Anda di halaman 1dari 3

Nama : Hasna Rofifah Novianti

NPM : 140210180029

Optimizing Genomic DNA Isolation andPCR Amplification For Pasak Bumi


(Eurycomalongifolia)

Penelitian tentang isolasi DNA dan penanda referensi yang dapat digunakan untuk analisis
molekuler lebih lanjut oleh karena itu diperlukan pengetahuan dasar yang mendasari dalam
membangun upaya konservasi yang tepat dari spesies tersebut. Kualitas DNA merupakan salah satu
faktor penentu keberhasilan analisis molekuler. Kualitas dan kemurnian stok DNA yang tinggi akan
mempengaruhi amplifikasi DNA pada proses Polymerase Chain Reaction (PCR). Berbeda dengan
tanaman herba, banyak bagian pohon yang mengandung beberapa penghambat DNA seperti
polisakarida, tanin, fenol, dan zat metabolit sekunder lainnya. Zat-zat tersebut akan menghuni
aktivitas DNA polimerase selama proses PCR. Berbagai metode dan teknologi tersedia untuk isolasi
genomic DNA. Secara umum, semua metode melibatkan gangguan dan lisis bahan awal diikuti
dengan penghilangan protein dan kontaminan lain dan akhirnya pemulihan DNA. Metode CTAB
(Cetyl Trimetyl Ammonium Bromide) digunakan dalam penelitian ini. Metode ini umumnya
digunakan sebagai pilihan untuk ekstraksi bahan tanaman dengan polisakarida tinggi dan zat
penghambat lainnya dan telah berhasil digunakan untuk beberapa tanaman dan pohon hutan tingkat
tinggi.

Internal Transcribed Spacer (ITS), maturase K (matK), trnL-trn Fintergenic spacer


andribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase oxygenase (rbcL) digunakan dalam penelitian ini sebagai
penanda standar untuk barcode. Pemanfaatan ketiga region dan spacer DNA kloroplas ini dikarenakan
kemampuannya yang tinggi dalam menentukan jenis tumbuhan dan menghasilkan urutan yang
berkualitas tinggi. Genom kloroplas juga merupakan unit pewarisan non rekombinasi, tunggal,
memiliki struktur yang stabil dan terutama secara maternal pada angiospermae.

Pada penelitian ini digunakan bahan sejumlah sepuluh sampel daun segar pasak bumi
dikumpulkan dari Padang Lawas, Sumatera Utara. Semua sampel disimpan dalam kantong plastik
yang berisi silika gel dan disimpan pada suhu kamar hingga DNA dilakukan ekstraksi. Metode
CTAB. digunakan untuk mengekstraksi DNA totalgenom daun pasak bumi. Untuk memeriksa stok
larutan kualitas DNA, 5 μL DNA yang digabungkan dengan 2 μL loading dye dijalankan pada gel
agarosa 5% menggunakan teknik horizontalelektroforesis. Untuk marker digunakan tangga DNA
1000 dan 5000 bp dari DNA SERVA. Gel diwarnai dengan GelRed. Visualisasi produk DNA
dilakukan dengan menggunakan ruang sinar ultraviolet (GelDoc-It, sistem Imaging UVP). Empat
marker standar barcode yaitu ITS, matK, rbcL dan trnL-trnF digunakan dalam penelitian ini.

Proses PCR terdiri dari empat tahap yaitu denaturasi awal, denaturasi, anil dan ekstensi akhir.
Denaturasi awal dilakukan pada suhu 95ᵒC selama 2 menit. Tahap denaturasi dilakukan pada suhu
95ᵒC selama 1 menit, sedangkan tahap annealing dilakukan pada suhu 52ᵒC dilanjutkan dengan
polimerisasi pada suhu 72ᵒC selama 2 menit. Tahap terakhir adalah ekstensi akhir yang dilakukan
pada suhu 72ᵒC selama 7 menit.

DNA berkualitas tinggi dicirikan oleh DNA dengan berat molekul tinggi, tanpa zat pencemar,
seperti protein, polisakarida, fenolat, atau metabolit sekunder lainnya. Hasil isolasi DNA dengan
metode CTAB menunjukkan bahwa metode ini memberikan hasil DNA yang lebih baik dari segi
kualitas dan kuantitas.

Berdasarkan penelitian ini, protokol CTAB (Cetyl trimethyl ammonium bromide) yang
dimodifikasi memungkinkan menghasilkan hasil DNA yang baik. CTAB mampu menghasilkan DNA
genom berkualitas tinggi yang dapat digunakan untuk RAPD (Random amplified Polymorphic DNA),
restriksi digestion, danamplifikasi gen barcode tanaman (matK andrbcL) dengan biaya yang lebih
hemat. Urutan target kloroplas dan ribosom-genom dipilih untuk menguji kesesuaian ekstrak DNA
genom untuk amplifikasi urutan dalam reaksi berantai polimerase.

Empat urutan terpilih adalah ITS, MatK, rbcL dantrnL-trnF. Dalam penelitian ini, produk
PCR yang diamplifikasi ditentukan. ITS, gen rbcL dan daerahtrnL-trnF DNA yang diisolasi dari pasak
bumi diamplifikasi oleh reaksi PCR. Sekuens ITS, rbcL dan matK yang biasa digunakan untuk
barcode tanaman dan rekonstruksi filogenetik. Kemampuan primer pada amplifikasi DNA pada
proses PCR ditentukan oleh ketidaksesuaian template-primer pada ujung ke-3 dari urutan primer.

Penelitian ini menunjukkan keberhasilan yang cukup besar dalam amplifikasi ITS, rbcL
daerah gen dan trnL-trnF. Hasil ini sesuai dengan. yang menyatakan bahwa, pada banyak kasus
amplifikasi rbcL positif tetapi negatif matK mungkin juga disebabkan oleh kualitas dan kuantitas
DNA yang lebih rendah. Penjelasan lain adalah karena variasi situs pengikatan gen matK. Kasus
serupa juga terjadi pada pakis yang menggunakan rangkaian matK. Keberhasilan amplifikasi
menggunakan trnL-trnF telah dilaporkan pada penelitian sebelumnya untuk Aquilaria, Styrax
sumatrana, Shorea, Taxus sumatrana, dan Dipterocarpus. Selanjutnya Gambar 4 menunjukkan isolasi
DNA genom yang baik yang menghasilkan amplifikasi yang baik selama proses PCR akan
menghasilkan urutan yang baik.
Hasil penelitian menunjukkan bahwa metode CTAB mampu menghasilkan kualitas DNA
yang baik dan pengenceran 30% menghasilkan pita terbaik dan selanjutnya dipilih untuk proses PCR.
Amplifikasi PCR menemukan bahwa hanya ITS, rbcL dantrnL-trnF yang dikonfirmasi menghasilkan
hasil terbaik dan dapat digunakan untuk analisis molekuler lebih lanjut.

Anda mungkin juga menyukai