ANALTICA:
1. Extrair 3L da amostra de DNA. 2. Homogeinizar com 1L de tampo de corrida 5X (Loading Buffer). 3. Aplicar as amostras nos poos. 4. Reservar 2 poos para utilizao de um padro de corrida (Ladder-1Kb). 5. Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (mdia utilizada 80V). 6. Analisar o gel sob radiao ultravioleta (Alpha Imager). 7. Tirar foto dos resultados obtidos.
PREPARATIVA:
Adicionar tampo de corrida ao material a ser purificado (diluio de 5X). Aplicar as amostras nos poos, pulando um poo entre cada amostra para evitar contaminao. Para volumes maiores, montar o gel com o pente de dentes largos ou unir os dentes do pente com fita adesiva antes de colocar o pente no gel ainda lquido (morno). Aplicar em outro poo o padro de tamanho molecular (Ladder-1kb). Ajustar a voltagem de acordo com o tempo de corrida desejado (mdia utilizada 80V). Vizualizar as bandas no gel utilizando a luz ultravioleta manual no comprimento de onda longo. Cortar a banda desejada utilizando bisturi limpo e coloc-la em um tubo de microcentrfuga previamente pesado. Seguir protocolo de Purificao de DNA a partir de Gel.
A30.2 SOLUES:
Tampo de corrida: soluo TAE 1X ( Tampo Tris-Acetate - Tris 40mM, Ac. Acetico 20mM, EDTA 1mM) diluir a soluo estoque 50x em gua Milli-Q TAE 50X (Soluo estoque) Trizma-Base cido actico glacial EDTA 0.5M pH 8.0 gua q.s.p. Tampo de amostra 5X ( Loading Buffer ) Glicerol (50%) Azul de Bromofenol (0.125%) Xileno Cianol (0.125%) TE pH8,0 q.s.p. Padro de tamanho molecular ( Ladder-1kb) Ladder 1kb (Gibco BRL - 1g/L) Tampo (Tris 10mM pH7,5, NaCl 50mM, EDTA 0,1mM) Loading Buffer 5X (0,1g/L) 100L 500L 400L p/ 50mL 25,0mL 0,0625g 0,0625g 50,0mL
Brometo de etdeo (10mg/mL) Brometo de etdeo 1g gua Milli-Q q.s.p. 100mL o Agitar durante 16 horas, guardar a 4 C. obs.: concentrao no gel: 5g/mL