LAPORAN PRAKTIKUM

KULTUR JARINGAN TANAMAN

ACARA PRAKTIKUM KE: 5

PEMBUATAN MEDIUM UNTUK KULTUR KALUS

Nama : Eva Sundari Febriana

NIM : 24020220120003
Kelompok : 6 (Enam)
Asisten : Rina Sari Asih

LABORATORIUM BIOTEKNOLOGI

PS BIOTEKNOLOGI-DEPARTEMEN BIOLOGI

FAKULTAS SAINS DAN MATEMATIKA

UNIVERSITAS DIPONEGORO

2022
 ACARA PRAKTIKUM KE: 5
PEMBUATAN MEDIUM UNTUK KULTUR KALUS

I. KOMPETENSI
Mahasiswa dapat membuat medium untuk kultur kalus.

II. TUJUAN
Mempelajari cara pembuatan medium untuk kultur kalus.
III. TINJAUAN PUSTAKA
3.1 Pengertian medium kultur
Media kultur jaringan tumbuhan berisi garam-garam mineral, hormon, vitamin,
sumber karbon, dan asam amino. Komponen penyusun media kultur kalus yang
berperan pada penginduksian kalus dari eksplan yang digunakan adalah penambahan
zat pengatur tumbuh ke dalam media. Pemilihan media kultur jaringan merupakan
kunci sukses dalam kultur jaringan. Hal ini menyebabkan banyak diadakan penelitian
untuk memodifikasi media-media yang memberikan respon berbeda terhadap
berbagai macam tanaman. Ada tiga jenis zat pengatur tumbuh yang dibutuhkan untuk
menginduksi pembelahan sel yaitu kelompok auksin yang meliputi IAA, IBA, NAA
dan 2,4-D; kelompok sitokinin dan adenin, meliputi BA, BAP, DMAA, Ad-SO4 dan
kinetin serta kelompok giberelin, yaitu GA3. Pembentukan kalus dapat diinduksi
dengan cara mengatur pemberian zat pengatur tumbuh dengan jenis dan konsentrasi
yang tepat (Shofiyani dan Purnawato, 2017).
Kebutuhan nutrisi untuk pertumbuhan bahan tanam/ eksplan yang optimal sangat
bervariasi antar jenis tanaman, bahkan di antara bagian tanaman yang berbeda. Ada
dua penggolongan media tumbuh yakni media padat dan media cair. Media padat
pada umumnya berupa padatan gel seperti agar. Media cair adalah nutrisi yang
dilarutkan di air (Mahmoud, 2013). Keberhasilan kultur jaringan tanaman dalam
perbanyakan mikro tanaman kentang tergantung pada media yang digunakan. Media
Murashige dan Skoog (MS) merupakan media yang sangat luas pemakaiannya karena
kelebihan dari medium MS ini memiliki kandungan nitrat, kalium, dan amonium
yang tinggi yang dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman (Setiawati dkk, 2018). edia
Kultur jaringan adalah media tanam yang terdiri dari berbagai komposisi dan macam
unsur hara. Media tanam pada kultur jaringan berisi kombinasi dari asam amino
essensial, garam-garam anorganik, vitamin-vitamin, larutan buffer, dan sumber energi
(glukosa). Media kultur jaringan merupakan salah satu faktor penentu keberhasilan
dalam perbanyakan tanaman secara in vitro, sebab media merupakan faktor penting
penentu keberhasilan in vitro. Media dengan jumlah zat seperti yang ditentukan,
diperlukan penimbangan dan penakaran bahan secara tepat. Ketidaktepatan ukuran
dapat menyebabkan terjadinya proses yang tidak dikehendaki.
3.2 Kultur kalus
Kultur kalus salah merupakan satu teknik yang digunakan untuk menghasilkan
bibit tanaman bebas penyakit. Pembentukan kalus dapat dipacu dengan penambahan
zpt dari golongan auksin seperti 2.4.D dan penambahan karbohidrat seperti sukrosa
(Fauziah dkk, 2012). Kultur kalus merupakan salah satu teknik kultur in vitro yang
banyak digunakan untuk menghasilkan bibit tanaman bebas penyakit. Terdapat
banyak keuntungan dalam penggunaan kultur kalus, diantaranya dapat diproduksi
dalam jumlah banyak dengan kondisi lingkungan yang terkontrol, tidak memerlukan
lahan yang luas, dan dapat menghasilkan metabolit yang lebih tinggi dari tanaman
aslinya. Kalus adalah kumpulan masa sel yang belum terorganisasi (amorphous) yang
terjadi dari sel-sel jaringan yang membelah diri secara terus menerus. Secara in vitro,
kalus dapat terbentuk pada bekas-bekas luka irisan karena sebagian sel pada
permukaan irisan tersebut akan mengalami proliferasi (Hendaryono dan Wijayani,
1994). Adapun tipe-tipe kalus yaitu: kalus embriogenik, kalus proliferatif, dan kalus
sense (Fauziyyah, 2012).
Kelebihan penggunaan kultur jaringan dengan menggunakan kalus adalah pada
kultur kalus penampakan morfologi lebih mudah diamati, terutama warna sehingga
penggunaan kultur dengan kalus sesuai dalam memproduksi zat warna atau pigmen
yang berasal dari tanaman. Kultur kalus juga digunakan untuk menginisiasi kultur
suspensi sel pada media cair. Terdapat tiga tahapan dalam kultur kalus, yaitu tahapan
induksi, proliferasi, dan diferensiasi (Purwaningrum, 2015). Embriogenesis somatik
yang terjadi secara tidak langsung diawali dengan pembentukan kalus dan embrioid
dapat dihasilkan melalui kultur kalus maupun suspensi sel. Kalus embriogenik dapat
dihasilkan. dari perlakuan 2,4-D dan atau dikombinasikan dengan zat pengatur
tumbuh lain (Yelnititis, 2012).

3.3 Komposisi medium kultur kalus

Keberhasilan kultur jaringan tanaman dalam perbanyakan tanaman mikro
tanaman kentang tergantung pada media yang digunakan. Media Murashige dan
Skoog (MS) merupakan media yang sangat luas pemakaiannya karena kelebihan dari
medium MS ini memiliki kandungan nitrat, kalium, dan amonium yang tinggi yang
dibutuhkan untuk pertumbuhan tanaman. Meskipun demikian, kandungan garam yang
tinggi dalam media tidak selalu optimal untuk pertumbuhan dan perkembangan
eksplan dan plantlet in vitro. Pada tanaman Mentha spicata penggunaan media ½ MS
menghasilkan pertumbuhan tunas lebih baik. Pengurangan komposisi media MS pada
tanaman blueberry menunjukkan peningkatan pembentukan tunas dan akar
(Tetsumura et al., 2008). Media ½ MS dengan penambahan ekstrak kentang dan air
kelapa merupakan media yang terbaik untuk induksi akar eksplan tanaman kentang.
Media MS penuh dan ¼ MS masih cukup baik untuk menumbuhkan eksplan tanaman
kentang dilihat dari tinggi tanaman, jumlah akar dan jumlah tunas.
 Kandungan media secara umum terdiri dari empat komponen pokok yaitu
mineral, gula, vitamin, dan zat pengatur tumbuh. Bahan tambahan biasanya adalah
pemadat berupa agar-agar jika kita membuat media padat. Sementara jika tidak, maka
tidak perlu ditambahkan agar-agar (Heriansyah dkk, 2020). Komposisi media kultur
sangat berpengaruh terhadap proses pertumbuhan dan perkembangan eksplan yang
ditanam secara in vitro. Media dasar menyediakan unsur hara makro, mikro, dan
vitamin yang sangat diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan jaringan
eksplan. Pada proses induksi embriogenesis somatik secara in vitro, peran media
adalah menyediakan nutrisi bagi proses pembentukan kalus serta pembentukan dan
perkembangan embrio somatik. Pada proses ini nutrisi hanya disuplai dari media
karena tidak ada koneksi dengan jaringan induk seperti pada pertumbuhan dan
perkembangan embrio zigotik (Ajijah, 2017).
IV. METODE
4.1 Alat
4.1.1 Alat tulis
4.1.2 Aluminium foil
4.1.3 Botol kultur
4.1.4 Erlenmeyer
4.1.5 Gelas ukur
4.1.6 Hot plate-magnetic stirrer
4.1.7 Kertas timbang
4.1.8 Laptop/handphone
4.1.9 Mikropipet
4.1.10 Ph meter
4.1.11 Timbangan analitik
4.1.12 Tissue

4.2 Bahan
4.2.1 Agar Bakteri
4.2.2 Aquades
4.2.3 HCl
4.2.4 Larutan stok NAA
4.2.5 Larutan stok TDZ
4.2.6 NaOH
4.2.7 Sukrosa

4.3 Cara Kerja

4.3.1 Akuades sebanyak 250 mL dimasukkan ke dalam magnetic stirrer
kemudian ditambahkan 50 mL stok dan diaduk
4.3.2 Sukrosa sebanyak 15 gram dimasukkan ke dalam 50 mL akuades dan
diaduk
4.3.3 NAA 20 mL 1 ppm (15 tetes) dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang
berisi 25 mL akuades dan diaduk
4.3.4 TDZ 15 mL 3 ppm (15 tetes) dimasukkan kedalam Erlenmeyer yang berisi
30 ml akuades dan diaduk
4.3.5 pH larutan diukur dengan penambahan konsentrasi NaOH/HCl yang
disesuaikan
4.3.6 pH larutan yang sudah sesuai ditambahkan dengan agar bakteri sebanyak
7,5 gr
4.3.7 akuades ditambahkan hingga mencapai volume 500 ml, kemudian
dipanaskan hingga mendidih diatas hot plate
4.3.8 Hot plate dimatikan dan media kultur dipindahkan ke dalam botol kultur
steril yang telah disiapkan.
V. HASIL PENGAMATAN

No Media Keterangan
.
1. Larutan stok NAA 1000 ppm akan dibuat
untuk media MS 500mL dengan konsentrasi
NAA 1 ppm. Berapa mL NAA yang
dibutuhkan?
Jawab:
Stok NAA 1000 ppm
• 1000 ppm = 1000mg/L = 1000mg/1000 mL
• 100 mg NAA + 3 sampai 5 tetes NaOH,
dilarutkan dalam 100mL akuades steril,
Gambar 1. Media murashige kemudian stirrer tanpa pemanas.
and skoog • Stok NAA 1000 ppm
Pembuatan media 500 mL yang mengandung 1
ppm NAA
Rumus: V1M1 = V2M2
V1.1000 ppm = 500 mL.1 ppm
V1 = 500/1000 = 0,5 mL
Jadi larutan NAA yang dibutuhkan pada media
500mL dengan konsentrasi NAA 1 pmm adalah
0,5 mL.
2.
Larutan stok TDZ 100 ppm akan dibuat pada
media 500mL dengan konsentrasi TDZ 2 ppm.
Berapa mL TDZ yang dibutuhkan?
Jawab:
Pembuatan media 500 mL dengan konsentrasi
TDZ 2ppm
Rumus: V1M1 = V2M2
V1.100 ppm = 500 mL.2 ppm
V1 = 1000/100 = 10 mL
Jadi larutan TDZ yang dibutuhkan pada media
Gambar 2. Kultur Jaringan pada 500mL dengan konsentrasi TDZ 2 ppm adalah 10
Medium MS mL.
VI. PEMBAHASAN
Praktikum Kultur Jaringan Tanaman Acara ke V yang berjudul “Pembuatan Medium
untuk Kultur Kalus” memiliki tujuan untuk mempelajari cara pembuatan medium untuk
kultur kalus. Praktikum ini dilaksanakan secara daring menggunakan aplikasi Microsoft
Teams. Tujuan dari praktikum ini yaitu untuk mempelajari cara pembuatan medium untuk
kultur kalus. Alat dan bahan yang digunakan dalam praktikum ini adalah laptop,
handphone, neraca analitik, mikropipet, gelas ukur, botol kultur, Erlenmeyer, alluminium
foil, kertas timbang, tissue, pH meter, hotplate/magnetic stirrer, Stok NAA, Stok TDZ,
HCl, NaOH, sukrosa, agar bakteri dan aquades.
Media kultur jaringan adalah campuran bahan-bahan yang dibuat sebagai sumber
nutrisi yang dapat memenuhi kebutuhan dari sel atau jaringan tanaman yang ditumbuhkan
secara in vitro hingga menjadi tanaman baru yang lengkap. Didukung oleh pendapat dari
Sitorus (2017), bahwa media kultur jaringan tumbuhan berisi garam-garam mineral,
hormon, vitamin, sumber karbon, dan asam amino. Sumber karbon merupakan salah satu
faktor yang sangat penting untuk menentukan keberhasilan kultur jaringan selain
kombinasi zat tumbuh (ZPT). Sumber karbon berfungsi sebagai sumber energi yang
dibutuhkan oleh sel untuk dapat melakukan pertumbuhan. Glukosa dan fruktosa sebagai
hasil hidrolisis sukrosa dapat merangsang pertumbuhan beberapa jaringan. Konsentrasi
sukrosa berpengaruh terhadap pertumbuhan kalus. Rosita (2015) juga menambahkan
bahwa media Murashige dan Skoog (MS) dapat digunakan pada hampir semua jenis kultur.
Modifikasi media kultur jaringan dengan menambah zat pengatur tumbuh perlu dilakukan
untuk menaikkan presentase keberhasilannya. Ada dua jenis hormon tanaman (auksin dan
sitokinin) yang banyak dipakai dalam propagasi secara in vitro. Auksin dapat merangsang
pembentukan akar sedangkan sitokinin berperan sebagai perangsang pembelahan sel dalam
jaringan yang dibuat eksplan serta merangsang pertumbuhan tunas daun.
Medium kultur dapat dibuat memasukkan 250 mL akuades ke dalam magnetic stirrer
kemudian ditambahkan sebanyak 50 mL stok dan diaduk. Selanjutnya, dimasukkan 15 gr
sukrosa ke dalam 50 mL akuades dan diaduk. Stok NAA 50 mL 1 ppm dimasukkan ke
dalam Labu Erlenmeyer yang berisi 25 mL akuades dan diaduk. Stok TDZ 15 Ml 3 ppm
dimasukkan ke dalam Erlenmeyer yang berisi 30 mL akuades dan diaduk. Kemudian pH
larutan diukur dengan penambahan konsentrasi NaOH/HCl yang disesuaikan. Jika pH
larutan sudah sesuai kemudian ditambahkan agar bakteri sebanyak 7,5 gr. Selanjutnya
akuades ditambahkan hingga mencapai volume 500 ml, kemudian dipanaskan hingga
mendidih menggunakan hot plate. Hot plate dimatikan dan media kultur dipindahkan ke
dalam botol kultur. Penambahan stok NAA dan TDZ berfungsi untuk merangsang
pembelahan sel dan mengatur pertumbuhan dan diffrensiasi akar dan taruk pada eksplan.
Hal ini didukung oleh pendapat dari Rasud (2020), bahwa media yang digunakan adalah
media dasar MS (Murashige & Skoog) yang ditambahkan 30 g/L sukrosa, 1 ppm Kinetin
serta zat pengatur tumbuh 2,4- D, dan NAA sesuai perlakuan yang dicobakan. Selanjutnya,
ditambahkan akuades hingga volume larutan mencapai 1 L dan pH media ditepatkan
5,75,8. Media tersebut selanjutnya ditambahkan 8 g/L agar, lalu dipanaskan pada hot
plate hingga suhu 80°C untuk melarutkan agar. Media kemudian dituang ke dalam botol
kultur dengan volume 25 mL/botol. Botol tersebut ditutup rapat dengan aluminium foil dan
diberi label, lalu disterilisasi dalam autoklaf pada tekanan 17,5 psi selama 15 menit. Rosita
dkk (2015) menyatakan bahwa komposisi media yang digunakan larutan stok media MS
dan WPM sebagai media tumbuh tanaman dengan NAA sebagai zat pengatur tumbuh
(ZPT) yang digunakan. Berdasarkan penelitian Harahap et al. (2014) pemberian kombinasi
BAP dan NAA pada media MS menunjukkan pengaruh yang berbeda nyata terhadap
persentase munculnya tunas, jumlah tunas, panjang tunas, dan umur munculnya tunas,
dengan hasil terbaik.
Media yang digunakan dalam kultur jaringan termasuk salah satu faktor penentu
keberhasilan dalam perbanyakan tanaman secara in vitro. Media kultur harus bisa
menyediakan semua nutrisi baik makro maupun mikro yang dibutuhkan. Selain itu, ada lagi
beberapa faktor penentu sehingga pembuatan media kultur jaringan bisa berhasil
diantaranya yakni, teknik sterilisasi, komposisi media yang ditambahkan, serta keberadaan
zat pengatur tumbuh pada media. Hal tersebut sesuai dengan pernyataan dari Setiawati
(2018), bahwa penanaman eksplan dilakukan secara steril di dalam laminar air flow
cabinet. Faktor lain yang menentukan keberhasilan dalam kultur jaringan adalah jenis dan
konsentrasi zat pengatur tumbuh (ZPT), yang penggunaannya tergantung pada tujuan dan
tahap pengkulturan. Konsentrasi ZPT pada medium sangat berperan dalam morfogenesis.
Sitokinin merupakan ZPT yang berperan dalam mendorong pembelahan sel atau jaringan
dan merangsang perkembangan tunas. Sitokinin dalam konsentrasi rendah dan sedang
dapat menginisiasi pertumbuhan tunas lateral sedangkan konsentrasi tinggi dapat
meningkatkan pertumbuhan tunas aksilar. Meta-Topolin (mT) merupakan sitokinin
aromatik yang diketahui dapat meningkatkan pembelahan sel, inisiasi tunas dan
pertumbuhan, dominansi apikal, penuaan dan perkembangan fotomorfogenetik.
VII. KESIMPULAN
Berdasarkan hasil praktikum yang telah dilaksanakan dapat disimpulkan bahwa
media kultur dibuat dari campuran bahan-bahan yang digunakan sebagai sumber nutrisi
dari sel atau jaringan tanaman yang ditumbuhkan secara in vitro. Medium kultur kalus
dapat dibuat dengan memasukkan akuades sebanyak 250 mL ke dalam magnetic stirrer,
kemudian ditambahkan 50 mL stok dan diaduk. Selanjutnya, 15 gr sukrosa dimasukkan ke
dalam 50 mL akuades dan diaduk. Stok NAA 50 mL 1 ppm dimasukkan ke dalam
Erlenmeyer yang berisi 25 mL akuades dan diaduk. Selanjutnya, 15 mL TDZ 3 ppm
dimasukkan kedalam Erlenmeyer yang berisi 30 mL akuades dan diaduk. Barulah
kemudian pH larutan diukur dan diberi tambahan NaOH/HCl untuk menyesuaikan dengan
pH optimalnya. Kemudian ditambahkan agar bakteri sebanyak 7,5 gr. Selanjutnya,
akuades ditambahkan hingga mencapai volume 500 mL dan dipanaskan hingga mendidih
diatas hot plate. Media kultur dipindahkan ke dalam botol dengan pH optimum sebelum
disterilisasi adalah 5,8. Derajat keasaman medium biasanya akan turun sekitar 0.3-0.5 unit
setelah disterilkan menggunakan autoklaf.
 DAFTAR PUSTAKA

Tia Setiawati, Auliya Zahra, Rully Budiono, Mohamad Nurzaman. 2018. Perbanyakan In
Vitro Tanaman (Solanum tuberosum [L.] cv. Granola) dengan Penambahan Meta-
Topolin Pada Media Modifikasi MS (Murashige & Skoog), V (1): 44-50.
Ajijah, Nur. 2016. Pengaruh Komposisi Media Dasar dan Jenis Eksplan terhadap
Pembentukan Embrio Somatik Kakao. J. Tanaman Industri Dan Penyegar. 3(3),
127–134.
Indah., Putri Nur., Dini E. 2013. Induksi Kalus Daun Nyamplung (Calophyllum inophyllum
Linn.) pada Beberapa Kombinasi Konsentrasi 6-Benzylaminopurine (BAP) dan 2,4-
Dichlorophenoxyacetic Acid (2,4-D). Jurnal Sains Dan Seni Pomits. Vol. 2(13):
2337-3520.
Fauziyyah., Dieni., Triani Hardiyati., Kamsinah. 2013. Upaya Memacu Pembentukan Kalus
Eksplan Embrio Kedelai (Glycine max (L.) Merril) Dengan Pemberian Kombinasi
2.4-D Dan Sukrosa Secara Kultur In Vitro. Jurnal Pembangunan Pedesaan.
Volume 12(1): 30 – 37.
Fitrianti, Alia. 2017. Efektivitas Asam 2,4-Diklorofenoksiasetat (2,4- D) Dan Kinetin Pada
Medium Ms Dalam Induksi Kalus Sambiloto Dengan Eksplan Potongan Daun.
Semarang: Universitas Negeri Semarang.
Heriansyah. Pebra. 2020. Rahasia Mudah Menguasai Kultur Jaringan Tanaman: Teori dan
Praktiknya. Bogor: Lindan Bestari.
Mahmound, O., & Kosar, M. 2013. Regeneration and Histological of plants Derived From
Leaf Explants In Vitro Culture of Strawberry. Agricultural Biotechnology Research
Institute of Iran.
Nursetiadi, Eka. 2015. Kajian Macam Media Dan Konsentrasi Bap Terhadap Multiplikasi
Tanaman Manggis (Garcinia mangostana L.) Secara In Vitro. Surakarta:
Universitas Sebelas Maret.
Purwaningrum, Yayuk. 2015. KULTUR Kalus Sebagai Penghasil Metabolit Sekunder
Berupa Pigmen. Jurnal Agriland. Vol. 2(2): 117-127.
Puspita, A. 2017. Potensi Biosida Ekstrak Akar dan Batang Pisang Kepok Untuk
Pertumbuhan Biji Kacang Hijau Secara In Vitro. Skripsi Pendidikan Biologi UMS
pp. 1-13.
Rosita, Emy., Lutfhi. 2015. Pengaruh Jenis Eksplan dan Komposisi Media terhadap
Pembentukan Tunas Tanaman Karet (Hevea brasiliensis Muell. Arg.) Secara In
Vitro. Jurnal Agroekoteknologi. Vol. 4(1): 1756 - 1761.
Singh, B.M., Rajoriya, C.M., Wani, I.A., Rawat, R.S., and Lal Jat, B. 2016. In vitro studies
of Ficus carica and its application in crop improvement. International Journal for
Research in Applied Science & Engineering Technology (IJRASET), 4 (11): 135-
148.
Sitorus., Ertina N., Endah D.H., Nintya S. 2017. Induksi Kalus Binahong (Basella rubra L.)
Secara In Vitro Pada Media Murashige & Skoog Dengan Konsentrasi Sukrosa Yang
Berbeda. Jurnal Bioma. Vol. 13(1): 1-7.
Widoretno., W., Retno Mastuti. 2018. Kultur Jaringan Tumbuhan. Malang: Universitas
Brawijaya.