TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER DAN EKSTRAK METANOL-

AIR DARI HERBA PEGAGAN EMBUN

(Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) TERHADAP Artemia salina Leach

SKRIPSI

Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat

Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S. Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi

Oleh:
Maria Rosa Irma Budi Cahyani
NIM : 038114065

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
YOGYAKARTA
2007
TOKSDTAS AKUT EKSTRAK DIETII, ETER DAII EKSTRAK METAIiOL
AIR DARI mRAA PDGAGANE,MIIJN (Etd@oEle dMt4tp nnalntL\
lEBEltDAl A.tznl, talltu la.n

Yeg dt:ajuteaoL! :

MadaRos lr6a BudiCdhyei

NlM i 038114065

YolEB Dwialu4a lvlsi

Td98E1......,.,,.-.......-..
 Psg6.l& strip6i
Berjtdul
ToKSIST/\SATUT f,KSTRAI(DIETIL EITR DANEKSITAK MDTANOI.
ArR DARIEEnAA PEGAGANEMnuN @tdtourlle ttMhAtod.,l&L,
TLSADAP -rrraiia &ai@Iach

OI€h:
Mdir Ro$ Im Budic.ltdi
NIM| 03El14065

DiFtutatar di h!d4.n rditi! Pengljiskip6i

lahlla!tall@i
Uliv€Eitar SMta Dh.m!
Pad!tanggdl5 Agushts2007

Yohr!€sDwidirla M.Si

L Yot aesDwiarnt4 M.si.

4\
2. ChrisrimP.launi M.Si.,Apt

3. lp.ng DjtdErto, S.Si, Apt ,w" 2.

 iv

”Belajarlah pada-Ku

Karna Aku lembut dan rendah hati

Dan jiwa-Ku akan diam dalam damai abadi”

Kupersembahkan karya sederhana ini untuk:

Tuhan Yang Maha Esa yang selalu memberkati kehidupanku

Bapak, Ibu dan Kakakku yang senantiasa mendoakan dan mendukungku

Frederikus Adi Prasetyo yang selalu menyiramiku dengan cinta kasih

Serta almamaterku
 TXf,NTATAAN I<EASI-IANT(ARIA

S!y. menyltata d6ngd sAdeguhn € bahw skipsi ydg sy. tulis ti.lal neiet
t&ya a&! b{gim oarg bia t€cuali}ug telrh diebutt ! dabn tft'p.! do dan .
post kr" sebaeri@ bylkirya kary. itdiab.

Mnir RosaIma Bldi Crb@i

 vi

PRAKATA

Puji dan syukur kepada Tuhan Yang Maha Esa atas berkat dan rahmat-Nya

yang berlimpah kepada penulis, sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi yang

berjudul TOKSISTAS AKUT EKSTRAK DIETIL ETER dan EKSTRAK

METANOL-AIR dari HERBA PEGAGAN EMBUN (Hydrocotyle sibthorpioides

Lmk.) terhadap Artemia salina Leach, sebagai salah satu syarat untuk memperoleh

gelar Sarjana Farmasi (S.Farm.) pada Fakultas Farmasi, Universitas Sanata Dharma,

Yogyakarta.

Keberhasilan penyusunan skripsi ini tidak lepas dari bantuan dan dukungan

berbagai pihak, baik berupa moril, materiil maupun spirituil. Penulis mengucapkan

terima kasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Ibu Rita Suhadi, M.Si., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi, Universitas

Sanata Dharma Yogyakarta.

2. Bapak Yohanes Dwiatmaka, M.Si. selaku pembimbing dan dosen penguji.

Terima kasih atas bimbingan, masukan, waktu dan perhatiannya selama

penelitian dan penyusunan skripsi ini.

3. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah

memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi

ini.

4. Bapak Ipang Djunarko, S.Si., Apt. selaku dosen penguji yang telah

memberikan masukan, perhatian, kritik dan saran demi kesempurnaan skripsi

ini.
 vii

5. Bapak, Ibu, kakakku Indah, beserta keluarga FX. Sulistyono, S.Pd., MM yang

telah memberikan dukungan baik material maupun spiritual.

6. Frederikus Adi Prasetyo, atas segala cinta dan semangat yang mampu

membuatku bertahan dalam menyelesaikan skripsi ini.

7. Alm. Damianus Bramantyo Idaman, semoga kau berbahagia di sisi-Nya.

Terima kasih atas segala kebersamaan yang pernah terjalin walau hanya

sebentar, namun akan selalu terkenang.

8. Devi, Komank, Titien, Ratna, Anien, terima kasih atas persahabatan dan

kebersamaan dalam suka maupun duka.

9. Mbak Sinta, Lia, Mbak Dika, Mas Wondo, Apri, Novi, Hartono, kkn_Merry

dan kkn_Iin terima kasih kerjasama, bantuan dan dukungannya.

10. Karyawan dan laboran Laboratorium (Mas Wagiran, Mas Sigit, Mas Andre,

Mas Parlan, Mas Kunto dan Pak Mukmin) yang telah banyak membantu

selama penelitian ini.

11. Semua angkatan ’03 terlebih kelas B dan semua pihak yang tidak dapat

disebutkan satu persatu, yang telah membantu selama penyelesaian skripsi ini.

Semoga Tuhan senanatiasa melimpahkan berkat dan Rahmat-Nya atas segala

kebaikan dan ketulusan yang telah diberikan.

 viii

Penulis menyadari masih banyak kekurangan dalam penyusunan skripsi ini.

Oleh karena itu, penulis mengharapkan kritik dan saran demi penyempurnaan skripsi

ini. Akhirnya besar harapan penulis semoga skripsi ini dapat bermanfaat bagi

perkembangan ilmu dan berbagai pihak.

Yogyakarta,....................2007

Penyusun
 ix

DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ………………………………………................................. i

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ................................................... ii

HALAMAN PENGESAHAN ............................................................................... iii

HALAMAN PERSEMBAHAN............................................................................. iv

PERNYATAAN KEASLIAN KARYA ................................................................ v

PRAKATA ............................................................................................................ vi

DAFTAR ISI ........................................................................................................ ix

DAFTAR TABEL ................................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR ............................................................................................ xiv

INTISARI............................................................................................................. xv

ABSTRACT .......................................................................................................... xvi

BAB I. PENGANTAR ………………………………………………................. 1

A. Latar Belakang ……………………………………………............... 1

1. Perumusan masalah ………………………..................…. ...... 2

2. Keaslian penelitian ………………….................……….......... 3

3. Manfaat penelitian …………………….................………...... 3

B. Tujuan Penelitian …………………………...................………......... 4

BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ………………....................………........ 5

A. Pegagan Embun ..…………………………..................………......... 5

1. Keterangan botani .. ……………….................………............ 5

 x

2. Nama lokal ............…….................…………………….......... 5

3. Uraian tanaman .....………….................…………………...... 5

4. Kandungan kimia ..................................................................... 6

B. Artemia salina Leach ........................................................................... 6

1. Keterangan zoologi .. ………………….................………....... 6

2. Morfologi ..............…………………................…….…........... 6

3. Lingkungan hidup .....…………………………........................ 8

4. Perkembangan dan siklus hidup ............................................... 9

5. Metode BST ............................................................................. 10

C. Apoptosis ............................................................................................. 14

D. Penyarian ............................................................................................. 15

E. Senyawa yang Diidentifikasi ............................................................... 17

1. Terpenoid ................. ……………………............................… 17

2. Flavonoid ..................……………….................……............... 18

F. Kromatografi Lapis Tipis .................................................................... 19

G. Keterangan Empiris .............................................................................. 21

BAB III. METODOLOGI PENELITIAN ............................................................. 21

A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................ 21

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional ...................................... 21

1. Variabel penelitian ................. …………………………........... 21

2. Definisi operasional ...............……………...……………......... 21

C. Bahan dan Alat Penelitian ..................................................................... 23

 xi

1. Bahan penelitian................. …………………………............... 23

2. Alat Penelitian...............……………...…………….................. 23

D. Tatacara Penelitian ............................................................................... 24

1. Determinasi herba pegagan embun ........…………….............. 24

2. Pengumpulan bahan ............………………………………...... 24

3. Pembuatan simplisia .....………………………………............ 24

4. Penyarian ................................................................................... 25

5. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB)...................…………....... 27

6. Penetasan telur ....…………………………………................... 27

7. Pembuatan larutan uji ……......................................................... 28

9. Uji toksisitas akut dengan metode BST ..................................... 28

10. Uji KLT ekstrak aktif pegagan embun .................................. 29

11. Analisis hasil ........................................................................... 30

BAB IV. HASIL PENELITIAN dan PEMBAHASAN ........................................ 31

A. Identifikasi Tanaman ............................................................................ 31

B. Pengumpulan Bahan ............................................................................. 31

C. Pembuatan Simplisia ............................................................................ 32

D. Penyarian Herba Pegagan Embun Menggunakan Pelarut Dietil Eter

dan Metanol ........................................................................................ 33

E. Air Laut Buatan (ALB) ……............................................................... 36

E. Penetasan Siste .................................................................................... 37

F. Toksisitas Akut dengan Metode BST ................................................. 39

 xii

G. Uji Kualitatif Ekstrak aktif dengan KLT ............................................ 50

BAB V. KESIMPULAN dan SARAN ................................................... 57

A. Kesimpulan ....................................................................................... 57

B. Saran .................................................................................................. 57

DAFTAR PUSTAKA ......................................................................................... 58

LAMPIRAN .................................................................................................. ..... 61

BIOGRAFI PENULIS .................................................................................. ..... 67

 xiii

DAFTAR TABEL

Tabel I. Kriteria ketoksikan akut ........................................................ ....... 14

Tabel II. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak

Dietil eter herba pegagan embun................................................ 46

Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak

metanol-air herba pegagan embun ................................................ 48

Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan terpenoid dalam ekstrak dietil eter herba

pegagan embun ............................................................................. 51

Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak dietil eter herba

pegagan embun .............................................................................. 53

 xiv

DAFTAR GAMBAR

Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa .................................................. 7

Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual ............................................................ 9

Gambar 3. Siklus sel .............................................................................................. 18

Gambar 4. Bagan mekanisme terjadinya apoptosis ............................................... 41

Gambar 5. Mekanisme monoterpenoid menginduksi apoptosis ........................... 42

Gambar 6. Mekanisme flavonoid menginduksi apoptosis .................................... 43

Gambar 7. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak dietil eter

herba pegagan embun .......................................................................... 47

Gambar 8. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak metanol-air

herba pegagan embun .......................................................................... 49

Gambar 9. Reaksi vanilin asam sulfat untuk pemeriksaan senyawa terpenoid .... 52

Gambar 10. Reaksi dengan uap amonia untuk pemeriksaan senyawa flavonoid ... 54
 xv

INTISARI

Penyakit kanker merupakan salah satu ancaman yang utama terhadap

kesehatan. Kanker termasuk urutan kelima terbanyak sebagai penyebab kematian.
Sedangkan sediaan antikanker hingga saat ini sangat terbatas, oleh karena itu perlu
dilakukan pencarian terhadap senyawa-senyawa antikanker yang baru. Herba pegagan
embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) diduga mengandung senyawa yang
berkhasiat sebagai antikanker namun sampai saat ini belum ada penelitian mengenai
hal ini. Untuk mengetahui aktivitas herba pegagan embun sebagai obat antikanker
maka dilakukan uji pendahuluan dengan menggunakan metode Brine Shrimp
Lethalithy Test (BST), yang dinyatakan dengan harga Median Lethal Concentration
50 (LC50).

Penelitian ini merupakan eksperimental murni dengan rancangan penelitian

Posttest Only Control Group Design. Penelitian dilakukan dengan menggunakan
ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun. Ekstrak diperoleh
dengan metode perkolasi. Sampel uji dibuat seri konsentrasi 125, 250, 500, 1000, dan
2000 µg/ml. Kontrol menggunakan air laut buatan, replikasi dilakukan 5 kali. Jumlah
larva Artemia salina Leach yang mati pada tiap konsentrasi dihitung setelah 24 jam
perlakuan. Nilai LC50 dihitung dengan analisis probit. Ekstrak dikatakan toksik
apabila harga LC50 ≤ 1000 µg/ml. Dari ekstrak yang paling toksik ( paling aktif )
dilakukan identifikasi menggunakan kromatografi lapis tipis (KLT) untuk mengetahui
golongan senyawa yang terkandung di dalamnya.

Hasil penelitian menunjukkan harga LC50 ekstrak metanol-air sebesar 769

µg/ml dan ekstrak dietil eter 229 µg/ml, sehingga ekstrak dietil eter lebih toksik
dibandingkan ekstrak metanol-air. Identifikasi kandungan golongan senyawa dengan
KLT menunjukkan bahwa ekstrak dietil eter mengandung flavonoid dan terpenoid.

Kata kunci : Herba pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.), BST,

Artemia, LC50, KLT, flavonoid, terpenoid.
 xvi

ABSTRACT
Cancer disease is one of the main threats for health. Cancer is included in the
four biggest deathly causes. Meanwhile, the dosage of anti cancer is very limited
nowadays, therefore it is necessary to find out some new anti cancer compounds.
Pagagan embun herbs (Hydrcotyle sibthorpiodes Lmk.) is considered contains merit
compounds as the anti cancer, but there is no research about it until now. For
knowing the activity of Pegagan embun herbs as anti cancer medicine, it needs to do
a preliminary examination using Brine Shrimp Lethality Test (BST) method, which is
presented with the value Median Lethal Concentration 50 (LC50).
This research is pure experimental with Posttest Only Control Group Design
as the research design. This research is elaborated using water methanol extract and
pegagan herbs diethyl ether extract. The extracts are gained through percolation
method. Concentration serials of examination sample made are 125, 250, 500, 1000,
and 2000 µg/ml. Control for the research used is artificial sea water and the
replication is made 5 times. Number of Artemia salina larva Leach that dies in every
concentration is counted after 24 hours of treatment. LC50 is counted using probit
analysis. Extract is said to be toxic if the rate of LC50 ≤ 1000 µg/ml. From the most
toxic extract (most active) is being identified using thin layer chromatography (TLC)
to know the compounds type contained in it.
The result of the research shows the LC 50 rate of water methanol extract as
mush as 769 µg/ml and diethyl ether extract as much as 229 µg/ml, so that diethyl
ether extract is more toxic than water methanol extract. The identification of
compounds type using TLC shows that diethyl ether extract contains flavonoid and
terpenoid.
Keywords: Pegagan embun herbs (Hydrocotyle sibthorpodes Lmk), BST, Artemia,
LC50, TLC, flavonoida, terpenoid.
 1

BAB I

PENGANTAR

A. Latar Belakang

Kanker adalah suatu penyakit sel dengan ciri atau gangguan atau

kegagalan mekanisme pengatur multiplikasi dan fungsi homeostatis lainnya pada

organisme multiseluler dan bersifat metastatis (Tanu, 1998). Sampai saat ini

penyakit kanker masih menjadi salah satu penyakit yang ditakuti masyarakat.

Menurut Siswandono dan Soekardjo (2000) sampai saat ini masih sedikit sekali

obat antikanker yang bekerja secara selektif untuk pengobatan jenis kanker

tertentu. Berbagai usaha penganggulangan terhadap penyakit ini telah dilakukan

namun hasil yang didapat belum maksimal, seperti pembedahan, terapi radiasi dan

kemoterapi.

Cara lain yang dipilih sebagian masyarakat adalah dengan memanfaatkan

bahan alam. Salah satu penelitiannya dilakukan terhadap herba pegagan embun.

Herba pegagan embun diduga mengandung senyawa yang berkhasiat sebagai

antikanker (Anonim, 2002). Herba pegagan embun mengandung beberapa

senyawa antara lain terpenoid minyak atsiri (trans-β-farnesene, β-pinene, α-

pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan ocimene yang

keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan sesquiterpenoid) dan

flavonoid.

Aktivitas sitotoksik herba pegagan embun disebabkan karena adanya

kandungan senyawa terpenoid (khususnya monoterpenoid dan sesquiterpenoid)

dan flavonoid yang mampu menginduksi terjadinya apoptosis. Apoptosis adalah

 2

program kematian sel. Terpenoid menginduksi apoptosis melalui jalur Fas/Fas

ligand (Rajesh, Rachele, Stenzel and Howard, 2003) dan flavonoid menginduksi

apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert, Johnson, Lewis, Raff,

Roberts and Walter, 2002). Kelarutan senyawa monoterpenoid dan

sesquiterpenoid sangat besar dalam pelarut dietil eter (Harborne, 1987),

sedangkan flavonoid sangat larut dalam metanol dan air. Oleh karena itu dalam

penelitian ini digunakan ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan

embun.

Skrining aktivitas sitotoksik dari ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air

herba pegagan embun dilakukan dengan metode Brine Shrimp Lethality Test

(BST). Prinsip metode ini adalah uji toksisitas akut terhadap larva Artemia salina

L. dengan penentuan nilai LC50 setelah perlakuan 24 jam (Meyer, Ferrigni,

Putnam, Jacobsen, Nichols, and McLaughlin, 1982). Suatu senyawa dikatakan

mempunyai potensi toksik jika nilai LC50 < 1000 μg/ml. Keberadaan senyawa

monoterpenoid dan sesquiterpenoid serta flavonoid di dalam ekstrak toksik herba

pegagan embun dipastikan melalui profil Kromatografi Lapis Tipis.

1. Perumusan masalah

a. Apakah ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun

mempunyai potensi toksik terhadap larva artemia?

b. Ekstrak manakah yang mempunyai potensi toksik lebih tinggi terhadap

larva artemia?

c. Golongan senyawa apakah yang terkandung dalam ekstrak toksik herba

pegagan embun?
 3

2. Keaslian penelitian

Penelitian yang pernah dilakukan terhadap herba pegagan embun

adalah isolasi dan identifikasi beberapa senyawa seperti monoterpenoid,

sesquiterpenoid, fenol dan minyak atsiri menggunakan metode Gas Liquid

Chromatography (GLC) oleh Anonim (2002). Telah diketahui bahwa

kandungan dari herba pegagan embun berkhasiat sebagai antitumor (Anonim,

2002). Tetapi sejauh penelusuran pustaka, belum pernah dilakukan penelitian

mengenai toksisitas akut ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba

pegagan embun terhadap larva artemia.

3. Manfaat penelitian

a. Manfaat teoritis

Penelitian ini diharapkan memberikan informasi yang berguna bagi

perkembangan ilmu pengetahuan terutama dalam bidang farmasi mengenai

seberapa besar aktivitas ketoksikan dari ekstrak dietil eter dan ekstrak

metanol-air herba pegagan embun dengan metode BST.

b. Manfaat praktis

Ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun dapat

digunakan sebagai bahan dalam skrining awal terhadap senyawa yang

berpotensi sebagai antikanker dengan metode BST.

 4

B. Tujuan Penelitian

1. Menetapkan nilai LC50 ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba

pegagan embun.

2. Mengetahui ekstrak mana yang mempunyai efek toksik lebih tinggi

terhadap larva artemia.

3. Mengetahui golongan senyawa yang terkandung pada ekstrak toksik herba

pegagan embun melalui profil kromatografi lapis tipis.

 5

BAB II

PENELAAHAN PUSTAKA

A. Pegagan Embun

1. Keterangan botani

Pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.) mempunyai sinonim

Hydrocotyle rotundifolia, Roxb. dan Hydrocotyle formosana Masamune yang

termasuk dalam familia Umbelliferae (Apiaceae) (Anonim, 2002).

2. Nama lokal

Pegagan embun, antanan beurit, antanan lembut (Sunda); Andem,

katepa’n, rending, semanggi (Jawa); Salatun: take cena (Madura), tikim, patikim;

Tian husui (Cina) (Anonim, 2002).

3. Uraian tanaman

Pegagan embun merupakan tanaman yang tumbuh merayap dengan

ramping, dapat tumbuh subur di tempat yang lembab, terbuka maupun teduh, di

pinggir jalan, pinggir selokan, lapangan rumput dan di tempat lain sampai setinggi

kira-kira 22500 m dari permukaan laut. Tanaman pegagan embun mempunyai

batang yang lunak dan berongga dengan panjang 45 cm/lebih, berdaun tunggal

berseling, mempunyai tangkai panjang berbentuk bulat atau reniform dengan

pinggir terbagi menjadi 5-7 lekukan dangkal, serta berwarna hijau. Bunga

tanaman pegagan embun merupakan bunga majemuk berbentuk bongkol yang

keluar dari ketiak daun dan berwarna kuning (Anonim,2002).

 6

4. Kandungan kimia

Herba pegagan embun yang berkhasiat untuk mengobati tumor, reumatik,

infeksi saluran nafas, gangguan pencernaan, dan masalah kulit mempunyai

kandungan kimiawi yang antara lain terdiri dari: terpenoid minyak atsiri (trans-β-

farnesene, β-pinene, α-pinene, β-caryophyllene, α-humulene, camphene, dan

ocimene yang keberadaannya dinyatakan dalam monoterpenoid dan

sesquiterpenoid) dan flavonoid (quersetin 3-galaktosid) (Anonim, 2002).

B. Artemia salina Leach

1. Keterangan zoologi

Artemia (Artemia salina Leach) yang digunakan dalam penelitian ini

termasuk dalam familia Artemidae (Oemarjati dan Wardhana, 1990).

1. Morfologi

a. Telur

Istilah untuk telur artemia yang benar adalah siste, yaitu telur yang telah

berkembang lebih lanjut menjadi embrio dan kemudian, diselubungi oleh

cangkang yang tebal dan kuat. Cangkang ini berguna untuk melindungi embrio

terhadap pengaruh kekeringan, benturan keras, sinar ultraviolet dan

mempermudah penguapan, sehingga ia sangat tahan terhadap keadaan lingkungan

yang buruk (Mudjiman, 1989).

b. Burayak

Apabila telur-telur artemia direndam dalam air laut yang bersuhu 25ºC,

akan menetas dalam waktu 24-36 jam. Dari dalam cangkang keluar beruyak
 7

(larva) yang dikenal dengan istilah nauplius. Dalam perkembangan selanjutnya

burayak akan mengalami 15 kali perubahan bentuk (metamorfosis) setelah itu

berubah menjadi artemia dewasa.

c. Artemia dewasa

Bentuk artemia dewasa lebih sempurna, dengan ukuran panjang sekitar 1

cm dan beratnya 10 mg. Bentuk artemia dewasa menyerupai udang kecil, bagian

kepala berukuran lebih besar kemudian mengecil pada bagian ekor. Panjang ekor

kurang lebih sepertiga dari total panjang tubuh. Dibagian kepala terdapat sepasang

mata dan sepasang antenula (sungut). Pada bagian tubuh terdapat sebelas pasang

kaki atau secara khusus disebut torakopoda, antara ekor dan pasangan kaki

belakang terdapat sepasang alat kelamin, penis pada jantan dan ovarium pada

betina (Mudjiman, 1989).

Gambar 1. Bagian-bagian tubuh artemia dewasa (Mudjiman, 1989)

3. Lingkungan hidup
 8

Artemia tidak dapat bertahan hidup pada suhu kurang dari 6ºC atau lebih

dari 35ºC. Akan tetapi, hal ini sangat jelas tergantung pada ras dan kebiasaan

tempat hidup mereka. Suhu yang baik untuk pertumbuhan artemia berkisar antara

25-30º C. Telur artemia yang kering akan bertahan pada suhu -273ºC dan 100ºC.

Daya tahan artemia terhadap perubahan kandungan ion-ion kimia dalam air

ternyata juga sangat tinggi.

Untuk perkembangan artemia yang baik, mereka membutuhkan kadar

garam yang tinggi. Sebab pada kadar garam yang tinggi dapat terhindar dari

musuh-musuh yang tidak dapat hidup pada kadar garam yang tinggi. Sedangkan

untuk pertumbuhan telur (siste) dibutuhkan kadar garam yang lebih rendah

daripada batas tertentu. Batas ini berlainan untuk setiap jenis artemia (Mudjiman,

1989).

Agar artemia dapat hidup lebih baik, kadar oksigen terlarutnya harus

mendekati titik kejenuhan, yaitu sekitar 3 ppm (bagian per juta). Terhadap

perubahan-perubahan kadar oksigen terlarut ini, sebenarnya artemia sangat pandai

menyesuaikan diri. Pada kadar oksigen yang hanya 1 ppm, artemia masih juga

dapat bertahan. Sebaliknya, merekapun dapat hidup pada kejenuhan oksigen lebih

dari 1,5 x 106 ppm (Mudjiman, 1989).

Pengaruh pH terhadap kehidupan artemia muda dan dewasa belum jelas

namun berpengaruh terhadap penetasan telur. Apabila pH untuk penetasan kurang

dari 8, maka efisiensi penetasan akan menurun. Siste banyak yang tidak menetas

atau waktu penetasannya menjadi lebih panjang (Mudjiman,1989).

4. Perkembangan dan siklus hidup

 9

Ditinjau dari segi cara berkembang biaknya, ada dua jenis artemia yaitu

jenis biseksual dan jenis partenogenetik. Jenis biseksual tidak dapat berkembang

biak secara parthenogenesis, dan sebaliknya jenis partenogenetik tidak dapat

berkembang biak secara biseksual (Mudjiman, 1989).

Pada perkembangbiakan biseksual maupun parthenogenesis dapat terjadi

secara ovovivipar maupun ovipar. Cara ovovivipar yang keluar dari induknya

sudah berupa burayak atau larva (nauplis), sedangkan cara ovipar yang keluar dari

induknya berupa telur bercangkang. Sebutan yang tepat untuk telur ini yaitu siste

karena berisi embrio. Apabila telur artemia berada dalam lingkungan yang sesuai

misalnya kadar garam, suhu, dan pH yang sesuai maka telur dapat memetas

menjadi nauplis dalam waktu 14 hari menjadi artemia dewasa (Mudjiman, 1989).

Gambar 2. Siklus hidup artemia biseksual (Mudjiman, 1989)

5. Metode BST
 10

a. Penggunaan artemia pada metode BST

Artemia digunakan sebagai hewan coba dalam praskrining aktivitas

antikanker di National Cancer Institute (NCI), Amerika Serikat. Metode ini sering

digunakan untuk skrining awal terhadap senyawa aktif yang terdapat di dalam

ekstrak tanaman karena murah, cepat, mudah (tidak memerlukan kondisi aseptis),

dan dapat dipercaya. Metode BST juga memiliki kekurangan karena artemia tidak

mampu mendeteksi senyawa yang dalam aktivitas fisiologinya memerlukan

aktivasi di dalam tubuh mamalia seperti 6-merkaptopurin dan siklofosfamida

(Meyer et al., 1982). Meskipun pengujian ini tidak dapat mendeteksi senyawa

yang dibutuhkan untuk aktivasi metabolik pada mamalia, tetapi uji BST ini dapat

dipercaya sebagai detektor aktivitas biologik (Solis, Wright, Gupta, and Phillipson

1992).

Uji larva udang ini juga dapat digunakan untuk skrining awal terhadap

senyawa-senyawa yang diduga berkhasiat sebagai antitumor karena uji ini sering

sekali mempunyai korelasi yang positif dengan potensinya sebagai antitumor

(Anderson, Goets, and Mc Laughin, 1991). Penggunaan larva artemia memang

tidak spesifik untuk antitumor, namun dapat menunjukkan kemampuannya untuk

memonitor kemungkinan adanya efek toksik secara lebih cepat dibandingkan

dengan prosedur pengujian sitotoksitas menggunakan biakan sel kanker (Meyer et

al., 1982).

Kemampuan artemia untuk mendeteksi efek sitotoksik sangat

dimungkinkan karena artemia mempunyai kesamaan sistem enzim dengan sistem

enzim pada mamalia, yaitu tipe DNA-dependent RNA polymerase dan oubaine
 11

sensitive Na+ dan K+ dependent ATPase (Solis et al., 1993), sehingga senyawa

maupun ekstrak yang mempunyai aktivitas pada sistem tersebut dapat terdeteksi.

DNA-dependent RNA polymerase merupakan sistem enzim yang berperan dalam

sistesis protein (polinukleotida). RNA polymerase akan berikatan dengan DNA

pada tahap transkripsi di dalam nukleus. Dalam hal ini DNA berperan sebagai

cetakan dalam pembuatan nukleotida RNA yang baru. RNA, khususnya RNA

messenger (mRNA) inilah yang membawa pesan genetik, yang kemudian akan

diterjemahkan RNA translasi (tRNA) dalam proses sintesis protein (Campbell,

Recee, and Mitchell, 2002).

Na+-K+ ATPase ditemukan dalam semua bagian tubuh manusia. Na+-K+

ATPase mengkatalisis hidrolisis ATP menjadi ADP serta menggunakan tenaga

untuk menggerakkan 3 Na+ keluar dari sel dalam pertukaran bagi tiap 2 K+ yang

digerakkan ke dalam sel bagi tiap mol ATP yang dihidrolisis. Ouabain merupakan

penghambat Na+-K+ ATPase yang paling aktif, di mana tempatnya berikatan yaitu

pada subunit terkecil dari suatu kompleks enzim dan letaknya tak jauh dari tempat

berikatannya ATP. Suatu penghambat (inhibitor) dalam darah manusia akan

bersaing dengan ikatan ouabain dan memungkinkan mengontrol transport Na+-K+.

Na+-K+ ATPase secara tidak langsung mempengaruhi transport Ca2+ di

dalam jantung. Jika kerja Na+-K+ ATPase dihambat oleh ouabain maka Ca2+ akan

meningkat, keadaan ini sangat bermanfaat dalam terapi payah jantung karena akan

memudahkan kontraksi otot jantung. Pada hewan, pemeliharaan tekanan dan

volume sel yang normal tergantung atas pompa Na+ dan K+. Tanpa pompa ini, Cl-

dan Na+ akan memasuki sel menuruni perbedaan konsentrasinya, serta air akan
 12

mengikuti sepanjang perbedaan osmotik yang diciptakan sehingga sel

membengkak (Ganong, 1995). Sel yang membengkak selanjutnya dapat

mengalami lisis sehingga sel tersebut mati.

Artemia dinilai sukup akurat mewakili model sel kanker, hal ini telah

dibuktikan oleh Meyer (1982) lewat penelitiannya. Hasil penelitiannya

menunjukkan bahwa suatu ekstrak yang berpotensi toksik dan bersifat sitotoksik,

ketika diujikan pada artemia juga memberikan hasil yang sama.

b. Parameter toksisitas

Toksisitas merupakan suatu istilah relatif yang biasa digunakan untuk

membandingkan apakah zat kimia yang satu lebih toksik dari yang lain. Uji

toksisitas tidak khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi

keseluruhan potensi toksik suatu senyawa pada aneka ragam jenis hewan uji.

Termasuk dalam uji toksisitas tidak khas ialah uji toksisitas akut. Uji toksisitas

akut merupakan uji toksisitas dengan pemberian suatu senyawa yang diberikan

dengan dosis tunggal pada hewan uji tertentu dan pengamatan dilakukan selama

24 jam. Maksud uji toksisitas akut adalah untuk menentukan gejala toksik sebagai

akibat pemberian suatu senyawa dan untuk menentukan tingkat letalitasnya

(Loomis, 1978). Selain uji toksisitas akut, di dalam uji toksisitas tidak khas

termasuk pula uji toksisitas subkronis dan uji toksisitas kronis. Uji toksisitas yang

khas yaitu uji toksisitas yang dirancang untuk mengevaluasi secara rinci potensi

toksik yang spesifik suatu senyawa pada aneka ragam hewan uji. Termasuk dalam

uji ini ialah uji potensial, uji kekarsinogenikan, uji kemutagenikan, uji

keteratogenikan, uji mata dan uji kulit.

 13

Tolok ukur pengamatan potensi ketoksikan meliputi tolok ukur kualitatif

dan kuantitatif. Tolok ukur kualitatif terdiri dari mekanisme efek toksik, wujud

efek toksik, sifat efek toksik dan gejala klinis. Tolok ukur kuantitatif berupa LC50,

yaitu konsentrasi yang dapat menyebabkan kematian pada 50% hewan uji. Dalam

tolok ukur kuantitatif ini terdapat hubungan antara konsentrasi dengan ketoksikan

suatu senyawa. Hubungan antara konsentrasi-respon lebih banyak digunakan

dalam evaluasi ketoksikan suatu senyawa karena tujuannya lebih ditujukan pada

resiko (ukuran kemungkinan timbulnya potensi toksik pada sekelompok hewan

uji).

Uji toksisitas akut digunakan untuk menentukan harga LD50 atau LC50

suatu senyawa bilamana lama pengamatan tidak ditunjukkan, maka dianggap

bahwa pengamatan dilakukan selama 24 jam (Donatus, 2001). Parameter LC50

digunakan dalam metode BST dan bukan LD50 karena dalam hal ini larva artemia

terpejani senyawa toksik yang ada pada media hidupnya, yaitu Air Laut Buatan

(ALB). Uji toksisitas akut dengan hewan uji Artemia salina Leach digunakan

sebagai uji pendahuluan pada penelitian yang mengarah pada uji sitotoksik. Suatu

senyawa disebut toksik jika harga LC50 dari uji toksisitas akut < 1000 µg/ml

(Meyer et al., 1982).

Parameter yang digunakan untuk menunjukkan adanya aktivitas biologis

suatu senyawa pada artemia adalah kematian. Keuntungan penggunaan arrtemia

sebagai hewan uji adalah kesederhanaan dalam pelaksanaan, waktu relatif singkat,

dan konsentrasi kecil sudah dapat menimbulkan aktivitas biologis (Meyer et al.,

1982)
 14

Tabel I. Kriteria ketoksikan akut (Loomis, 1978)

KRITERIA LC50 (µg/ml)

Luar biasa toksik 1 atau kurang

Sangat toksik 1 – 50

Cukup toksik 50 – 500

Sedikit toksik 500 – 5000

Praktis tidak toksik 5000 – 15.000

Relatif kurang berbahaya ≥ 15.000

C. Apoptosis

Kematian sel (apoptosis) meruoakan bagian penting dalam perkembangan

manusia, yang terjadi selama proses oogenesis, perkembangan otak dan pada

pembentukan kaki serta tangan. Apoptosis melibatkan gen-gen khusus dan jalur

pemberi signal yang mendasari program kematian sel. Apoptosis dapat terjadi

pada suatu sel tanpa menyebabkan kerusakan pada sel dan jaringan di sekitarnya

(Rajesh, et al., 2003).

Karakteristik apoptosis bila ditinjau dari segi morfologi :

1. penyusutan sel : sel menjadi lebih kecil dan kehilangan kontak dengan sel-

sel yang berada di sekelilingnya.

2. terjadi ”blebbing” yaitu adanya tonjolan-tonjolan kecil di permukaan

membran sel.
 15

3. pemecahan sel membentuk ”badan apoptotik” dan terjadi fagositosis dari

pecahan-pecahan sel ini oleh makrofag.

Apoptosis diatur oleh berbagai jalur pemberi signal yang kesemuanya itu

melibatkan caspase. Caspase merupakan kelompok dari sistein protease, yaitu

suatu enzim yang bertugas mencerna protein. Dalam tubuh manusia, kebanyakan

caspase berada dalam bentuk inaktif yang kemudian akan diaktivasi melalui

proses proteolisis menjadi bentuk yang lebih aktif.

Monoterpenoid/sesquiterpenoid berpotensi menginduksi apoptosis melalui

jalur Fas/Fas ligand. Potensi monoterpenoid/sesquiterpenoid dalam menginduksi

apoptosis disebabkan karena monoterpenoid/sesquiterpenoid dapat menghambat

peralihan fase G2/M dalam siklus sel (Rajesh, et al 2003). Flavonoid menginduksi

apoptosis dengan mencegah terjadinya mutasi p53 (Albert et al., 2002).

D. Penyarian

Kegiatan penarikan zat yang dapat larut dari bahan yang tidak dapat larut

dengan pelarut cair disebut dengan istilah penyarian. Faktor yang mempengaruhi

kecepatan penyarian adalah kecepatan difusi zat yang dapat larut melalui lapisan-

lapisan batas antara cairan penyari dengan bahan yang mengandung zat tersebut.

Untuk melakukan penyarian harus diketahui zat aktif yang dikandungnya

sehingga mempermudah pemilihan cairan penyari serta cara penyarian yang tepat.

Secara umum ada 4 metode penyarian yaitu maserasi, infundasi, perkolasi dan

destilasi uap (Anonim, 1986).

 16

Perkolasi merupakan cara penyarian yang dilakukan dengan mengalirkan

cairan penyarian melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Metode perkolasi

digunakan dalam penelitian ini karena dapat menyari zat aktif lebih optimal

dibandingkan dengan menggunakan metode maserasi. Hal tersebut dikarenakan:

1. aliran cairan penyari menyebabkan adanya pergantian larutan yang terjadi

dengan larutan yang konsentrasinya lebih rendah, sehingga meningkatkan

derajat perbedaan konsentrasi.

2. ruangan diantara butir-butir serbuk simplisia membentuk saluran tempat

mengalir cairan penyari. Oleh karena kecilnya cairan kapiler tersebut, maka

kecepatan pelarut cukup untuk mengurangi lapisan atas, sehingga dapat

meningkatkan perbedaan konsentrasi (Anonim, 1986).

Selain itu, perkolasi lebih efisien bila dibandingkan dengan maserasi karena

prosesnya yang berkesinambungan di mana cairan penyari yang telah jenuh akan

digantikan dengan cairan penyari yang lebih segar terus-menerus (Silva, Lee,

Kinghorn, 1998)

Prinsip perkolasi adalah sebagai berikut : serbuk simplisia ditempatkan

dalam suatu bejana silinder yang bagian bawahnya diberi sekat berpori, cairan

penyari dialirkan dari atas ke bawah melalui serbuk tersebut, cairan penyari akan

melarutkan zat aktif sel-sel yang dapat dilalui sampai mencapai keadaan jenuh,

gerak ke bawah disebabkan oleh kekuatan gaya beratnya sendiri dan cairan di

atasnya, dikurangi dengan daya kapiler yang cenderung untuk menahan. Kekuatan

yang berperan dalam perkolasi antara lain : gaya berat, kekentalan, daya larut,
 17

tegangan permukaan, difusi osmosa, adhesi, daya kapiler dan daya geseran

(Anonim, 1986).

Alat yang digunakan untuk perkolasi adalah perkolator, cairan yang

digunakan untuk menyari yang disebut cairan penyari atau menstrum, larutan zat

aktif yang keluar dari perkolator disebut sari atau perkolat, sedang sisa setelah

dilakukan penyarian disebut ampas atau sisa perkolasi (Anonim, 1986).

E. Senyawa Yang Diidentifikasi

1. Terpenoid

Senyawa terpenoid pada umumnya terdapat dalam sitoplasma sel

tumbuhan serta berperan penting baik dalam pertumbuhan dan metabolisme

maupun pada ekologi tumbuhan. Terpenoid terdiri atas beberapa macam senyawa,

mulai dari komponen minyak atsiri, yaitu monoterpena dan sesquiterpena,

diterpena, triterpena, sterol serta pigmen karotenoid. Semua senyawa terpenoid

berasal dari molekul isoprena CH2=C(CH3)-CH=CH2. Terpenoid biasanya dapat

diekstraksi dari jaringan tumbuhan dengan menggunakan petroleum eter, dietil

eter atau kloroform (Harborne, 1987). Senyawa terpenoid berpotensi sebagai agen

antikanker karena mempunyai sifat sitotoksik yaitu dengan menahan peralihan

fase G2/M dalam siklus sel(Rajesh et al., 2003).

 18

Gambar 3. Siklus sel (Katzung and Trevor. 1993)

Menurut (Mursyidi, 1990), senyawa terpenoid dapat dipisahkan dengan

Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Fase gerak yang digunakan yaitu toluen-etil

asetat (93:7 v/v). Sedangkan fase diam yang digunakan adalah silika gel GF254

atau selulosa. Terpenoid dideteksi dengan menggunakan pereaksi vanilin asam

sulfat.

2. Flavonoid

Senyawa fenol alam, flavonoid terdapat dalam hampir semua tumbuhan

dari bangsa algae hingga Gymnospermae. Di dalam tumbuhan, flavonoid biasanya

berikatan dengan gula sebagai glikosida. Molekul yang berikatan dengan gula

disebut aglikon. Aglikon flavonoid adalah polifenol sehingga flavonoid

mempunyai sifat kimia fenol (Mursyidi,1990). Golongan senyawa flavonoid

bersifat polar karena mempunyai gugus hidroksil yang tidak tersulih atau

mempunyai suatu gula, sehingga pada umumnya flavonoid cukup larut dalam

pelarut polar. Golongan senyawa flavonoid bersifat polar sehingga pada umumnya

flavonoid cukup larut dalam pelarut polar seperti etanol (EtOH), metanol
 19

(MeOH), butanol (BuOH), aseton, dimetilsulfoksida (DMSO) serta air. Gula yang

terikat pada flavonoid cenderung menyebabkan flavonoid lebih mudah larut

dalam air, dengan demikian campuran pelarut dengan air merupakan pelarut yang

lebih baik untuk glikosida.

Efek flavonoid terhadap macam-macam organisme sangat banyak

macamnya dan dapat menjelaskan mengapa tumbuhan yang mengandung

flavonoid dipakai dalam pengobatan tradisional (Mursyidi, 1990). Menurut

Anonim (2006), flavonoid merupakan salah satu jenis metabolit sekunder yang

diduga menunjukkan adanya aktivitas sebagai antikanker. Flavonoid sebagai

senyawa antikanker pada prinsipnya bersifat sitotoksik, antimetabolit,

antimitotik/mitostatik, menghambat salah satu atau beberapa fase siklus

metabolisme sel (Colis, 1874 cit Santa, 1998).

Adanya senyawa flavonoid dalam suatu bahan dapat dianalisis dengan

KLT. Biasanya digunakan fase diam selulosa dan fase gerak seperti n-butanol-

asam asetat-air (4:1:5 v/v) diambil lapisan atas, kloroform-etil asetat (60:40 v/v),

dan kloroform-aseton-asam format (75:16,5:8,5 v/v). Deteksi terhadap bercak

yang timbul setelah pengembangan dapat menggunakan sinar UV, pereaksi

semprot seperti sitroborat, pereaksi alumunium klorida, dan antimoni triklorida

(Wagner, Brady, dan Zgainski, 1984).

F. Kromatografi Lapis Tipis

Metode pemisahan fisikokimia yang banyak digunakan dalam berbagai

penelitian adalah Kromatografi Lapis Tipis (KLT). Campuran senyawa yang akan
 20

dipisahkan berupa larutan, ditotolkan berupa bercak atau pita pada lempeng

kromatografi, selanjutnya dikembangkan dalam bejana tertutup rapat yang berisi

larutan pengembang yang cocok (fase gerak), pemisahan terjadi selama

perambatan kapiler (Stahl, 1985).

Fase diam (lapisan penjerap) dibuat dari salah satu penjerap yang khusus

digunakan untuk KLT. Penjerap yang umum digunakan adalah silika gel,

alumunium oksida, kieselgur, selulosa dan lain-lain. Fase gerak ialah medium

yang terdiri dari satu atau beberapa pelarut, bergerak di dalam fase diam yang

merupakan lapisan berpori, yang dipengaruhi oleh gaya kapiler. Pelarut yang

digunakan memiliki tingkat mutu analitik dan jika perlu dapat digunakan

campuran pelarut yang terdiri dari 3 jenis pelarut (Stahl, 1985).

Deteksi senyawa pada plat KLT paling sederhana adalah jika senyawa

yang menunjukkan penyerapan di daerah UV dengan panjang gelombang 254 nm

(gelombang pendek) atau gelombang 365 nm (gelombang panjang) (Stahl, 1985).

Deteksi senyawa pada plat KLT biasanya juga dilakukan dengan penyemprotan

dan karena permukaan lebih sempit, maka penyemprotannya merupakan prosedur

nisbi yang sederhana (Harborne, 1987).

Harga Rf yang diperoleh pada KLT tidak tetap, berkisar antara 0,00-1,00

dan ditentukan hanya dua desimal. Bilangan hRf merupakan angka Rf dikalikan

faktor 100 (h), menghasilkan nilai berkisar antara 0-100. Harga Rf untuk senyawa

murni dapat dibandingkan dengan harga-harga standar (Stahl, 1985). Jarak

pengembangan senyawa pada kromatografi biasanya dapat digunakan untuk

identifikasi senyawa yang dianalisa.

 21

Jarak titik pusat bercak dari titik awal

Rf = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯
Jarak garis depan dari titik awal

Kelebihan khas KLT adalah keserbagunaan, kecepatan, dan kepekannya.

Keserbagunaan KLT disebabkan oleh kenyataan bahwa di samping selulosa,

sejumlah penjerap yang berbeda-beda dapat disaputkan pada plat kaca atau

penyangga lain dan digunakan untuk kromatografi. Kecepatan KLT yang lebih

besar disebabkan oleh sifat penjerap yang lebih padat bila disaputkan pada plat

dan merupakan keuntungan bila digunakan untuk menelaah senyawa labil.

Kepekaan KLT sedemikian rupa sehingga bila diperlukan dapat dipisahkan bahan

yang jumlahnya kurang dari ukuran µg (Harborne, 1987).

G. Keterangan Empiris

Penelitian ini dilakukan untuk mendapatkan data empiris tentang potensi

toksik ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter herba pegagan embun terhadap

larva artemia dengan metode BST yang dinyatakan dalam LC50, serta untuk

memperoleh profil kromatografi lapis tipis ekstrak aktif herba pegagan embun.

Data empiris yang diperoleh melalui uji toksisitas akut ekstrak dietil eter

dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun ini memungkinkan untuk dilakukan

eksplorasi guna mendapatkan senyawa toksik yang dapat dilanjutkan dengan uji

sitotoksisitas untuk mendapatkan senyawa antikanker.

 22

BAB III

METODOLOGI PENELITIAN

A. Jenis dan Rancangan Penelitian

Penelitian ini termasuk jenis penelitian eksperimental murni dengan

rancangan Posttest Only Control Group Design.

B. Variabel Penelitian dan Definisi Operasional

1. Variabel penelitian

a. Variabel bebas

Jenis ekstrak yang digunakan yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-

air herba pegagan embun dengan berbagai seri konsentrasi.

b. Variabel tergantung

Nilai LC50 ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan

embun yang diperoleh dari analisis probit.

c. Variabel pengacau terkendali

1) Lingkungan tempat percobaan: sinar lampu 5 watt, suhu penetasan

sebesar 25º C, serta pH air laut buatan antara 7-8 dengan kadar garam

5 permil

2) Umur larva artemia adalah 48 jam.

2. Definisi operasional

a. Herba pegagan embun yang digunakan dalam penelitian ini adalah seluruh

bagian tanaman yang berada di atas tanah meliputi bunga, daun, dan batang.
 23

b. Konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun yaitu 10, 32, 102, 328

dan 1049 µg/ml dan konsentrasi ekstrak metanol- air herba pegagan embun

yaitu 250; 500; 1000; 2000 dan 4000 µg/ml

c. Ekstrak dietil eter merupakan sari yang diperoleh dari hasil perkolasi serbuk

herba pegagan embun menggunakan penyari dietil eter

d. Ekstrak metanol-air merupakan sari yang diperoleh dari hasil perkolasi serbuk

herba pegagan embun menggunakan penyari metanol-air

e. Jumlah kematian larva artemia setelah diberi perlakuan selama 24 jam.

f. Kematian artemia ditunjukkan dengan keadaan dimana tidak ada lagi

pergerakkan dari artemia, baik itu tenggelam, melayang maupun mengapung.

C. Bahan dan Alat Penelitian

1. Bahan penelitian

Bahan utama penelitian ini adalah herba pegagan embun yang telah

dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata Dharma

Yogyakarta, telur artemia, ragi Saccharomyces cerevisae, aquadest, selulosa,

pereaksi semprot AlCl3 dan amonia, natrium klorida, magnesium sulfat,

magnesium klorida, kalsium klorida, natrium hidrokarbonat, n-butanol, asam

asetat, serta bahan kimia yang bila tidak disebutkan lain berderajat pro analisys

meliputi: dietil eter dan metanol.

2. Alat penelitian

Alat yang digunakan dalam penelitian ini meliputi perkolator, waterbath

(Memmert), oven (Mettler), bak penetasan artemia, flakon, aerator, lampu 5 watt,
 24

mikropipet, pipet volume 5 ml (Pyrex), pipet tetes, bejana kromatografi, kertas

saring, alat semprot, lampu UV 254 nm dan 365 nm, gelas ukur (Pyrex),

Erlenmeyer (Pyrex), cawan porselen, batang pengaduk, sendok, blender (Retch

bv), pengayak, neraca analitik (Mettler Toledo AB 204).

D. Tata Cara Penelitian

1. Determinasi herba pegagan embun

Determinasi dilakukan terhadap tanaman pegagan embun dengan

menggunakan buku acuan (Backer and Bakhuizen van den Brink, 1965) dengan

tujuan untuk memastikan bahwa tanaman yang digunakan adalah Hydrocotyle

sibthorpioides Lmk. Hasil determinasi berupa nama jenis (spesies) tanaman yang

digunakan dalam penelitian ini.

2. Pengumpulan bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba pegagan

embun yang telah dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta dan dikumpulkan pada bulan Januari, sedangkan hewan uji

yang digunakan berupa telur Artemia salina Leach (Ocean Star International,

Inc.).

3. Pembuatan simplisia

Herba pegagan embun yang sudah diambil dicuci dengan air bersih yang

mengalir, kemudian diangin-anginkan. Apabila sudah bersih daun herba pegagan

dikeringkan di bawah sinar matahari secara tidak langsung dengan ditutup kain

hitam. Pengeringan dapat dilanjutkan dengan menggunakan oven agar diperoleh

 25

simplisia yang benar-benar kering. Simplisia dapat diasumsikan kering apabila

diremas dapat hancur. Setelah kering dipotong kecil-kecil dan dibuat menjadi

serbuk dengan menggunakan blender kering dan kemudian diayak menggunakan

ayakan tepung. Serbuk diayak sampai seluruhnya dapat melewati ayakan sehingga

diperoleh serbuk yang halus.

4. Penyarian

Metode penyarian yang dilakukan pada penelitian ini yaitu dengan metode

perkolasi menggunakan alat perkolator. Cairan penyari yang digunakan yaitu

dietil eter dan campuran metanol-air (1:1 v/v).

a. Penyarian untuk mendapatkan ekstrak dietil eter

Serbuk simplisia ditimbang sebanyak 200 gram. Kemudian dilakukan

maserasi pendahuluan terlebih dahulu selama 3 jam menggunakan pelarut dietil

eter. Sebelum serbuk yang telah dimaserasi dimasukkan ke dalam perkolator,

bagian leher perkolator diberi saringan yang dibalut dengan kapas dan kertas

saring. Saringan dengan lubang yang kasar diletakkan paling atas kemudian di

bawahnya saringan yang lebih halus dengan tujuan agar kotoran dan serbuk dapat

tersaring sehingga tidak menyumbat aliran perkolat serta tidak masuk ke dalam

perkolat. Serbuk dimasukkan sedikit demi sedikit sambil ditekan-tekan.

Selanjutnya dietil eter dituangkan secukupnya sampai di atas simplisia masih

terdapat selapis cairan penyari. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam.

Selanjutnya perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit

(Anonim, 1986) dan ditambahkan berulang-ulang dietil eter secukupnya sehingga

selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Penyarian dihentikan jika
 26

pada perkolat yang terakhir hasilnya negatif yang ditandai dengan tetesan terakhir

yang jernih. Zat aktif diperoleh setelah perkolat diuapkan menggunakan vaccum

rotary evaporator sampai kental. Agar proses penguapan dietil eter sempurna

maka setelah divaccum, diuapkan di atas waterbath sampai bau dietil eter hilang

menggunakan cawan porselen.

b. Penyarian untuk mendapatkan ekstrak metanol-air

Setelah didapatkan ekstrak dietil eter, serbuk (ampas) dikeringkan terlebih

dahulu di dalam oven. Setelah serbuk benar-benar kering, penyarian dilanjutkan

dengan menggunakan pelarut metanol-air (1:1 v/v). Sebelumnya dilakukan

maserasi pendahuluan terlebih dahulu selama 3 jam menggunakan pelarut

metanol-air (1:1 v/v). Selanjutnya serbuk dimasukkan ke dalam perkolator sedikit

demi sedikit sambil ditekan-tekan, lalu dituangkan campuran pelarut metanol-air

(1:1 v/v) secukupnya sampai di atas simplisia masih terdapat selapis cairan

penyari. Perkolator ditutup dan dibiarkan selama 24 jam. Selanjutnya perkolat

dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml per menit (Anonim, 1986) dan

ditambahkan berulang-ulang campuran pelarut metanol-air (1:1 v/v) secukupnya

sehingga selalu terdapat selapis cairan penyari di atas simplisia. Penyarian

dihentikan jika pada perkolat yang terakhir hasilnya negatif yang ditandai dengan

tetesan terakhir yang jernih. Zat aktif diperoleh setelah perkolat diuapkan

menggunakan vaccum rotary evaporator sampai kental. Agar proses penguapan

campuran pelarut metanol-air sempurna maka setelah divaccum, diuapkan di atas

waterbath sampai didapatkan ekstrak kental menggunakan cawan porselen.

 27

5. Pembuatan Air Laut Buatan (ALB)

Komposisi bahan yang digunakan untuk pembuatan air laut buatan

berkadar garam 5 permil adalah 5 gram natrium klorida (NaCl); 1,3 gram

magnesium sulfat (MgSO4); 1 gram magnesium klorida (MgCl2); 0,3 gram

kalsium klorida (CaCl2); 0,2 gram kalium klorida (KCl), dan 2 gram natrium

hidrokarbonat (NaHCO3) dicampur dalam 1 liter aquadest. Bahan-bahan sebagian

dilarutkan dalam sebagian aquadest dalam labu takar 1 liter. Khusus untuk

magnesium sulfat dilarutkan dalam air panas, sedangkan natrium hidrokarbonat

dilarutkan dengan air bebas CO2. Kemudian ditambahkan aquadest sampai

volume tepat 1 liter. Air laut buatan berkadar garam 5 permil dan pH antara 7,3-

8,4 (Mudjiman, 1989).

6. Penetasan telur artemia

Artemia diteteskan dari telurnya dengan media ALB berkadar 5 permil.

ALB yang akan digunakan untuk menetaskan telur artemia diaerasi terlebih

dahulu selama 2 jam. Telur artemia diteteskan dalam aquarium yang disekat

menjadi dua bagian, bagian gelap dan bagian terang, dengan sekat berlubang.

Bagian gelap merupakan telur artemia ditaburkan. Telur menetas kira-kira 24-36

jam kemudian menjadi nauplius (Mudjiman, 1991). Nauplius yang aktif akan

bergerak menuju tempat yang terang melalui lubang pada sekat. Setelah 48 jam,

nauplius diambil dari bagian yang terang menggunakan pipet dan digunakan

sebagai hewan uji (Meyer et al., 1982).

 28

7. Pembuatan larutan uji

a. Pembuatan larutan stok

Larutan stok ekstrak dietil eter juga dipersiapkan sebagai larutan A dan

larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental dietil eter

menggunakan cawan porselen yang telah ditara, kemudian dilarutkan dengan 10

ml dietil eter p.a. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A dengan

10 ml dietil eter p.a. Larutan stok ekstrak metanol-air dipersiapkan sebagai larutan

A dan larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental

metanol-air menggunakan cawan porselen yang telah ditara, kemudian dilarutkan

dengan 10 ml metanol p.a. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan A

dengan 10 ml metanol p.a.

b. Pembuatan larutan sampel

Dari larutan stok tersebut dibuat seri konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml

sebagai uji awal BST (Meyer et al., 1982). Kelompok kontrol dan kelompok

perlakuan masing-masing dibuat dalam tiga kali replikasi. Setelah dilakukan uji

awal BST dan diperoleh hasil yang baik kemudian dibuat menjadi lima seri

konsentrasi. Ekstrak dietil eter dibuat dalam seri konsentrasi 10, 32, 102, 328 dan

1049 µg/ml serta untuk ekstrak metanol-air dibuat dalam seri konsentrasi 250,

500, 1000, 2000 dan 4000 µg/ml Kelompok kontrol dan kelompok perlakuan

masing-masing dibuat dalam lima kali replikasi.

9. Toksisitas akut dengan BST

Uji toksisitas akut dengan dilakukan BST menggunakan larva artemia

yang berumur 48 jam (Meyer et al., 1982). Flakon yang telah berisi sampel,yaitu
 29

masing-masing berupe ekstrak metanol-air dan ekstrak dietil eter dengan berbagai

seri konsentrasi terlebih dahulu dikeringuapkan di atas waterbath. Hal ini

bertujuan supaya pelarut menguap dan diharapkan hanya ekstrak herba pegagan

embun yang tertinggal. Ditambahkan ± 3 ml ALB, kemudian divortex. Sepuluh

ekor larva artemia yang berumur 48 jam, diambil secara acak dan dimasukkan ke

dalam flakon. Kemudian ditambah ALB hingga volumenya mencapai 5 ml dan

diberi 1 tetes ragi (3mg/5ml) sebagai makanan. Setiap pengujian selalu disertai

dengan kontrol dan masing-masing konsentrasi dibuat dalam 5 kali replikasi.

Flakon dijaga agar selalu mendapat penerangan. Setelah 24 jam, jumlah larva

artemia yang mati dihitung dan dianalisis untuk mengetahui harga LC50. Larva

udang dikatakan mati bila larva tersebut tidak dapat menunjukkan gerakan aktif

lagi (Carballo et al., 2002).

10. KLT ekstrak aktif herba pegagan embun

Uji kualitatif ekstrak yang aktif herba pegagan dengan KLT ini bertujuan

untuk mengetahui kandungan senyawa terpenoid dan flavonoid yang terdapat

dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air daun pegagan embun.

a. Identifikasi terpenoid

Dalam identifikasi senyawa terpenoid menggunakan fase diam silika gel

GF 254 dan fase gerak toluen-etil asetat (93:7 v/v). Deteksi bercak terpenoid

dilakukan menggunakan pereaksi semprot vanilin asam sulfat. Lempeng KLT

yang sudah disemprot dengan pereaksi vanilin asam sulfat, dipanaskan di dalam

oven pada suhu 110° C selama 10 menit hingga muncul warna ungu keabu-abuan.

Pengamatan dilakukan pada sinar tampak (secara visibel).

 30

b. Identifikasi flavonoid

Dalam identifikasi senyawa flavonoid dilakukan dengan menggunakan

fase diam selulosa, sedangkan fase geraknya n-butanol:asam asetat:air (4:1:5 v/v).

Pembanding yang digunakan yaitu rutin. Lempeng KLT dimasukkan dalam

bejana berisi fase gerak yang telah jenuh lalu dielusi sampai jarak rambat 10 cm.

Pengamatan bercak dilakukan di bawah sinar UV dengan panjang gelombang 254

nm dan 365 nm. Deteksi juga dilakukan dengan menggunakan uap amonia untuk

memastikan keberadaan senyawa flavonoid. Caranya adalah dengan meletakkan

lempeng KLT yang telah selesai dielusi dalam sebuah chamber yang di dalamnya

sudah diletakkan larutan amonia. Lempeng KLT dibiarkan terkena uap dari

amonia tersebut selama beberapa saat hingga muncul warna kuning.

11. Analisis hasil

Presentase kematian larva artemia dapat dihitung menggunakan rumus

Abott, hal ini dilakukan karena terdapat kematian larva artemia pada kontrol

(Negara, 2003).

Jml. kematian pada tes uji – Jml. Kematian pada kontrol

% kematian = ⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯⎯ X 100%
Jml. hewan uji – Jml. kematian pada kontrol

Data persentase kematian larva artemia yang diperoleh kemudian

dianalisis menggunakan analisis probit menggunakan program SPSS 10.00 dengan

memplotkan antara log konsentrasi vs respon (nilai probit) untuk menetapkan

harga LC50. Adanya kandungan senyawa monoterpenoid dan sesquiterpenoid serta

senyawa flavonoid dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air dipastikan

melalui uji Kromatografi Lapis Tipis (KLT).

 31

BAB IV

HASIL PENELITIAN DAN PEMBAHASAN

A. Identifikasi Tanaman

Identifikasi tanaman menjadi langkah awal dalam penelitian yang

menggunakan herba pegagan embun. Identifikasi tanaman dilakukan untuk

memastikan kebenaran identitas tanaman menggunakan kunci determinasi

menurut Backer and Bakhuizen van den Brink Jr (1965).

Berdasarkan identifikasi tanaman yang telah dilakukan (lampiran 1),

diperoleh kesimpulan bahwa tanaman yang digunakan adalah benar-benar herba

pegagan embun (Hydrocotyle sibthorpioides Lmk.).

B. Pengumpulan Bahan

Bahan utama yang digunakan dalam penelitian ini adalah herba pegagan

embun yang telah dibudidayakan dari bibit liar di lingkungan Universitas Sanata

Dharma Yogyakarta dan dikumpulkan pada bulan Januari. Herba pegagan embun

yang digunakan meliputi seluruh bagian tanaman yang berada di atas tanah yaitu

bunga, daun, dan batang.

Herba pegagan embun ini dibudidayakan dengan tujuan untuk

menghindari variasi kandungan kimia tanaman yang terlalu besar karena

perbedaan kondisi lingkungan. Umur tanaman (± 2 bulan) yang digunakan dalam

penelitian ini diupayakan seragam, supaya kadar senyawa aktif di dalam herba
 32

pegagan embun tidak berbeda secara bermakna, begitu pula dengan bagian

tanaman yang digunakan dalam penelitian ini.

C. Pembuatan Simplisia

Herba pegagan embun yang telah dikumpulkan dibersihkan dan dicuci

dengan air yang mengalir dengan tujuan agar kotoran yang melekat pada daun

dapat terlepas serta tidak menempel lagi. Herba dikeringkan di bawah sinar

matahari secara tidak langsung dengan ditutup kain hitam sehingga senyawa aktif

yang terdapat di dalam herba pegagan embun tidak rusak. Pengeringan ini

menurut Anonim (1986) dimaksudkan untuk menurunkan kadar air sehingga tidak

ditumbuhi jamur, mempermudah pembuatan serbuk, dan menjamin agar

kualitasnya tetap baik sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama.

Reaksi enzimatis serta perubahan kimiawi dapat juga diminimalkan, sehingga

senyawa aktif yang terkandung dalam herba pegagan embun tidak hilang terurai.

Pengeringan dihentikan apabila apabila kadar air yang terkandung dalam simplisia

kurang dari 10% karena reaksi enzimatis yang dapat menguraikan senyawa aktif

sudah tidak berlangsung (Anonim, 1986). Untuk mengetahui kapan proses

pengeringan dihentikan adalah dengan meremas herba sampai hancur. Jika kadar

air masih tinggi, maka herba tersebut masih lembab dan tidak hancur jika diremas.

Simplisia kering dibuat menjadi serbuk dengan tujuan untuk memperluas

permukaan serbuk yang kontak dengan cairan penyari sehingga kandungan kimia

yang terlarut dalam proses penyarian lebih banyak dan penyarian dapat

berlangsung lebih sempurna (Anonim, 1986). Pada umumnya penyarian akan

 33

bertambah baik bila permukaan serbuk yang bersentuhan dengan cairan penyari

semakin luas, sehingga semakin halus serbuk yang dihasilkan maka akan semakin

baik pula penyariannya. Namun menurut Anonim (1986) pada metode perkolasi,

serbuk yang terlalu halus menyebabkan cairan penyari tidak dapat mengalir

sehingga mengakibatkan penyarian tidak optimal. Pada penelitian ini serbuk yang

dihasilkan halus, namun tidak menyumbat perkolator sehingga cairan penyari

dapat menembus pori-pori serbuk dan penyarian berlangsung dengan sempurna.

D. Penyarian Herba Pegagan Embun Menggunakan Pelarut Dietil Eter dan

Metanol

Penyarian merupakan peristiwa perpindahan massa zat aktif yang semula

berada di dalam sel ditarik oleh cairan penyari sehingga di dalam cairan penyari

terdapat zat aktif. Perkolasi merupakan suatu metode penyarian yang dilakukan

dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi

(Anonim, 1986). Perkolasi dipilih sebagai metode penyarian dalam penelitian ini

karena lebih efisien bila dibandingkan dengan metode maserasi, hal ini

dikarenakan prosesnya yang berkesinambungan dimana cairan penyari yang telah

jenuh akan digantikan dengan cairan penyari yang lebih segar terus-menerus

(Silva, Lee, Kinghorn, 1998). Cairan penyari yang digunakan yaitu dietil eter dan

campuran metanol-air (1:1 v/v). Dietil eter merupakan pelarut organik yang

bersifat non polar dibandingkan dengan metanol. Dalam penelitian ini

penggunaan dietil eter dimaksudkan untuk menarik senyawa atau zat aktif yang

terkandung dalam herba pegagan embun terutama yang bersifat non polar seperti
 34

senyawa terpenoid. Sedangkan penggunaan metanol yang bersifat lebih polar

dibandingkan dietil eter dimaksudkan untuk menarik senyawa ataupun zat aktif

yang terkandung dalam herba pegagan embun yang bersifat polar seperti

flavonoid.

Maserasi pendahuluan dilakukan sekurang-kurangnya 3 jam untuk

membuka pori-pori serbuk sehingga cairan penyari dapat menembus sel dan

melarutkan zat aktif dengan sempurna. Serbuk simplisia yang sebelumnya telah

dibasahi dengan cairan penyari yang cukup untuk mengembangkan sel dengan

sempurna, maka aliran cairan penyarinya tidak akan mengalami hambatan.

Perendaman dengan dietil eter selama 24 jam pada proses perkolasi

dimaksudkan supaya serbuk simplisia menjadi terbasahi dan serbuk menjadi lebih

mengembang sehingga dapat tersusun dengan baik. Penyusunan dikatakan baik

apabila tidak ada rongga udara dalam serbuk simplisia dan kondisi simplisia tidak

terlalu padat sehingga cairan penyari dapat membasahi seluruh serbuk simplisia

dengan sempurna dan dapat menyari dengan optimal. Pada penelitian ini

penyusunan serbuk simplisia telah diusahakan sebaik mungkin sehingga tidak lagi

terdapat rongga udara.

Perkolat dibiarkan menetes dengan kecepatan 1 ml/menit atau 20

tetes/menit. Jika tetesan terlalu cepat yaitu lebih dari 20 tetes/menit maka

penyarian berjalan tidak sempurna. Sedangkan jika tetesan terlalu lambat yaitu

kurang dari 20 tetes/menit maka besar kemungkinan cairan penyari untuk

menguap sehingga akan terjadi pemborosan cairan penyari dan juga pemborosan

waktu. Pada penelitian ini kecepatan penetesan perkolat 1 ml/menit atau 20

 35

tetes/menit sehingga penyarian berlangsung sempurna. Kecepatan penetesan dietil

eter harus sama dengan kecepatan menetesnya perkolat, supaya permukaan serbuk

tidak menjadi kering sehingga penyarian zat aktif optimal. Perkolat yang

dihasilkan pertama kali merupakan cairan yang berwarna sangat pekat, hal ini

menandakan bahwa banyak zat aktif yang terlarut dalam dietil eter. Perkolasi

dihentikan setelah perkolat terakhir yang menetes sudah tidak berwarna (jernih),

hal ini menandakan bahwa sudah tidak ada lagi zat aktif yang terlarut dalam dietil

eter.

Sari dietil eter diuapkan di atas waterbath untuk mendapatkan ekstrak

kental menggunakan cawan porselen. Penguapan dilakukan pada suhu 60º C.

Suhu 60º C merupakan suhu optimal untuk penguapan di atas waterbath karena

suhu yang lebih tinggi dapat menyebabkan rusaknya zat aktif. Karena penguapan

tidak selesai dalam satu hari maka sari dietil eter disimpan di kulkas untuk

mencegah tumbuhnya mikroorganisme. Hasil yang diperoleh berupa ekstrak

kental.

Ekstrak metanol-air diperoleh dengan mengeringkan terlebih dahulu

serbuk simplisia yang telah disari dengan dietil eter. Pengeringan serbuk simplisia

dilakukan dengan cara dioven sampai sisa dietil eter benar-benar hilang,

kemudian dilakukan maserasi pendahuluan dengan penyari metanol-air (1:1 v/v)

selama sekurang-kurangnya 3 jam untuk membuka pori-pori serbuk sehingga

cairan penyari dapat menembus sel dan melarutkan zat aktif dengan sempurna.

Untuk mendapatkan ekstrak kental metanol, maka sari metanol diuapkan di atas
 36

waterbath pada suhu 60º C menggunakan cawan porselen. Untuk ekstrak metanol,

hasil yang didapat berupa ekstrak kental.

Ekstrak yang telah diperoleh kemudian disimpan di dalam eksikator.

Dalam eksikator tidak ada lagi air dan udara yang dapat masuk, yang

memungkinkan terjadinya perubahan senyawa dalam ekstrak tersebut atau dapat

merusak senyawa oleh adanya bakteri atau cendawan.

E. Air Laut Buatan (ALB)

Pembuatan ALB dimaksudkan untuk menyesuaikan lingkungan hidup

artemia sehingga sama seperti air laut alami. Bahan yang digunakan untuk

membuat air laut buatan terdiri dari natrium klorida, magnesium sulfat,

magnesium klorida, kalisum klorida dan natrium hidrokarbonat. Bahan-bahan

tersebut secara keseluruhan berbentuk padat dan bersifat higroskopis. Khusus

untuk magnesium klorida sebelum dicampur dengan bahan lain terlebih dahulu

dilarutkan dalam air panas untuk mempermudah proses pelarutannya, sedangkan

untuk natrium hidrokarbonat terlebih dahulu dilarutkan dengan air bebas

karbondioksida untuk mempertahankan kebasaan atau agar pH ALB stabil (antara

8-9). Pemecahan cangkang siste dibantu oleh kegiatan enzim penetasan yang

membutuhkan pH lebih dari 8, sehingga pH berpengaruh terhadap penetasan siste.

Apabila pH kurang dari 8 maka efisiensi penetasannya akan menurun, siste yang

tidak menetas banyak atau waktu penetasannya menjadi lebih lama.

Air laut buatan tersebut mempunyai kadar garam 5 permil yang artinya

dalam 1 ml aquadest mengandung 5 mg natrium klorida. Air laut yang digunakan

 37

dalam penelitian ini berkadar garam 5 permil supaya telur artemia menetas secara

optimal (Mudjiman, 1989). Dalam penelitian ini, selama penetasan siste maupun

pelaksanaan uji BST selalu digunakan ALB dengan kadar garam yang sama yaitu

5 permil supaya artemia hidup dalam kondisi yang sama. Dalam kondisi

lingkungan hidup yang sama diharapkan siste dapat menetas dengan sempurna

dan pada waktu digunakan dalam uji BST dapat memberikan hasil yang optimal,

yiatu berupa kematian artemia yang harus terjadi akibat zat aktif yang terkandung

dalam ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air. .

F. Penetasan Siste

Siste yang digunakan dalam penelitian ini dalam bentuk kering. Siste

kering memiliki kadar air kurang dari 10% yang berisi embrio dalam keadaan

diapauze (metabolisme terhenti sementara). Untuk menetaskan siste kering,

terlebih dahulu diperlukan perendaman dalam aquadest selama 1 jam yang

bertujuan agar siste menyerap sejumlah air dan diperkirakan dalam waktu 1 jam

kadar air di dalam siste sudah mencapai lebih dari 65%, sehingga embrio yang

semula berada dalam keadaan diapauze metabolismenya dapat aktif kembali.

Proses penyerapan air ke dalam telur berlangsung secara hiperosmotik (tekanan

osmose di dalam telur yang lebih tinggi daripada di luarnya).

ALB yang akan digunakan untuk menetaskan siste diaerasi selama 2 jam.

Aerasi ini bertujuan untuk memberikan oksigen yang cukup bagi kelangsungan

hidup artemia. Kekuatan aerasi sedang, tidak terlalu kuat dan tidak terlalu lemah.

Siste ditetaskan dalam bak penetasan bersekat. Bak penetasan tersebut terdiri dari
 38

dua bagian yaitu bagian gelap dan bagian terang yang dipisahkan oleh sebuah

sekat yang bercelah. ALB yang telah diaerasi dituangkan ke dalam bak penetasan

pada bagian gelap dengan ketinggian melebihi bagian terbawah dari sekat. Hal ini

dimaksudkan agar ketika siste ditebarkan tidak mengalir ke bagian terang. Siste

ditebarkan ke bagian yang gelap. Suhu ALB selama penetasan perlu

dipertahankan antara 25-30° C untuk mempercepat pemisahan cangkang siste

dengan nauplius. Hal ini dapat dicapai dengan bantuan lampu 5 watt yang

digantungkan di atas bak penetasan pada bagian yang terang. Penetasan siste

menjadi nauplius berlangsung selama 24-36 jam. Nauplius akan menuju ke bagian

terang karena artemia memiliki sifat fototropik positif (tertarik pada cahaya).

Nauplius yang berada pada bagian terang inilah yang akan digunakan untuk BST,

karena nauplius yang mampu bergerak menuju bagian yang terang menandakan

bahwa nauplius tersebut sehat.

Nauplius dapat bertahan selama ± 2 hari setelah menetas tanpa diberi

makanan. Nauplius yang baru menetas berwarna kemerah-merahan karena masih

mengandung makanan cadangan, namun setelah 24 jam cadangan makanan larva

habis bersamaan dengan terbentuknya mulut, saluran pencernaan dan dubur.

Dengan demikian maka nauplius mulai membutuhkan lebih banyak makanan

demi kelangsungan hidupnya.

Suspensi ragi Saccharomyces cerevisae diberikan sebagai sumber

makanan bagi larva artemia. Sebelum dibuat suspensi, ragi dipanaskan terlebih

dahulu dengan oven pada suhu 100°C selama 10 menit untuk menghindari

tumbuhnya jamur dan bakteri pada ragi yang dapat mengganggu jalannya
 39

penelitian. Hal ini perlu diperhatikan supaya kematian artemia benar- benar

disebabkan karena bahan uji, yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air

herba pegagan embun, bukan karena jamur atau bakteri.

G. Toksisitas Akut dengan Metode BST

Uji toksisitas akut berdasarkan metode BST dilakukan dengan

menggunakan larva artemia yang berumur 48 jam, karena pada umur tersebut

larva artemia masih sangat peka. Hal ini disebabkan karena pada umur 48 jam

membran yang menyelubungi tubuh artemia masih tipis sehingga senyawa

monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak

dietil eter dan ekstrak metanol-air bisa berdifusi masuk ke dalam tubuh artemia,

sehingga kematian artemia benar-benar disebabkan karena keberadaan senyawa

tersebut di dalam tubuh artemia. Bila artemia yang digunakan dalam uji BST

berumur lebih dari 48 jam dikhawatirkan membran yang menyelubungi tubuh

artemia sudah mengeras (terbentuk karapak) sehingga

monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam ekstrak

dietil eter dan ekstrak metanol-air tidak bisa berdifusi masuk ke dalam tubuh

artemia dan tidak dapat menimbulkan kematian. Bila artemia yang digunakan

dalam uji BST berumur kurang dari 48 jam dikhawatirkan organ-organ belum

terbentuk dengan sempurna, sehingga kematian artemia bukan disebabkan

keberadaan monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid yang terkandung dalam

ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air.

 40

Selain itu, penggunaan larva artemia dalam mendeteksi senyawa yang

memiliki aktivitas sitotoksik berdasarkan pada adanya kesamaan sistem enzim

antara artemia dengan mamalia. Sistem enzim tersebut adalah tipe DNA-

dependent RNA polymerase dan oubaine sensitive Na+ and K+ dependent ATPase

(Solis et all., 1993), sehingga jika suatu senyawa antikanker berefek toksik

terhadap larva artemia maka senyawa tersebut dapat digunakan pada mamalia.

Tetapi perkembangan larva artemia tidak dapat dikaitkan dengan perkembangan

sel kanker karena memang tidak ada penelitian yang menegaskan hal tersebut.

Senyawa yang diduga mempunyai aktivitas sitotoksik dalam herba

pegagan embun adalah senyawa monoterpenoid/esquiterpenoid dan flavonoid.

Namun mekanisme kedua senyawa tersebut dalam membunuh sel kanker belum

diketahui secara terperinci.

Mekanisme sitotoksisitas dari monoterpenoid/sesquiterpenoid yaitu

dengan menginduksi terjadinya apoptosis. Sel akan mendapatkan signal terlebih

dahulu sebelum melakukan apoptosis. Signal untuk melakukan apoptosis ini

diatur oleh protein sel. Protein sel akan mempengaruhi mitokondria untuk

meningkatkan permeabilitas membrannya, sehingga mengakibatkan keluarnya

faktor-faktor pemicu terjadinya apoptosis, seperti sitokrom c dan Apaf 1.

Sitokrom c dilepaskan seiring dengan meningkatnya permeabilitas membran

mitokondria, berikatan dengan Apaf 1 dan ATP. Kemudian akan mengikat pro-

caspase 9 membentuk kompleks apoptosome. Kompleks ini akan memotong pro-

caspase 9 menjadi bentuk yang lebih aktif yaitu caspase 9, yang kemudian akan

mengaktivasi caspase 3 dan terjadi apoptosis.

 41

Gambar 6. Bagan mekanisme terjadinya apoptosis (Rajesh et al., 2003)

Monoterpenoid/sesquiterpenoid menginduksi apoptosis melalui jalur

ekstrinsik dengan jalur Fas/Fas ligand. Dalam menjalankan tugasnya suatu Fas

reseptor harus berinteraksi dengan Fas ligand. Interaksi antara Fas reseptor dan

Fas ligand membentuk death-induced signaling complex (DISC). DISC terdiri

dari berbagai protein di antaranya FADD, caspase 8 dan caspase 10. DISC

merupakan kompleks protein yang akan memberikan sinyal untuk melakukan

apoptosis.

Monoterpenoid, khususnya dapat menghambat peralihan fase G2/M dalam

siklus sel dan selama penghambatan ini tidak dihasilkan FADD. FADD dapat

mempercepat terjadinya apoptosis di dalam sel, akan tetapi FADD dapat pula

melindungi sel dari radiasi yang dimaksudkan untuk menghancurkan sel kanker.

Dalam hal ini, monoterpenoid akan menggantikan kedudukan FADD sehingga

proses apoptosis dapat tetap berlangsung dan sel kanker dapat dimatikan.
 42

Gambar 7. Mekanisme monoterpenoid menginduksi apoptosis (Rajesh, et al., 2003)

Senyawa flavonoid banyak disebut-sebut berpotensi sebagai antitumor

atau antikanker. Flavonoid dapat menginduksi terjadinya apoptosis (mekanisme

kematian sel yang terprogram) pada sel kanker dengan mencegah terjadinya

mutasi protein 53 (p53). Pada sel normal, jika suatu sel terpapar radiasi ionisasi

atau promoter-promoter lain yang dapat menyebabkan kerusakan DNA maka

protein 53 bekerja dengan memutus siklus sel tersebut. Langkah selanjutnya ada

dua kemungkinan yaitu sel ini akan memperbaiki kerusakan DNA sehingga

menjadi sel normal kembali yang kemudian dapat membelah menghasilkan sel-sel

normal atau kemungkinan kedua yaitu jika kerusakan DNA sangat parah dan tidak

dapat diperbaiki lagi, maka akan terjadi kematian sel yang terprogram atau yang

lebih dikenal dengan apoptosis (Albert, Johnson, Lewis, Raff, Roberts and Walter,

2002).

Namun pada sel yang kekurangan atau tidak mempunyai p53, salah

satunya akibat terjadinya mutasi p53, jika sel tersebut terkena radiasi ionisasi atau

promotor-promotor lain dan menyebabkan kerusakan DNA, maka tidak terjadi

pemutusan siklus sel tersebut. Langkah selanjutnya juga ada dua kemungkinan

yaitu pembelahan sel dengan kerusakan kromosom terus berlangsung

menyebabkan kegagalan mitosis dan sel mati sehingga tumor menjadi jinak atau
 43

kemungkinan kedua yaitu sel tumor mengalami mutasi, seleksi dan evolusi yang

berkepanjangan yang menyebabkan terjadinya kanker.

Gambar 8. Mekanisme flavonoid menginduksi apoptosis (Albert, et al., 2002)

Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid seperti sudah dijelaskan di

atas, diketahui dapat menyebabkan kematian sel. Kematian sel dapat terjadi

apabila monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid berada di dalam tubuh

artemia. Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid dapat masuk ke dalam

tubuh artemia melalui kulit artemia yang belum terselubungi karapak (pada umur

48 jam). Monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid dapat masuk ke dalam

tubuh artemia melalui mekanisme difusi pasif. Artemia diibaratkan sebagai

sebuah sel yang dilapisi membran semipermeabel, kemudian molekul-molekul

monoterpenoid/sesquiterpenoid dan flavonoid akan bergerak melewatinya.

Molekul-molekul tersebut bergerak dari sisi yang kadarnya lebih tinggi menuju

sisi lain yang kadarnya lebih rendah. Di dalam sel, molekul-molekul itu akan
 44

merusak sistem enzim yang ada (DNA-dependent RNA polymerase atau Na+-K+

ATPase) sehingga dapat mengakibatkan kematian sel.

Sampel yang digunakan adalah ekstrak ekstrak dietil eter dengan

konsentrasi 10, 32, 102, 328 dan 1049 µg/ml dan metanol dengan konsentrasi 250,

500, 1000, 2000 dan 4000 µg/ml. Konsentrasi tersebut didapatkan setelah

melakukan uji BST awal dengan konsentrasi 10, 100, dan 1000 µg/ml. Setelah

dilakukan pengujian dengan masing-masing ekstrak pada konsentrasi 10, 100, dan

1000 µg/ml, diperoleh jumlah larva yang mati dan kemudian digunakan untuk

menghitung persentase kematian larva tersebut. Dari data persentase kematian ini

diambil konsentrasi yang memberikan harga persentase kematian larva antara

20%-80% sebagai konsentrasi terendah dan konsentrasi tertinggi. Digunakan

persentase kematian larva antara 20%-80% karena dengan persentase kematian

tersebut sudah dapat memberikan kurva yang lebih linier, sehingga LC50 yang

didapatkan pada uji BST ini lebih dapat menggambarkan hasil yang sebenarnya.

Flakon-flakon yang telah berisi larutan uji dikeringuapkan diatas

waterbath pada suhu 60ºC. Hal ini dimaksudkan untuk menguapkan pelarut,

sehingga yang tertinggal di dalam flakon hanya ekstrak yang berisi zat aktif dan

jika terdapat kematian pada artemia bukan disebabkan oleh adanya pelarut. ALB

yang digunakan untuk uji toksisitas akut ini juga diaerasi selama 2 jam untuk

memberikan oksigen yang cukup bagi kelangsungan hidup artemia, sehingga bila

terdapat artemia yang mati bukan disebabkan karena kekurangan oksigen. Dalam

uji toksisitas ini juga digunakan kelompok kontrol yang berfungsi sebagai faktor

koreksi akan kematian larva yang bukan disebabkan oleh pengaruh ekstrak herba
 45

pegagan embun. Pembuatan kontrol sama dengan pembuatan sampel uji, hanya

saja pada kontrol tidak berisi sampel (ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air).

Suspensi ragi diberikan sebagai sumber makanan bagi larva artemia.

Suspensi ragi ini dibuat dengan melarutkan 3 mg ragi dalam 5 ml ALB.

Pemberian makanan pada larva artemia ini tidak boleh berlebihan cukup setetes

saja pada tiap flakonnya. Hal ini dikarenakan artemia merupakan filter feeder,

yaitu makan dengan cara menyaring makanannya. Sebagai filter feeder, artemia

menelan apa saja yang ukurannya kecil (kurang dari 50 µm). Artemia tidak bisa

membedakan mana makanan dan mana yang bukan makanan. Apabila makanan

baru masuk ke dalam tubuh artemia secara terus-menerus dalam jumlah yang

berlebihan, maka akan mendesak makanan yang sudah ada sebelumnya yang

belum sempat dicerna dengan sempurna. Bila terjadi demikian, maka makanan

yang belum sempat dicerna dengan sempurna tersebut akan keluar lagi dari usus.

Keadaan seperti ini akan membuat artemia menjadi kelaparan dalam timbunan

makanan dan dapat menyebabkan kematian. Hal tersebut dapat mengacaukan

pengambilan data karena larva mati bukan karena pemberian perlakuan melainkan

karena pemberian makanan yang berlebihan. Flakon-flakon tersebut diletakkan

dalam suatu kotak yang ditutupi dengan kain supaya terhindar dari serangga dan

diberi penerangan dengan lampu 5 watt supaya suhu pada waktu penelitian sama

dengan suhu pada waktu penetasan siste.

Jumlah larva artemia yang hidup dihitung setelah 24 jam. Larva dikatakan

masih hidup jika masih menunjukkan pergerakan yang aktif. Pergerakan pada

larva dilakukan oleh sungut besar atau antena II-nya. Sungut tersebut akan terus-
 46

menerus bergerak selama larva masih hidup karena selain berfungsi sebagai alat

gerak, sungut tersebut berfungsi juga sebagai alat pernafasan. Dengan menghitung

larva artemia yang hidup, maka besarnya kematian larva bisa ditentukan. Hasil

perhitungan dengan menggunakan rumus Abbot data yang diperoleh berupa

besarnya persen kematian dikarenakan ada kontrol yang mati. Kontrol digunakan

untuk mengoreksi kematian larva yang bukan disebabkan oleh pengaruh ekstrak

dietil eter dan ekstrak metanol-air herba pegagan embun.

Tabel II. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak dietil
eter herba pegagan embun

Konsentrasi ekstrak Kematian

dietil eter (%)
(µg/ml)
10 19,1
32 21,3
102 23,9
328 61,7
1049 73,9

Hasil penelitian menunjukkan bahwa besarnya konsentrasi senyawa uji

berbanding lurus dengan persen kematian artemia (Tabel II dan III), semakin

tinggi konsentrasi maka semakin tinggi persen kematian artemia. Data yang

diperoleh kemudian dianalisis dengan metode analisis probit menggunakan

program SPSS 10.0 dengan taraf kepercayaan 95% untuk menentukan nilai LC50.

Analisis probit digunakan dalam penentuan LC50, karena analisis probit dapat

mengamati efek yang terjadi akibat pemberian suatu konsentrasi, selain itu dapat

memberikan nilai regresi yang menghasilkan garis linear sehingga memudahkan

dalam penentuan nilai LC50. Pada analisis probit, konsentrasi sampel

ditransformasikan ke dalam bentuk logaritma konsentrasi sebagai variabel tetap

 47

(nilai x), sedangkan nilai probit dari prosentase kematian ditetapkan menjadi

variabel tergantung (nilai y).

Persamaan garis linear untuk ekstrak dietil eter yang diperoleh dari hasil

analisis probit yaitu y = 0,83893x – 1,98107 (lampiran 4). Nilai LC50 yang

diperoleh sebesar 229 µg/ml. Kurva hubungan antara nilai probit dengan log

konsentrasi ekstrak dietil eter dapat dilihat pada gambar 3.

Probit Transformed Responses

,8

,6

,4

,2

,0

-,2

-,4

-,6
Probit

-,8

-1,0 Rsq = 0,8566

,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Log of KONS

Gambar 4. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak dietil eter
herba pegagan embun

Konsentrasi ekstrak dietil eter herba pegagan embun dimana dapat

membunuh 50% hewan uji (LC50) juga dapat diketahui dengan menggunakan

kurva di atas, yaitu dengan menarik garis lurus pada probit 0,0 ke arah kanan

sampai pada garis, lalu ditarik garis ke arah bawah, didapatkan log konsentrasi

sebesar 2,36 sehingga konsentrasinya sebesar 229 μg/ml.

Berdasarkan kurva (Gambar 3) diperoleh pula nilai Rsq yang merupakan

koefisien determinasi. Nilai Rsq mengukur tingkat ketepatan/kecocokan dari

 48

regresi linier sederhana, yaitu merupakan proporsi/presentase sumbangan x

terhadap variasi (naik dan turunnya) y. Nilai Rsq yang diperoleh sebesar 0,8566,

berarti bahwa presentase sumbangan x yaitu konsentrasi ekstrak dietil eter herba

pegagan embun terhadap variasi yaitu respon (jumlah kematian artemia) sebesar

85,66%.

Berdasarkan kurva hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi

ekstrak dietil eter yang dihasilkan, terdapat korelasi yang diharapkan antara

konsentrasi dengan respon (nilai probit). Korelasi yang positif ditunjukkan dengan

meningkatnya nilai probit seiring dengan meningkatnya log konsentrasi serta nilai

koefisien korelasi yang mendekati 1 (r = 0,9255). Nilai r menggambarkan

hubungan yang kuat antara variabel x dan y, yang diperoleh dengan mengambil

akar dari Rsq. Pada tabel nilai r dengan taraf kepercayaan 95% didapatkan nilai r

sebesar 0,88 sehingga nilai r hitung lebih besar daripada nilai r tabel. Hal ini

menunjukkan adanya korelasi yang linier antara konsentrasi dengan nilai probit.

Tabel III. Persentase kematian larva artemia akibat pemberian ekstrak

metanol-air herba pegagan embun

Konsentrasi ekstrak Kematian

metanol-air (%)
(µg/ml)
250 18,4
500 38,0
1000 57,4
2000 76,1
4000 91,5

Persamaan garis linear untuk ekstrak metanol-air diperoleh persamaan

garis linear y = 1,82781x – 5,27533 (lampiran 5). Nilai LC50 yang diperoleh
 49

sebesar 769 µg/ml. Kurva hubungan antara nilai probit dengan log konsentrasi

ekstrak dietil eter dapat dilihat pada gambar 4.

Probit Transformed Responses

1,5

1,0

,5

0,0

-,5
Probit

-1,0 Rsq = 0,9975

2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8

Log of KONS

Gambar 5. Kurva hubungan nilai probit versus log konsentrasi ekstrak metanol-air
herba pegagan embun

Menurut Meyer et all. (1982), suatu bahan uji dikatakan bersifat toksik

terhadap larva artemia jika mempunyai nilai LC50 < 1000 µg/ml, semakin kecil

nilai LC50 berarti toksisitasnya semakin besar. Hasil penelitian ini menunjukkan

bahwa nilai LC50 dari kedua ekstrak < 1000 µg/ml yaitu untuk ekstrak dietil eter

sebesar 229 µg/ml dan ekstrak metanol-air sebesar 769 µg/ml. Dari hasil tersebut

diketahui bahwa ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air sama-sama bersifat

toksik terhadap larva artemia karena mempunyai nilai LC50 < 1000 µg/ml, namun

ekstrak yang bersifat lebih toksik adalah ekstrak dietil eter. Menurut kriteria

ketoksikan akut (Loomis, 1978), ekstrak dietil eter dengan nilai LC50 229 µg/ml

bersifat cukup toksik dan ekstrak metanol-air dengan nilai LC50 769 µg/ml

bersifat sedikit toksik.

 50

H. Uji Kualitatif Ekstrak Aktif dengan KLT

Uji kromatografi lapis tipis dilakukan terhadap ekstrak toksik herba

pegagan embun yaitu ekstrak dietil eter dan ekstrak metanol-air. Metode KLT

dipilih karena memiliki banyak kelebihan dibandingkan kromatografi lain,

diantaranya yaitu membutuhkan waktu yang singkat, memerlukan jumlah

cuplikan yang sedikit serta pengerjaan yang sederhana. Pemeriksaan kandungan

kimia secara KLT ini bertujuan untuk mendapatkan gambaran mengenai

kandungan senyawa terpenoid dan flavonoid dalam ekstrak aktif herba pegagan

embun.

Pereaksi-pereaksi yang digunakan dalam KLT mampu memberikan hasil

berupa informasi umum mengenai golongan senyawa terpenoid dan flavonoid

yang terkandung dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun namun belum

dapat memberikan informasi mengenai senyawa yang lebih terperinci.

1. Identifikasi terpenoid

Fase diam yang digunakan untuk mendeteksi adanya senyawa terpenoid

adalah silika gel GF254. Silika gel GF254 merupakan silika gel yang mengandung

gypsum (CaSO4) yang berfungsi sebagai perekat agar silika gel lebih terikat pada

lempeng pendukungnya yang mengandung indikator fluoresensi pada panjang

gelombang 254 nm. Jika senyawa pada bercak memiliki ikatan rangkap

terkonjugasi atau cincin aromatik maka bercak akan meredam pada panjang

gelombang 254 nm, sedangkan pada panjang gelombang 365 nm bercak akan

berfluoresensi. Fase gerak yang digunakan toluene-etil asetat (93:7 v/v) (Stahl,

1985). Deteksi yang digunakan untuk mengidentifikasi senyawa golongan

 51

terpenoid yaitu pereaksi vanilin asam sulfat. Pada pemeriksaan senyawa terpenoid

pada ekstrak dietil eter tidak digunakan pembanding karena pemeriksaan ini

ditujukan untuk mengetahui keberadaan senyawa terpenoid, khususnya

monoterpenoid dan sesquiterpenoid.

Tabel IV. Hasil KLT pemeriksaan terpenoid dalam ekstrak dietil eter herba
pegagan embun

Bercak Vanillin asam sulfat

Rf Warna
1. Sampel 1. 0,17 Ungu
2. 0,41 Ungu keabu-abuan
3. 0,87 Ungu

Gambar 10. Kromatogram ekstrak dietil eter herba pegagan embun untuk
pemeriksaan senyawa terpenoid
Keterangan :
Fase diam : Silika gel GF254
Fase gerak : Toluene-etil asetat (97:3 v/v)
Sampel : ekstrak dietil eter herba pegagan embun
Deteksi : vanillin asam sulfat (110°C, 10 menit)

Berdasarkan deteksi menggunakan pereaksi semprot vanilin asam sulfat

terdapat bercak berwarna ungu keabu-abuan dengan nilai Rf 0,41. Secara umum,
 52

pemeriksaan senyawa terpenoid menggunakan peraksi vanilin asam sulfat

menghasilkan bercak berwarna biru keabu-abuan, sehingga dapat disimpulkan

bahwa dalam ekstrak dietil eter herba pegagan embun terdapat senyawa terpenoid,

khususnya monoterpenoid atau sesquiterpenoid. Keberadaan

monoterpenoid/sesquiterpenoid ini dalam ekstrak dietil eter yang memungkinkan

adanya khasiat antitumor pada herba pegagan embun, karena

monoterpenoid/sesquiterpenoid telah diketahui dapat mematikan sel.

O
CH 3
O C
H
+ + H2SO4

HO

CH 2 OH
Vanilin
Terpenoid

CH3
O

OH

kompleks ungu keabu-abuan

Gambar 9. Reaksi vanilin asam sulfat untuk pemeriksaan senyawa

terpenoid
 53

2. Identifikasi flavonoid

Pemeriksaan senyawa flavonoid terhadap ekstrak metanol-air

menggunakan fase diam selulosa. Selulosa digunakan dalam identifikasi flavonoid

karena tidak mengandung logam pengotor bila dibandingkan dengan fase diam

silika gel yang mengandung logam Si dan gugus hidroksil. Semakin besar jumlah

gugus hidroksil pada senyawa maka akan semakin kuat senyawa itu ditahan oleh

fase diam (Johnson, 1991) sehingga menyebabkan flavonoid tidak dapat ikut

terelusi bersama fase gerak. Fase gerak yang digunakan yaitu n-butanol : asam

asetat : air (4:1:5 v/v) diambil fase atasnya, sedangkan pembanding yang

digunakan adalah rutin. Rutin merupakan suatu glikosida flavonol. Menurut

Harborne (1987), kebanyakan senyawa fenol terutama flavonoid dapat dideteksi

pada kromatogram berdasarkan warna atau fluoresensi di bawah sinar UV.

Deteksi bercak dengan pereaksi uap ammonia menghasilkan bercak berwarna

kuning (Wagner et al.,1984).

Tabel V. Hasil KLT pemeriksaan flavonoid dalam ekstrak metanol air herba
pegagan embun

Bercak UV 365 nm Uap ammonia

Rf Warna Rf Warna
1. Sampel 1. 0,86 Ungu 1. 0,86 Kuning
2. Rutin 1. 0,68 Ungu 1. 0,68 Kuning

Hasil deteksi pada sinar UV 365 nm menunjukkan bahwa bercak-bercak

sampel berfluoresensi menghasilkan warna ungu (lembayung gelap) dan setelah

diuapi dengan ammonia berubah menjadi warna kuning dengan nilai Rf 0,86.

Pada pembanding rutin juga ditemui warna bercak ungu (lembayung gelap) dan
 54

setelah diuapi dengan ammonia berubah menjadi warna kuning dengan nilai Rf

0,68. Menurut Mursyidi (1990), glikosida flavonoid biasanya memberikan warna

khas ungu tua yang kemudian berubah menjadi hijau kekuningan bila diuapi

ammonia dengan nilai Rf 0,6-0,8.

-
O
OH

O
O -NH 4+
+ NH3

O
O

O-

komp leks warna kun ing

Gambar 9. Reaksi dengan uap amonia untukpemeriksaan senyawa

flavonoid

Hasil uji KLT menunjukkan adanya kemiripan warna bercak dan nilai Rf

antara sampel (ekstrak metanol-air) dengan pembanding rutin. Dengan demikian

dapat dikatakan bahwa ekstrak metanol-air mengandung flavonoid. Jenis

flavonoid yang terdapat dalam ekstrak metanol-air yaitu glikosida flavonoid.

Glikosida flavonoid mudah larut dalam pelarut dan campuran pelarut dengan air

akan meningkatkan kelarutannya. Hal ini sesuai dengan pemilihan cairan penyari

yang digunakan dan diharapkan kandungan flavonoid ini menunjukkan potensi

sitotoksik karena mampu mematikan sel.

 55

A B

Gambar 11. Kromatogram ekstrak metanol-air herba pegagan embun untuk

pemeriksaan senyawa flavonoid
Keterangan :
Fase diam : Selulosa
Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5)
a. Pembanding : rutin
b. Sampel : ekstrak metanol-air herba pegagan embun
A. Deteksi sinar UV 365 nm.
B. Deteksi uap amonia
 56

BAB V

KESIMPULAN DAN SARAN

A. Kesimpulan

1. Potensi toksik ekstrak dietil eter yang dinyatakan dengan nilai LC50

sebesar 229 μg/ml dan ekstrak metanol-air sebesar 769 μg/ml.

2. Ekstrak dietil eter mempunyai potensi toksik lebih tinggi daripada ekstrak

metanol-air (Meyer et al, 1982). Menurut Loomis (1978), ekstrak dietil

eter bersifat cukup toksik & ekstrak metanol-air bersifat sedikit toksik.

3. Ekstrak dietil eter mengandung senyawa terpenoid (khususnya mono- &

sesquiterpenoid) dan ekstrak metanol-air mengandung senyawa flavonoid

B. Saran

Perlu dilakukan fraksinasi terhadap ekstrak dietil eter. Kemudian dari

fraksi yang diperoleh dapat dilakukan uji sitotoksisitas menggunakan biakan

sel kanker untuk mengetahui kemungkinannya sebagai senyawa antikanker.

 57

DAFTAR PUSTAKA

Albert, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., and Walter. P., 2002,
Molecular Biology of The Cell, Fourth Edition, Garland Science, Taylor
and Francis Group, New York.

Anonim, 1986, Sediaan Galenik, 1-17, Departemen Kesehatan Replubik

Indonesia, Jakarta.

Anonim, 2002, Chemical compotition of two species of Hydrocotyle (Apiaceae),

File : minijaj@usa.net. Diakses pada tanggal 22 Maret 2002.

Anonim, 2006, Flavonoid, File : http://www.en.wikipedia.org/wiki/flavonoid.

diakses pada tanggal 4 Mei 2006.

Anonim, 2007, Kapsul Sarang Semut, File :

http://www.pikiranrakyat.cakrawala/index.htm. diakses pada tanggal 14
April 2007

Backer, C.A., and Bakhuizen van den Brink, R.C., 1963, Flora of Java, Vol. II,
172, Noodoff, GGroningen, The Netherlands.

Campbell, N.A., Recee, J.B., and Mitchell, L.G., 2002, BIOLOGY, diterjemahkan
oleh Rahayu Lestari, Edisi 5, 322-328, Penerbit Erlangga, Jakarta.

Carballo, J. Luis, Zaira, L.H., Perez, P., Garcia Gravalos, M.D., 2002, A
comparison between two brine shrimp assay to detect in vitro cytoxicity in
marine natural product, http://www.biomedcentral.com/1472-6750/2/17.
Diakses pada tanggal 10 Agustus 2005.

Colis, B.M., Chemotheraphy of Cancer, Asian J Mod Med., 1874, 10;52-450.

Dwiatmaka, Y., 2000, Skrining Tanaman Berkhasiat Antikanker dengan Metode

BST dalam Yuswanto, (Eds), kanker, 101-115, Penerbit Sanata Dharma,
Yogyakarta.

Harborne, J.B., 1987, Phytochemical Methods, Alih bahasa Padmawinata, K.,

Soediro, I., 13, 126-137, Institut Tehnologi Bandung, Bandung.

Ganong, W.F., 1995, Buku Ajar Fisiologi Kedokteran, diterjemahkan oleh dr.
Petrus Andrianto, Edisi 14, 22-29, Penerbit Buku Kedokteran EGC,
Jakarta.

Johnson. L., Stevenson, 1991, Basic Liquid Chromatography, diterjemahkan oleh

Kosasih Padmawinata, 56-57, Penerbit ITB, Bandung.
 58

Katzung, B. E., Trevor, A. J., 1993, Pharmacology, Examination and Board

Review, 4th ed, 371, Prentice-Hall International Inc, USA.

Loomis, T.A., 1978, Essential of Toxicology, Edisi III, diterjemahkan oleh Imono
Argo Donatus, 28-233, IKIP Semarang, Semarang.

Marby, T.J., Markham, K.R., and Thomas, M.B., 1970, The Systematic
Identification of Flavonoid, 13, Springer Verlag, Berlin.

Markham, K.R., 1988, Techniques of Flavonoid Identification, diterjemahkan oleh

Kosasih Padmawinata, 15-17, Penerbit ITB, Bandung.

Meyer, B.N., Ferrigni, N.R., Putnam, J.E., Jacobsen, L.B., Nichols, D.E., and
McLaughlin, J.L., 1982, Brine Shrimp : A Convinient General Bioassay
Active Constituent, Planta Medica Volume 45, 31-34.

Mudjiman, A., 1989, Udang Renik Air Asin, 15-18, Bathara, Jakarta.

Mudjiman, A., 1991, Makanan Ikan, 72-88, Penebar Swadaya, Jakarta.

Mursyidi, A., 1990, Analisis Metabolit Sekunder, 171-175, Penerbit UGM,

Yogyakarta.

Negara, A., 2003, Penggunaan Analisis Probit Untuk Pendugaan Tingkat

Kepekaan Populasi Spodoptera Exigua Terhadap Deltametrin Di Daerah
Istimewa Yogyakarta
http://www.penelitian.com//pdf+abbot+rumus.html.
Diakses pada tanggal 12 Januari 2007

Oemarjati, B.S., dan Wardhana, W., 1990, Taksonomi Avertebrata, 123-124,

Universitas Indonesia Press, Jakarta.

Rajesh, D., Rachelle, A., Stenzel, and Howard, S.P., 2003, Perillyl Alcohol as a
Radio/Chemosensitizer in Malignant Glioma
http://www.jbc.org/cgi/content/full/278/38/35968
Diakses pada tanggal 28 Juli 2007

Robinson, T., 1995, The Organic Constituent of Higher Plants, diterjemahkan

oleh Kosasih Padmawinata, 71-71, 191-193, edisi VII, Penerbit ITB,
Bandung.

Silva, G.L., Lee, I.S., Kinghorn, A.D., 1998, Special Problem with the Extraction
of Plants, in Cannel, R.J.R. (Ed), Natural Products Isolation, Humana
Press Inc., Totowa, New Jersey, 349-352.
 59

Sirait, A.M., Soetiarto, F., Oemiati, R., 2003, Ketahanan Hidup Penderita Kanker
Serviks di Rumah Sakit Dharmais Jakarta, Buletin Penelitian Kesehatan,
Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan, DepKes RI, Jakarta, 13-
24.

Siswandono dan Soekardjo, B., 2000, Kimia Medisinal, Edisi kedua, Airlangga
Univercity Press, Surabaya.

Solis, P.N., Wright, C.Q., Anderson, M.M., Gupta, M.P., and Phillipson, J.D.,
1993, A Microwell Cytotoxicity Assay using Artemia salina (Brine
Shrimp), Planta Medica Volume 59, 250-252.

Stahl, E., 1985, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy,

diterjemahkan oleh Kosasih Padmawinata, 3-6, edisi VII, Penerbit ITB,
Bandung.

Tanu, I., 1998, Farmakologi dan Terapi, Bagian Farmakologi Fakultas

Kedokteran, Universitas Indonesia, Jakarta, 686-687.

Wagner, H., Brady, S., dan Zgainski, E.M., 1984, Plant Drug Analysis A Thin
Layer Chromatography Atlas, 8, 40-41, Springer Verlag, Berlin.
 c.' fi*t FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITASSANATA DHAIIMA
(bpus !r)r hi4a4 M@{ohdj
rdp. lo274J 333037, 333e63 Fd (0274) 336s2e-r.rcsrm : sD sN yocyA
L&dF4
SURATPENGESAHANDETERMINASI
No:!r /LKTO/Iai-USD/d / 07

Laboralorium KcbunTananra
tr ObotFakulbs Famlsi Unive6ilrs S.naraDhalma,ncntrhkd batrsa
telahmelakukan dcrcminasileadrpsarucontohranaman. dengeuma:
!.lruc a1tIe t ibtharpioi.tes Lft k.
(Pcsae.n Embun)

Detcminasi
lelahdilakukanecda
benasesuai

Backer,C.A..dd
Backiruizen
Vdnde BrinkJr.,R.c't96J,;lotu of Joa, vol. r,3-9,25-26,
N v.p.
Nod.dho crcningen,
ThcNedolands.

aacko.C.A,,md Backhuizen Vm dc Brirk lr., R.C.,t965,

,rlrfa o/Jo.4 Vot. , l7t-t22, N.V.p.
NNrdholi 6 roninsen,'thc Ncdftands.

jenisGpesies)
Hins$ lclaeorir
Tar:mante^cbutdipaki drlampeneliri.n:

ToksGibsAkut Ek$ok MchnotAir dln EksrakDiclil ErcrHedaP.gdur [mbun(/trro.,,]/g

sibltorpkides Lnk.) tcthtdtp /14euiasatinaLeaoi.

Meia l{osaImaBudiCahyani
FakulbsFamasiUniveNiras
SanabDhdma
Hdbariur disimDon
LaboanoiumBiologiumun, F.&uliisF.m6i UnivcNilas

Demikian
su?tpenBeentu
deteminasi
inidibu unrukdapatdipequnakm
seblgoi

t d'-*"on r.a,l
Lampiran 2. Foto tanaman pegagan embun
Lampiran 3. Foto aquarium untuk uji BST
Lampiran 4. Foto KLT untuk pemeriksaan terpenoid ekstrak dietil eter
herba pegagan embun

Keterangan :
Fase diam : Silika gel GF254
Fase gerak : Toluene-etil asetat (97:3 v/v)
Sampel : ekstrak dietil eter herba pegagan embun
Deteksi : vanillin asam sulfat (110°C, 10 menit)
Lampiran 5. Foto KLT untuk pemeriksaan flavonoid ekstrak metanol-air
herba pegagan embun

A B

Keterangan :
Fase diam : Selulosa
Fase gerak : n-butanol : asam asetat : air (4 : 1 : 5)
a. Pembanding : rutin
b. Sampel : ekstrak metanol-air herba pegagan embun
A. Deteksi sinar UV 365 nm.
B. Deteksi uap amonia
Lampiran 6. Analisis probit ekstrak dietil eter

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
DATA Information

5 unweighted cases accepted.

0 cases rejected because of missing data.
0 cases are in the control group.
0 cases rejected because LOG-transform can't be done.
MODEL Information

ONLY Normal Sigmoid is requested.

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
Parameter estimates converged after 11 iterations.
Optimal solution found.

Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept +

BX):

Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E.

KONS ,83893 ,27919 3,00486

Intercept Standard Error Intercept/S.E.

-1,98107 ,61213 -3,23635

Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = 1,510 DF = 3 P

= ,680

Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no

heterogeneity
factor is used in the calculation of confidence limits.

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
Observed and Expected Frequencies

Number of Observed Expected

KONS Subjects Responses Responses Residual
Prob

,12670 1,00 10,0 1,9 1,267 ,643 \

,23627 1,51 10,0 2,1 2,363 -,233
,38416 2,01 10,0 2,4 3,842 -1,452
,55140 2,52 10,0 6,2 5,514 ,656
,70987 3,02 10,0 7,4 7,099 ,291
* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
Confidence Limits for Effective KONS

95% Confidence Limits

Prob KONS Lower Upper

,01 ,38764 ,00001 4,30391

,02 ,81916 ,00006 6,90867
,03 1,31684 ,00023 9,35950
,04 1,88201 ,00063 11,78833
,05 2,51637 ,00143 14,24839
,06 3,22218 ,00288 16,76978
,07 4,00218 ,00531 19,37345
,08 4,85953 ,00915 22,07618
,09 5,79774 ,01501 24,89297
,10 6,82071 ,02363 27,83819
,15 13,36626 ,15195 45,03134
,20 22,81528 ,64521 68,21474
,25 36,09495 2,13704 101,68699
,30 54,49449 5,90271 154,45863
,35 79,82443 13,93220 247,14254
,40 114,66950 28,30184 429,30665
,45 162,79804 50,04893 822,26392
,50 229,84620 79,15109 1727,32013
,55 324,50806 115,86005 3920,30345
,60 460,70905 161,72970 9512,34154
,65 661,81838 220,06291 24668,64785
,70 969,44251 296,63504 69115,18065
,75 1463,61966 401,56727 214201,85099
,80 2315,52113 554,04063 766551,33494
,85 3952,43364 795,58902 3433638,55573
,90 7745,42293 1238,12180 22949967,8097
,91 9112,03952 1375,57819 36368145,1125
,92 10871,28325 1541,42417 60001423,7548
,93 13200,13358 1745,94086 104111828,026
,94 16395,52937 2005,31692 192787849,289
,95 20994,26747 2346,79869 389554419,575
,96 28070,67545 2820,60065 890937598,652
,97 40118,14828 3532,31910 2466049609,34
,98 64491,63342 4756,63414 9559361491,08
,99 136282,78175 7582,31264 81107086093,4
 Probit Transformed Responses
,8

,6

,4

,2

,0

-,2

-,4

-,6
Probit

-,8

-1,0 Rsq = 0,8566

,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5

Log of KONS
Lampiran 7. Analisis probit ekstrak metanol-air

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
DATA Information

5 unweighted cases accepted.

0 cases rejected because of missing data.
0 cases are in the control group.
0 cases rejected because LOG-transform can't be done.
MODEL Information

ONLY Normal Sigmoid is requested.

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * * *
Parameter estimates converged after 12 iterations.
Optimal solution found.

Parameter Estimates (PROBIT model: (PROBIT(p)) = Intercept +

BX):

Regression Coeff. Standard Error Coeff./S.E.

KONS 1,82781 ,50803 3,59785

Intercept Standard Error Intercept/S.E.

-5,27533 1,51410 -3,48413

Pearson Goodness-of-Fit Chi Square = ,037 DF = 3 P

= ,998

Since Goodness-of-Fit Chi square is NOT significant, no

heterogeneity
factor is used in the calculation of confidence limits.

* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * *
Observed and Expected Frequencies

Number of Observed Expected

KONS Subjects Responses Responses Residual
Prob

,18610 2,40 10,0 1,8 1,861 -,021

,36612 2,70 10,0 3,8 3,661 ,139
,58242 3,00 10,0 5,7 5,824 -,084
,77587 3,30 10,0 7,6 7,759 -,149
,90466 3,60 10,0 9,2 9,047 ,103
* * * * * * * * * * P R O B I T A N A L Y S I S * * * * * *
Confidence Limits for Effective KONS

95% Confidence Limits

Prob KONS Lower Upper

,01 41,05819 ,95017 130,84696

,02 57,88148 2,00333 164,80507
,03 71,97208 3,21219 191,00096
,04 84,79033 4,57861 213,57399
,05 96,88301 6,10522 234,02072
,06 108,52524 7,79589 253,07727
,07 119,87880 9,65548 271,16915
,08 131,04886 11,68968 288,56897
,09 142,10882 13,90487 305,46459
,10 153,11279 16,30801 321,99291
,15 208,50500 31,42436 402,14275
,20 266,50102 52,57854 483,01691
,25 328,95545 81,18826 569,28681
,30 397,42157 118,93950 665,32588
,35 473,52467 167,71395 776,59996
,40 559,17237 229,40669 910,97956
,45 656,75445 305,58859 1080,57345
,50 769,40106 397,07445 1304,50655
,55 901,36884 503,70723 1613,12049
,60 1058,66819 624,85637 2054,66731
,65 1250,15237 760,77482 2707,78230
,70 1489,54671 914,28004 3708,48621
,75 1799,56887 1092,42165 5314,00235
,80 2221,29730 1309,15432 8070,02268
,85 2839,15496 1592,47422 13332,67747
,90 3866,28713 2008,68032 25437,73272
,91 4165,66678 2121,07341 29781,94437
,92 4517,23124 2249,06338 35365,71175
,93 4938,13763 2397,31825 42746,11172
,94 5454,74969 2572,84025 52857,29420
,95 6110,23517 2786,78798 67387,09251
,96 6981,66850 3058,47031 89711,83596
,97 8225,10613 3425,54337 127664,31315
,98 10227,41688 3976,99997 204342,50432
,99 14418,02586 5019,44658 429949,56126
 Probit Transformed Responses
1,5

1,0

,5

0,0

-,5
Probit

-1,0 Rsq = 0,9975

2,2 2,4 2,6 2,8 3,0 3,2 3,4 3,6 3,8

Log of KONS
Lampiran 8. Cara perhitungan pembuatan seri konsentrasi larutan sampel

herba pegagan embun

a. Pembuatan larutan stok

Larutan stok ekstrak metanol-air dipersiapkan sebagai larutan A dan

larutan B. Larutan A dibuat dengan menimbang 100 mg ekstrak kental metanol-

air yang kemudian dilarutkan dengan 10 ml metanol pa. Larutan B dibuat dengan

mengencerkan 1 ml larutan A dengan 10 ml metanol pa. Larutan stok ekstrak

dietil eter juga dipersiapkan sebagai larutan A dan larutan B. Larutan A dibuat

dengan menimbang 100 mg ekstrak kental dietil eter yang kemudian dilarutkan

dengan 10 ml dietil eter pa. Larutan B dibuat dengan mengencerkan 1 ml larutan

A dengan 10 ml dietil eter pa.

b. Pembuatan seri konsentrasi untuk ekstrak metanol-air

• Untuk konsentrasi 250 µg/ml (0,25 mg/ml):

Diambil dari larutan A

V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,25 mg/ml
5 ml x 0,25 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 0,125 ml
• Untuk konsentrasi 500 µg/ml (0,50 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,50 mg/ml
5 ml x 0,50 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 0,25 ml
 • Untuk konsentrasi 1000 µg/ml (1 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 1 mg/ml
5 ml x 1 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 0,5 ml
• Untuk konsentrasi 2000 µg/ml (2 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 2 mg/ml
5 ml x 2 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 1 ml
• Untuk konsentrasi 4000 µg/ml (4 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 4 mg/ml
5 ml x 4 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 2 ml
c. Pembuatan seri konsentrasi untuk ekstrak dietil eter
• Untuk konsentrasi 10 µg/ml (0,01 mg/ml):
Diambil dari larutan B
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,01 mg/ml
5 ml x 0,01 mg/ml
V1 = -------------------------
1 mg/ml
V1 = 0,05 ml
• Untuk konsentrasi 32 µg/ml (0,032 mg/ml):
Diambil dari larutan B
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,032 mg/ml
5 ml x 0,032 mg/ml
V1 = -------------------------
1 mg/ml
V1 = 0,16 ml
• Untuk konsentrasi 102 µg/ml (0,102 mg/ml):
Diambil dari larutan B
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 1 mg/ml = 5 ml x 0,102 mg/ml
5 ml x 0,102 mg/ml
V1 = -------------------------
1 mg/ml
V1 = 0,5 ml
• Untuk konsentrasi 328 µg/ml (0,328 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 0,328 mg/ml
5 ml x 0,328 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 0,16 ml
• Untuk konsentrasi 1049 µg/ml (1,049 mg/ml):
Diambil dari larutan A
V1 x C1 = V2 x C2
V1 x 10 mg/ml = 5 ml x 1,049 mg/ml
5 ml x 1,049 mg/ml
V1 = -------------------------
10 mg/ml
V1 = 0,52 ml
 BIOGRAFI PENULIS

Maria Rosa Irma Budi Cahyani dilahirkan

di Magelang, Jawa Tengah pada tanggal 2

Oktober 1984 sebagai putri kedua dari

pasangan YB. Sudono dan Lea Budiningsih.

Penulis menempuh pendidikan di Taman

Kanak-Kanak St. Theresia Muntilan pada

tahun 1989-1991, dan pada tahun 1997

menyelesaikan pendidikan di Sekolah Dasar Marsudirini Mater Dei

Muntilan. Pada tahun 1997-2000, penulis menempuh pendidikan di

Sekolah Menengah Pertama Negri I Muntilan, dan melanjutkan ke

Sekolah Menengah Umum Stella Duce II Yogyakarta pada 2001-2003.

Pada tahun 2003, penulis ,melanjutkan pendidikan ke jenjang Strata Satu

(S1) Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.