ENZIMAS Enzimas so um grupo de substncias orgnicas de natureza geralmente protica (existem tambm enzimas constitudos de RNA [1], os ribozimas),

com atividade intra ou extracelular que tm funes catalisadoras, catalisando reaes qumicas que, sem a sua presena, aconteceriam a uma velocidade demasiado baixa. Isso conseguido atravs do abaixamento da energia de ativao necessria para que se d uma reao qumica, resultando no aumento da velocidade da reao e possibilitando o metabolismo dos seres vivos. A capacidade cataltica dos enzimas torna-os adequados para aplicaes industriais, como na indstria farmacutica ou na alimentar. Em sistemas vivos, a maioria das reaes bioqumicas d-se em vias metablicas, que so seqncias de reaes em que o produto de uma reao utilizado como reagente na reao seguinte. Diferentes enzimas catalisam diferentes passos de vias metablicas, agindo de forma concertada de modo a no interromper o fluxo nessas vias. Cada enzima pode sofrer regulao da sua atividade, aumentando-a, diminuindoa ou mesmo interrompendo-a, de modo a modular o fluxo da via metablica em que se insere. Como so catalisadoras, as enzimas no so consumidas na reao e no alteram seu equilbrio qumico. A atividade enzimtica pode depender da presena de determinadas molculas, genericamente chamadas cofatores. A natureza qumica dos cofatores muito varivel, podendo ser, por exemplo, um ou mais ions metlicos (como o ferro), ou uma molcula orgnica (como a vitamina B12). Estes cofatores podem participar ou no diretamente na reao enzimtica. Determinadas substncias, podem inibir a atividade de algumas enzimas, diminuindo-a ou eliminando-a totalmente; so os chamados inibidores enzimticos. Uma enzima uma protena que catalisa ou acelera uma reao biolgica. Pode, portanto, ser definida como um biocatalizador cuja natureza protica determina a presena de certas propriedades, tais como: especificidade de substrato, dependncia da temperatura e dependncia do pH. Pelo fato de serem protenas com estrutura terciria ou quaternria, as enzimas so dotadas de dobramentos tridimensionais em suas ceias polipeptdicas, o que lhes confere uma forma caracterstica e exclusiva. Assim, diferentes enzimas tm diferentes formas e, portanto, diferentes papis biolgicos. Para que uma enzima atue, necessrio que os substratos "se encaixem" na enzima. Esse "encaixe", porm, depende da forma, isto , do "contorno" da enzima. Por isso, substratos que se "encaixam" em uma determinada enzima no se "encaixam" em outras diferentes, e a reao no ocorre; da a especificidade das enzimas quanto aos substratos em que atuam. Uma vez ocorrido o "encaixe", forma-se o complexo enzima-substrato, que se assemelha ao sistema "chave-fechadura". O local da enzima onde o substrato se "encaixa" denominado stio ativo (ou centro ativo). No caso de substncias que reagem entre si, sob a ao catalisadora das enzimas, a reao facilitada, tornandose mais rpida, pois a proximidade entre as molculas "encaixadas" acelera o processo

reativo; aps a reao, a enzima desliga-se do substrato e permanece intacta. A maioria dos enzimas so protenas, exceto o grupo de molculas de RNA que tem funo cataltica e podem ter um tamanho desde 64 resduos de aminocidos, como o caso do monmero da enzima 4-oxalocrotonato tautomerase,[9] at um tamanho de 2.500 resduos, como o caso da sntese de cidos graxos.[10] A atividade dos enzimas so determinadas pela sua estrutura quaternria.[11] A maioria das enzimas so maiores do que o substrato sobre o qual atuam, e s uma pequena poro da enzima (cerca de 3-4 aminocidos) est envolvida na catlise.[12] A regio que contm estes resduos catalticos, que liga-se ao substrato e que desempenha a reao, denominada de centro cataltico. As enzimas tambm podem ter stios onde se ligam cofatores, que so necessrios s reaes catalticas. Algumas enzimas tambm podem ter stios de ligaes para pequenas molculas, que so produtos ou substratos, diretos ou indiretos, da reao catalisada. Estas ligaes servem para aumentar ou diminuir a atividade da enzima, providenciando um meio de regulao por feedback. Tal como todas as protenas, os enzimas so formadas por longas cadeias lineares de aminocidos que sofrem um enovelamento que tem como resultado um produto com estrutura tridimensional. Cada seqncia nica de aminocidos produz tambm uma estrutura tridimensional nica que tem propriedades especficas. Cadeias individuais de protenas podem, por vezes, agrupar-se para formar um complexo protico. A maioria das enzimas pode sofrer desnaturao, isto , a sua estrutura pode sofrer desagregao e inativao pelo aumento de temperatura ou mudana de pH, o que provoca alteraes na conformao tridimensional da protena. Dependendo da enzima, a desnaturao pode ter efeitos reversveis ou irreversveis. Funcionamento de uma enzima Ao enzimtica: o composto que sofre ao de uma enzima chama-se substrato. A molcula da enzima possui um ou mais centros ativos, aos quais o substrato se combina para que seja exercida a ao enzimtica. A forma tridimensional da enzima importante para a sua atividade, pois os centros ativos so regies cuja conformao tridimensional complementar da molcula do substrato (mecanismo chavefechadura). As enzimas podem ser classificadas de acordo com a sua funo: Oxidorredutases: So enzimas que catalisam reaes de transferncia de eltrons, ou seja: reaes de oxi-reduo. So as desidrogenases e as Oxidases Transferases: Enzimas que catalisam reaes de transferncia de grupamentos funcionais como grupos amina, fosfato, acil, carboxil, etc. Como exemplos temos as Quinases e as Transaminases. Hidrolases : Catalisam reaes de hidrlise de ligao covalente. Ex: As peptidades. Liases: Catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico. As Dehidratases e as Descarboxilases so bons exemplos.

Isomerases: Catalisam reaes de interconverso entre ismeros pticos ou geomtricos. As Epimerases so exemplos. Ligases: Catalisam reaes de formao e novas molculas a partir da ligao entre duas j existentes, sempre s custas de energia (ATP). So as Sintetases. Agora vou tentar escrever uma equao a partir disso: -ao de uma enzima tipo ligase A+B+E + ATP --> AB+ ADP+ E A e B - o substrato E - a enzima ATP - a energia necessria AB - a molcula formada ADP - a "energia gasta" E - a enzima ENZIMAS
Prof. Dr. Luiz Antonio Gallo Colaboradores: Giuliana Castro Magalhes Paulo F. Mendes Filho

I - CONCEITO As enzimas so protenas especializadas em catalisar reaes biolgicas, ou seja aumentam a velocidade de uma reao qumica sem interferir no processo. Elas esto associadas a biomolculas, devido as suas extraordinria especificidade e poder cataltico. I- a. Histria O nome enzima provm de "in yeasts", no qual suspeitava-se que as catlises biolgicas estavam envolvidas com a fermentao do acar em lcool. A primeira descoberta foi feita por Payen e Persoz em 1833, quando encontraram uma substncia termolbil no precipitado do lcool, extrato de malte, que convertia amido em acar, mais tarde denominada amilase. A primeira teoria foi publicada em 1835 por Berzelius. Pasteur em 1860 postulou que as enzimas esto associadas estrutura e a vida da clula. Em 1877 Buchener obteve sucesso na extrao de enzimas de clulas de leveduras que catalisavam a fermentao alcolica. Isto demonstrou que estas enzimas catalisavam a maioria das vias metablicas energticas e podem funcionar independentemente da sua estrutura. A enzima foi primeiramente isolada na forma cristalina, mas isto foi compreendido melhor quando Summer em 1926 isolou urease de feijo e evidenciou que estes cristais consistem em protenas. Hoje 2000 diferentes enzimas so conhecidas, nas quais muitas so isoladas na forma pura homogeneizada e 200 na forma cristalizada.

II- NATUREZA E ESTRUTURA ENZIMTICA Todas as enzimas so protenas, mas nem todas as protenas so enzimas. As protenas, como um todo, ocupam um papel de destaque na dinmica e estruturao dos organismos vivos. As enzimas, parte deste grupo de protenas, funcionam como catalisadores, permitindo que uma reao qumica venha a ocorrer dentro dos limites das temperaturas biolgicas. Para um perfeito entendimento sobre a estrutura de uma enzima e como esta funciona, devemos consider-la tanto como uma protena quanto um catalisador biolgico. Como uma protena a enzima apresenta blocos de construo denominados aminocidos. Algumas protenas, tais como ribonucleases, quimiotripsina e tripsina, so constitudas apenas de aminocidos. Outras protenas, alm dos aminocidos, contm componentes orgnicos e inorgnicos e so denominadas de protenas conjugadas. A peroxidase e a catalase so exemplos de enzimas com estrutura conjugada e que apresentam porfirina frrica como cofator. As ligaes peptdicas que ligam cadeias lineares de aminocidos caracterizam a estrutura primria das protenas. Considerando-se apenas a estrutura primria de uma protena, a molcula deveria ser muito extensa e muito fina. Porm, muitas enzimas apresentam uma forma globosa em vez da fina fita linear, evidenciando estruturaes de ordem superior, conhecidas como estrutura secundria, terciria e quaternria, que ocorrem em funo de interaes intrnsecas entre os blocos constituintes da molcula. A estrutura secundria de uma protena caracterizada pela formao de alfa hlices e folhas beta, conformaes resultantes das interaes acima mencionadas. Somente esta estrutura adicional explica como uma molcula de protena possa ser to compacta. Quando as quatro pontes de dissulfeto que estabilizam a estrutura de uma ribonuclease so reduzidas em uma soluo de uria, a cadeia polipeptdica assume uma conformao espiralada randmica e perde toda a sua atividade enzimtica. Removendo-se a uria e o agente redutor e deixando-se as pontes de dissulfeto restabelecerem-se, mais de 90% da atividade enzimtica volta a ocorrer e as propriedades da molcula retornam quelas do estado original. Na estrutura terciria, a protena est enrolada de uma maneira complexa e irregular, formando um prisma compacto, triangular e s vezes achatado. Nesta conformao os grupos heme e quase todos os resduos de aminocidos polares esto na superfcie enquanto que quase todos os resduos de aminocidos no polares esto orientados para o interior da molcula. Consequentemente, os resduos hidroflicos esto expostos ao solvente, gua, enquanto os resduos hidrofbicos so removidos da gua o quanto possvel. Um nmero grande de diferentes ligaes est envolvido na estabilizao desta conformao terciria. Estas incluem ligaes eletrostticas, pontes de hidrognio, pontes hidrofbicas, pontes dipolares e pontes de dissulfeto. Muitas enzimas so compostas de uma cadeia polipeptdica simples. Este caso de enzimas como a ribonuclease, lisosima, tripsina, pepsina e algumas alfas amilases. Ao contrrio, existe um grande nmero de enzimas que so compostas por mais de uma cadeia peptdica. A enzima lactato-desidrogenase composta por quatro cadeias polipeptdicas. A repetio das cadeias polipeptdicas na construo de uma macromolcula de protena caracteriza a estruturao quaternria que esta pode assumir. III- NOMENCLATURA E CLASSIFICAO DAS ENZIMAS: A nomenclatura das enzimas tem sido utilizada de vrias maneiras. A mais utilizada

feita pela adio do sufixo ase ao nome do substrato (chamada de Nome Recomendado), ou seja, a molcula na qual a enzima exerce sua ao cataltica. Neste caso, a enzima urease catalisa a hidrlise da uria em amnia e CO2, a arginase catalisa a hidrlise da arginina em ornitina e uria, e a fosfatase catalisa a hidrlise de steres de fosfato. Entretanto, esta nomenclatura simples no tem se mostrado prtica uma vez que muitas enzimas recebem denominaes que, do ponto de vista qumico, so muito pouco informativos. Por esta razo, e tambm devido descoberta de novas enzimas, foi proposta uma classificao sistemtica recomendada por uma comisso internacional de especialistas no estudo de tais macromolculas. O novo sistema de classificao divide as enzimas em seis Classes principais, nas quais esto inclusas subclasses de acordo com o tipo de reao catalisada. De acordo com esta sistemtica, cada enzima designada por um Nome Recomendado, usualmente pequeno e apropriado para o uso dirio, um Nome Sistemtico, o qual identifica a reao catalisada, e um Nmero de Classificao, o qual usado quando uma identificao precisa necessria. Como exemplo do novo sistema de classificao, considere a reao abaixo catalisada por uma enzima: ATP + creatina ADP + fosfocreatina. O Nome Recomendado para esta enzima, que o normalmente usado, creatininaquinase e o Nome Sistemtico, baseado na reao catalisada, ATP:creatina fosfotransferase. Seu nmero de classificao EC 2.7.3.2, onde EC representa Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology IUBMB, o primeiro dgito, 2, a Classe (transferase), o segundo dgito, 7, a Subclasse (fosfotransferase), o terceiro dgito, 3, a Sub-subclasse em que a fosfotransferase apresenta um grupo nitrogenado como aceptor, e o quarto dgito, 2, designa uma creatina quinase. O quadro abaixo relaciona os cdigos utilizados para a aplicao do nmero de identificao das enzimas. Classificao das Enzimas Segundo a Comisso de Enzimas 1. Oxido-redutases (reaes de oxidao-reduo ou transferncia de eltrons Desidrogenases e Oxidases) 1.1.atuando em CH-OH 1.2.atuando em C=O 1.3.atuando em C=O1.4.atuando em CH-NH2 1.5.atuando em CH-NH1.6.atuando em NADH, NADPH 2.Transferases (transferem grupos funcionais como amina, fosfato, acil, carboxil Quinases e Transaminases) 2.1.grupos com um carbono 2.2.grupos aldedo ou cetona 2.3.grupos acil 2.4.grupos glicosil 2.7.grupos fosfatos 2.8.grupos contendo enxfre 3.Hidrolases (reaes de hidrlise de ligao covalente - Peptidases) 3.1.steres 3.2.ligaes glicosdicas

3.4.ligaes peptdicas 3.5.outras ligaes C-N 3.6.anidridos cidos 4.Liases (catalisam a quebra de ligaes covalentes e a remoo de molculas de gua, amnia e gs carbnico Dehidratases e Descarboxilases) 4.1. =C=C= 4.2. =C=O 4.3. =C=N5.Isomerases (reaes de interconverso entre ismeros ticos ou geomtricos Epimerases) 5.1.racemases 6.Ligases (catalisam reaes de formao de novas molculas a partir da ligao entre duas pr-existentes, sempre s custas de energia - Sintetases) 6.1. C-O 6.2. C-S 6.3. C-N 6.4. C-C IV- CINTICA DA CATLISE ENZIMTICA A cintica enzimtica a parte da Enzimologia que estuda a velocidade das reaes enzimticas bem como os fatores que a influenciam. Os princpios gerais da cintica das reaes qumicas aplicam-se s reaes catalisadas enzimaticamente, embora estas tambm mostrem um padro distinto que no usualmente encontrado nas reaes no enzimticas: saturao com o substrato. Em concentraes de substrato muito baixas, a velocidade inicial de reao v0 quase proporcional concentrao da concentrao do substrato e a reao de primeira ordem em relao ao substrato. Entretanto, a proporo que a concentrao do substrato aumenta, a taxa inicial passa a crescer menos, significando que no mais proporcional concentrao do substrato. Nessa zona, as ordens das reaes esto misturadas. Com o posterior aumento na concentrao do substrato, a taxa de reao torna-se essencialmente independente da concentrao do substrato e aproxima-se assintoticamente a uma taxa constante. Nesses valores de concentraes de substrato a reao de ordem zero em relao ao substrato e a enzima tida como estando saturada com o substrato. Todas as enzimas apresentam o efeito da saturao, porm variando consideravelmente no que diz respeito concentrao requerida para produzi-lo. Esse efeito de saturao levou alguns pesquisadores a estabelecerem a hiptese de que enzima e substrato reagem reversvelmente para formar um complexo, passo essencial na catlise de uma reao. Em 1913 a teoria da ao e cintica enzimtica foi desenvolvida por dois cientistas chamados L. Michaelis e M. L. Menten, na qual uma reao enzimtica pode ser expressa pela seguinte equao, considerando-se apenas um substrato: Enzima + Substrato [EnzimaSsubstrato] Enzima + Produto As molculas do substrato passam por uma srie de formas geomtrica e eletricamente alteradas antes de formarem produtos da reao e a energia livre destes intermedirios, especialmente aquelas que se encontram em estados de transio mais instveis, so os mais determinantes da taxa de reao. As enzimas tm muito maior

afinidade por estes estados de transio do substrato do que tm por formas mais estveis. Como esta interao abaixa a energia destes estados de transio crticos, as enzimas podem acelerar uma determinada reao. A partir do modelo de reao proposto por estes pesquisadores, desenvolveu-se uma equao que nos permite demonstrar como a velocidade de uma reao varia em funo da concentrao do substrato. Esta equao relaciona a velocidade (V0), a velocidade mxima (Vmax) e a concentrao inicial de substrato com a constante de Michaelis-Menten (Km). O Km de um substrato a concentrao do substrato na qual a velocidade inicial de reao equivale metade da velocidade mxima. Para reaes que envolvem um substrato expressa em moles por litro e independente da concentrao da enzima. A constante de Michaelis-Menten de uma enzima , uma caracterstica muito importante e fundamental, no apenas matematicamente na determinao da velocidade da reao catalisada como tambm na avaliao da atividade e na purificao das enzimas nos tecidos. V- MECANISMO DA AO ENZIMTICA - a. Enzima como catalisador O princpio de catalisador diminuir a energia de ativao. A enzima se liga a uma molcula de substrato em uma regio especfica denominada stio de ligao. Esta regio um encaixe que apresenta um lado envolvido por cadeias de aminocidos que ajudam a ligar o substrato, e o outro lado desta cadeia age na catlise. Em 1894 Emil Fischer props o modelo chave fechadura para explicar a ao enzimtica. A enzima se encaixa com o substrato especfico no stio ativo, como uma chave e fechadura. Tanto a enzima quanto o substrato sofrem conformao para o encaixe. A enzima no aceita simplesmente o substrato, o substrato distorcido para conformao exata do estado de transio, denominado encaixe por induo, proposto por Koshland (1958). A enzima tambm encontra o lado especfico da cadeia posicionando no lugar exato da ligao no processo cataltico, muitas vezes o lado da cadeia pode ser bsico ou cido promovendo a adio ou remoo de prtons. Em outras circunstncias a enzima se agrupa a um on metlico na posio correta para a ocorrncia da catlise. Ao completar a reao cataltica a enzima libera o produto e retorna a forma original. O processo ocorre em duas etapas: (1) S + E ES* (etapa reversvel) (2) ES E + P (etapa irreversvel) * complexo enzima-substrato V- b. Inibio Enzimtica Muitos tipos de molculas inibem as enzimas e podem agir de vrias formas. A principal distino entre inibio reversvel e inibio irreversvel. A forma que envolve ligaes no-covalentes reversvel, atravs da remoo do inibidor. Em alguns casos as ligaes no-covalentes podem ser irreversveis sob diferentes condies fisiolgicas. J a inibio irreversvel, a ligao molecular covalente. So geralmente encontrados em reaes que apresentam toxinas especficas. V- b.1. Inibio Reversvel

Existem vrios modos que esto envolvidos com ligao no covalente, eles diferenciam quanto ao mecanismo pelo qual diminuem a atividade enzimtica e como eles afetam na cintica da reao. V- b.1.1. Inibio Reversvel Competitiva Uma molcula apresenta estrutura semelhante ao substrato da enzima que se liga para realizar a catlise, ela poder aceitar esta molcula no seu local de ligao, mas no pode levar ao processo cataltico, pois ocupando o stio ativo do substrato correto. Portanto o inibidor compete pelo mesmo local do substrato. O efeito da reao modifica o Km, mas no altera a velocidade. V- b.1.2. Inibidor Reversvel no Competitivo Ocorre quando um molcula ou on pode se ligar em um segundo local na superfcie enzimtica (no no stio ativo). Isto pode distorcer a enzima tornando o processo cataltico ineficiente. O inibidor no competitivo pode ser uma molcula que no se assemelha com o substrato, mas apresenta uma grande afinidade com a enzima. o mecanismo inverso do inibidor competitivo, porque inibe a ligao do complexo ES e no da enzima livre. O efeito da reao modifica a velocidade e o Km permanece constante. V- c. Inibio Irreversvel Algumas substncias se ligam covalentemente s enzimas deixando-as inativas. Na maioria dos casos a substncia reage com o grupo funcional no stio ativo bloqueando o local do substrato, deixando a enzima catalticamente inativa. Inibidores irreversveis podem ser extremamente seletivos pois so semelhantes ao substrato. So muito utilizados como resduos, os quais apresentam grupos de tomos que se configuram semelhantemente ao estado de transio que se ligam ao substrato. V- d. Cofatores Para alguns tipos de processos biolgicos, apenas a cadeia protica no suficiente, por isso a protena requer uma molcula denominada cofator a qual pode ser uma pequena molcula orgnica, denominada coenzima ou um on metlico. Os cofatores so geralmente estveis em temperatura alta. A catlise ativa enzimacofator denominada holoenzima, quando o cofator removido, se mantm a protena, a qual catabolicamente inativa e denominada apoenzima. Coenzimas A molcula orgnica que se liga s enzimas para ativar uma reao, denominada coenzima, cada tipo apresenta uma funo qumica particular, algumas so agentes oxi-redutoras, outras transferidoras etc. Como exemplo explanatrio, consideramos a coenzima dinucleotdeo nicotinamida de adenina (NAD+). Esta molcula contm duas principais partes: a poro difostato adenosina, ligando uma ribose a uma nicotinamida. A outra poro a parte final da molcula do NAD onde o anel de nicotinamida ser imediatamente reduzido e ainda servir como agente oxidante. Uma reao tpica que o NAD participa na converso do lcool em aldedos e cetonas, o qual age como agente oxidante. Algumas vezes difcil distinguir uma verdadeira coenzima de um segundo substrato. Durante uma catlise, uma coenzima tem a capacidade de, atravs de oxi-redues, ser reutilizada por outra enzima, voltando novamente a ciclo metablico. Por exemplo o NAD aps a oxidao do substrato, passa a NADH, ativa a reao, deixa a enzima e

novamente ser oxidada por um sistema de aceptor de eltrons, voltando a ser NAD e assim podendo se ligar a outra enzima. J um segundo substrato nunca deixa a enzima, ele reduzido e oxidado no ciclo metablico. Muitas coenzimas so fortemente relacionadas com vitaminas. As vitaminas so molculas orgnicas essenciais para o processo biolgico em organismos superiores e no podem ser sintetizados por eles mesmos. Portanto estas coenzimas so essenciais aos processos metablicos vitais dos organismos superiores. Outra estrutura que apresenta a mesma funo de coenzima, so as metaloenzimas. So enzimas que tm ons metlicos ligados covalentemente nas cadeias de aminocidos ou em grupos prostticos como o grupo heme. Os metais que se ligam as enzimas agem como metais catalticos em reaes hidrolticas e outros com agentes redutores. VI- TCNICAS EMPREGADAS NO ESTUDO DAS ENZIMAS VI- 1) Anlise de Velocidade de reao cataltica Existem duas formas essenciais para o estudo da cintica de uma enzima. Primeiramente deve ser feito medies sob condies na qual mantenha o estado de equilbrio, depois observar a aplicabilidade da equao de Michaelis-Menten, e determinar a velocidade de reao pela concentrao do substrato e da enzima. 2 ) Anlise do Equilbrio de Reao O equilbrio de uma reao enzimtica estabelecido em segundos ou poucos minutos . Vejamos algumas tcnicas de avaliao: Espectrofotometria um mtodo simples e apurado. medido pela absoro de luz na regio espectral do substrato ou produto formado na reao. Fluorescncia similar a metodologia de espectrofotometria. O substrato ou o produto deve emitir fluorescncia neste espectro. A tcnica vantajosa por ser altamente sensvel, a soluo a ser empregada deve estar extremamente diluda. Titulao automtica utilizada quando a reao produz ou consome cido ou base. Titula-se na soluo cido ou base para que o pH continue constante. A quantidade de cido ou base consumido o valor da reao cataltica enzimtica. Anlise Radioativa avaliado quando o substrato marcado com istopo radioativo, o qual ser perdido ou transferido durante a reao a ser estudada. um mtodo extremamente sensvel para anlise cintica enzimtica. 3) Anlises de reaes com alta velocidade a) "Stopped Flow" A enzima e o substrato so inicialmente separados em seringas, que rapidamente libera seu contedo at uma cmara misturadora e em seguida passa para a seringa que pra a reao. Neste instante um detector mede a absorbncia de luz ou fluorimetria.

b) "Temperature Jump" O processo ocorre quando a mistura de reao, que est em equilbrio numa Temperatura 1, rapidamente passada uma temperatura 2 . O ponto de equilbrio mudar e a reao deve ocorrer para que a reao alcance um novo equilbrio. A mudana rpida de temperatura obtida por uma exploso de corrente eltrica nos eletrodos imergidos na mistura de reao. O tempo de relaxamento entre a mudana de temperatura medido por absorbncia ou fluorescncia. 4) Anlise quantitativa da atividade enzimtica Para obteno de uma anlise quantitativa necessrio saber: - Toda estequiometria de uma reao cataltica - Se a enzima requer adio de cofatores como um on ou coenzima - A dependncia da enzima sob a concentrao do cofator ou substrato. O pH timo - A temperatura pela qual a enzima est estvel e apresenta alta atividade. - O procedimento para determinao do aparecimento e desaparecimento do substrato de um produto de reao. A anlise quantitativa confirmada quando o substrato ou o produto colorido ou absorvido em luz ultravioleta. O valor de aparecimento ou desaparecimento do produto ou substrato absorvido por luz pode ser analisado pelo espectrofotmetro. Alm do produto ou substrato pode - se analisar o intermedirio (aquele que serve como ponte para o desencadeamento de outra reao). a) Purificao enzimtica As enzimas so encontradas na natureza em misturas complexas, geralmente as clulas apresentam centenas ou mais diferentes enzimas, para um estudo aprofundado deve-se purificar a enzima a ser estudada. Em alguns casos possvel atravs da aplicao de mtodos especficos utilizar enzimas nos estado impuro, mas na maioria dos casos, a presena de outras enzimas interfere nos substratos desviando as reaes especficas. b) Mtodos de purificao 1) Teste primeiramente faz-se uma anlise quantitativa da atividade da enzima a ser estudada. A enzima deve ser isolada utilizando - se o teste de atividade em diferentes fraes, sendo mais importante que a exatido do mtodo. 2) Procedimento Geral definio da unidade enzimtica, concentrao e atividade especfica. 3) Origem enzimtica determinao do local (tecido) de maior quantidade, geralmente a rpida centrifugao adquire enzimas mitocondrial. 4) Extrao necessrio ter a enzima em soluo e, portanto, a ruptura de membranas. Deve se utilizar um tampo, pois ao romper o tecido pode ocorrer liberao de substncias cidas que degradam a enzima. Os mtodos utilizados so o mecnico com partculas de areia, nitrognio lquido, "shaker" em alta velocidade , ondas de ultrassom e solventes como acetona. c) Unidade de atividade enzimtica definida pela quantidade que causa transformao de 1 mmol de substrato por minuto a 25C sob condies timas. A atividade especfica o nmero de unidade de enzimas por miligrama de protena, mede a pureza da enzima.

A atividade molar ou molecular ou nmero de "turnover", o nmero de molculas do substrato transformado por uma nica molcula de enzima ou nico stio de ligao em um minuto, quando a enzima est no valor de limite. A atividade molar pode ser calculada pela velocidade mxima. A nova unidade internacional da atividade enzimtica determinada pela "Comisso da Enzima" o "katal", o qual definido como a transformao do substrato em 1 mol por segundo. Mtodos de Fracionamento O extrato de enzimas apresenta inmeras substncias com diferentes pesos moleculares e de acordo com seu interesse de estudo utilizam-se diferentes mtodos: 1) Precipitao por diferena de pH 2) Desnaturao por aquecimento 3) Precipitao com solventes orgnicos (etanol, acetona) 4) Precipitao por sais (sulfato de amnia) 5) Adsoro 6) Cromatografia - o mecanismo de separao depende da adsoro, troca inica, afinidade especfica para imobilizar ligantes especficos ou efeitos de peneiramento molecular. 7) Eletroforese - a mobilidade das protenas causada por campo eltrico 8) Cristalizao 9) Concentrao reduo de volume atravs de evaporao do solvente ou congelamento.