Buku Petunjuk Praktikum 2022

PETUNJUK PRAKTIKUM
BIOKIMIA FARMASI
Kode 1773
Koordinator :
apt. Setyowati Triastuti Utami, M. Sc., Ph. D
DEPARTEMEN KIMIA FARMASI

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
2022
Petunjuk Praktikum Biokimia 2022
KATA PENGANTAR
Alhamdulillah, puji syukur dipanjatkan kepada Allah SWT karena

dengan limpahan rahmat dan petunjuk-Nya penyusunan buku Petunjuk
Praktikum Biokimia ini dapat diselesaikan dengan baik. Selain sebagai
panduan kegiatan Praktikum, petunjuk praktikum ini juga dapat
digunakan sebagai referensi tambahan pada kegiatan yang berkaitan
dengan biokimia. Petunjuk praktikum untuk semester III tahun
2022/2023 ini merupakan penyempurnaan dari petunjuk praktikum
sebelumnya.
Secara garis besar petunjuk Praktikum Biokimia ini berisi materi

tentang pengenalan alat alat yang digunakan dalam praktikum Biokimia,
penentuan aktivitas spesifik enzim, Km dan Vmaks, pemisahan enzim
dengan SDS-PAGE serta materi karbohidrat mengenai pengaruh kondisi
lapar terhadap kadar glikogen hepar. Selain itu juga akan disampaikan
praktikum kering dengan analisis struktur protein. Setelah melakukan
praktikum ini diharapkan mahasiswa akan mampu melakukan analisis
adanya perubahan dalam proses biokimia tubuh, mampu menentukan
kadar protein, menentukan aktivitas spesifik enzim, menentukan K m dan
Vmaks suatu enzim, dan memisahkan protein.
Masih banyak kekurangan dalam buku petunjuk praktikum ini,

oleh karena itu diharapkan saran dan kritik untuk perbaikan buku
petunjuk di masa yang akan datang. Ucapan terimakasih disampaikan
Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

1
kepada semua pihak yang telah membantu baik dalam hal penyusunan
petunjuk praktikum maupun dalam pelaksanaan praktikum.
Yogyakarta, Maret 2022
Tim Pengampu:
1. Prof. Dr. apt. Edy Meiyanto, M. Si 7. apt. Setyowati Triastuti, PhD
2. Dr. apt. Rumiyati, M.Si 8. Dr. apt. Tatang Irianti, M. Sc
3. Dr. apt. Riris Istighfari Jenie, M.Si 9. Dr. apt. Purwanto, M. Sc
4. Dr. apt. Muthi Ikawati, M.Sc 10. Cintya Nurul Apsari, M.Si
5. Dr.rer.nat. apt. Adam Hermawan, M.Sc 11. Asefin Nurul Ikhtiyarini,M. Si
6. apt. M. Novrizal Abdi Sahid, M.Eng., Ph.D

2
DAFTAR ISI
Halaman
KATA PENGANTAR........................................................................................... 1
DAFTAR ISI........................................................................................................... 3
TATA TERTIB LABORATORIUM................................................................. 4
ACARA PRAKTIKUM........................................................................................ 5
PERCOBAAN I Pengenalan alat-alat dan safety bahan kimia yang
digunakan dalam Praktikum……...…………. 6
PERCOBAAN II-A Pengaruh Kemurnian Enzim terhadap Aktivitasnya:
Penentuan Aktivitas Spesifik........................... 17
PERCOBAAN II-B Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas
Enzim: Penetapan Nilai Km dan Vmaks............. 30
PERCOBAAN III Pemisahan Protein dengan Metode SDS-PAGE 35
PERCOBAAN IV Pengaruh Kondisi Lapar (Keadaan Puasa) terhadap
Kandungan Glikogen Hepar Ayam............... 44
PERCOBAAN V Analisis Struktur Protein ……………………… 53
DAFTAR PUSTAKA............................................................................................. 68

3
TATA TERTIB LABORATORIUM

1. Mahasiswa datang 15 menit sebelum praktikum dimulai
2. Mahasiswa yang terlambat 15 menit atau lebih tanpa alasan yang
jelas tidak diperkenankan mengikuti praktikum
3. Tidak disediakan waktu khusus untuk inhal. Mahasiswa yang
berhalangan hadir dapat mengikuti praktikum golongan lain
untuk acara yang sama dengan mengisi blangko surat
permohonan kepada Koordinator Praktikum. Mahasiswa yang
berhalangan hadir, harus segera memproses surat tersebut
melalui teknisi laboratorium Biokimia
4. Mahasiswa TIDAK diperkenankan memakai SANDAL dan KAOS
OBLONG
5. Mahasiswa TIDAK diperkenankan MAKAN, MINUM, MEROKOK
selama praktikum
6. Mahasiswa diwajibkan memiliki buku petunjuk praktikum
dalam bentuk hard copy
7. Mahasiswa diwajibkan untuk mengikuti semua mata praktikum
8. Jas laboratorium dan name tag dipakai sebelum
memasuki laboratorium
9. Laporan praktikum dibuat BERKELOMPOK dan dikumpulkan di
akhir acara tiap-tiap praktikum, TIDAK dikerjakan dirumah.
10. Penilaian :
a. Post-test : 25%
b. Laporan : 35%
c. Responsi : 40%

4
ACARA PRAKTIKUM
1. Pengenalan alat alat yang digunakan dalam Praktikum (hal 6 -

16)
2. Pengaruh Kemurnian Enzim terhadap Aktivitasnya: Penentuan
Aktivitas Spesifik (hal 17 - 29)
a. Pembuatan kurva baku albumin dengan Metode Biuret
b. Penetapan kadar protein total dari sitosol
c. Penentuan aktivitas spesifik enzim GST
3. Pengaruh Konsentrasi Substrat terhadap Aktivitas
Enzim: Penentuan Km dan Vmaks (hal 30 - 34)
4. Pemisahan Protein dengan Metode SDS-PAGE (hal 35 - 43)
a. Pembuatan gel pemisah
b. Pembuatan gel penumpuk
c. Elektroforesis
d. Staining sampel
5. Pengaruh Kondisi Lapar (Keadaan Puasa) terhadap
Kandungan Glikogen Hepar Ayam (hal 43 - 50)
a. Pembuatan kurva baku glikogen dengan reagen Antron
b. Pengambilan dan penyiapan organ hepar
c. Ekstraksi glikogen
d. Penetapan kadar glikogen dari sampel hepar dengan
reagen Antron
6. Analisis Struktur Protein (dry lab.) (hal 51 – 64)

5
PERCOBAAN I
PENGENALAN ALAT ALAT YANG DIGUNAKAN DI DALAM
PRAKTIKUM
Editor: Dr. Apt., Rumiyati, M.Si., Dr.rer.nat. Apt., Adam

Hermawan, M.Sc., dan Apt., Setyowati Triastuti Utami, M. Sc.,
Ph.D.
A. Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat mengetahui dan memahami prinsip
dasar alat-alat yang digunakan di dalam praktikum
Biokimia
2. Mahasiswa dapat menggunakan alat- alat dengan benar
B. Pendahuluan
1. Mikropipet
Mikropipet adalah alat yang digunakan untuk mentransfer cairan
dalam jumlah kecil (<1 ml). Skala pada mikropipet menggunakan
satuan mikroliter (1000µl = 1 ml). Ada tiga ukuran mikropipet
dalam laboratorium biokimia, dengan tiga rentang volume yaitu
P20 = 0,5- 20 ml, P200 = 20-200 µl, dan P1000 = 200-1000 µl.

6
Ukuran mikropipet dapat dilihat pada bagian atas plunger (gambar

1b). Alat ini digunakan bersama tip plastik (biasanya steril) dalam
berbagai macam warna sesuai ukurannya.
a b
Gambar 1. Contoh mikropipet dan bagian-bagiannya. a. Gambar
keseluruhan pipet, b. Bagian penunjuk ukuran mikropipet
Beberapa catatan mengenai penggunaan mikropipet :

● Rentang volume penggunaan mikropipet adalah:
P20: 0,5-20 µl
P200: 20-200 µl
P1000: 200-1000 µl
• Tidak diperbolehkan melebihi batas atas atau bawah
volume mikropipet yang akan mengakibatkan mikropipet

7
menjadi tidak akurat bahkan dapat menimbulkan

kerusakan.
● Cara mengatur volume yang diinginkan yaitu dengan
memutar Volume adjustment dial seperti dalam Gambar 1A
bagian c. Untuk meningkatkan volume putarlah tombol
searah jarum jam atau berlawanan jarum jam untuk
mengurangi volume.
Pengaturan ukuran volume dan pembacaan mikropipet:
● P20: memiliki volume maksimum sebesar 20 µl dan
rentang akurasi di antara 0,5 µl dan 20 µl. Display volume
pada mikropipet (biasanya hitam-hitam-merah) dibaca
sebagai XX.X µl. Perubahan warna angka pada mikropipet
menunjukkan perubahan angka desimal.
● P200: memiliki volume maksimum sebesar 200 µl dan
rentang akurasi di antara 20 µl dan 200 µl. Display volume
pada mikropipet (satu warna) dibaca sebagai XXX µl.
● P1000: memiliki volume maksimum sebesar 1000 µl (= 1
ml) dan rentang akurasi di antara 200 µl dan 1000 µl.
Contoh di bawah menunjukkan bagaimana untuk membaca

mikropipet:

8
Gambar 2. Contoh pembacaan mikropipet
● Tempatkan tip di discharge end of the pipettor (ujung

mikropipet untuk memasukkan pipet (gambar 1 (f)).
CATATAN: Jika kondisi steril diperlukan, ujung pipet tidak

diizinkan menyentuh objek apapun (termasuk tangan Anda).
Plunger (Gambar 1 (a)) mempunyai 2 titik berhenti yang berbeda

ketika ditekan.
● Posisi yang pertama dari titik-titik berhenti adalah titik
resistance awal dan pada tingkat tekanan Plunger kedua ini
akan menghasilkan volume larutan yang ingin ditransfer.
● Titik kedua akan ditemukan ketika plunger tertekan
setelah titik resistance awal sampai bersentuhan dengan
body pipettor. Pada titik ini plunger tidak dapat ditekan

9
lebih lanjut. Titik kedua ini digunakan untuk mengeluarkan

semua larutan dari ujung tip plastik. Dengan kata lain, jika
saat pengambilan cairan penekanannya sampai titik
pertama maka saat pengeluaran harus ditekan pada saat
titik kedua. Demikian sebaliknya jika saat pengambilan
ditekan sampai titik kedua maka saat mengeluarkan hanya
ditekan sampai titik pertama.
● Tekan plunger sampai mencapai titik resistance awal dan
masukkan ujung tip ke dalam larutan, hanya nyaris di
bawah permukaan larutan dan tidak sedalam mungkin.
Gambar 3. Posisi tip saat mengambil larutan
● Hati-hati dan perlahan-lahan melepaskan plunger.

CATATAN: Jika Anda memipet larutan kental, pastikan tip
terisi sampai volume yang diinginkan, sebelum Anda
mengangkat tip dari larutan tersebut, untuk menghindari

10
adanya gelembung di ujung tip plastik yang akan

menghasilkan volume yang tidak akurat.
● Masukkan larutan ke dalam wadah yang diinginkan dengan
menekan plunger. Kemudian tekan plunger ke titik
resistance awal, tunggu satu detik, dan kemudian lanjutkan
menekan plunger sejauh mungkin untuk mengeluarkan
seluruh volume larutan.
● Buang tip plastik dengan menekan ke bawah pada ujung
shaft.
Gambar 4. Contoh penggunaan mikropipet
CATATAN:
● Jangan membalik mikropipet (menaruh ujung tip pada
posisi di atas). Hal ini dapat menyebabkan cairan masuk ke

11
dalam pipet dan akan merusaknya ataupun membuat

pekerjaan steril menjadi terkontaminasi.
● Ketika membuang larutan dengan pipet, selalu lepaskan
plunger secara perlahan. Hal ini untuk mencegah cairan
terhisap ke ujung pipet dan menyumbatnya, terutama
penting dengan pipet volume besar (200- 1000 µl).
● Pastikan Anda menggunakan ukuran tip yang tepat untuk
setiap pipet.
● Selalu gunakan tip baru untuk setiap cairan yang berbeda.
● Gunakan pipet yang tepat untuk volume yang akan
dibagikan. Jangan pernah menggunakan pipet 200-1000
untuk mengeluarkan volume di bawah 200 µl, Penggunaan
di bawah atau di atas skala pipet dapat merusak instrumen.
2. pH meter
Larutan bufer (dapar) adalah larutan yang dapat
mempertahankan perubahan pH akibat perubahan sekelilingnya
baik yang bersifat asam maupun basa. Larutan bufer sering
digunakan di dalam percobaan biokimia. Larutan bufer dapat
dibuat dari campuran asam dan basa konjugatnya. Bufer dapat juga
dibuat dari campuran asam lemah dengan garam yang
mengandung anion yang sama dengan asam lemahnya, atau basa
lemah dengan garam yang mengandung kation yang sama dengan

12
basa lemahnya. Nilai pH larutan bufer seperti dirumuskan oleh

persamaan Henderson-Hasselbach tergantung oleh: nilai pKa dan
rasio perbandingan garam dan asam yang digunakan.
Ada beberapa jenis larutan bufer antara lain bufer borat, sitrat,
Tris. Pemilihan jenis tersebut dipengaruhi oleh keperluan atau
maksud penggunaan bufer tersebut. Sebagai contoh larutan bufer
fosfat tidak sesuai digunakan untuk larutan larutan yang
mengandung logam logam berat, karena logam berat akan
mengendap dengan fosfat. Sementara itu untuk larutan yang
mengandung logam logam berat dapat digunakan dapar Tris, untuk
itu pada percoabaan percobaan biologis dapat digunakan dapat
Tris ini. Sebagai contoh bufer posfat memiliki pH antara 5,3-8,0.
Bufer posfat dapat dibuat dari campuran Na2HPO4 dan NaH2PO4.
Besarnya nilai pH pada larutan tersebut bergantung pada
komposisi campuran Na2HPO4 dan NaH2PO4.
pH meter
pH meter adalah alat yang digunakan untuk mengukur pH
(keasaman atau alkalinitas) dari larutan bufer. Alat ini mempunyai
dua bagian yaitu 1) elektroda yang dihubungkan dengan 2)
meteran elektronik yang dapat mengukur dan menampilkan
pembacaan pH. Bagian elektroda (probe) pada bagian bawahnya
mengandung bohlam yang merupakan bagian sensitif dari probe

13
yang berisi sensor. Bagian elektroda ini sensitif terhadap

ions H+ dan mengandung mengandung 0.1 M HCl dan Ag/AgCl
(Gambar 6).
Gambar 5. Contoh gambar alat pH meter dan bagian bagiannya
Sebelum digunakan untuk pengukuran, pH meter harus dikalibrasi

terlebih dahulu dengan menggunakan setidaknya dua atau 3
larutan bufer standar yang menjangkau rentang nilai pH yang akan
diukur. Untuk kalibrasi biasanya digunakan larutan bufer pada pH
4, pH 7 dan pH 10. Berikut urutan di dalam melakukan kalibrasi pH
meter dengan menggunakan larutan bufer.
Cara Kerja:
1. Sebelum pH meter digunakan untuk mengukur pH suatu
larutan, lakukan kalibrasi terhadap pH meter. Ambil larutan

14
buffer yang akan digunakan untuk kalibrasi ke dalam beaker

glass. Masukkan elektroda ke larutan tersebut. Ukur nilai pH
nya kemudian pH pada pH meter disesuaikan dengan nilai pH
yang digunakan untuk kalibrasi. Diantara pembacaan pH,
elektroda harus dicuci dengan air dengan botol semprot dan
kemudian dilap dengan tisu dan kemudian diletakkan pada
tempatnya.
2. Ukurlah pH dari larutan bufer sebagai berikut:
Tabel 1.1. Penentuan pH
No. Larutan pH terukur
1. Dapar fosfat A
2. Dapar fosfat B
3. Dapar Tris A
4. Dapar Tris B
3. Sentrifus preparatif
Sentrifus preparatif adalah alat yang digunakan untuk
memisahkan partikel-partikel sampel di dalam larutan (Gambar 6).
Pemisahan terjadi akibat gaya gravitasi dan gaya sentrifugal dan
antara lain dipengaruhi oleh faktor ukuran partikel, densitas dan
kecepatan rotor. Larutan sampel ditempatkan dalam rotor yang
dapat berotasi pada sumbu tetap. Partikel dalam larutan sampel
akan terpisah menjadi supernatant (berupa cairan) dan pellet
(yang mengendap). Semakin cepat perputaran rotor, maka akan

15
semakin banyak sedimentasi yang terbentuk. Satuan yang

menggambarkan daya pemisah alat tersebut dengan satuan gaya
sentrifugal (G) yang dipengaruhi oleh kecepatan sudut rotor dan
jarak radial (r) partikel dari sumbu rotasi. Satuan g itu sendiri bisa
di konversi ke nilai RPM (jumlah putaran permenit) dan ke
nilai Relative Centrifugal Force (RCF).
Gambar 6. Contoh alat sentrifus
Ada dua jenis rotor pada sentrifus yang umum diketahui

yaitu swing out dan angel atau fixed. Sentrifus dengan rotor jenis
swing out memiliki selongsong tabung yang melekat secara bebas
pada rotor. Sehingga apabila rotor sentrifus berotasi akan
mengakibatkan selongsong bersama dengan tabung sentrifus
didalamnya akan berada pada posisi mendatar. Pada sentrifus
yang memiliki rotor jenis angel atau fixed. Pada rotor jenis ini,
selongsong tabung melekat secara permanen dengan sudut

16
kemiringan sekitar 45 derajat. Kecepatan putaran lebih cepat

karena minimnya gesekan udara dibanding rotor jenis swing out.
Fixed - rotor
Swing - rotor
Gambar 7. Bagian bagian alat sentrifus dan jenis rotornya
Berdasarkan kecepatannya sentrifus dapat dikelompokkan antara

lain:
1. Sentrifus mikro yang memiliki kecepatan maksimum 12.000
putaran/menit
2. Sentrifus berkecepatan tinggi yang memiliki kecepatan
masksimum 25.000 putaran/menit dan gaya sentrifugal 60.000 g.
3. Ultrasentrifus yang memiliki kecepatan maksimum 80.000
putaran/menit

17
Hal hal yang perlu diperhatikan didalam penggunaan alat sentrifus:

1. Alat sentrifus boleh dioperasikan setelah alat tertutup rapat
dan kedudukan tabung dalam selongsong seimbang.
Pengertian seimbang disini adalah seimbang dalam bobot
bukan volume sehingga sebelum melakukan sentrifugasi
perlu dilakukan penimbangan terlebih dahulu.
Keseimbangan diperlukan untuk meminimalisir terjadinya
getaran. Pada saat rotor berputar, frekuensi getaran akan
semakin kuat jika kedudukan tabung dalam selongsong tidak
seimbang. Hal tersebut dapat mengganggu pembentukan
dan sedimen yang terbentuk menjadi rentan terurai kembali.
2. Tabung sentrifus hanya boleh terisi maksimum ¾ bagian
volume. Hal ini dimaksudkan agar saat rotor berputar
dengan kecepatan maksimal, tekanan volume objek dalam
tabung tidak sampai mendesak tutup tabung yang dapat
berakibat fatal.
3. Setelah pemakaian sentrifus selesai, pastikan alat benar-
benar sudah berhenti dan kemudian baru dibuka tutup
sentrifusnya
Cara Kerja
1. Pastikan bahwa sebelum alat sentrifus dioperasikan, rotor
harus dalam keadaan seimbang dengan cara:

18
Tabung tabung (tube) dan isinya harus ditimbang terlebih

dahulu kemudian diletakkan/disusun pada rotor secara
berlawanan arah satu sama lainnya (misal hanya ada satu
sampel (1 tube) maka harus dibuat seimbang dengan 1 tube yg
lain yang diisi dengan air/pelarut lainnya dengan berat yang
sama dan diposisikan berlawanan.
2. Ambil larutan sampel yang sudah disiapkan sebanyak 1000 uL
dan tuang ke dalam ependrof dan kemudian di sentrifugasi
dengan kecepatan sebagai berikut. Pisahkan supernatan dan
pelet yang terbentuk:
Tabel 1.2. Pengamatan supernatan setelah

sentrifugasi
No. Sampel Kecepatan (rpm) Pengamatan
supernatan/pellet
1. A 3000
2. B 4000
4. Alat elektroforesis SDS (SDS PAGE)
SDS PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel

Electrophoresis adalah teknik pemisahan protein berdasarkan

19
berat molekulnya. Teknik ini banyak digunakan dalam forensik,

genetika, bioteknologi, dan biologi molekuler untuk memisahkan
molekul protein berdasarkan mobilitas elektroforesisnya.
Prinsip SDS-PAGE menyatakan bahwa molekul bermuatan
bermigrasi ke elektroda dengan tanda yang berlawanan ketika
ditempatkan dalam medan listrik. Pemisahan molekul bermuatan
tergantung pada mobilitas relatif spesies bermuatan.
Molekul yang lebih kecil bermigrasi lebih cepat karena
resistensi yang lebih kecil selama elektroforesis. Struktur dan
muatan protein juga mempengaruhi kecepatan migrasi. Natrium
dodesil sulfat dan poliakrilamida menghilangkan pengaruh
struktur dan muatan protein, dan protein dipisahkan berdasarkan
panjang rantai polipeptida.
SDS adalah deterjen yang ada dalam buffer sampel SDS-PAGE.
SDS bersama dengan beberapa zat pereduksi berfungsi untuk
memutuskan ikatan disulfida protein sehingga mengganggu
struktur tersier protein.
Komponen peralatan untuk SDS-PAGE adalah sebagai berikut:

20
Casting stand (tempat untuk

cetakan gel)
Casting frame and glass plate
sandwich (cetakan gel)
Plastic combs (sisir)
Glass plates with integrated
spacers (kaca ut mencetak gel)
Sample loading guides
(Penunjuk loading sampel)
Clamping frame and electrode
assembly (tempat gel dan
elektroda)
Gambar 8. Komponen yang diperlukan untuk SDS-PAGE
Urutan prosedur penggunaan alat :
1. Bersihkan kaca dengan etanol 70%
2. Masukkan kaca pada casting frame

3. Kunci kaca pada casting frame
4. Letakkan pada casting stand, lakukan uji kebocoran
dengan menggunakan air.
5. Setelah dipastikan tidak terjadi kebocoran, pipet larutan
akrilamid-bisakrilamid dengan mikropipet secara
perlahan, dimulai dari resolving gel lalu stacking gel, dan
pasanglah sisir. Tunggu hingga gel berpolimerisasi.
6. Pasang glass plate yg terdapat gel, pada clamping frame dan
electrode assembly.

21
7. Tuangkan running buffer

8. Ambil sisir, lalu bersihkan sumuran dengan mikropipet.
9. Pipet sample satu per satu ke dalam sumuran
Gambar 9. Tata cara menyusun glass plate

22
Gambar 10. Penyusunan aparatus glass plate pada electophoretic electrode

and clamp

16
PERCOBAAN II-A
PENGARUH KEMURNIAN ENZIM TERHADAP AKTIVITASNYA:
PENENTUAN AKTIVITAS SPESIFIK
Editor: Prof. Dr. Sismindari, SU., Apt., Dr. Rumiyati, M.Si., Apt.,
apt. Setyowati Triastuti Utami, M. Sc., PhD
Pendahuluan
Enzim adalah sekelompok protein yang berfungsi sebagai
katalisator untuk berbagai reaksi kimia dalam sistem biologis.
Enzim ditemukan sebagai makromolekul baik ekstraselular atau
intraselular. Secara kualitatif, keberadaan suatu enzim
diidentifikasi dari reaksi yang dikatalis, sedangkan secara
kuantitatif, dapat diukur dengan kecepatan reaksinya.
Enzim bekerja sangat spesifik karena hanya dapat
mengkatalisis satu atau beberapa reaksi saja. Penggolongan enzim
didasarkan oleh macam reaksi yang dikatalisis, sehingga dapat
digolongkan ke dalam 6 golongan:
1. Oksidoreduktase: enzim ini mengkatalisis reaksi-reaksi
oksidasi reduksi
2. Transferase: enzim ini mengkatalisis reaksi pemindahan
berbagai gugus seperti amina, karboksil, karbonil, metil, asil,
glikosil atau fosforil

17
3. Hidrolase: enzim ini mengkatalisis pemutusan ikatan kovalen

sambil mengikat air
4. Liase: enzim ini mengkatalisis reaksi pemecahan ikatan
kovalen tanpa mengikat air
5. Isomerase: enzim ini mengkatalisis reaksi isomerisasi
6. Ligase (sintetase): enzim ini mengkatalisis pembentukan
ikatan kovalen.
Aktivitas enzim (µmol produk/menit) selain dipengaruhi

kadar enzim tersebut, juga dipengaruhi oleh faktor-faktor fisika-
kimia antara lain suhu dan pH. Sedangkan kecepatan reaksi
enzimatik (aktivitas enzim) umumnya dinyatakan sebagai aktivitas
spesifik dengan satuan µmol produk/menit/mg protein. Semakin
besar aktivitas spesifik menunjukkan semakin tinggi tingkat
kemurniannya.
Tujuan Praktikum
1. Mahasiswa dapat menetapkan nilai aktivitas enzim
2. Mahasiswa dapat menetapkan kadar protein dengan metode
Biuret
3. Mahasiswa dapat menghitung aktivitas spesifik enzim

18
Dasar Teori
Kecepatan reaksi yang dikatalisis oleh suatu enzim
diantaranya dipengaruhi oleh kadar enzim dalam suatu campuran
reaksi. Kadar enzim dalam ekstrak kasar dipengaruhi apakah gena
penyandi enzim itu terekspresi. Ekspresi suatu gena dapat
dikelompokkan sebagai ekspresi konstutif atau terinduksi. Untuk
ekspresi suatu gena dapat dilihat aktivitas suatu enzim dalam
ekstrak kasar dalam sejumlah protein (mg) maka kadar protein
total juga harus diketahui.
Aktivitas spesifik menunjukkan jumlah µmol produk yang
terbentuk dalam waktu satu menit oleh satu mg protein yang
mengandung enzim. Oleh karena itu harga aktivitas spesifik
menunjukkan kemurnian suatu enzim dalam campuran protein.
Semakin tinggi harga aktivitas spesifik semakin tinggi kemurnian
enzim tersebut dalam campuran protein itu. Penyampaian dalam
bentuk aktivitas spesifik suatu enzim yang terdapat dalam keadaan
tidak murni akan memberikan gambaran ekspresi enzim itu pada
keadaan tertentu. Aktivitas spesifik menggambarkan kemurnian
enzim dalam suatu sediaan.
Glutation-S-transferase (GST) merupakan sekelompok
enzim sitosolik multifungsional yang memainkan peranan penting
pada detoksifikasi senyawa-senyawa xenobiotik elektrofilik yang
masuk ke dalam tubuh. GST merupakan suatu famili enzim

19
detoksifikasi yang penting, ditemukan dalam fraksi sitosol

kebanyakan sel dan dikelompokkan menjadi enam kelas yaitu:
alpha, mu, phi, theta, sigma, dan zeta. Organ tubuh seperti liver,
ginjal, usus halus serta paru memiliki kandungan GST yang cukup
tinggi. Beberapa substrat spesifik digunakan di dalam klasifikasi
isoenzim ini. Kelas alpha menunjukkan aktivitas yang tinggi
terhadap kumen hidroperoksida, kelas phi sangat aktif terhadap
asam etakrinat, sedangkan tingkat aktivitas terhadap trans-
stilbene oksida dan 1,2-dikloro-4-nitrobenzen (DCNB) digunakan
dalam klasifikasi isoenzim GST kelas mu. Untuk GST kelas phi
digunakan substrat spesifik asam etakrinat, sementara itu senyawa
1-kloro-2,4-dikloro benzen (CDNB) merupakan substrat umum
untuk enzim GST.
Tahapan kerja
1. Penentuan aktivitas enzim
2. Pembuatan kurva baku albumin
3. Penetapkan kadar protein total
4. Menghitung aktivitas spesifik.
Bahan (Disiapkan oleh Lab)

1. Sitosol hati tikus yang mengandung GST
2. Bufer fosfat 0,1M pH 7,5

20
Alat
1. Ultra sentrifugator (Hitachi SCP 85H),
2. Neraca elektrik (Shimadzu, type LS-6DT),
3. Delivery pipet (Gilson pipetman berbagai ukuran),
4. Tip pipet (biru, putih, kuning) berbagai ukuran (Gilson),
5. Alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium analisis.
Cara Kerja
1. Penyiapan Fraksi Sitosol yang Mengandung Glutation S-
Transferase dari Tikus (disiapkan oleh lab)
a. Tikus jantan (galur Sprague-Dawley, berat 200-250 g)
sebanyak 5 ekor diberi makan pelet dan minum air.
b. Setelah waktu perlakuan selesai, tikus dipuasakan 24 jam
c. Tikus dikorbankan “dengan cara dislokasi leher” dan hepar
diambil untuk penyiapan fraksi sitosol yang mengandung
GST dengan metode sentrifugasi bertingkat.
d. Hepar tikus diambil dan langsung dimasukkan ke dalam
bufer fosfat 0,1 M (KH2PO4 dan K2HPO4) dingin pH 7.5,
kemudian ditimbang.
e. Selanjutnya hepar tikus dalam bufer fosfat dihancurkan
menggunakan blender dingin dengan kecepatan 440 rpm
selama 5 menit.

21
f. Homogenat yang telah halus disentrifugasi dengan

kekuatan 10.000 x g selama 30 menit pada suhu 40C.
g. Supernatan diambil dan dipindahkan ke tabung baru,
endapan yang diperoleh dibuang.
h. Supernatan disentrifugasi lagi dengan kekuatan 105.000 x
g selama 90 menit pada suhu 4 0C.
i. Supernatan yang diperoleh merupakan fraksi sitosol yang
mengandung enzim GST. Fraksi sitosol yang diperoleh
disimpan pada suhu –800C sampai saat digunakan untuk
konjugasi CDNB dengan GSH.
2. Penentuan Aktivitas Enzim (Glutation S-transferase)

liver tikus
Dasar teori
Aktivitas GST ditentukan dengan substrat CDNB dan GSH
membentuk GS-DNB yang dapat diukur pada panjang gelombang
340 nm. Apabila jumlah GSH dan CDNB berlebihan maka dalam
kurun waktu tertentu (1 menit) jumlah GS-DNB (µmol/min) yang
terbentuk sesuai dengan jumlah GST.
Bahan
a. GST dalam sitosol

22
b. Bufer fosfat 0,1 M pH 6 (NaH2PO4 0.1M 87.7ml + Na2HPO4

0.1M 12.3ml)
c. Larutan GSH 50 mM, timbang 151,5 mg GSH dan larutkan
dalam 10 ml air
d. Larutan CDNB 50 mM, timbang 101,3 mg CDNB dan
larutkan dalam 10 ml etanol
Alat
a. Spektrofotometer Genesys-5 Milton Roy, pH meter TOA
HM-60S,
b. Delivery pipet (Gilson pipetman berbagai ukuran),
c. Tip pipet (biru, putih, kuning) berbagai ukuran (Gilson),
d. Alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium
analisis.
Cara kerja
Aktivitas GST ditentukan dengan substrat CDNB sebagai berikut :
a. Pada kuvet 1 ml dimasukkan campuran seperti pada Tabel 2.1
no 1
Tabel 2.1. Penentuan Aktivitas GST
Bufer
Fraksi sitosol fosfat GSH 0.05M CDNB
No. Keterangan
(μl) 0.1M pH 6 (μl) 0.05M (μl)
(μl)
1 40 920 20 20 Sampel
2 Aquades 40 920 20 20 Blanko

23
b. Sebagai blangko dibuat campuran seperti pada Tabel 2.1 no 2.

c. Produk konjugat GS-DNB yang terbentuk diukur pada λ 340
dari menit ke-0 sampai menit ke-3, menggunakan
spektrofotometer ( program simple kinetic ).
Catatan: 1. waktu pengukuran yang dianggap sebagai menit
ke-0 disamakan untuk perlakuan yang lain.
2. waktu mulai dihitung sejak penambahan CDNB.
d. Hasil pengukuran berupa rate ( = Δ serapan per menit ).

Selanjutnya diukur aktivitas enzim GST (V) dalam satuan µmol
produk/menit.
Pengamatan :
Kecepatan reaksi = ΔA/min = .............. /min (B)
Perhitungan:
Diketahui ε GS-DNB = 8.500 µmol-1 cm-1
Aktivitas GST=kecepatan reaksi (B) : 8.500 =....µmol GS-

DNB/min (C)
Catatan: Hasil perhitungan ini masih diperlukan untuk
penghitungan aktivitas spesifik enzim (no. 4).

24
3. Pembuatan Kurva Baku Bovin Serum Albumin (BSA)

dengan Metode Biuret
Dasar teori
Penentuan kadar protein secara Biuret berdasarkan atas
pengukuran serapan cahaya oleh ikatan kompleks yang warnanya
ungu. Ini terjadi apabila protein bereaksi dengan tembaga dalam
lingkungan alkali.
2+
NH2
O=C C=O
O C
Cu2+/OH- R-HC N N CH-R
2 Cu
NH
O=C N N C=O
O C
R-HC CH-R
NH2
Rantai peptida Kompleks peptida-logam Cu (panjang gelombang 550 nm)
Gambar 1. Reaksi pembentukan kompleks peptide-logam Cu
Bahan
a. Reagen Biuret
1,5 g kupri sulfat (CuSO4 5H2O), Na-Ktartrat dalam 500 ml
air dalam labu takar 1 liter. Kemudian ditambahkan 300 ml
NaOH 10% sambil dikocok-kocok, selanjutnya
ditambahkan air sampai garis tanda. Larutan biru ini dapat
disimpan lama. Apabila pembuatannya kurang baik dapat

25
terjadi endapan hitam atau merah (reagen yang demikian

tidak boleh dipakai).
b. Larutan standar protein bovin serum albumin (BSA) 5%
(5g/100ml). Untuk mempermudah larutnya albumin
tambahkan beberapa tetes NaOH 3%.
c. Bufer fosfat 0.1 M pH 7.5 (NaH2PO4 0.1M 13ml + Na2HPO4
0.1M 87 ml).
Alat
a. Spektrofotometer Genesys-5 Milton Roy, pH meter TOA
HM-60S,
b. Delivery pipet (Gilson pipetman berbagai ukuran),
c. Tip pipet (biru, putih, kuning) berbagai ukuran (Gilson),
d. Alat-alat gelas yang lazim digunakan di laboratorium
analisis.
Cara kerja
a. Ditimbang albumin sebanyak 1,25g dimasukkan ke dalam
labu takar 25 ml (konsentrasi 5%).
b. Ditambahkan aquades sedikit untuk membasahi albumin
(jangan dikocok untuk menghindari pembuihan),
kemudian ditambahkan aquades lagi sampai tanda.
c. Dibuat kurva baku albumin dengan seri kadar 100-700
μg/ml dengan komposisi seperti pada Tabel 2.2.

26
Tabel 2.2. Pembuatan Kurva Baku Bovine Serum Albumin

(BSA)
No. Larutan Kadar Bufer Reagen Keteranga
albumin stok BSA fosfat Biuret 0.1M n
(μl) mg/ml 0.1M pH (μl)
7.5 (μl)
1 20 1.0 180 800 -
2 30 1.5 170 800 -
3 40 2.0 160 800 -
4 60 3.0 140 800 -
5 80 4.0 120 800 -
6 - - 200 800 Blanko
1 100 100 800 Sampel
d. Setelah didiamkan selama 10 menit diamati serapannya pada

panjang gelombang 550nm (λ 550nm).
a. Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol yang Mengandung

GST
Dasar teori
Kandungan protein total dalam fraksi sitosol ditetapkan
secara Biuret berdasarkan atas pengukuran serapan cahaya oleh

27
ikatan kompleks yang warnanya ungu. Ini terjadi apabila protein

bereaksi dengan tembaga dalam lingkungan alkali.
Cara kerja
Penetapan dilakukan secara spektrofotometri dengan metode
Biuret dan menggunakan bovine serum albumin dengan
konsentrasi 5,0 % b/v sebagai pembanding.
a. Disiapkan larutan campuran fraksi sitosol, bufer fosfat 0.1M
pH 7.5 dan reagen Biuret seperti pada Tabel 2.3. di bawah ini,
dicampur hati-hati.
Tabel 2.3. Penetapan Kadar Protein Fraksi Sitosol

Bufer fosfat Reagen Biuret
Fraksi sitosol
No. 0.1M pH 7.5 0.1M Keterangan
(μL)
(μL) (μL)
1 100 100 800 Sampel
2 200 800 Blanko
b. Setelah tepat 10 menit serapan dibaca pada λ 550 nm

terhadap blanko yang terdiri dari 800 μl reagen Biuret dan
200 μl bufer fosfat 0,1 M (lihat tabel).
c. Kadar protein sitosol = ………/1000 x (Vol total/Vol fraksi
sitosol) mg/µl (D)

28
d. Dalam 40 µl mengandung protein = (D) x 40 = ……….mg (E)

Catatan: Perhatikan adanya faktor pengenceran.
Perhitungan Aktivitas Spesifik Enzim

a. Aktivitas enzim = ........... µmol GS-DNB/min
b. Jumlah protein dalam sitosol yang diambil (40 µl) =
..........mg (E)
c. Kadar protein larutan sitosol =mg/ml
d. Aktivitas spesifik GST = µmol GS-DNB/min/mg protein =
(C) : (E)
= ............................ µmol GS-DNB/min/mg protein
Catatan:
1 unit (U) enzim adalah
jumlah enzim yang mengkatalisis reaksi 1 μmol substrat
per menit (pada kondisi standar)
Aktivitas spesifik enzim adalah
jumlah unit enzim per ml dibagi dengan konsentrasi
protein dalam mg/ml atau jumlah unit enzim per mg
protein, sehingga satuan aktivitas spesifik enzim adalah
unit/mg.
Kemurnian enzim sebanding dengan nilai aktivitas spesifiknya
artinya semakin besar nilai aktivitas spesifik, semakim
tinggi kemurnian enzim tersebut.

29
PERCOBAAN II-B
PENGARUH KONSENTRASI SUBSTRAT TERHADAP AKTIVITAS
ENZIM: PENETAPAN NILAI KM dan Vmaks
Editor: Prof. Dr. Sismindari, SU., Apt., Prof. Dr. Edy Meiyanto,
M.Si., Apt., dan apt. Setyowati Triastuti Utami, M. Sc., PhD
A. Tujuan
a. Mahasiswa dapat membuktikan adanya pengaruh
konsentrasi substrat terhadap aktivitas enzim.
b. Mahasiswa dapat menetapkan nilai KM dan Vmaks suatu
enzim.
B. Dasar Teori
Konsentrasi substrat mempengaruhi kecepatan reaksi
enzimatik. Hubungan tersebut dapat dinyatakan secara kuantitatif
dalam kurva hiperbolik seperti ditunjukkan pada Gambar 1.
Bentuk kurva hiperbolik itu dapat diekspresikan secara aljabar dan
disebut sebagai persamaan Michaelis-Menten, dengan [ S] =
konsentrasi substrat, Vo = kecepatan reaksi enzimatik pada saat
awal reaksi, ketika produk reaksi baru saja terbentuk (Gambar 2),
Vmaks = kecepatan reaksi enzimatik maksimum dan KM= tetapan

30
Michaelis-Menten. Persamaan Michaelis-Menten tersebut adalah

sebagai berikut:
Persamaan ini dapat pula diubah secara aljabar ke dalam bentuk

yang lebih operasional untuk menghubungkan data yang diperoleh
pada percobaan yaitu:
Persamaan ini disebut persamaan Lineweaver-Burk. Persamaan ini

berbentuk garis lurus dengan slope (kemiringan garis) = a = KM
/Vmaks dan intercept (titik potong) pada absis = -1/KM, titik potong
pada sumbu tegak (ordinat) = b adalah 1/Vmaks dan garis yang
diperoleh disebut Lineweaver-Burk Plot. Dengan menggunakan
persamaan Lineweaver-Burk pengukuran kecepatan reaksi cukup
dilakukan dalam 3 atau 4 konsentrasi substrat saja. Keuntungan
yang lain, dengan menggunakan persamaan tersebut nilai KM dan
Vmaks dapat langsung dilihat atau dihitung. Sedangkan dengan
persamaan Michaelis, untuk membuat hiperbola yang tepat sesuai

31
dengan persamaan diperlukan jumlah titik yang lebih banyak. Nilai

Vmaks sukar ditetapkan, sedangkan nilai KM harus dihitung secara
grafis dari kurva.
A B
Gambar 1. A. Kurva Michaelis-Menten: Vo terhadap konsentrasi substrat.

Titik menunjukkan interval 0,5 Km antar konsentrasi substrat antara 0,5
Km dan 5 Km. B. Kurva Lineweaver-Burk.
Gambar 2. Kurva terbentuknya produk enzimatik

32
C. Cara Kerja
1. Sesuai dengan percobaan I, Bagian 1: Penentuan Aktivitas GST,
namun dengan berbagai konsentrasi substrat (GSH).
2. Disiapkan reaksi dalam kuvet 1 ml, sesuai dengan Tabel 3.1
sebagai berikut:
Tabel 3.1. Pengukuran Kecepatan Reaksi pada Berbagai

Konsentrasi Substrat GSH
GSH CDNB Bufer fosfat Fraksi sitosol
(50 mM dalam (50 mM dalam 0,1 M pH 6 (μl)
akuades) etanol) (μl)
(μl) (μl)
20 5 935 40
20 10 930 40
20 15 925 40
20 20 920 40
20 25 915 40
BLANKO 20 - 940 40

33
3. Isilah Tabel 3.2 berikut :

Tabel 3.2. Penentuan Aktivitas GST pada Berbagai
Konsentrasi Substrat GSH
Konsentrasi
Kecepatan reaksi
susbtrat[S] (mM) 1/[S] 1/V
(V)
0,25
0,5
0,75
1,0
1,25
1,5
4. Buatlah plot V vs. [S], 1/V vs. 1/[S] .Kemudian tentukan nilai KM
dan Vmaks enzim GST.
Hitung harga KM dan Vmaks. Apa arti harga tersebut?

34
PERCOBAAN III
PEMISAHAN PROTEIN DENGAN METODE SDS-PAGE

(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Editor: Dr. apt. Riris Istighfari Jenie, M.Si.; Dr. apt. Muthi
Ikawati, M.Sc.; Dr. rer. nat. Tatang Irianti, M.Sc.; Prof. Dr. apt.
Sismindari, SU.
A. Tujuan
Mahasiswa dapat melakukan pemisahan dan

menentukan bobot molekul protein dengan metode SDS-PAGE.
B. Dasar teori
Protein dapat dipisahkan dengan metode elektroforesis gel

poliakrilamid berdasarkan adanya perbedaan berat atau ukuran
molekul. Pada metode ini, mula-mula protein didenaturasi dengan
pemanasan dalam larutan dapar tris yang mengandung sodium
dodesil sulfat (SDS). Protein yang terdenaturasi strukturnya akan
menjadi linier dan bermuatan negatif, akibat interaksi hidrofobik
antara SDS ( - ) dengan molekul protein yang telah terdenaturasi.
Akibat perlakuan tersebut tidak akan ada perbedaan muatan dan
konformasi di antara protein yang ada di dalam larutan tersebut.
Interaksi ini sebanding dengan ukuran molekul protein, sehingga
makin besar ukuran molekul suatu protein maka akan semakin

35
banyak muatan negatif. Dengan adanya medan listrik komplek

protein terdenaturasi-SDS didalam gel poliakrilamid akan berjalan
ke satu arah yaitu ke kutub positif (anoda). Semakin kecil ukuran
molekul akan semakin jauh jarak yang ditempuh.
Gel poliakrilamid merupakan hasil polimerisasi a
ntara akrilamid dan N,N-metilen-bisakrilamid yang berfungsi
sebagai pembentuk silang. Monomer akrilamid dan N,N-metilen-
bisakrilamid akan bereaksi membentukpolimer dengan adanya
senyawa radikal. Sebagai inisiator pembentukan senyawa radikal,
biasanya digunakan amonium persulfat (APS), sedangkan
penambahan TEMED (N,N,N’,N’-tetrametil etilendiamin)
digunakan sebagai penyetabil senyawa radikal bebas. Rasio
konsentrasi kedua monomer, yaitu akrilamid dan N,N'-metilen-
bisakrilamid, merupakan faktor penentu ukuran pori.
Pada pemisahan protein menggunakan gel poliakrilamid
digunakan 2 macam gel, yaitu gel pemisah (main gel atau resolving
gel) dan gel penumpuk (stacking gel). Gel pemisah berfungsi untuk
memisahkan protein sesuai dengan urutan bobot molekul protein,
sedangkan gel penumpuk berfungsi sebagai wadah (sumuran)
sampel yang dapat membatasi dengan sampel yang lain dan untuk
memampatkan sampel. Pemisahan protein sampel dan protein
marker (penanda) dilakukan bersamaan sehingga kondisi
elektroforesisnya sama. Untuk menghitung bobot molekul suatu

36
protein, dibuat kurva antara jarak migrasi (mm) dengan bobot

molekul protein marker (penanda). Selanjutnya, dilakukan plotting
jarak migrasi protein sampel pada kurva tersebut dan bobot
molekul protein sampel dapat dihitung.
D. Bahan dan Alat

Bahan:
• Ekstrak hati tikus dan crude GST
• Dapar sampel :Tris-klorida 0,5 M pH 6,8 , gliserol 70%
(v/v), SDS 10% (b/v), 2- merkaptoetanol, biru bromfenol
1% (b/v) .
• Dapar elektroda : Tris-HCl 25 mM, glisin 250 mM (pH 8,3),
SDS 0,1%
• Larutan pewarna: Coomassie Brilliant Blue R250 0,25 %,
metanol 50% (v/ v), asam asetat glasial 10% (v/v)
• Larutan pencuci warna gel: metanol 30% (v/v), asam asetat
glasial 10% (v/v)
• Isobutanol
• Protein marker (penanda)
Alat
Seperangkat alat elektroforesis SDS-PAGE, mikropipet, tip,

shaking water bath.

37
D. Cara Kerja
1. Kaca untuk pencetak gel dibersihkan dengan etanol,

dikeringkan kemudian dipasang pada alatnya
2. Pembuatan gel poliakrilamid 10%.
3. Dibuat campuran gel pemisah seperti pada Tabel 4.1.
Catatan:penambahan larutan sesuai dengan urutan. Siapkan

dahulu komposisi untuk masing-masing gel pemisah maupun
penumpuk yaitu bahan a-e sesuai Tabel 4.1, sedangkan larutan
f dan g ditambahkan sesaat sebelum larutan gel dituang ke
cetakan gel. Gel pemisah dicetak terlebih dahulu, setelah gel
tersebut mengeras, baru gel penumpuk dicetak di atas gel
pemisah.
Tabel 4.1. Komposisi gel SDS-PAGE
Gel
Bahan Gel Penumpuk
Pemisah
a. Akrilamid/bisakrilamid 30% 5,0 ml 1,7 ml
b. 1,5 M Tris-HCl pH 8,6 3,8 ml -
c. 1,5 M Tris-HCl pH 6,8 - 1,25 ml
d. Aquades steril 5,9 ml 6,8 ml
e. SDS 10% 150 μL 100 μL
f. Amonium Persulfat 10% 150 μL 100 μL

38
4. Tuang segera campuran gel pemisah ke dalam ruang antara

lempeng kaca. Sisakan kira-kira 2,5 cm dari tepi atas lempeng kaca
untuk gel penumpuk.
5. Teteskan isobutanol untuk menyingkirkan udara pada bagian
atas gel dan agar batas antar gel dapat terbentuk dengan baik.
6. Biarkan gel pemisah berpolimerisasi.
7. Setelah gel pemisah berpolimerisasi, bersihkan isobutanol
8. Dibuat gel penumpuk, seperti pada Tabel 4.1.
9. Tuangkan campuran gel penumpuk di atas gel pemisah.

Sisipkan plastik (sisir) pembentuk sumuran sampel.
10. Biarkan hingga gel penumpuk berpolimerisasi. Setelah gel
penumpuk berpolimerisasi, plastik pembentuk sumur diangkat
dan klem serta spacer dilepas.
11. Letakkan dan klem lempeng kaca dan gel secara vertikal pada
alat elektroforesis. Isi tempat dapar dengan dapar elektroda.
Singkirkan gelembung udara pada bagian bawah gel.
12. Campur larutkan sampel/ marker protein dengan dapar
sampel. Setelah itu, larutan tersebut dipanaskan pada air
mendidih (95 - 100ºC) selama 5 menit.

39
13. Beri nomor pada sumuran, kemudian masukkan sampel dan

marker protein ke dalam sumur. Perlu dicatat nomor sumuran
dan nama sampel yang dimasukkan.
Catatan: masukkan ke dalam sumuran 10 µl sampel + 5 µl dapar
sampel, untuk marker protein, masukkan ke dalam
sumuransebanyak 5 µl.
14. Hubungkan alat elektroforesis dengan power supply. Jalankan
elektroforesis dengan voltase 200 volt/cm. Setelah pewarna
masuk ke gel pemisah, voltase dinaikkan menjadi 250 volt/cm.
15. Setelah elektroforesis selesai, buka klem. Angkat spacer pada
kedua sisi lempeng kaca, kemudian pisahkan lempeng kaca dari
gel. Potong gel pada batas antara gel penumpuk dan gel pemisah.
Tandai salah satu ujung gel (dipotong sedikit di salah satu ujung
atas gel)
16. Angkat gel dan rendam dalam larutan pewarna (coomassie blue)
selama 30 - 60 menit. Kemudian gel dipindahkan ke dalam
larutan pencuci (asam asetat metanol) Jika perlu, ganti larutan

40
pencuci beberapa kali sehingga warna latar belakang memudar

dan pita-pita protein jelas terlihat.
17. Bandingkan mobilitas protein-protein sampel dengan protein
marker untuk menentukan berat molekulnya.
Cara menentukan berat molekul:
Buat kurva baku protein penanda (protein marker) pada

kertas grafik semilog, dengan sumbu x adalah mobilitas protein
penanda (mm) dan sumbu y adalah berat molekul protein
penanda (kDa). Mobilitas protein ditentukan dengan mengukur
jarak (mm) pita-pita protein dari batas atas gel pemisah.
Untuk menentukan berat molekul protein sampel, ukur
jarak pita-pita protein sampel dari batas atas gel pemisah.
Kemudian dengan menggunakan kurva standar protein
penanda, tentukan berat molekul protein sampel (Tabel 4.2 dan
4.3).

41
Tabel 4.2. Jarak migrasi protein marker (penanda)

Pita Jarak migrasi Berat Molekul Nama Protein
no. (mm) (kDa)
1 205000 Myosin
2 116000 β-Galaktosidase
3 97500 Phosphorilase B
4 66000 Albumin, Bovine
5 45000 Albumin, Egg
6 29000 Carbonyc
Anhydrase
Tabel 4.3. Berat molekul protein dalam sampel crude

ekstrak dan fraksi sitosol
Pita no. Jarak (mm) Pita no. Perkiraan
dari dari Berat
Crude
crude Fraksi sitosol fraksi Molekul
ekstrak
ekstrak sitosol (kDa)

42

43
PERCOBAAN IV
PENGARUH KONDISI LAPAR (KEADAAN PUASA) TERHADAP
KANDUNGAN GLIKOGEN HEPAR AYAM
Editor: Dr. Rumiyati, M.Si., Apt. dan Cintya Nurul Apsari, M.Si.
A. Pendahuluan
Sumber energi yang diperlukan untuk proses metabolisme
dalam sel berasal dari karbohidrat, lipid, dan protein. Untuk bisa
menjadi energi, senyawa tersebut mengalami berbagai reaksi
enzimatik. Tubuh mendapatkan sumber energi (glukosa) melalui
diet langsung dari makanan yang dikonsumsi maupun dari asam
amino serta laktat melalui proses glukoneogenesis.
Glukosa yang diperoleh tersebut selain akan tetap larut
dalam cairan tubuh juga akan disimpan dalam bentuk glikogen
yang berupa polimer. Glikogen merupakan bentuk simpanan
glukosa yang utama. Sumber energi tersebut (glikogen) utamanya
disimpan di dalam hepar. Sumber utama yang kedua dari simpanan
glukosa adalah glikogen di dalam otot skelet. Namun demikian
glikogen otot tidak umum sebagai persediaan energi bagi jaringan
tubuh yang lain karena kekurangan enzim glukose-6-fosfatase. Di
samping itu glikogen juga ditemukan dalam ginjal dan intestin,
tetapi merupakan organ penyimpan minor. Glikolisis merupakan

44
jalur utama dalam metabolisme karbohidrat untuk menghasilkan

energi. Jalur ini sangat penting, karena tidak hanya berperan dalam
metabolisme karbohidrat saja, tetapi bersama-sama dengan siklus
asam sitrat dapat berperan sebagai jalur amfibolik, selain harus
berfungsi setiap saat dan tersebar dalam seluruh makhluk hidup.
Dalam keadaan cukup makan kelebihan glukosa disimpan
sebagai glikogen di dalam hepar (proses glikogenesis). Namun
dalam keadaan kelaparan, dimana tidak ada lagi glukosa yang
diabsorbsi dari usus, gikogen hepar akan dibongkar dan diubah
menjadi glukosa (proses glikogenolisis) dan glikogen akan habis
dalam waktu 24 jam. Setelah 24 jam kadar glukosa darah
dipertahankan melalui proses sintesis glukosa dari senyawa non-
karbohidrat (glukoneogenesis). Simpanan glikogen dalam hepar
dianggap sebagai buffer utama kadar glukosa darah, sehingga
dengan mengukur kadar glikogen pada hepar dalam kondisi lapar
dan normal mahasiswa dapat memahami proses glikogenolisis.
B. Tujuan Praktikum
Membandingkan kadar glikogen pada hepar ayam yang
lapar (keadaan puasa) dan mendapat makanan cukup sehingga
dapat mengetahui pengaruh kondisi lapar terhadap kadar glikogen
dalam tubuh.

45
C. Dasar
Kandungan glikogen dalam hepar ditetapkan dengan
reagen Antron. Gula akan bereaksi dengan reagen Antron dalam
suasana asam menghasilkan warna biru kehijauan yang kemudian
diukur menggunakan spektrofotometer visibel pada λ maksimum
620nm.
D. Tahapan kerja
1. Pembuatan kurva baku glikogen dengan reagen Antron

2. Pengambilan dan penyiapan organ hepar
3. Ekstraksi glikogen
4. Penetapan kadar glikogen dari sampel hepar dengan
reagen Antron
Bahan
1. Glikogen murni
2. Hepar dari ayam yang dipuasakan selama 24 jam
3. Hepar dari ayam yang mendapat makanan cukup (tidak
dipuasakan).
Pereaksi
1. NaCl 0,9 %

46
2. Etanol absolut (95%)

3. TCA 5%
4. Dietil eter
5. Larutan I-KI (0,05 N I2 dalam 3% KI)
6. Mortir dan stemper
7. Reagen Antron 0,2%
8. H2SO4 pekat
Catatan: Asam sulfat pekat adalah cairan yang dapat
melepuhkan kulit, harap hati-hati, gunakan almari asam, bila
perlu gunakan sarung tangan.
Alat
1. Mortir dan stamfer
2. Tabung reaksi
3. Penangas air
4. Spektrofotometer visibel
5. Alat sentrifugasi
6. Kelereng (untuk menutup tabung reaksi).
Cara Kerja
1. Pembuatan Kurva Baku Glikogen dengan Reagen Antron
a. Dibuat stok glikogen murni dengan kadar 0.1% sebanyak
10 ml.

47
b. Dibuat satu seri pengenceran bertingkat dari larutan stok

glikogen, untuk mendapatkan 6 seri kadar (tuliskan kadar
pada Tabel 5.1).
Tabel 5.1. Seri Pengenceran untuk Kurva Baku Glikogen

Tabun Glikogen stok Aquadest Kadar
g ke- (0,1%) (ml) (H2O) (ml) glikogen (%)
1 0,1 1,9
2 0,2 1,8
3 0,4 1,6
4 0,6 1,4
5 0,8 1,2
6 1,0 1,0
c. Pada masing-masing larutan glikogen tersebut direaksikan

dengan pereaksi Antron sebagai berikut:
i. Diambil 1 ml larutan glikogen (dalam tabung reaksi)
ditambah 1 ml aquades dan 3 ml H2SO4 pekat.
Catatan: H2SO4 pekat ditambahkan perlahan-lahan
(diteteskan) lewat dinding tabung reaksi, dilakukan
di dalam almari asam.

48
ii. Campuran di panaskan dalam air mendidih

(penangas air) selama 5 menit.
Catatan: selama pemanasan, tabung reaksi ditutup
dengan kelereng agar uap H2SO4 tidak terhirup.
iii. Ditambahkan 0,5 ml reagen Antron dan dipanaskan
lagi (seperti pada tahap c2) selama 5 menit.
iv. Campuran didinginkan dan dibaca serapannya pada
panjang gelombang 620 nm (λ 620 nm).
d. Dibuat kurva baku glikogen dengan kadar glikogen (sumbu

X) versus absobansi (sumbu Y) hingga diperoleh
persamaan:
Y = BX + A.
Tabel 5.2 Seri kadar dan absorbansi untuk Kurva Baku

Glikogen
Tabun Kadar glikogen Absorbansi pada λ 620
g ke- (%) nm
1
2
3
4
5

49
a. Pengambilan dan Penyiapan Organ Hepar

a. Hepar ayam segar dibersihkan dari jaringan sekitarnya,
ditempatkan dalam larutan NaCl 0,9 g/dl (9g/l), suhu 4°C.
B. Hepar ayam dikeluarkan dari larutan, dikeringkan di
antara dua kertas saring, dan ditimbang (catat beratnya).
C. Hepar ayam dilumatkan menggunakan mortir-stamfer
dengan penambahan 100 ml aquades dan TCA 5%.
3.Ekstraksi Glikogen
a. Homogenat yang didapat pada langkah no.2 didekantir dan
disaring dengan kertas Whatman no 54.
b. Filtrat ditampung pada labu yang didinginkan di dalam es.
c. Endapan yang tersisa dalam kertas saring dipindahkan ke
dalam mortar dan ditambahan TCA 5% sebanyak setengah
volume dari yang digunakan pada tahap 2c dan
dihomogenisasi lagi.
d. Dilakukan langkah penyaringan seperti pada tahap 3a.
e. Diambil setetes filtrat hasil dari penyaringan tahap 3d dan
direaksikan dengan larutan I-KI di dalam cawan porselen,
mengapa? (Catatan: penambahan larutan I-KI untuk memastikan
bahwa glikogen sudah terekstraksi sempurna)

50
f. Filtrat hasil dari penyaringan tahap 3a dan 3d digabung

dalam tabung sentrifugasi dan ditambah etanol 95%
sebanyak 2x volume filtrat.
g. Campuran diaduk pelan-pelan dan didiamkan sampai
terjadi pengendapan glikogen.
h. Dilakukan sentrifugasi dan endapannya dilarutkan dalam
sesedikit mungkin air.
i. Langkah pengendapan (2f-g) diulangi kemudian
disentrifugasi.
j. Endapan yang didapat dicuci dengan etanol dan eter.
k. Endapan yang diperoleh dikumpulkan dan dilarutkan
dengan aquades sedikit demi sedikit ad 10 ml (dalam labu
takar 10 ml).
4. Penetapan Kadar Glikogen dari Sampel Hepar dengan

Reagen Antron
a. Diambil satu mililiter (1 ml) sampel menggunakan pipet
volume, masukkan ke dalam tabung reaksi, ditambah 1 ml
aquades dan 3 ml H2SO4 pekat
b. Campuran di panaskan dalam air mendidih (penangas air)
selama 5 menit.
c. Ditambahkan 0,5 ml reagen Antron dan dipanaskan lagi
(seperti pada tahap 4b) selama 5 menit.

51
d. Campuran didinginkan dan dibaca serapannya pada λ 620

nm.
e. Kadar glikogen dalam hepar ayam (sampel) ditetapkan
dengan memasukkan harga absorbansi yang diperoleh ke
dalam persamaan kurva baku (1d).
f. Kandungan glikogen pada hepar ayam yang dipuasakan
(lapar) dibandingkan dengan kandungan glikogen pada
ayam yang tidak dipuasakan (kenyang).

52
PERCOBAAN V
ANALISIS STRUKTUR PROTEIN
Editor: Dr.rer.nat. Adam Hermawan, M.Sc., Apt., Dr. Riris
Istighfari Jenie, M.Si., Apt. dan Dr. Muthi Ikawati, M.Sc., Apt.
i. Tujuan
Mahasiswa dapat memperoleh gambaran struktur protein
ii. Dasar
Protein adalah makromolekul yang bertanggung jawab atas
proses biologis dalam sel. Protein terdiri dari rantai asam amino,
ditentukan oleh urutan nukleotida dalam gen. Bergantung pada
urutan asam amino (asam amino yang berbeda memiliki sifat
biokimia yang berbeda) dan interaksi dengan lingkungannya,
protein melipat ke dalam struktur tiga dimensi, yang
memungkinkan mereka untuk berinteraksi dengan protein dan
molekul lain dan menjalankan fungsinya.
Struktur protein
Ada empat tingkatan organisasi struktur protein (Gambar
1). Struktur primer protein: urutan asam amino yang dihubungkan
bersama oleh ikatan peptida (ikatan kovalen). Struktur sekunder
protein: Polipeptida melipat menjadi α helix, β sheet, atau random
coil (koil acak) (ikatan H terlibat). Struktur tersier protein: lipatan

53
3-D dari rantai polipeptida tunggal (ikatan H, ikatan disulfida,

ikatan ion, interaksi van der Waals, interaksi hidrofobik). Struktur
kuartener protein: Asosiasi dua atau lebih polipeptida terlipat (sub
unit) untuk membentuk protein multimerik (ikatan dan interaksi
yang mirip dengan struktur tersier)
Gambar 1. Tingkatan organisasi struktur protein
Protein dapat diklasifikasikan ke dalam kelompok sesuai

dengan urutan atau kesamaan strukturnya. Kelompok-kelompok
ini sering mengandung protein yang telah dikarakterisasi dan telah
diketahui fungsinya. Dengan demikian, ketika protein baru
teridentifikasi, sifat-sifat fungsionalnya dapat diprediksikan.
Protein dapat diklasifikasikan ke dalam beberapa kelompok
berdasarkan family yang menjadi milik mereka, domain yang
dikandungnya, serta fitur urutan yang mereka miliki

54
Domain adalah unit fungsional dan/atau struktural yang

berbeda dalam protein. Biasanya mereka bertanggung jawab atas
fungsi atau interaksi tertentu, berkontribusi pada peran
keseluruhan protein. Domain mungkin ada dalam berbagai konteks
biologis, di mana domain serupa dapat ditemukan dalam protein
dengan fungsi yang berbeda. Misalnya, domain Src homology3
(SH3) adalah domain kecil dari sekitar 50 residu asam amino yang
terlibat dalam interaksi protein-protein. Domain SH3 memiliki
struktur 3D yang khas (lihat Gambar 2).
Gambar 2. Struktur domain SH3
Contoh lain adalah domain-domain yang terdapat dalam protein

bernama Type 1 Insulin-like growth factor receptor (1IGR) (gambar

55
3) dimana domain digambarkan dalam warna-warna yang

berbeda. Contoh domain lainnya adalah catalytic domain pada
enzim, DNA binding domain pada reseptor, ligand binding domain
pada reseptor.
Gambar 3. Domain yang terdapat pada 1IGR
iii. Cara Kerja
1. Buka situs web http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ dan pilih pada

kolom Search: protein,

56
for: accession number protein yang akan dicari

(seperti tertera pada soal) kemudian klik Search
2. Akan muncul tampilan sebagai berikut.

57

58
3. Buka halaman PDBSUM (http://www.ebi.ac.uk/thornton-

srv/databases/cgi-bin/pdbsum/GetPage.pl?pdbcode=index.html),
lalu masukkan kode sesuai soal
4. Hasilnya akan muncul tampilan berikut ini

59
5. Analisis struktur sekundernya dengan jalan klik pada link Protein

 Chain

60
6. Analisis asam amino apa yang terikat dengan ligan

61

62
7. Analisis interaksi apa saja yang terdapat pada protein tersebut

63
8. Lakukan perhitungan PI dengan database isoelectric.org

64

65

66
Soal
1. Lakukan analisis struktur protein terhadap protein sesuai
cara kerja yang telah dijelaskan! Lakukan Print Screen
setiap tahapannya!
2. Jelaskan mengenai fungsi protein yang Anda analisis!
3. Protein tersebut memiliki struktur primer.
a. Terdiri dari berapa Asam Amino protein tersebut?
b. Berapa berat molekul protein tersebut?
4. Sebutkan motif apa saja yang ada pada struktur sekunder
protein tersebut!
5. Sebutkan interaksi apa saja yang ada pada struktur tersier
dan kuarterner protein tersebut!
6. Protein tersebut berinteraksi dengan ligan.
a. Apakah ligan yang berinteraksi dengan protein
tersebut?
b. Asam amino apakah yang berinteraksi dengan ligan?
7. Tentukan nilai pI (titik isoelektrik) menggunakan database
http://isoelectric.org !

67
DAFTAR PUSTAKA
1. Lehninger, A.L., 2003, Principles of Biochemistry, Worth

publishers Inc., New York.
2. Elliot, W.H. and Elliot, D.C., 1996, Biochemistry and Molecular
Biology, John wiley & Sons, New York.
3. Stryer, L., 2002, Biochemistry, 5 th ed., Freeman and Company,
San Francisco.
4. Clark, J.M. and Robert, L.S., 1977, Experimental Biochemisytry, 2
nd ed., Feeman and Company, San Francisco.
5. Plummer, DT., 1971, An Introduction to Practical Biochemistry,
Tata Mc Graw-Hill Publising Company Ltd
6. Sambrook, J., Fritsch, E.F., Maniatis, T., 1989, Molecular Cloning:
A Laborratoryy Manual, 2 nd ed. , Cold Spring Harbor
Laboratory Press USA.
7. Scope, R. K., 1987, Protein Purification, Principles and Practice,
2 nd ed., Springer Verlag, New York
8. Artikel ilmiah terbaru dari Pubmed

68

Buku Petunjuk Praktikum 2022

Diunggah oleh

Informasi Dokumen

Hak Cipta

Bagikan dokumen Ini

Bagikan atau Tanam Dokumen

Opsi Berbagi

Apakah menurut Anda dokumen ini bermanfaat?

Apakah konten ini tidak pantas?

Hak Cipta:

Buku Petunjuk Praktikum 2022

Diunggah oleh

Hak Cipta:

PETUNJUK PRAKTIKUM

DEPARTEMEN KIMIA FARMASI

Alhamdulillah, puji syukur dipanjatkan kepada Allah SWT karena

Secara garis besar petunjuk Praktikum Biokimia ini berisi materi

Masih banyak kekurangan dalam buku petunjuk praktikum ini,

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Yogyakarta, Maret 2022

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

TATA TERTIB LABORATORIUM

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

1. Pengenalan alat alat yang digunakan dalam Praktikum (hal 6 -

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Editor: Dr. Apt., Rumiyati, M.Si., Dr.rer.nat. Apt., Adam

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Ukuran mikropipet dapat dilihat pada bagian atas plunger (gambar

Beberapa catatan mengenai penggunaan mikropipet :

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

menjadi tidak akurat bahkan dapat menimbulkan

Contoh di bawah menunjukkan bagaimana untuk membaca

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Gambar 2. Contoh pembacaan mikropipet

● Tempatkan tip di discharge end of the pipettor (ujung

CATATAN: Jika kondisi steril diperlukan, ujung pipet tidak

Plunger (Gambar 1 (a)) mempunyai 2 titik berhenti yang berbeda

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

lebih lanjut. Titik kedua ini digunakan untuk mengeluarkan

Gambar 3. Posisi tip saat mengambil larutan

● Hati-hati dan perlahan-lahan melepaskan plunger.

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

adanya gelembung di ujung tip plastik yang akan

Gambar 4. Contoh penggunaan mikropipet

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

dalam pipet dan akan merusaknya ataupun membuat

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

basa lemahnya. Nilai pH larutan bufer seperti dirumuskan oleh

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

yang berisi sensor. Bagian elektroda ini sensitif terhadap

Gambar 5. Contoh gambar alat pH meter dan bagian bagiannya

Sebelum digunakan untuk pengukuran, pH meter harus dikalibrasi

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

buffer yang akan digunakan untuk kalibrasi ke dalam beaker

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

semakin banyak sedimentasi yang terbentuk. Satuan yang

Gambar 6. Contoh alat sentrifus

Ada dua jenis rotor pada sentrifus yang umum diketahui

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

kemiringan sekitar 45 derajat. Kecepatan putaran lebih cepat

Gambar 7. Bagian bagian alat sentrifus dan jenis rotornya

Berdasarkan kecepatannya sentrifus dapat dikelompokkan antara

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Hal hal yang perlu diperhatikan didalam penggunaan alat sentrifus:

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Tabung tabung (tube) dan isinya harus ditimbang terlebih

Tabel 1.2. Pengamatan supernatan setelah

4. Alat elektroforesis SDS (SDS PAGE)

SDS PAGE atau Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

berat molekulnya. Teknik ini banyak digunakan dalam forensik,

Komponen peralatan untuk SDS-PAGE adalah sebagai berikut:

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM

Casting stand (tempat untuk

Gambar 8. Komponen yang diperlukan untuk SDS-PAGE

Urutan prosedur penggunaan alat :

1. Bersihkan kaca dengan etanol 70%

2. Masukkan kaca pada casting frame

Laboratorium Biokimia Fakultas Farmasi UGM