A. PELAKSANA : Pendamping prakti9kum ( Dosen dan Aisten ) dan Mahasiswa.

B. ALAT DAN BAHAN : 1. Botol sampel 2. Bunsen burner

3. Tali pengikat botol sampel 4. Tabung reaksi
5. Pinset 6. Spatula
7. Mortar dan pestle 8. Pipet ukur 1 ml
9. Cawan petri 10. Drugalsky
11. Inkubator 12. Jarum ose
13. Desinfektan/Alkohol 70 % 14. Cotton bud steril
15. Pepton water 16. Akuades steril
17. Wrapping 18. Alkohol 96 %

C. DASAR TEORI :

Populasi bakteri di alam terdiri atas beragam jenis yang saling berinteraksi satu sama lain
dan untuk mempelajarinya diperlukan suatu proses isolasi bakteri dalam skala laboratorium
sehingga campuran bakteri tersebut dapat dipisah pisah menjadi kultur murni bakteri. Usaha atau
proses memisahkan bakteri dari campuran bakteri menjadi kultur murni disebut dengan isolasi.

Bakteri terdapat hampir di semua lingkungan seperti tanah, air, makanan,

hewan,tumbuhan, manusia, dan lainnya. Melihat begitu banyaknya lingkungan ekologis yang
ditempati oleh bakteri, maka proses isolasi bakteri memerlukan pendekatan yang berbeda untuk
setiap kondisi lingkungan. Salah satu tahapan awal yang sangat penting dalam proses isolasi
adalah tahapan pengambilan sampel. Dalam bidang mikrobiologi,tahap ini menjadi sangat krusial
karena sangat menentukan keberhasilan dan kebenaran hasil isolasi. Pengambilan sampel yang
sembarang menyebabkan data yang diperoleh tidak valid dan tidak dapat
dipertanggungjawabkan.

Setelah tahap pengambilan sampel dilakukan dengan baik dan benar, tahab berikutnya
adalah tahap isolasi bakteri. Dalam isolasi bakteri,Sejumlah sampel umumnya dilakukan
pengenceran.

1. Isolasi Bakteri dengan Pengenceran ( Diluton )

Sampel yang telah diperoleh setelah sampai di laboratorium harus segera dianalisis
sehingga hasil analisis yang diperoleh akan lebih valid. Pengenceran yang dilakukan dalam proses
isolasi ini pada prinsipnya ada dua tehnik yaitu :
1) Tehnik Preparasi Suspensi,
Tehnik ini dapat dilakukan melalui tiga cara yaitu :
 a) Tehnik ulas ( swab )
Dikukan untuk sampel yang memiliki permukaan relatif luas atau besar
sehingga tidak memungkinkan untuk dipindahkan seperti meja, lantai, atau
karena adanya pertimbangan lain sehingga hanya memungkinkan untuk di-
swab, misalnya luka dan pengambilan secret vagina.
b) Tehnik bilas ( Rinse )
Dilakukan untuk sampel yang memiliki permukaan yang luas tetapi masih
memungkinkan untuk dimasukan ke dalam akuades steril, contohnya adalah
sayur sayuran, kertas, sisik ikan, dan lainnya.
c) Tehnik penghancuran/ Penghalusan ( Maseration )
Digunakan untuk sampel yang berbentuk padatan seperti daging, bakso,
sosis, dan lainnya sehinggga permukaan sampel manjadi lebih luas dan
kemungkinan untuk kontak ( bersentuhan ) dengan pelarut lebih besar yang
pada akhirnya jumlah bakteri yang diperoleh akan lebih besar.
2) Tehnik Pengencer Bertingkat
Tehnik ini dilakukan dengan maksud untuk menurunkan jumlah bakteri
yang akan diperoleh sehingga kemungkinkan bakteri mengalami penumpukan
ketika ditumbuhkan pada medium agar cawan agar cawan dapat dihindarkan.
Penentuan berapa tingkat pengenceran yang akan digunakan disesuaikan
dengan sampel yang akan dianalisis, apabila sampel tersebut dimungkinkan
memiliki jumlah bakteri yang tinggi maka pengenceranya dibuat setinggi
mungkin, misalnya tanah. Tetapi apabila sampel tersebut mungkin hanya
memiliki jumlah bakteri yang rendah, maka tingkat pengenceranya dapat
dikurangi, misalnya biskuit dalam kemasan. Prinsip yang harus selalu dipegang
dalam pengenceran bertingkat adalah perbandingan antara jumlah sampel
dengan jumlah pelarut adalah 1 : 9.
2. Tehnik Inokulasi Pada Medium Agar
1) Tehnik Inokulasi dari Suspensi
Merupakan kelanjutan dari tehnik pengenceran bertingkat di atas yang secara
umum dibedakan atas dua metode yaitu :
a) Metode sebar ( Spread plate )
Merupakan metode inokulasi bakteri yang dilakukan dengan cara
menuangkan suspensi bakteri sebanyak 0,1 ml di atas medium agar cawan yang
telah memadat. Suspensi tersebut kemudian diratakan dengan menggunakan
 batang L ( druglasky ) secara pelan pelan supaya tidak merusak permukaan
medium agar cawan. Medium cawan selanjutnya diinkubasi selama 1 – 2 hari
dan diamati ada tidaknya pertumbuhan bakteri.
b) Metode tuang ( pour plate )
Merupakan metode inokulasi bakteri yang dilakukan dengan cara
menuangkan suspensi sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri steril kosong.
Selanjutnya ke dalam cawan petri tersebut dituangkan medium agar dengan
suhu 350C – 450C dan diratakan dengan cara cawan petri digerak gerakan
membentuk angka 8. Medium selanjutnya diinkubasi selama 1 – 2 hari dan
diamati ada dan tidaknya pertumbuhan bakteri.
2) Tehnik Inkulasi Secara Goresan ( Streak Plates )
Tehnik ini ditujukan untuk memurnikan bakteri dari populasi bakteri atau
dapat juga untuk subkultur isolat murni dari medium lama ke medium yang baru.
Medium agar ke medium agar lainnya dan dilakukan dengan cara menggoreskan
ujung jarum ose yang telah mengandung bakteri ke permukaan medium agar lain.
Dalam proses menggores, setiap orang dapat mengikuti pola tertentu seperti bentuk
kuadran, segitiga, huruf T, atau berkreasi sendiri sesuai dengan keinginan. Namun
yang perlu diperhatikan adalah, setiap goresan yang satu harus bersambung dengan
goresan berikutnya sehingga pada goresan terakhir diharapkan bakteri tumbuh
membentuk satu koloni yang terpisah dari koloni yang lan.
D. PROSEDUR KERJA :
1. Tehnik pengambilan sampel air terbuka
Sampling secara langsung air sungai, danau, rawa, dan air tercemar lainnya
dilakukan dengan prosedur sbagai berikut :
1) Disiapkan botol steril berukuran 100 ml atau lebih.
2) Lakukan sterilisasi dengan menggunakan desinfektan atau gunakan sarung
tangan kecil ( glove ).
3) Buka tutup botol steril tersebut dan pegang bagian bawah botol dengan
kencang.
4) Celupkan botol steril ke dalam badan air dengan kedalaman ± 20 cm dari
permukaan air dan mulut botol menghadap ke arah yang berlawanan dengan
arah aliran air.
5) Setelah penuh, segera diangkat dan buang sedikit air yang tertampung sehingga
volume tinggal ¾ dari volume botol.
 6) Lakukan sterilisasi mulut botol dengan cara dibakar dengan api.
7) Tutup rapat botol tersebut dan segera dibawa ke laboratorium.
Sampling secara langsung air sungai, danau, rawa, dan air lainnya yang
tercemar dilakukan dengan metode sebagai berikut :
1) Disiapkam botol steril yang berukuran 100 ml atau lebih.
2) Ikat botol steril dengan seutas tali.
3) Botol steril dibuka tutupnya dan segera diturunkan ke dalam air dengan
kedalaman ± 20 cm ( jika airnya jernih botol masih terlihat dari atas )
4) Setelah penuh tarik botol ke atas.
5) Pegang bagian bawah botol dan buang sedikit air yang tertampung sehingga
volumenya tinggal ¾ dari volume botol.
6) Lakukan sterilisasi mulut botol dengan cara di bakar dengan api.
7) Tutup rapat botol dan segera dibawa ke laboratorium.
2. Tehnik Pengambilan sampel air tertutup / jaringan Pipa.
Sampling jaringan pipa dilakukan dengan cara sebagai berikut :
1) Pilih kran yang akan digunakan sebagai tempat pengambilan kran ( kran harus
bersih dan tidak kran yang kotor / berminyak, berkarat, ada di tolet, dll ).
2) Siapkan botol steril berkapasitas minimal 100 ml.
3) Buka penuh kran selama ± 2 menit sehingga aliran airnya penuh dan konstan.
4) Tutup rapat kran air dan sterilkan mulut kran dengan cara dibakar dengan api
sampai keluar uap air.
5) Buka kembali kran secara penuh, dan buka tutup botol steril kemudian dipegang
bagian bawah botol secara kencang.
6) Posisi botol steril di bawah kran untuk menampung air sampai ¾ volume botol
7) Tutup kran dengan rapat.
8) Sterilkan mulut botol dengan cara dibakar dengan nyala api.
9) Tutup botol dengan rapat dan segera dibawa ke laboratorium.
3. Prosedur preparasi suspensi secara ulas ( sweb ).
1) Disiapkan cotton bud steril dan pepton water dalam tabung reaksi.
2) Nyalakan api bunsen di sekitar tempat kerja.
3) Bersihkan tangan dengan alkohol 70 % ( menggunakan sarung tangan steril lebih
dianjurkan ).
4) Buka tutup pepton water kemudian bakar mulut tabung di sekitar nyala api.
5) Buka kemasan cotton bud steril dan pegang salah satu ujungnya.
 6) Celupkan ujung cotton bud lainnya kedalam pepton water.
7) Angkat cotton bud dari pepton water, kemudian ulaskan kepermukaan sampel
yang akan dianalisis ( ulaskan dilakukan dengan cara memutar cotton bud
sehingga seluruh permukaan cotton bud dapat menyetuh permukaan sampel ).
8) Angkat cotton bud dari permukaan sampel permukaan kemudian dimasukan ke
dalam pepto water tadi ( ujung cotton bud yang dipegang dipotong / digunting
sehingga tidak masuk ke dalam pepton water ).
4. Prosedur peparasi suspensi secara bilas ( Rinse )
1) Disiapkan sampel yang akan dianalisis ( jika ukurannya terlalu besar bisa
dipotong ).
2) Disiapkan pula akuades steril dalam tabung reaksi atau botol dengan volume 45
ml.
3) Disiapkan pula api bunsen di sekitar tempat kerja.
4) Sterilkan pinset atau spatula di atas api kemudian gunakan untuk mengambil
sampel ( sebanyak 5 g ) untuk dimasukan ke dalam tabung atau botol berisi
akuades steril ( perlu diingat bahwa perbandingan sampel dan pelarut adalah
1:9 ).
5) Tutup rapat tabung reaksi / botol tersebut untuk kemudian di kocok pelan pelan.
5. Prosedur preparasi suspensi secara penghancuran / penghalusan ( Maseration )
1) Disiapkan mortar dan pastle steril.
2) Sampel dimasukan kedalam mortar untuk kemudian ditumbuk, dihaluskan,
dihancurkan.
3) Sampel diambil dengan menggunakan sendok atau spatula steril untuk
kemudian dimasukan ke dalam akuades steril ( ingat pebandingan sampel 1 : 9 )
Dalam tabung reaksi.
4) Tabung reaksi ditutup rapat dan dikocok pelan pelan.
6. Prosedur pengenceran secara bertingkat
 Prosedur kerja dari tehnik pengenceran bertingkat secara lengkap ( misalnya
menggunakan sampel susu sapi mentah ) adalah sebagai berikut :
1) Diambil 1 ml susu sapi mentah untuk dimasukan ke dalam 9 ml akuades steril
pertama ( selanjutnya disebut sebagai pengenceran 10 -1 )
2) Dari pengenceran 10-1 diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukn ke dalam 9 ml
akuades steril ke dua ( selanjutnya disebut pengenceran 10 -2 ).
3) Dari pengenceran 10-2 diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukan ke dalam 9 ml
akuades steril ke tiga ( selanjutnya disebut pengecer 10 -3 )
4) Dari pengenceran 10-3 diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukan ke dalam 9 ml
akuades steril ke empat ( selanjutnya disebut pengecer 10 -4 )
5) Dari pengenceran 10-4 diambil sebanyak 1 ml untuk dimasukan ke dalam 9 ml
akuades steril ke lima ( selanjutnya disebut pengecer 10 -5 )
6) Dari pengenceran ( 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 ) masing masing diambil sebanyak 0,1
ml ( metode spread plate ) atau 1 ml ( metode paur plate ) untuk dimasukan ke
dalam medium agar cawan yang berbeda.
7) Selanjutnya suspensi diratakan menggunakan drugalsky ( metode spread plate )
atau dapat pula medium agar cawan digerakan seperti angka 8 ( metode pour
plate )
8) Medium agar cawan diinkubasi selama 1 atau 2 hari dengan posisi terbalik dan
diamati adanya pertumbuhan bakteri, setelah itu dibandingkan kepadatan
pertumbuhan bakteri sesuai dengan tingkat pengencerannya.
7. Prosedur tehnik inokulasi dari suspensi melalui penyebaran ( spread plates )
1) Dituang medium agar yang masih cair ke dalam cawan petri steril dan didiamkan
beberapa saat sampai memadat.
2) Diambil suspensi bakteri sebanyak 0,1 ml menggunakan pipet ukur steril dan
disebar di atas permukaan medium agar cawan tersebut.
3) Suspensi diratakan ke seluruh permukaan medium agar cawan secara hati hati
menggunakan batang L atau drugalsky sehingga permukaan medium tidak rusak.
4) Medium agar cawan dibungkus dengan kertas atau di-seal menggunakan
wrapping kemudian diinkubasi dalam posisi terbalik di dalam inkubator.
8. Prosedur tehnik inokulasi dari suspensi melalui penuangan ( pour plates )
1) Diambil suspensi bakteri sebanyak 1 ml menggunakan pipet steril kemudian
dituang ke dalam cawan petri steril.
 2) Dituang medium agar yang masih cair ( suhu 35 0 C - 400C ) ke dalam cawan petri
steril tersebut kemudian cawan petri di gerak gerakan membentuk angka 8
secara berlahan lahan sehingga medium tersebar merata diseluruh permukaan
cawan petri.
3) Cawan petri didiamkan beberapa lama sampai medium di dalamnya memadat.
4) Cawan petri dibungkus dengan kertas atau di-seal menggunakan wrapping
kemudian diinkubasi dalam posisi terbalik di dalam inkubator.

9. Prosedur tehnik inokulasi secara goresan ( Streak plate )

1) Dituang medium agar yang masih cair ke dalam cawan petri steril dan didiamkan
beberapa saat sampai memadat.
2) Diambil jarum ose dari botol alkohol 96 % dan dipanaskan di api bunsen sampai
membara kemudian didiamkan beberapa saat di dekat api.
3) Ujung jarum ose yang sudah dingin disentuhkan pada kultur bakteri kemudian
digoreskan pada permukaan medium agar cawan yang telah memadat sesuai
dengan pola goresan yang diinginkan.
4) Medium agar cawan dibungkus dengan kertas atau di-seal menggunakan
wrapping kemudian diinkubasi dalam posisi terbalik di dalam inkubator.