM EDTA
50 mM Glukosa

4. Larutan Denaturing (dibuat baru)

0,4 N NaOH
2% SDS

5. Larutan Potassium Asetat (pH 4,8)

Siapkan 120 ml dari SM potassium asetat. Tambahkan 23 ml asam asetat glasial
dan 57 ml H₂0. Volume total 200 ml. Larutan ini mengandung potasium 3M dan asetat
SM
Simpan dalarn es sampai digunakan

6. Phenol/Kloroform yang dijenuhkan dengan TE

Tuang kristal Phenol ke dalarn waterbath suhu 65 °C dengan shaking seperlunya.
Campur dengan TE dengan bagian volume yang sama dengan fenol. Campurkan dengan
bagian volume yang sama dengan bagian bawah dari campuran tadi kloroform : 1soamil
alkohol (49:1).

7. Klorofonn: Isoamil alkohol (24: 1)

8. Etanol (100% dan 70%)
9. Dnase-free RNase A
 Buat larutan 10 mg/ml RNase A dalam 10 mM Tris-HCI, pH 7,5 dan 15 mM
NaCl. Panaskan pada suhu 100 °C selama 10 menit dan dinginkan perlahan-lahan
padatemperatur kamar.

Cara Kerja:

1. Inokulat 1 koloni tunggal atau 10 ul dan sel (sebelumnya telah dibekukan) yg

mengandung plasmid target ke dalam 5 ml medium LB dan 50 ug/ml antibiotik yg
tepat (eg ampicillin) tergantung pada gen resisten antibiotik yg dibawa oleh plasmid
spesifik. Tanam bakteri pada suhu 37 °C, selama semalam pada 160 rpm.

2. Ambil 1,5 ml overnight kultur ke dalam 2 tabung mikrosentrifuge dan sentrifugasi

pada 10.000 xg selama 2 menit. Buang supernatan dan balikkan tabung di atas kertas
tissue untuk mengeringkan pellet bakteri selama 4 menit

3. Resuspensi pellet dengan menambahkan 0. I ml (100 ul) buffer lisis dingin dan vortex
selama 2 menit. Inkubasi tabung selama 5 menit pada suhu kamar. Langkah ini akan
menghancurkan bakteri dengan osmosis hiperlitik sehingga melepaskan DNA dan iss
sel yang lain.

4. Tambahkan 0.2 ml (200 ul) campuran alkali yg dibuat recentier paratus dan
campurtah dengan jalan membolak-balik tabungnya. Jangan divortex! Inkubasi
tabung dalam es selama 5 menit Fungsi langkah kerja ini adalah mendenaturasi
plasmid dan DNA kromosom serta protein.

5. Tambahkan 0,15 ml (150 ul) cairan potassium asetat dingin. Campurkan dengan jalan
membolak-balik tabung selama 20 detik dan inkubasi dalam es selama 5 menit
Tujuannya adalah untuk secara selektif merenaturasi DNA plasmid. Beberapa DNA
kromosom mungkin akan renaturasi sebagian dan diikat oleh protein, yang mana akan
diekstraksi oleh fenol/klorofonn pada langkah selanjutnya.

6. Sentrifugasi pada 12.000 x g selama 5 menit dan pindahkan superatan perlahan-lahan

ke dalam tabung yang baru.

7. Tambahkan RNase (bebas DNase) ke dalam supernatan hingga konsentrasi akhirnya

20 ug/ml. Inkubasi tabung pada suhu 37 °C selama 20 menit. RNase A merusak RNA
total dalam sampel.

8. Tambahkan TE-fenol jenuh/klorofonn dalarn volume yg sama (dengan volume

supernatan dalam tabung) ke dalam masing-masing tabung dan campurkan dengan
jalan mem-vortex selama 1 menit.
9. Sentrifugasi pada 12.000 xg selama 4 menit dan pindahkan fase air bagian atas ke
dalam tabung baru.
10. Tambahkan kloroform dengan volume yang sama dengan volume cairan yg didapat
pada langkah 9. Campurkan dengan jalan memn-vortex selama 1 menit dan
sentrifugasi seperti pada langkah 9.
11. Sentrifugasi pada 12.000 x 9 selama 4 menit dan pindahkan supernatan ke dalam
tabung baru Langkah 8-11 akan membuang RNase, protein, dan DNA-protein
12. Tambahkan etanol 100% sebanyak 2-2.5 x volume dan Na Asetat sebanyak 1/10 x
volume. Campurkan dengan jalan mebolak-balikkan tabung dan biarkan DNA
plasmid mengendap selama 20 menit pada -80 °C atau selama 2 jam pada -20 °C
13. Sentrifugasi pada 12.000 xg selama 10 menit. Tuang supernatan perlahan-lahan, bilas
pellet dengan hati-hati menggunakan 1 ml etanol 70% dingin. Keringkan DNA
plasmid di bawah kondisi vacuum selama 20 menit.
14. Larutkan DNA plasmid kering ke dalam 25 ul buffer TE atau air deionisasi steril.
Ambil 2-4 ul untuk mengukur konsentrasinya dan simpan pada suhu -20 °C sampai
digunakan.
Pada praktikum ini yang digunakan adalah plasmid DNA, pengkode sifat
resistensi Ampicillin, yang dibawa oleh bakteri Eschericia colt.

III.

Salah satu cara analisis DNA adalah dengan menggunakan elektroforens gel
agarosa Elektroforesis gel agarosa adalah metode untuk memisahkan dan
memvisualisasikan fragmen DNA yang dihasilkan dari digesti terbatas DNA Fragmen
DNA dipisahkan berdasarkan mutan dan ukurannya, dengan melewatkan DNA melalui
matriks gel agarosa yang diletakkan pada medan elektrik Elektroforesis melalus gel
agarosa merupakan metode standar untuk pemisahan, identifikasi dan pemurnian fragmen
DNA
Agarosa adalah koloid laut yang dimurnikan dari ganggang. Ketika dipanaskan
dalam buffer agarosa akan melarut, kemudian ketika didinginkan akan membentuk
padatan berupa gel, sehingga dimungkinkan untuk mencetak dan membentuk lubang
sumuran pada gel
Gel agarosa dibuat dengan melelehkan agarosa dalam buffer, kemudian
dituangkan pada cetakan dan diamkan sampai dingin, Setelah mengeras, agarosa
membentuk matriks dengan kerapatan yang ditentukan oleh konsentrasi agarosa Jika
medan magnit diberikan antara kedua ujung gel, DNA yang bermuatan negatif pada pH
netral, bergerak ke anoda. Kecepatan migrasi ini ditentukan oleh ukuran (panjang) DNA,
konformasi DNA, konsentrasi agarosa dan besaran tegangan yang digunakan Molekul
DNA untai ganda linier, yang diletakkan pada salah satu ujung gel, bergerak melalui
matriks gel pada kecepatan yang berbanding terbalik terhadap log jumlah pasang basa.
Molekul yang lebih besar bergerak lebih lambat karena terjadi gesekan lebih besar saat
mereka harus melewati pori-pori gel, sehingga kurang efisien lajunya dari pada molekul
yang lebih kecil. DNA yang berbentuk sirkuler superkoil, sirkuler bernoktah dan linier
dari DNA berukuran sama akan migrasi melalui gel dengan kecepatan berbeda. Mobilitas
relatif dari ketiga bentuk itu terutarna tergantung banyak faktor. Pada umumnya bentuk
sirkuler superkoil migrasi lebib cepat daripada bentuk linier.