DAFTAR ISI

Halaman

DAFTAR ISI ...................................................................................................... ii

DAFTAR TABEL ............................................................................................. v
DAFTAR GAMBAR ........................................................................................ vi
DAFTAR SINGKATAN .................................................................................. vii
DAFTAR LAMPIRAN...................................................................................... x

BAB I. PENDAHULUAN................................................................................. 1
1.1. Latar Belakang ......................................................................................... 1
1.2. Peumusan Masalah…………………………………………..................... 5
1.3. Pertanyaan Penelitian ................................................................................ 6
1.3.1. Pertanyaan utama........................................................................... 6
1.3.2. Pertanyaan tambahan..................................................................... 6
1.4. Tujuan Penelitian....................................................................................... 7
1.4.1. Tujuan umum................................................................................ 7
1.4.2. Tujuan khusus............................................................................... 7
1.5. Manfaat Penelitian.................................................................................... 8
1.5.1. Bidang pendidikan....................................................................... 8
1.5.2. Bidang penelitian.......................................................................... 9
1.5.3. Bidang pelayanan masyarakat...................................................... 9
1.6. Orisinalitas............................................................................................... 10
1.7. Potensi Hak Atas Kekayaan Intelektual................................................... 10
1.8. Rencana publikasi ilmiah......................................................................... 10

BAB II. TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Penyakit Ginjal Kronik ………………………………………………… 13
2.1.1. Defenisi dan klasifikasi …………………………………………. 13
2.1.2. Terapi ………………………………………………………........ 14
2.2. Hemodialisis............................................................................................. 15
2.2.1. Defenisi dan Prinsip kerja............................................................. 15
2.2.2. Epidemiologi ................................................................................ 17
2.2.3. Indikasi ........................................................................................ 18
2.2.3.1. Akut …………………………………………………… 18
2.2.3.2. Kronis ………………………………………………..... 19
2.2.4. Komplikasi …………………………………………………….. 19
2.2.4.1. Akut …………………………………………………… 20
2.2.4.2. Kronis …………………………………………………. 20
2.2.5. Hemodialisis sebagai status inflamasi ...................................... 21
2.2.6. Penyakit kardiovaskular sebagai penyebab utama kematian
pasien hemodiálisis …………...................................................... 24

ii
 2.2.6.1. Resiko penyakit kardivaskular …………………….
2.2.6.2. Peran IL-6 sebagai faktor resiko penyakit
Kardivaskular ……………………………………..
2.2.6.3. Manifestasi penyakit kardivaskular ……………….
2.2.6.4. Patogenesis kalsifikasi vaskular …………………..
2.2.7. Harapan hidup pasien hemodiálisis ………………………..
2.2.7.1. Defenisi …………………………………………....
2.2.7.2. Faktor-faktor yang mempengaruhi ………………..
2.3. α-2 heremans schmid glycoprotein (AHSG)……………………….
2.3.1. Defenisi ………………………………………....................
2.3.2. Fungsi Fetuin-A ………………………………....................
2.3.2.1. Peranan Fetuin-A pada kalsifikasi vaskular ………
2.3.2.2. Peranan Fetuin-A pada inflamasi ............................
2.3.3. Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar Fetuin-A................
2.3.4. Metode pemeriksaan Fetuin-A serum ………........................
2.3.5. Gen AHSG…………………………………………...............
2.3.6. Polimorfisme gen AHSG.........................................................
2.3.7. Metode pemeriksaan polimorfisme gen AHSG.......................
2.4. Kerangka Teori..................................................................................
2.5. Kerangka Konsep..............................................................................
2.6. Hipotesis Penelitian............................................................................
2.6.1. Hipotesis mayor ....................................................................
2.6.2. Hipotesis minor

BAB III. METODE PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian........................................................................
3.2. Waktu dan Tempat penelitian...........................................................
3.3. Populasi dan sampel Penelitian.........................................................
3.3.1. Populasi …………………………………………………….
3.3.2. Sampel dan Teknik Pemilihan Sampel..................................
3.3.3. Kriteria Penerimaan dan penolakan ..……………………….
3.3.4. Besar sampel..........................................................................
3.4. Variabel penelitian dan Definisi Operasional ...................................
3.4.1. Identifikasi Variabel ..............................................................
3.4.2. Definisi Operasional .............................................................
3.5. Kerangka penelitian................……………………………………..
3.6. Prosedur Kerja Penelitian ………………………………………….
3.6.1. Identifikasi subjek penelitian ...............................................
3.6.2. Pengumpulan data
3.6.3. Follow up ...............................................................................
3.6.4. Penelitian selesai atau dihentikan ..........................................
3.7 Pengolahan data .....................................................................
3.7.1. Editing ……………………………………………..
3.7.2. Coding ……………………………………………..
3.7.3. Entry ……………………………………………….

iii
 3.7.4. Cleaning data ………………………………………
3.8. Analisis data .....................................................................................
3.8.1. AnalisisUnivariat ……..……………………………...
3.8.2. Analisis Bivariat…..………………………………….
3.8.3. AnalisisMultivariat …………………………………
3.9. Etika Penelitian ………………………….........................................

DAFTAR PUSTAKA
LAMPIRAN

iv
 DAFTAR TABEL

No. Judul Halaman

Tabel 1. Kriteria Penyakit Ginjal Kronik...........................................................

Tabel 2. Klasifikasi Penyakit Ginjal Kronik atas Dasar Derajat Penyakit ........

Tabel 3. Rencana Tata Laksana PGK sesuai dengan derajatnya .......................

Tabel 4. Pasien Baru dan pasien aktif yang menjalani HD di Indonesia dari

Tahun 2007-2011 (IRR,2011) .............................................................

Tabel 5. Komplikasi Kronik HD ........................................................................

Tabel 6. Faktor Resiko PKV pada pasien PGK .................................................

Tabel 7. Kesimpulan patogenesis kalsifikasi vaskular......................................

Tabel 8. Harapan hidup Pasien Dialisis (Kidney Support, 2015) ......................

Tabel 9. Beberapa penelitian yang menghubungkan Fetuin-A dan outcome

pasien diálisis......................................................................................

Tabel 10. Beberapa penelitian yang menghubungkan polimorfisme gen

AHSG, kadar fetuin dan mortalitas pasien diálisis............................

Tabel 11. Defenisi operasional setiap variabel................................................

v
 DAFTAR GAMBAR

No Judul Halaman

Gambar 1. Prinsip Kerja HD (Dipiro et al,2011) ...…………………….

Gambar 2. Insidensi & prevalensi RRT di US………………………….

Gambar 3. Mortalitas PKV pada populasi umum dibandingkan dengan

Pasien dialisis. GP general population (sarnak,2003)...........

Gambar 4. Penyebab Kematian pasien Hemodialisis (IRR,2011) ..........

Gambar 5. Faktor Risiko aterosklerosis pada uremia ..............................

Gambar 6. Mekanisme Kalsifikasi vaskular pada psien PGK .................

Gambar 7. Kalsifikasi intima dan media pada PGK ................................

Gambar 8. Skoring kalsifikasi aorta abdominalis (AAC Scores) ............

Gambar 9 Harapan hidup 5 tahun berdasarkan penyakit ginjal yang

mendasari diberbagai negara……………………………......

Gambar 10. Struktur skematik Fetuin-A…………………...................

Gambar 11. Kartun dari Fetuin-A manusia…………………....................

Gambar 12. Lokasi genom gen AHSG………………………..................

Gambar 13. Kerangka teori………………………………........................

Gambar 14. Kerangka konsep....................................................................

Gambar 15. Kerangka penelitian...............................................................

vi
 DAFTAR SINGKATAN

AHSG : α2-Heremans Schmid Glycoprotein

ALP : Alkaline phosphatase

BCP : basic calcium phosphate

BMI : Body Mass Index

BMP2a : Bone Matrix Protein 2a

Cbfa : Core binding factor alpha

DM : Diabetes Melitus

DN : Diabetes Nefropati

ELISA : Enzyme Linked Immunosorbent Assay

FGF : Fibroblast Growth Factor

GNK : Glomerulonefritis Kronik

Hb : Hemoglobin

HD : Hemodialisis

HN : Hipertensi Nefropati

HRP : Horseradish Peroksidase

hs-CRP : high sensitivity-C Reactive Protein

IMT : Indeks Massa Tubuh

IRR : Indonesian Renal Registry

KNG : Kininogen

KDOQI : Kidney Disease Outcome Quality Initiative

KSGH : Klinik Spesialis Ginjal Hipertensi

vii
LFG : Laju Filtrasi Glomerulus

LPS : Lipopolisakarida 

MGP : matrix Gla protein

MMP : matrix metalloproteinase

NHANES : National Health and Nutrition Examination

Survey

NKF : National Kidney Foundation

OC : Osteocalcin

ON : Osteonectin

OPG : Osteoprotegerin

OPN : Osteopontin

PCR : polymerase chain reaction

PD : Peritoneal Dialisis

PEW : Protein Energy Wasting

PGK : Penyakit Ginjal Kronik

PKV : Penyakit kardiovaskular

RANK : Receptor Activator of Nuclear factor-Kappa B

RFLP : Restriction Fragment Length Polymorphism

RR : resiko relative

RRT : Renal Replacement Therapy

Runx2 : Runt-related transcription factor 2

SNP : Single Nucleotide Polymorphism

TNF-α : Tumor Necrosis Factor

viii
TGF : Transforming Growth Factor

USRDS : United Sate Renal Data System

VSMC : Vascular Smooth Muscle Cell

ix
 DAFTAR LAMPIRAN

Halaman

Lampiran 1. Lembar penjelasan kepada calon subjek penelitian …...........

Lampiran 2. Formulir persetujuan setelah penjelasan..................................

Lampiran 3. Draf log book subjek penelitian……………………………..

Lampiran 4. Alat yang digunakan dalam penelitian……………………...

Lampiran 5. Daftar riwayat hidup……………………………………….

Lampiran 6. Dummy table ………………………………………………..

x
 1

BAB I

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang

Angka morbiditas dan mortalitas pasien penyakit ginjal kronik (PGK) tahap

akhir yang menjalani dialisis masih sangat tinggi, kira-kira 15-20 persen per tahun,

meskipun telah dilakukan perbaikan penatalaksanaan penyakit kardiovaskular (PKV),

infeksi dan terapi dialisis (USRDS, 2009). Resiko kematian pada kelompok usia 25-

34 tahun lebih tinggi (sampai 1000 kali) dibanding populasi umum begitu juga pada

pasien berusia 45 tahun (sampai 100 kali) (Kuzniar et al, 2008). Harapan hidup

setelah memulai diálisis pada pasien yang berusia 40-45 tahun yaitu lebih kurang 8

tahun dan hanya 4.5 tahun pada pasien yang berusia 60-64 tahun. Menurut United

State Renal Data System (USRDS) (2009) harapan hidup kumulatif 5 tahun pasien

hemodialisis (HD) kronik di Amerika Utara sekitar 25% dibandingkan tahun 2005

yang hanya 20%. Angka kematian ini lebih tinggi 2-3 kali dibanding dengan kanker

prostat dan payudara pada usia yang sama. Angka mortalitas ini akan terus

bertambah oleh karena meningkatnya insidensi pasien PGK yang menjalani dialisis.

Data pada Indonesian Renal Registry (IRR) menunjukkan insidensi pasien PGK

yang menjalani HD meningkat dua kali lipat selama tiga tahun yaitu 4.977 orang pada

tahun 2007 menjadi 9.649 orang pada tahun 2010.

Salah satu penyebab utama morbiditas dan mortalitas pasien PGK tahap akhir

di berbagai negara adalah PKV (Foley et al, 1998; Levin, 2003). Di Jepang hal ini

merupakan penyebab lebih dari 40% kematian pasien HD (Oikawa et al, 2007).
 2

Menurut IRR pada tahun 2010, penyebab kematian pasien HD yang terbanyak di

Indonesia adalah PKV yaitu 44%. Meskipun prevalensinya menurun di populasi

umum, namun pola ini tidak diikuti pada pasien HD, sehingga penyakit ini masih

terjadi pada 50% kasus kematian pasien HD (USRDS, 2010). Pada pasien dialisis,

mortalitas akibat penyakit ini 20-30 kali lebih tinggi dibandingkan populasi umum

(Foley et al, 1998; Qunibi W, 2007). Angka kematian ini lebih tinggi 100 kali pada

pasien anak-anak yang menjalani dialisis dibanding populasi umum (Qunibi W,

2007).

Salah satu petanda prognostik terhadap kematian akibat PKV pada pasien HD

adalah kalsifikasi vaskular khususnya kalsifikasi arteri koroner yang derajatnya lebih

berat 2.5-5 kali dibanding pasien non HD. Hal ini memprihatinkan karena lebih dari

90% pasien HD yang berusia 19-39 tahun mengalami kalsifikasi arteri koroner

(Ketteler et al, 2005). Data lain menunjukkan bahwa pada usia 30 tahun pasien

dialisis memiliki resiko kematian 500 kali lebih besar dibanding populasi umum pada

usia yang sama akibat kalsifikasi arteri koroner (Ketteler et al, 2005).

Meskipun prevalensinya sangat tinggi, tetapi masih ada 30% pasien PGK dan

15% pasien dialisis yang tidak mengalaminya, walaupun terdapat banyak faktor yang

mendukung terjadinya kalsifikasi vaskular ini pada pasien tersebut (Qunibi, 2007).

Hal ini menyebabkan munculnya dugaan bahwa faktor genetik dan produknya juga

memiliki peranan.

Penelitian pada dekade terakhir menunjukkan bahwa kalsifikasi vaskular tidak

lagi sekedar fenomena degeneratif pasif tetapi sama aktifnya seperti pembentukan

tulang, yang dipengaruhi oleh interaksi faktor stimulator dan inhibitor. Salah satu
 3

faktor inhibitor tersebut adalah α2-Heremans Schmid Glycoprotein (AHSG) yang

dikenal dengan Fetuin-A. Penelitian menunjukkan pada pasien dialisis, semakin

rendah kadarnya semakin luas kalsifikasi vaskular (Moe et al, 2005; Cozzolino et al,

2006; Wang et al, 2009) dan semakin meningkat kekakuan aorta (Hermans et al,

2006; Kuzniar, 2008). Kadarnya secara independen berhubungan dengan mortalitas

akibat penyakit non kardiovaskular (Hermans et al, 2007) maupun PKV, yaitu

semakin rendah kadarnya semakin cepat kematian terjadi dan peningkatan kadarnya

0.1 g/L mengurangi semua penyebab kematian sebanyak 13% (Bláha et al, 2009).

Sampai saat ini di Indonesia belum ada data mengenai kadar fetuin-A sebagai

prediktor kematian pasien HD.

Fetuin-A adalah glikoprotein dengan berat molekul 62-kDa, merupakan

superfamili cystatin dari cysteine protease inhibitor, disintesis pada jaringan hati

manusia dan ditemukan diseluruh tubuh pada bagian ekstraselular. Peranan Fetuin-A

secara fisiologi masih dalam penelitian. Namun beberapa laporan telah membuktikan

bahwa Fetuin-A merupakan protein multifungsi yang dapat bekerja sebagai

penghambat kalsifikasi vaskular dengan menghambat pembentukan produk kalsium

pospat (Schaver et al, 2003, Cozzolino et al, 2005). Fetuin-A sebagai protein fase

akut negatif juga berperan dalam proses inflamasi yaitu mencegah perburukan

inflamasi (Suliman et al, 2008; Zeidan et al, 2012) dengan membatasi produksi

sitokin proinflamasi seperti menekan pelepasan TNF-α (Ombrellino, 2001).

Inflamasi merupakan salah satu penyebab rendahnya kadar Fetuin-A sirkulasi

(Cozzolino et al, 2006), meskipun faktor lain juga berkontribusi, seperti

polimorfisme pada gen AHSG yang mengkode Fetuin-A. Hal ini dibuktikan oleh
 4

Schaver et al (2003) bahwa defisiensi Fetuin-A pada tikus dapat menyebabkan

kalsifikasi pada berbagai organ, dimana keparahan dan lokasi kalsifikasi tergantung

pada genetiknya (Westerfeld et al, 2007). Di Indonesia belum ada data mengenai

faktor-faktor yang mempengaruhi kadar fetuin-A pada pasien HD.

Gen AHSG pada manusia terletak pada kromosom 3q27, terdiri dari 7 exon

yang terentang sepanjang 8.2 kb (Osawa et al, 2001). Sampai saat ini telah diketahui

319 single nucleotide polymorphism (SNP) pada gen AHSG. SNP rs4918 terletak

pada exon ke-7 dan mengkodekan asam amino Thr256Ser (NCBI, 2013) merupakan

SNP yang paling banyak dianalisis dalam hubungannya dengan kadar Fetuin-A serum

di berbagai populasi.

Stenvinkel et al (2005) di Swedia mendapatkan adanya polimorfisme

Thr256Ser pada gen AHSG menurunkan kadar Fetuin-A pasien HD. Penurunan ini

meningkatkan resiko mortalitas PKV akibat kalsifikasi vaskular dan mortalitas non

kardiovaskular akibat inflamasi ataupun penyakit lainnya. Penelitian lain oleh

Verduijn et al (2010) di Belanda juga memperlihatkan pengaruh polimorfisme

Thr256Ser (alel G) gen AHSG pada mortalitas pasien HD {HR 0.99 (95%CI 0.81-

1.21)}. Hal ini menimbulkan dugaan bahwa adanya polimorfisme Thr256Ser pada

gen AHSG menurunkan kadar Fetuin-A sirkulasi sehingga meningkatkan resiko

mortalitas baik akibat PKV melalui kalsifikasi vaskular ataupun inflamasi.

Berbeda halnya dengan kedua peneliti diatas, Cozzolino et al (2007) di Italia

mendapatkan tidak ada hubungan antara polimorfisme Thr256Ser gen AHSG dengan

penurunan kadar Fetuin-A pasien HD. Sehingga secara tersirat penelitian ini

menunjukkan bahwa polimorfisme gen AHSG bukanlah faktor prognostik negatif

 5

perkembangan PKV pada pasien HD. Sampai saat ini belum ada data di Indonesia

mengenai polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG dan pengaruhnya terhadap kadar

Fetuin-A, penyebab kematian dan lama harapan hidup pasien HD kroniknya.

1.2. Perumusan Masalah

Berdasarkan uraian dalam latar belakang penelitian diatas dapat diambil

kesimpulan:

1. Angka morbiditas dan mortalitas pasien PGK dengan dialisis akibat

PKV cukup tinggi. Angka ini akan terus meningkat oleh karena insidensi

pasien PGK yang menjalani HD di berbagai negara termasuk Indonesia

terus bertambah.

2. Salah satu petanda prognostik kematian akibat PKV adalah kalsifikasi

vaskular. Meskipun prevalensinya sangat tinggi, masih ada pasien PGK

dan HD yang tidak mengalami kalsifikasi vaskular selama hidupnya

walau banyak faktor yang mendukung terjadinya kalsifikasi vaskular

ini. Sehingga menimbulkan dugaan bahwa ada peranan faktor genetik

dan produknya.

3. Penelitian pada dekade terakhir menunjukkan bahwa kalsifikasi vaskular

sama aktifnya seperti pembentukan tulang yang dipengaruhi faktor

stimulator dan inhibitor. Salah satu faktor inhibitor tersebut adalah α2-

Heremans Schmid Glycoprotein (AHSG) yang dikenal dengan Fetuin-A.

Beberapa penelitian mendapatkan pada pasien dialisis kadarnya

berhubungan dengan mortalitas akibat PKV maupun non kardiovaskular,

 6

yaitu semakin rendah kadarnya semakin cepat kematian terjadi dan

semakin luas kalsifikasi vaskular. Tetapi di Indonesia belum ada data

mengenai kadar fetuin-A sebagai prediktor kematian pasien HD.

4. Banyak faktor yang mempengaruhi penurunan kadar Fetuin-A sirkulasi,

salah satunya polimorfisme pada gen AHSG yang menyandi Fetuin-A.

SNP Thr256Ser merupakan SNP yang paling banyak dianalisis dalam

hubungannya dengan kadar Fetuin-A serum di berbagai populasi. Sampai

saat ini belum ada data mengenai faktor-faktor yang mempengaruhi kadar

fetuin-A pada pasien HD di Indonesia.

5. Sampai saat ini pengaruh polimorfisme gen AHSG pada kadar Fetuin-A

dan mortalitas pada pasien dialisis masih kontroversi pada berbagai

negara di Eropa. Sedangkan di Indonesia belum ada data mengenai

polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG dan pengaruhnya terhadap

kadar Fetuin-A, penyebab kematian dan lama harapan hidup pasien HD

kroniknya.

1.3. Pertanyaan Penelitian

Dari kesimpulan diatas dapat dirumuskan pertanyaan penelitian sebagai

berikut:

1.3.1. Pertanyaan utama:

Adakah pengaruh polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG terhadap

terhadap lama harapan hidup pasien HD kronik di Indonesia?

1.3.2. Pertanyaan tambahan:

 7

a. Adakah pengaruh polimorfisme Thr256Ser gen AHSG terhadap kadar

Fetuin-A pada pasien HD kronik di Indonesia?

b. Adakah pengaruh polimorfisme Thr256Ser gen AHSG terhadap

kalsifikasi vaskular pada pasien HD kronik di Indonesia?

c. Adakah pengaruh kadar Fetuin-A terhadap kalsifikasi vaskular pada

pasien HD kronik di Indonesia?

d. Adakah pengaruh kadar Fetuin-A terhadap lama harapan hidup pada

pasien HD kronik di Indonesia?

e. Adakah pengaruh kadar IL-6 terhadap lama harapan hidup pada pasien

HD kronik di Indonesia?

f. Adakah pengaruh kadar Il-6 terhadap kalsifikasi vaskular pada pasien HD

kronik di Indonesia?

g. Adakah pengaruh IL-6 terhadap kadar Fetuin-A pada pasien HD kronik di

Indonesia?

1.4. Tujuan Penelitian

1.4.1. Tujuan umum

Menentukan pengaruh polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG

terhadap lama harapan hidup pada pasien HD kronik di Indonesia.

1.4.2. Tujuan khusus

a. Menentukan pengaruh polimorfisme Thr256Ser gen AHSG terhadap kadar

Fetuin-A pada pasien HD kronik di Indonesia?

 8

b. Menentukan pengaruh polimorfisme Thr256Ser gen AHSG terhadap

kalsifikasi vaskular pada pasien HD kronik di Indonesia?

c. Menentukan pengaruh kadar Fetuin-A terhadap kalsifikasi vaskular pada

pasien HD kronik di Indonesia?

d. Menentukan pengaruh kadar Fetuin-A terhadap lama harapan hidup pada

pasien HD kronik di Indonesia?

e. Menentukan pengaruh kadar IL-6 terhadap lama harapan hidup pada

pasien HD kronik di Indonesia?

f. Menentukan pengaruh kadar Il-6 terhadap kalsifikasi vaskular pada

pasien HD kronik di Indonesia?

g. Menentukan pengaruh IL-6 terhadap kadar Fetuin-A pada pasien HD

kronik di Indonesia?

1.5. Manfaat Penelitian

1.5.1. Bidang pendidikan

a. Mendapatkan distribusi polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG pasien

HD kronik di Indonesia.

b. Membuktikan atau membantah polimorfisme Thr256Ser pada gen

AHSG dan kadar fetuin-A sebagai prediktor mortalitas pasien HD kronik

di Indonesia

c. Mendapatkan faktor-faktor yang mempengaruhi kadar fetuin-A pada

pasien HD kronik di Indonesia.

d. Mengembangkan teori peranan genetik pada pasien HD

 9

e. Mengembangkan teori jalur Fetuin-A mempengaruhi mortalitas pada

pasien HD kronik.

1.5.2. Bidang penelitian

a. Sebagai data dasar bagi peneliti lain mengenai polimorfisme

Thr256Ser pada gen AHSG pasien HD kronik di Indonesia

b. Jika hipotesa terbukti, hasil penelitian ini sebagai masukan bagi peneliti

lain untuk meneliti alel yang sama pada ras yang berbeda atau meneliti

alel yang lain jika hipotesa tidak terbukti

c. Sebagai data dasar bagi peneliti lain untuk menggunakan petanda yang

berbeda guna membuktikan jalur Fetuin-A mempengaruhi mortalitas

pada pasien HD kronik

d. Sebagai data dasar bagi peneliti lain untuk mencari faktor lain yang

mempengaruhi kadar Fetuin-A

1.5.3. Bidang pelayanan masyarakat

a. Jika hipotesa terbukti, hasil penelitian ini sebagai masukan bagi praktisi

medis dalam upaya memperbaiki prognosa pasien HD kronik dengan

menentukan penatalaksanaan yang tepat dan optimal seperti rekayasa

genetika dan pemberian Fetuin A sebagai terapi pencegahan terjadinya

kalsifikasi vaskular. Selain itu bisa dilakukan pemberian anti inflamasi

sebagai terapi pencegahan penurunan kadar fetuin-A sehingga angka

mortalitas akibat PKV dapat diturunkan.

 10

1.6. Orisinalitas

Berdasarkan penelusuran secara kepustakaaan, peneliti belum

menemukan penelitian di Indonesia tentang:

1. Polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG dan pengaruhnya terhadap kadar

Fetuin-A, penyebab kematian dan lama harapan hidup pasien HD kronik.

2. Kadar fetuin-A sebagai prediktor penyebab kematian dan lama harapan

hidup pasien HD kronik.

3. Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar fetuin-A pada pasien HD kronik.

1.7. Potensi Hak Kekayaan Intelektual

Potensi Hak Kekayaan Intelektual (HAKI) pada penelitian ini adalah:

1. Mendapatkan distribusi polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG pasien

HD kronik di Indonesia

2. Membuktikan atau membantah polimorfisme Thr256Ser pada gen

AHSG sebagai salah satu prediktor mortalitas pasien HD kronik di

Indonesia.

1.8. Rencana publikasi ilmiah

Hasil disertasi ini akan disusun dalam bentuk bentuk beberapa artikel ilmiah

yang diharapkan dapat dipublikasikan pada jurnal maupun acara nasional dan

internasional.
 11

Tabel 1. Kriteria Penyakit Ginjal Kronik

No Judul artikel Nama jurnal/ Tempat/ Rencana Periode

. seminar Waktu kirim review

1. Pengaruh polimorfisme Kidney

Thr256Ser gen AHSG International

terhadap kadar Fetuin-A pada Journal

pasien HD kronik di

Indonesia

2. Pengaruh polimorfisme Journal of

Thr256Ser gen AHSG Nephrology &

terhadap kalsifikasi vaskular Therapeutics

pada pasien HD kronik di

Indonesia

3. Polimorfisme Thr256Ser NDT journal

pada gen AHSG sebagai

prediktor lama harapan hidup

pada pasien HD

kronik di Indonesia

4. Pengaruh kadar Fetuin-A The Indonesian Indonesia

terhadap kalsifikasi vaskular Journal of

pada pasien HD kronik di Nephrology and

 12

Indonesia Hypertension

5. Kadar Fetuin-A sebagai The Indonesian Indonesia

prediktor lama harapan hidup Journal of

pada pasien HD Internal Medicine

kronik di Indonesia

6. Pengaruh kadar IL-6 12th scientific Jakarta,

terhadap kalsifikasi vaskular meeting InaSH Indonesia

pada pasien HD kronik di 2018

Indonesia

7. Kadar IL-6 sebagai prediktor Konas Pernefri Aceh,

mortalitas pada pasien HD 2018 Indonesia

kronik di Indonesia

8. Pengaruh IL-6 terhadap ERA EDTA 2018 Denmark

kadar Fetuin-A pada pasien

HD kronik di Indonesia
 13

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Penyakit Ginjal Kronik

2.1.1. Defenisi dan klasifikasi

Penyakit Ginjal Kronik adalah suatu proses patofisiologis dengan etiologi

yang beragam, mengakibatkan penurunan fungsi ginjal yang progresif, dan pada

umumnya berakhir dengan gagal ginjal. Selanjutnya, gagal ginjal adalah suatu

keadaan klinis yang ditandai dengan penurunan fungsi ginjal irreversibel, pada

suatu derajat yang memerlukan terapi pengganti ginjal yang tetap, berupa

dialisis atau transplantasi ginjal (Suwitra, 2006).

Klasifikasi PGK didasarkan atas dua hal yaitu, atas dasar derajat penyakit

(tabel 1) dan atas dasar diagnosis etiologi. Klasifikasi atas dasar penyakit,

dibuat berdasarkan laju filtrasi glomerulus (LFG), yang dihitung dengan

mempergunakan rumus Cockcroft-Gault sebagai berikut (Suwitra, 2006):

LFG (ml/menit/1,73 m2) = (140-umur) x BB

72x kreatinin plasma (mg/dl)

Untuk perempuan : LFG x 0,85

 14

Tabel 1. Klasifikasi PGK atas dasar derajat penyakit

Derajat Penjelasan LFG

(ml/mnt/1,73 m2)

1 Kerusakan ginjal dengan LFG normal atau > 90

meningkat

2 Kerusakan ginjal dengan LFG meningkat 60-89

ringan

3 Kerusakan ginjal dengan LFG meningkat 30-59

sedang

4 Kerusakan ginjal dengan LFG meningkat 15-29

berat

5 Gagal ginjal <15 atau dialisis

2.1.2. Terapi

Perencanaan tatalaksana PGK sesuai dengan derajatnya, dapat dilihat di table

Tabel 3. Rencana tatalaksana PGK sesuai dengan derajatnya

Derajat LFG ( mL/menit/1,73 m²) Rencana tatalaksana

1 ≥ 90 Terapi penyakit dasar, kondisi komorbid,

evaluasi perburukan (progression) fungsi

ginjal, memperkecil risiko kardiovaskular

2 60-89 Menghambat perburukan (progression)

 15

fungsi ginjal

3 30-59 Evaluasi dan terapi komplikasi

4 15-29 Persiapan untuk terapi pengganti ginjal

5 < 15 atau dialisis Terapi untuk pengganti ginjal

Sumber: (Suwitra, 2006)

Terapi untuk penyakit penyebab tentu sesuai dengan patofisiologi masing-

masing penyakit. Pencegahan progresivitas penyakit ginjal kronik bisa dilakukan

dengan beberapa cara, antara lain restriksi protein, kontrol glukosa, kontrol tekanan

darah dan proteinuria, penyesuaian dosis obat-obatan dan edukasi. Pada pasien yang

sudah mengalami penyakit ginjal dan terdapat gejala uremia, hemodialisis atau terapi

pengganti lain bisa dilakukan (Brenner&Lazarus, 2012).

2.2. Hemodialisis

2.2.1. Defenisi dan prinsip kerja

Hemodialisis adalah suatu proses terapi pengganti ginjal dimana

terjadi difusi partikel terlarut (salut) dan air secara pasif melalui kompartemen

cair yaitu darah menuju kompartemen cairan dialisat melewati membran semi

permeabel dalam dialiser, yang berfungsi sebagai nefron sehingga dapat

mengeluarkan produk sisa metabolisme dan mengoreksi gangguan

keseimbangan cairan dan elektrolit pada pasien gagal ginjal (Price and Wilson,

2005).
 16

Dalam suatu proses HD, darah penderita dipompa oleh mesin untuk

dialirkan ke dalam kompartemen darah yang dibatasi oleh selaput

semipermeabel buatan dengan kompartemen dialisat pada suatu tabung

ginjal (dialyzer). Kompartemen dialisat dialiri cairan diálisis yang bebas

pirogen, berisi larutan dengan komposisi elektrolit mirip serum normal dan

tidak mengandung sisa metabolisme nitrogen. Cairan diálisis dan darah yang

terpisah akan mengalami perubahan konsentrasi karena zat terlarut berpindah

dari konsentrasi yang tinggi ke arah konsentrasi yang rendah sampai konsentrasi

zat terlarut sama di kedua kompartemen (difusi). Pada proses diálisis, dengan

menaikkan tekanan hidrostatik negatif pada kompartemen dialisat (ultrafiltrasi),

air dan zat-zat terlarut dapat berpindah dari kompartemen darah ke

kompartemen dialisat untuk selanjutnya dibuang (Gambar 2) (Rahardjo et al,

2009). 

Gambar 1. Prinsip Kerja HD (Dipiro et al, 2011)

 17

Setelah terjadi proses HD di dalam dialiser, maka darah akan

dikembalikan ke tubuh pasien. Sedangkan dialisat yang telah berisi produk

limbah yang tertarik dari darah pasien akan dibuang oleh mesin dialisis dengan

cairan pembuang yang disebut ultrafiltrat. Semakin banyak zat toksik atau

cairan tubuh yang dikeluarkan maka bersihan ureum yang dicapai selama HD

akan semakin optimal (Depkes, 1999; Brunner & Suddarth, 2001; Black, 2005

dalam Septiwi, 2011).

2.2.2. Epidemiologi

Insiden dialisis di AS meningkat 0,27% pada tahun 2010

dibandingkan tahun 2009. Sampai 31 Desember 2010 terjadi peningkatan

prevalensi yang menjalani HD sekitar 4% dibandingkan tahun 2009 (USRDS,

2012).

Gambar 2. Insidensi & prevalensi RRT di US (USRDS, 2011)

 18

Hemodiálisis diperkenalkan pertama kali sebagai terapi pengganti

ginjal di Indonesia tahun 1967 oleh R.P. Sidabutar dan mulai aktif tahun 1970.

Sejak itu fasilitas HD terus berkembang dan sekarang telah dilaksanakan di

banyak rumah sakit (Rahardjo et al, 2009). Data pada IRR (2011) menunjukkan

insidensi pasien PGK yang menjalani HD meningkat tiga kali lipat selama

empat tahun yaitu 4977 orang pada tahun 2007 menjadi 15353 orang pada tahun

2011.

Tabel 4. Pasien baru dan pasien aktif yang menjalani HD di Indonesia dari

tahun 2007-2011 (IRR, 2011)

2007 2008 2009 2010 2011

Pasien Baru 4977 5392 8193 9649 15353

Pasien Aktif 1885 1936 4707 5184 6951

2.2.3. Indikasi

Indikasi HD dibedakan menjadi HD emergensi atau HD segera dan

HD kronik.29

A. Indikasi HD emergensi antara lain:

a) Kegawatan ginjal

a. Klinis (keadaan uremik berat, overhidrasi)

b. Oligouria (produksi urine < 200 ml/12 jam)
c. Anuria (produksi urine < 50 ml/12 jam)
d. Hiperkalemia (terutama jika terjadi perubahan ECG, biasanya
 19

K>6,5 mmol/l).
e. Asidosis berat (pH < 7,1 atau bikarbonat < 12 mEq/l).
f. Uremia (BUN > 150 mg/dL)
g. Ensefalopati uremikum.
h. Neuropati/miopati uremikum.
i. Perikarditis uremikum.
j. Disnatremia berat (Na >160 atau < 115 mmol/L)
k. Hipertermia.
b) Keracunan akut (alkohol, obat-obatan) yang bisa melewati membran dialisis.

B. Indikasi HD kronik

Hemodialisis kronik adalah HD yang dikerjakan berkelanjutan seumur

hidup penderita. Menurut Kidney Disease Outcomes Quality Initiative

(KDOQI) dialisis dimulai jika LFG<15 ml/mnt. Keadaan pasien yang

mempunyai LFG<15 ml/menit tidak selalu sama, sehingga dialisis dianggap

baru perlu dimulai jika dijumpai salah satu dari hal tersebut di bawah ini: 29

a. LFG <15 ml/menit, tergantung gejala klinis

b. Gejala uremia meliputi ; lethargy, anoreksia, mual dan muntah.

c. Adanya malnutrisi atau hilangnya massa otot.

d. Hipertensi yang sulit dikontrol dan adanya kelebihan cairan.

e. Komplikasi metabolik yang refrakter.

2.2.4. Komplikasi

Walaupun HD dapat memperpanjang usia tanpa batas yang jelas,

tindakan ini tidak akan mengubah perjalanan alami penyakit ginjal yang

mendasari dan juga tidak akan mengembalikan seluruh fungsi ginjal. Pasien
 20

yang menjalani HD akan mengalami sejumlah permasalahan dan komplikasi

serta adanya berbagai perubahan bentuk dan fungsi sistem dalam tubuh.

Komplikasi HD dapat dibedakan menjadi komplikasi akut dan komplikasi

kronik:

a. Komplikasi akut

Komplikasi akut adalah komplikasi yang terjadi selama HD

berlangsung. Komplikasi yang sering terjadi adalah : hipotensi, kram otot,

mual muntah, sakit kepala, sakit dada, sakit punggung, pruritus, demam, dan

menggigil.

b. Komplikasi kronik

Komplikasi kronik adalah komplikasi yang terjadi pada pasien dengan

HD kronik. Komplikasi kronik yang sering terjadi dapat dilihat pada tabel

dibawah ini.

Tabel 5. Komplikasi kronik HD

Penyakit kardiovaskular

Malnutrisi

Gangguan mineral tulang (Renal osteodystrophy)

Infeksi

Inflamasi kronik

Hipertensi / volume excess

Anemia
 21

Neuropathy

Disfungsi reproduksi

Komplikasi pada akses

Gangguan perdarahan

Aquired cystic kidney disease

2.2.5. Hemodialisis sebagai status inflamasi

Hemodialisis dianggap sebagai status inflamasi kronik oleh karena 30-

50% pasien HD terbukti mengalami inflamasi (Yao et al, 2004). Inflamasi

kronis pada PGK dapat terjadi dengan atau tanpa adanya infeksi akut atau

penyakit sistemik aktif. Saat HD berlangsung dapat terjadi bioinkompatibilitas

dan reaksi akibat dialisat yang terkontaminasi bakteri sehingga berakibat pada

terlepasnya sitokin (Boure, 2004; Erten, 2007). Selama proses HD, terjadi

peningkatan kadar penanda inflamasi yang bersirkulasi seperti β2-

mikroglobulin, komponen aktif komplemen, sitokin (IL-1, IL-6, IL-18, dan

TNF-α), fibrinogen, hyaluronan, myeloperoxidase, HsCRP, dan pentraxin-3

(PTX3) mengalami absorbsi ke dalam membran dialiser dan sebagian dari zat

tersebut akan dieliminasi dari darah (Tzanatos, 2000; Malaponte, 2002). Faktor

komplemen yang teraktivasi, seperti C3a dan C5a, meningkat selama HD dan

mencapai kadar maksimal 15-30 menit setelah inisiasi HD, menyebabkan

aktivasi leukosit, produksi dan pelepasan sitokin, serta produksi ROS (Reactive

Oxygen Species) yang berlebihan (Schindler, 2004).

 22

Peningkatan kadar penanda inflamasi yang bersirkulasi, berhubungan

dengan morbiditas dan mortalitas PKV pada pasien PGK (Stevinkel, 2008).

Telah dibuktikan bahwa peningkatan HsCRP serum terdapat pada 30-60%

pasien dialisis dan berkorelasi dengan prevalensi PKV yang tinggi pada

populasi tersebut. Hal tersebut tidak terbatas pada pasien dengan penyakit ginjal

tahap akhir yang telah menjalani dialisis, bahkan pasien dengan gangguan

fungsi ginjal yang ringan menunjukkan tanda-tanda mikro-inflamasi (Sarnak,

2003).Tampaknya bahwa peningkatan klirens sitokin proinflamasi yang

bersirkulasi, endotoksemia akibat volume overload dan stres oksidatif

berkontribusi pada fenomena tersebut (Alscher and Thomas, 2005).

Peran IL-6 sebagai faktor resiko kalsifikasi vaskular pada PGK

Stres oksidatif telah diketahui sebagai faktor yang terlibat didalam

menginisiasi kedua keadaan PGK dan PKV (Stevinkel, 2008). Progresivitas dari PGK

menjadi PKV melalui beberapa jalur, antara lain: inflamasi akibat pelepasan sitokin

proinflamasi dan disfungsi endotel akibat retensi dari toksin uremik dan

ketidakseimbangan antara produksi ROS dengan antioksidan endogen (Santoro dan

Mancini, 2002).

Interleukin-6 adalah suatu polipeptida dengan berat molekul 22-27 kDa

yang disekresikan oleh monosit terakativasi, makrofag, fibroblast, sel adiposit dan sel

endotel sebagai respon terhadap berbagai stimuli seperti TNF-α, IL-1β , endotoksin

bakteri, stress oksidatif (Baratawidjadja, 2006). Penyakit Ginjal Kronis merupakan

suatu status inflamasi, dimana stimulus inflamasi yang banyak terdapat pada pasien
 23

PGK menyebabkan dilepaskannya sitokin termasuk IL-1, IL-6 dan TNF- α (Guntur,

2004). Kadar IL-6 ditemukan meningkat pada 40-50% pasien PGK. Secara

epidemiologi IL-6 terbukti sebagai prediktor yang kuat untuk terjadinya

atherosklerosis pada PGK. Pada penelitian metaanalisis didapatkan bahwa IL-6

merupakan biomarker yang lebih kuat dibandingkan albumin, CRP dan Fetuin-A

sebagai prediktor mortalitas PKV (Filiopoulus, 2009). Faktor-faktor yang mungkin

menyebabkan peningkatan kadar IL-6 pada pasien PGK adalah hilangnya fungsi

ginjal, uremia beserta komplikasinya (seperti penimbunan cairan, stress oksidatif dan

kerentanan terhadap infeksi) serta faktor yang berkaitan dengan proses dialisis itu

sendiri (seperti membrane dialisis yang tidak biokompetible, penggunaan cairan

dialisat yang tidak steril) (Stenvinkel et al, 2005). Oleh Caglar et al dilaporkan

terjadinya peningkatan kadar IL-6 dua jam setelah proses HD selesai, di mana hal ini

membuktikan bahwa pada proses HD terjadi HD-induced delayed inflammatory

response (Stenvinkel et al, 2005). Temuan temuan yang memperkuat bukti bahwa IL-

6 merupakan sitokin pro-atherogenik: kadar IL-6 yang meningkat merupakan stimuli

utama ekpresi ICAM yang akan menarik lekosit bermigrasi ke permukaan endotel,

IL-6 juga berkontribusi terhadap proses atherosclerosis melalui berbagai mekanisme

metabolik, endothelial dan koagulasi, serta IL-6 juga berperan pada pembentukan

plak fibrous pada proses atherosclerosis, peningkatan IL-6 juga berperan secara

independent terhadap progresifitas atherosklerosis carotid pada periode 12 bulan

pertama terapi dialisis. (Stinghen dan Pecoits, 2007).

 24

2.2.6. Penyakit kardiovaskular sebagai penyebab utama kematian pada

pasien PGK dengan hemodialisis

Penyakit kardiovaskular merupakan penyebab utama morbiditas dan

mortalitas pasien PGK pada semua stadium (Skorecki, 2005). Meskipun

prevalensi PKV telah menurun sebagai penyebab kematian pada populasi

umum, namun pola ini tidak diikuti pada pasien HD. Sebagai gambaran,

mortalitas PKV pada populasi umum (~2.000 kematian) dibandingkan

mortalitas pada pasien HD (~50.000 kematian).

Mortalitas akibat PKV 20-30 kali lebih tinggi pada pasien dialisis

dibandingkan kelompok kontrol (Foley, 1998; Qunibi, 2007). Tingkat

mortalitas pasien HD yang masih muda (<30 tahun) lebih tinggi 500 kali

dibanding usia yang sama pada populasi umum (Ketteler et al, 2005) dan

tingkat mortalitas ini tetap lebih tinggi lima kali lipat, meskipun pada pasien

usia tua (Gambar…)(Sarnak, 2003). Angka kematian ini ternyata lebih tinggi

lagi pada pasien dialisis anak-anak yaitu 100 kali dibanding populasi umum

(Qunibi, 2007) dan 1000 kali lebih tinggi dibandingkan pada anak-anak

penderita PKV non dialisis. Resiko kematian akibat PKV meningkat 22%

setiap 10 tahun peningkatan usia (NKF KDOQI, 2002). Hasil tersebut

menunjukkan bahwa tingkat mortalitas PKV per tahun jauh lebih tinggi pada

pasien HD tanpa mempertimbangkan jenis kelamin, ras atau usia.

 25

Gambar 3. Mortalitas PKV pada populasi umum dibandingkan dengan

pasien dialisis. GP: general population (Sarnak, 2003)

Penyakit jantung merupakan penyebab kematian paling penting pada

40% pasien PGK dan 50% pasien HD (USRDS, 2010). Oikawa et al (2007)

mendapatkan bahwa 40% kasus kematian pasien HD di Jepang disebabkan oleh

penyakit ini. Menurut IRR (2011), penyebab terbanyak kematian pasien HD di

Indonesia adalah PKV yaitu 45% (gambar ).

Gambar 4. Penyebab kematian pasien hemodialisis (IRR, 2011).

 26

Kalsifikasi vaskular khususnya kalsifikasi arteri koroner merupakan petanda

prognostik terhadap kematian akibat PKV pada pasien HD. Sebuah penelitian

menunjukkan kalsifikasi arteri koroner pada pasien HD 2.5-5 kali lebih berat

derajatnya dibanding pasien non HD. Menurut London dkk, harapan hidup pasien

dengan kalsifikasi arteri media lebih lama dibandingkan pasien dengan kalsifikasi

arteri intima. Namun harapan hidup ini lebih pendek bila dibandingkan dengan pasien

tanpa kalsifikasi (Ossareh, 2011). Hal ini menjadi lebih memprihatinkan karena

kalsifikasi arteri koroner akibat gangguan metabolisme kalsium dan pospat ini,

dialami oleh lebih dari 90% pasien HD yang berusia 19-39 tahun (Ketteler et al,

2005).

Terdapat dua alasan potensial untuk peningkatan risiko mortalitas PKV yang

dramatis pada pasien HD. Pertama adalah tingginya prevalensi PKV, dan kedua

adalah tingginya tingkat kasus kematian pada pasien yang telah memiliki PKV.

Berbagai data menunjukkan bahwa pasien HD memiliki prevalensi penyakit jantung

iskemik dan gagal jantung kongestif yang lebih tinggi dibandingkan populasi umum,

yaitu sekitar 30% pasien. Prevalensi hipertrofi ventrikel kiri meningkat dengan

menurunnya LFG, sehingga 75% pasien dialisis mengalaminya. Perlu juga

diperhatikan bahwa pasien dengan penurunan LFG lebih cenderung mengalami

kematian akibat PKV daripada berkembang ke PGTA (Sarnak, 2003).

 27

Risiko PKV pada PGK

Berbagai macam faktor risiko tradisional dan perubahan metabolik yang

didapatkan pada kondisi uremia (faktor risiko non-tradisional), berkontribusi terhadap

terjadinya faktor risiko PKV pada populasi tersebut (Stevinkel, 2008).

1. Faktor resiko tradisional

Faktor resiko tradisional yaitu faktor resiko pada penelitian Framingham seperti

usia, hipertensi, dislipidemia, merokok dan diabetes melitus (DM). Prevalensi

morbiditas dan mortalitas akibat faktor ini lebih tinggi pada pasien PGK dibanding

individu dengan fungsi ginjal normal.

2. Faktor resiko non tradisional

Faktor resiko non tradisional merupakan faktor resiko yang muncul akibat

penurunan fungsi ginjal yang dikenal dengan faktor resiko sehubungan uremia seperti

anemia, hiperparatiroidisme sekunder, inflamasi, stres oksidatif dan kalsifikasi

vaskular serta proses dialisis (Stenvinkel et al, 2003; Cozzolino et al, 2008).

Peningkatan kadar sirkulasi petanda inflamasi seperti CRP dan IL dihubungkan

dengan morbiditas dan mortalitas PKV pada pasien PGK (Stenvinkel et al, 2008).

Tabel 6. Faktor resiko PKV pada pasien PGK

Biochemical Risk Markers

Traditional risk factors

Age —

Male gender —
 28

Biochemical Risk Markers

Hypertension —

Left ventricular hypertrophy —

Smoking —

Diabetes mellitus HbA1c, glucose

Dyslipidemia Cholesterol [28], Lp(a)

Novel risk and/or uremia-related

risk factors

Inflammation IL-6, IL-18, S-albumin, WBC, fibrinogen,

hyaluronan, MPO, CRP, PTX3

Oxidative stress MPO, plasmalogens, oxLDL, AOPP

Endothelial dysfunction PTX3, ADMA, tHcys, U-albumin, VCAM

Protein-energy wasting S-albumin, S-creatinine, prealbumin

Sympathetic activation Norepinephrine

Coagulation/fibrinolysis disorders Fibrinogen

Insulin resistance HOMA

Genetics/epigenetics SNPs, telomere attrition, DNA-methylation

Vascular calcification PO4, Ca, PTH, fetuin-A, OPG, OPN

Classical uremic toxins S-creatinine, P-cresol

New uremic toxins Proteomics

 29

Biochemical Risk Markers

Volume NT-pro-BNP, troponin-T

Subclinical hypothyroidism fT3, T3

Adipokines Leptin, visfatin, adiponectin

Anemia Hemoglobin

HbA1c, glycated hemoglobin; Lp(a), lipoprotein(a); IL, interleukin; WBC, white

blood cell count; MPO, myeloperoxidase; CRP, C-reactive protein; PTX3, pentraxin-

3; ADMA, asymmetric dimethylarginine; oxLDL, oxidized LDL; AOPP, advanced

oxidation protein products; tHcys, homocystine; U-alb, urinary albumin excretion;

VCAM, vascular cell adhesion molecule; HOMA, homeostasis model assessment

method; SNP, single nucleotide polymorphism; PTH, parathyroid hormone; OPG,

osteoprotegerin; OPN, osteopontin; NT-pro-BNP, N-terminal pro-brain natriuretic

peptide; T3, triiodothyronine.

Manifestasi PKV pada pasien PGK dengan HD

Terdapat beberapa kelainan patologik dan manifestasi klinik PKV pada PGK.

Salah satunya adalah kalsifikasi vaskular. Ada 2 tipe kalsifikasi vaskular pada

penderita PGK yaitu kalsifikasi aterosklerotik ditandai dengan kalsifikasi pada tunika

intima dan terbentuknya plak aterosklerotik serta kalsifikasi tunika media ditandai

dengan kalsifikasi linear yang lebih berhubungan dengan gangguan metabolisme

mineral. berupa  endapan mineral kalsium fosfat dalam bentuk hidroksiapatita.

 30

Aterosklerosis adalah proses proliferasi atau radang yang progresif dan

dinamis pada otot polos pembuluh darah, berupa kombinasi disfungsi endotel dan

respon inflamasi yang berlebihan. Proses ini melibatkan beberapa komponen

inflamasi, remodeling dan deposit lemak vaskuler, fibrosis serta thrombosis (Arici

dan Walls, 2001).

Proses pembentukan aterosklerosis disebut aterogenesis yaitu sebuah

proses peradangan yang terjadi pada dinding pembuluh darah, yang terjadi dalam

beberapa tahap. Pada fase awal, yang terjadi adalah disfungsi endotel dengan

degradasi ikatan dan struktur mosaik, sehingga memungkinkan senyawa di dalam

plasma darah seperti low density lipoprotein (LDL) menerobos dan mengendap pada

ruang subendotel akibat peningkatan permeabilitas. Endapan tersebut dengan

perlahan akan mengecilkan penampang pembuluh darah dalam rentang waktu dekade

(Deanfield, 2007).

KLASIK TERKAIT-UREMIA TERKAIT-DIALISIS

Hipertensi ↑ LDL teroksidasi Bioinkompatibilitas
Hiperlipidemia Radikal bebas Infeksi
Diabetes Hiperhomosisteinemia Endotoksin
Merokok Infeksi: herpes, klamidia
Asidosis
Toksin

PELEPASAN
DISFUNGSI SITOKIN
ENDOTEL PROINFLAMASI

PROTEIN REAKTAN FASE AKUT

↑(CPR, SAA, FIBRINOGEN)
↓
RESPON INFLAMASI SISTEMIK
↓
PERCEPATAN
ATEROSKLEROSIS
 31

Gambar 5. Faktor risiko aterosklerosis pada uremia (Santoro and Mancini, 2002).

Pada respon inflamasi yang berhubungan dengan uremia, khususnya respon

seluler yang dimediasi oleh sel seperti monosit dan makrofag, terbukti

keberadaan makrofag pada arterial intima diungkap memiliki peran yang sangat vital

bagi perkembangan aterosklerosis, dengan sekresi beragam sitokin yang

mempercepat patogenesis ini. Inflamasi yang berlangsung terus menerus ini

diperantarai oleh mediator inflamasi lewat jalur kemotaktik dan haptotatik. (Stinghen

and Pecoits-Filho,2007). 

Selama berlangsungnya PGK akumulasi ureum akan meningkatkan

toksiksitas ureum yang dapat dihubungkan dengan meningkatnya perburukan PKV.

Toksin ureum terdiri dari kelompok zat yang heterogen seperti zat organik dan

peptida yang pada kondisi normal diekskresikan lewat ginjal yang sehat dan ditahan

jika didapatkan gangguan fungsi ginjal. Secara teori toksin ureum pada PGK dapat

menyebabkan perubahan fenotip sel-sel endotel dimana lebih mudah mensintesa dan

mengekspresikan molekul adhesi seperti :Vasculer Adhesion Molecule -1 (VCAM-1),

Intercelluler Adhesion Molecule-1 (ICAM-1), serta kemokin seperti monocyte

chemoattractant protein - 1 (MCP - 1) dan interleukin-8 (IL-8) akibat peningkatan

kadar atau sintesa IL-1β dan TNF-α. IL-1β (Stinghen and Pecoits-Filho,2007).

ICAM-1 akan berikatan dengan Leucocyte Functioning Antigen (LFA) sehingga

monosit akan terikat pada permukaan endotel dan masuk ke dalam subendotel (per-

diapedesis). Migrasi monosit ke tunika intima akan berubah menjadi makrophag,

memakan lipid (vLDL dan LDL yang telah diopsonifikasi oleh ROS), dan menjadi
 32

sel busa (foam cells) yang disebut juga ateroma. Foam cell akan mengekspresikan

growth factor dan sitokin yang lain sehingga membentuk plak aterosklerosis

(Guntur,2001; Purwanto, 2008)

Patogenesis kalsifikasi vaskular

Patogenesis kalsifikasi vaskular pada pasien PGK dan dialisis sangat

kompleks dan belum sepenuhnya dimengerti. Namun para ahli memperkirakan

keadaan ini dipengaruhi secara garis besar oleh tiga faktor (Ossareh, 2011):

1. Kerentanan genetik

Hanya sedikit data yang menunjukkan predisposisi genetik pada kalsifikasi

vaskular di populasi gagal ginjal dibandingkan pada populasi non gagal ginjal.

Beberapa gen yang terlibat pada kalsifikasi vaskular dapat dilihat pada

tabel....dibawah.

2. Faktor-faktor yang berhubungan dengan metabolisme mineral

Kalsifikasi vaskular pada pasien PGK terbukti kuat berhubungan dengan

gangguan metabolisme mineral seperti hiperfosfatemia, hiperkalsemia,

hiperparatiroidisme dan peningkatan produk CaxPO4 (Block et al, 2004). Ada dua

mekanisme yang dinyatakan dapat menerangkan kondisi ini:

1. Pasif; presipitasi produk Ca.PO4 langsung pada pembuluh darah

2. Induksi aktif akibat ekspresi bone-associated genes pada vascular smooth

muscle cells (VSMCs)

Yang dkk membuktikan induksi mineralisasi pada sel otot polos manusia secara

invitro terjadi akibat peningkatan kadar kalsium dan pospat jangka lama. Kadar
 33

kalsium dan pospat yang tinggi meningkatkan kerja sodium-dependent phosphate

cotransporter tipe III, Pit-1.

3. Faktor-faktor yang tidak berhubungan dengan metabolisme mineral

Dahulu kalsifikasi vaskular dinyatakan sebagai fenomena degeneratif pasif

tetapi penelitian terbaru telah membuktikan bahwa proses ini sama aktifnya seperti

pembentukan tulang yang dipengaruhi oleh interaksi antara faktor stimulator seperti

bone matrix 2a (BMP2a), tumor necrosis factor (TNF)-α, fibroblast growth factor

(FGF)-23, osteocalcin (OC), osteonectin (ON), core binding factor (Cbfa)-1, alkaline

phosphatase (ALP) dan receptor activator of nuclear factor-kappa B (RANK) ligand

dengan faktor inhibitor seperti matrix Gla protein (MGP), BMP7, osteoprotegerin

(OPG), fetuin-A dan osteopontin (OPN) yang ada pada VSMCs.

Progresifitasnya dikendalikan oleh proses aktif yang diperantarai oleh sel,

yaitu cell-regulated ossification, sehingga mengakibatkan perubahan fenotipe

vascular smooth muscle cells (VSMCs), yang berada di lapisan medial dinding

pembuluh darah menjadi sel pembentuk tulang.17 Pada kondisi normal, mesenchymal

stem cells berdiferensiasi menjadi adipocytes, osteoblasts dan chondrocytes. Tetapi

pada PGK, diabetes, usia lanjut dan inflamasi, VSMCs ini dapat berde-diferensiasi

atau berubah menjadi osteo/chondrocytic-like VSMCs melalui peningkatan kerja

anggota superfamili transforming growth factor (TGF)-β1 seperti core binding factor

alpha1/ runt-related transcription factor 2 (Cbfa1/Runx2). Faktor transkripsi ini

penting untuk perkembangan tulang normal sehingga peningkatan kerjanya

mengindikasikan perobahan fenotipe. Osteo/chondrocytic-like VSMCs ini mengalami

kalsifikasi sama seperti pembentukan tulang.

 34

Pada awalnya, jika terdapat kelebihan mineral kalsium fosfat terjadi deposit

dari soluble amorphous calcium-phosphate complex. Deposit ini tidak akan

membahayakan jika ada protein inhibitor fetuin A, MGP, OPN, dan OPG.1,17 Menurut

studi terbaru, bahwa awal terjadinya kalsifikasi dan diferensiasi sel pembuluh darah

dimulai dari adanya formasi nanocrystals.1 Nanocrystals ini diambil oleh VSMCs

dengan cara endositosis. Degradasi lisosom dari kristal yang sudah terendositosis

menyebabkan pelepasan kalsium dan phosphor dari dalam sel. Selain itu, fosfat

inorganik akan berakumulasi di dalam sel melalui sodium-dependent phosphate

transporter Pit-1 (dan Pit-2). Dalam usaha untuk kompensasi kelebihan kalsium dan

phosphor, maka Osteo/chondrocytic-like VSMCs akan membentuk matrix vesicles

yang berisi produk kalsium dan phosphor serta inhibitor mineral, seperti fetuin A.

Jika sistem pembersihan normal (sistem retikuloendotelial) kewalahan, kompleks

mineral ini menumpuk pada arteri menyebabkan trauma sel lokal dan abnormalitas

pembuluh darah. Vesikel matrik inilah merupakan awal kalsifikasi di semua jaringan

tulang dimana kristal hidroksiapatit berasal dari mereka selama fase 1 mineralisasi

phosphatase-dependent.

Fase 2 mineralisasi dimulai dengan pemecahan membran vesikel matrik yang

menyebabkan hidroksiapatit terpapar ke cairan ekstraselular. Pemecahan kalsium

didalam sel yang diinduksi oleh nanocrystal terendositosis dan uptake fosfat ke

dalam sel akan memicu apoptosis dari VSMC, yang pada dinding pembulah darah

normal hanya sedikit terjadi. Tetapi adanya sel inflamasi seperti TNF-α yang

merupakan sitokin proapoptosis akan mengganggu keseimbangan antara proliferasi

dan kematian sel, sehingga terjadi peningkatan pembentukan matrix vesicles yang
 35

berisi apoptotic bodies. Apoptotic bodies dan matrix vesicles akan menyebabkan

mekanisme umpan balik positif, sehingga terjadi pelepasan nanocrystal ke sekitarnya,

sehingga meningkatkan proses kalsifikasi. Selanjutnya, jika terjadi

ketidakseimbangan antara inhibitors dan promotors, maka amorphous calcium

phosphate dan/atau nanocrystals bisa berubah menjadi bentuk stable hydroxyapatite

crystal. (gambar 3)

Gambar 6.Mekanisme kalsifikasi vaskular pada pasien PGK.

Gangguan metabolisme mineral dan tulang sering tejadi pada pasien PGK.

Fungsi ginjal yang menurun, disertai dengan peningkatan kadar FGF23, menurunnya

ekskresi fosfat inorganik, dan disregulasi metabolisme tulang. Kelainan ini saling

berhubungan. Indikator dari gangguan ini ditandai dengan perubahan berbagai

biomarker seperti OPG, Klotho, FGF23, PTH dan calcitriol. Hasil dari gangguan

metabolisme mineral, adalah perubahan kadar Ca, Pi, Mg di dalam serum dan
 36

jaringan pembuluh darah, disertai dengan perubahan metabolik dan inflamasi. Hal ini

menyebabkan berkurangnya inhibitor mineral lokal dalam sirkulasi seperti fetuin A,

PPi, dan MGP, sehingga mendukung terjadinya kalsifikasi pembuluh darah. Ca,

kalsium; FGF23, fibroblast growth factor 23; Mg, magnesium; MGP, matrix Gla

protein; OPG, osteoprotegerin; Pi, inorganic phosphate; PPi, inorganic

pyrophosphate; PTH, hormon paratiroid.

Tabel 7. Kesimpulan patogenesis kalsifikasi vaskular (Ossareh, 2011)

Mekanisme Deskripsi

Kerentanan genetik

Tikus percobaan Dyscalc gene

Apolipoprotein E null

Low-density lipoprotein-receptor null

Matrix Gla protein null

Klotho null

Carbonic anhydrase inhibitor null

Manusia Fetuin-A null

SNP kromosom 9p21.3

Variasi jalur gen human lipoxygenase

Variasi AA gen paratiroid

SNP bone morphogenic protein

SNP gen glucose transporter-1 XbaI

 37

Faktor-faktor yang berhubungan Peningkatan kadar kalsium

dengan metabolisme mineral Peningkatan kadar pospat

Penurunan kadar hormon paratiroid

Dosis tinggi suplemen vit D aktif

Faktor-faktor yang tidak

berhubungan dengan metabolisme

mineral

Aktivator Bone morphogenetic protein 2

Receptor activator of nuclear factor-

kappa B ligand

Inhibitor Bone morphogenetic protein 7

Osteopontin

Osteoprotegerin

Fetuin-A

Smad6

Pyrophosphate

Faktor yang mempengaruhi kalsifikasi vaskular

1. Usia

Proses aterosklerosis dimulai semenjak masa kanak-kanak, dan berlanjut

membentuk atheroma dengan berbagai lesi sehingga terbentuk kalsifikasi.4 Oleh

karenanya, usia diduga sebagai faktor penentu yang penting terhadap adanya

kalsifikasi di aorta abdominalis. Terdapat lima studi yang membuktikan adanya

 38

hubungan yang positif antara kalsifikasi vaskular dengan usia. Studi terbesar

dilakukan oleh Reaven dan Sack pada 245 partisipan, dengan mengunakan

pemeriksaan electron beam computed tomography (EBCT). Studi ini menemukan

bahwa pasien yang berusia diatas 61 tahun mempunyai kalsifikasi aorta yang berat.4

Studi yang dilakukan oleh Allison dkk menyatakan bahwa pada usia dibawah

50 tahun, prevalensi kalsifikasi aorta abdominalis hanya 16% (perempuan) dan 20%

(laki-laki). Hal ini menjadi meningkat sampai 93% (perempuan) dan 98% (laki-laki)

ketika usia diatas 70 tahun.4

2. Diabetes mellitus

Diabetes mellitus berhubungan dengan kalsifikasi arteri, intima maupun

media. Terdapat enam studi yang meneliti hubungan kalsifikasi aorta abdominalis

dengan diabetes mellitus, dimana lima studi mendukung hubungan tersebut4

Sedangkan studi yang dilakukan Matsushita dkk, tidak menemukan hubungan antara

diabetes mellitus dengan kalsifikasi pembuluh darah. Namun, studi retrospektif ini

merupakan studi kecil jika dibandingkan studi lain. 4

3. Lama hemodialisis

Terdapat empat studi yang meneliti faktor resiko terhadap kalsifikasi aorta

abdominalis pada pasien PGK. Studi ini menunjukkan bahwa kalsifikasi aorta

abdominalis lebih sering terjadi pada pasien yang telah menjalani dialisis lebih lama,

baik pada pasien yang menjalani peritoneal dialisis maupun HD.

Kawaguchi dkk menemukan bahwa rata-rata lama dialisis pada pasien dengan

kalsifikasi aorta abdominal grade 1 adalah 41 bulan, sementara pasien dengan

kalsifikasi grade 3, telah menjalani dialisis selama 68 bulan (p<0,001).4

 39

4. Kadar kalsium dan phosphor serum

Diduga bahwa parameter metabolik seperti hiperfosfatemia dan peningkatan

produk kalsium fosfor memegang peran penting pada tingginya angka kejadian

kalsifikasi pembuluh darah pada pasien PGK.4

Banyak studi yang menunjukkan bahwa terdapat hubungan antara

peningkatan kadar kalsium serum >10,5 mg/dl dengan kalsifikasi pada pasien PGK.

Mortalitaspun berkorelasi dengan peningkatan kadar phosphor serum >5,5 mg/dl. 20

Diagnosa kalsifikasi vaskular

Agar dapat mendeteksi adanya kalsifikasi melalui modalitas pencitraan,

penting untuk memahami histopatologi dari kalsifikasi vaskular. Klasifikasi

kalsifikasi vaskular menurut lapisan arteri dibagi menjadi dua yaitu, intima dan

media.4 Kedua tipe ini dapat diamati melalui aorta abdominal, meskipun kalsifikasi

media lebih sering terjadi pada aorta abdominalis.4 Kalsifikasi media sering dijumpai

pada pasien gagal ginjal dan diabetes mellitus, sehingga diduga kalsifikasi ini timbul

akibat adanya gangguan metabolik, elektrolit dan kesimbangan pH.4

Terdapat beberapa metode pencitraan dalam mendeteksi kalsifikasi vaskular,

mulai dari pemeriksaan radiografi yang simpel, ultrasound dua dimensi, sampai

multi-slice computed tomography (MSCT). MSCT, adalah generasi terbaru dari

electron beam CT, sering digunakan untuk diagnosis dan follow-up dari progresi

kalsifikasi vaskular. Namun, MSCT tidak dapat membedakan antara kalsifikasi

intima dan media. Ultrasonografi digunakan secara luas, tidak mahal, sehingga dapat

memberikan pilihan alternatif untuk mendeteksi kalsifikasi pembuluh darah

superficial, seperti arteri karotis dan arteri femoralis.17 Tetapi tidak ada satupun
 40

modalitas pencitraan yang dijadikan sebagai gold standard dalam menilai kalsifikasi

vaskular.4

Peranan foto lateral x-ray

Pada beberapa tahun terakhir, pemeriksaan radiografi semakin banyak

digunakan untuk mendeteksi kalsifikasi vaskular. Perbedaan antara kalsifikasi intima

dan media dapat ditentukan dengan pemeriksaan radiografi, dimana jika terdapat

gambaran dengan distribusi irregular dan patchy, disebut kalsifikasi intima, sementara

jika ditemukan gambaran seperti rail-road track maka disebut sebagai kalsifikasi

media (gambar 4). Semenjak diketahui bahwa kalsifikasi media sering ditemukan

pada pasien PGK, maka digunakan pemeriksaan radiografi untuk menentukan

adanya kalsifikasi.17

Foto lateral abdominal atau lateral lumbal adalah metode yang paling

sederhana dalam menilai kalsifikasi aorta abdominalis. Pencitraan ini lebih disukai

dalam hal mendeteksi kalsifikasi vaskular karena biayanya rendah, waktu

pemeriksaaan cepat, digunakan secara luas serta radiasi yang lebih rendah

dibandingkan dengan CT.13

 41

Gambar 7. Kalsifikasi intima dan media pada PGK. (A) distribusi irregular dan

patchy (kalsifikasi intima); (B dan C) rail-road track (kalsifikasi media); (D)

Terdapat gambaran keduanya (kalsifikasi intima dan media).

Metode penilaiannya simpel, yaitu dengan menggunakan sistim skoring.

Kauppila dkk, menilai kalsifikasi aorta abdominalis pada pasien HD dengan

menggunakan abdominal aorta calcification scores (AAC scores). Penilaiannya

menggunakan segmen aorta abdominalis yang berada di depan vertebra lumbal satu

sampai keempat. Derajat 0 artinya tidak ada deposit kalsifikasi di depan vertebra;

derajat 1 artinya terdapat deposit kalsifikasi kurang dari 1/3 dari dinding aorta; derajat

2 artinya terdapat kalsifikasi 1/3-2/3 dari dinding aorta; dan derajat 3 artinya

kalsifikasi terjadi lebih dari 2/3 dinding aorta.

Berdasarkan sistem skoring ini, maka nilai skor minimal adalah 0 sampai

maksimal yaitu 24. Pasien dikatakan tidak ada kalsifikasi jika skornya 0, kalsifikasi

ringan jika skor 1-4, kalsifikasi berat jika skor diatas 4 (gambar 5) 5 Studi yang
 42

dilakukan oleh Shantha dkk menyatakan bahwa AAC scores mempunyai sensitifitas

83% dan spesifisitas 75% dalam mendeteksi adanya kalsifikasi vaskular dan

kalsifikasi katup jika dibandingkan dengan menggunakan ultrasonografi dan

echocardiogram pada pasien dialisis.18 Tehnik ini juga menunjukkan korelasi yang

tinggi dengan skor yang digunakan pada EBCT.17

Pada studi yang dilakukan oleh Kawaguchi dkk, derajat 1 sama artinya dengan

tidak ada kalsifikasi; derajat 2 berarti kalsifikasi patchy (hanya sebagian); sedangkan

derajat 3 menandakan adanya kalsifikasi di sepanjang aorta abdominalis, sehingga

membentuk seperti gambaran pipa4. Namun dikatakan bahwa pemeriksaan dengan

menggunakan foto polos radiografi sangat subjektif dan kurang sensitif jika

dibandingkan dengan MSCT.17

Walaupun terdapat kontroversi dalam hal ini, The Kidney Disease Improving

Global Outcome (KDIGO) tetap merekomendasikan radiografi abdominal lateral

untuk mendeteksi ada atau tidaknya kalsifikasi vaskular sebagai suatu alternatif

pemeriksaan (2C (kualitas bukti klinis rendah dan lemah)).17

 43

Gambar 8. Skoring kalsifikasi aorta abdominalis (AAC scores). Derajat

kalsifikasi dinilai di dinding anterior dan posterior aorta abdominalis yang letaknya

berdampingan dengan vertebrae L1-L4, kemudian ditentukan skornya.

2.2.7. Harapan hidup pasien hemodialisis

Defenisi Menurut World Health Organization (2004) definisi harapan

hidup adalah lama usia rata-rata seseorang dapat bertahan hidup dalam

keadaan sehat total dengan mempertimbangkan usia hidupnya yang lebih

rendah apabila disertai suatu penyakit ataupun cedera. Harapan hidup

biasanya digunakan sebagai indikator untuk menilai kesehatan dan

menggambarkan adanya beban karena suatu penyakit dalam suatu populasi

(Turin et al, 2012).

Harapan hidup pasien HD sangat bervariasi tergantung pada kondisi

medis dan keteraturan pasien menjalani HD tersebut. Harapan hidup rata-rata

 44

pasien HD adalah sekitar 5-10 tahun, namun banyak pasien yang dapat

bertahan hidup secara baik menjalani HD selama 20 tahun atau bahkan 30

tahun (National Kidney Foundation, 2015). Hasil penelitian yang dilakukan

oleh Rakowski et al (2006) mengatakan bahwa harapan hidup pasien HD

yaitu 2 tahun, ini merupakan periode follow-up tersingkat secara teori. Hal ini

juga didukung oleh hasil penelitian yang dilakukan oleh Muzasti (2011) yang

mendapatkan harapan hidup rata-rata pasien HD di Medan, Sumatera Utara

selama 25,83 bulan dengan harapan hidup terendah selama 2 bulan sedangkan

yang terpanjang yaitu selama 67 bulan.

Faktor-faktor yang mempengaruhi

1. Faktor yang berhubungan dengan prosedur HD

a. Lama HD

Chertow et.al (2000) mendapatkan bahwa setiap tahunnya dialisis

meningkatkan resiko kematian ± 6%.

2. Faktor yang tidak berhubungan dengan prosedur HD

a. Usia memulai HD

Harapan hidup pasien HD menurun sesuai pertambahan usia, dimana

prognosa paling baik yaitu usia <45 tahun dan prognosa paling buruk adalah

usia lanjut dengan harapan hidup 5 dan 10 tahun hanya 15% dan 5% (USRDS,

2010).
 45

Tabel 8. Harapan hidup pasien Dialisis (Kidney Support, 2015)

Pasien dengan resiko rendah 90-95% bertahan hidup setelah 2 tahun

( <70 tahun, tanpa penyakit lain) menjalani terapi

Pasien dengan resiko sedang 2 dari 3 dapat bertahan hidup setelah 2

(70-80 tahun atau <70 tahun, dengan tahun menjalani terapi

satu penyakit serius lain)

Pasien dengan resiko tinggi 1 dari 3 dapat bertahan hidup setelah 2

( >80 tahun atau usia lain, dengan dua tahun menjalani terapi

penyakit serius lain)

b. Penyakit ginjal yang mendasarinya

Berdasarkan penyakit ginjal yang mendasarinya, penyakit polikistik dan

glomerulonefritis kronik memiliki harapan hidup 5 tahun yang paling baik,

sedangkan yang terburuk adalah diabetes nefropati (DN) yaitu hanya 20%. Pada

tahun 2010, USRDS mendapatkan bahwa penyebab utama pasien menjalani

HD adalah DN (44%) dengan harapan hidup 10 tahun dibandingkan pasien

nondiabetik hanya 4% berbanding 14%.

 46

Gambar 9. Harapan hidup 5 tahun berdasarkan penyakit ginjal

yang mendasari di berbagai negara.

c. Kadar albumin

Serum albumin merupakan indikator yang kuat dan poten dalam

penentuan status nutrisi, resiko mortalitas dan sebagai penanda untuk

penyimpanan protein visceral (Pifer et al, 2002). Nilai albumin yang rendah

pada pasien HD selain dipengaruhi kurangnya asupan protein harian, juga

disebabkan oleh adanya inflamasi (Nugrahani, 2007). Sehingga dengan

dilakukannya terapi HD dapat pula menyebabkan keadaan hipoalbuminemia

yang dapat memperburuk harapan hidup (Rivai, 2009).

Adanya keadaan hipoalbuminemia pada saat memulai HD merupakan

prediktor yang kuat terjadinya peningkatan kematian sejalan dengan lamanya

HD (Chung et al, 2000). Konsentrasi albumin plasma di bawah 4 g/dL

dihubungkan dengan peningkatan probabilitas kematian dimana besar

probabilitasnya semakin besar jika konsentrasinya di bawah 3 g/dL.

 47

d. Indeks Massa Tubuh (IMT)

Penelitian membuktikan bahwa pasien yang bertubuh kecil [diukur

dengan (IMT)] memiliki resiko lebih besar mengalami kematian (Dwyer et al,

2005), dibandingkan dengan pasien yang memiliki IMT dan massa otot tinggi

(Ramkumar et al, 2005; Kakiya et al, 2006). Berbeda dengan populasi umum,

pasien HD dengan IMT berlebih memiliki harapan hidup yang lebih lama

(Leavey et al, 2001; Salahudeen et al, 2003; Beddhu et al, 2003; Johansen et al,

2004; Stack et al, 200; de Mutsert et al, 2007). de Mutsert R et al (2007) pada

penelitiannya yang melibatkan lebih dari 1300 pasien HD menyimpulkan

bahwa peningkatan IMT setiap unit menurunkan resiko relatif kematian

sebanyak 30%.

e. Kadar kalsium dan phospat

Beberapa penelitian melaporkan bahwa peningkatan kadar kalsium

berhubungan dengan peningkatan mortalitas yang disebabkan karena

peningkatan resiko PKV (Kovesdy, 2010; Slinin, 2005 dalam Yusop et al,

2013). Penelitian Qunibi et al (2004) menyatakan bahwa peningkatan kadar

fosfat >6,5 mg/dL berhubungan kuat dengan peningkatan resiko kematian

akibat PKV pada pasien HD. Pasien dengan kadar fosfat >6,5 mg/dL,

mempunyai faktor resiko kematian 27% lebih tinggi dibandingkan dengan

pasien dengan kadar fosfat antara 2,4-6,5 mg/dL.

Resiko relatif kematian paling rendah terlihat pada pasien dengan konsentrasi

kalsium serum kurang dari 8 mg/dL (2 mmol/L) dan konsentrasi phospat

serum antara 3-5 mg/dL (0.97-1.61 mmol/L) (Block et al, 2004). Mereka juga
 48

mendapatkan resiko relatif kematian meningkat menjadi 1.5 dan 1.8 kali jika

produk CaxP diatas 70 mg2/dL2 (Young et al, 2005; Slinin et al, 2005;

Noordzij et al, 2005; Noordzij et al, 2006). Hal ini terbukti pada penelitian

Dialysis Outcomes and Practice Patterns yang melibatkan 25.588 pasien

dimana mortalitas tertinggi terlihat jika kadar kalsium diatas 10.0 mg/dL dan

kadar phospat diatas 7.0 mg/dL (Tentori et al, 2008).

6. Kadar Fetuin-A

Penelitian klinis menunjukkan bahwa kadar Fetuin-A yang rendah

merupakan prediktor prognosis yang buruk pada pasien PGK. Kadar Fetuin-A

secara independen berhubungan dengan kalsifikasi vaskular yaitu semakin

rendah kadar Fetuin-A semakin luas kalsifikasi vaskularnya (Moe et al, 2005;

Cozzolino et al, 2006; Wang et al, 2009) dan semakin meningkat kekakuan

aorta (Hermans et al, 2006; Kuzniar, 2008) yang merupakan prediktor

mortalitas akibat PKV pada pasien dialisis (Ketteler, 2003; Hermans, 2007).

Bahkan Hermans et al (2007) mendapatkan bahwa kadar Fetuin-A juga

berhubungan dengan peningkatan mortalitas akibat penyakit non

kardiovaskular. Penelitian lain di Belanda juga mendapatkan hasil yang sama

bahwa makin tinggi kadar Fetuin-A maka makin rendah resiko kematian

(Verduijn et al, 2010).

Menurut Honda dkk nilai cut off Fetuin-A untuk memprediksi kematian

pasien HD adalah 0.19 g/L dengan sensitivitas/spesifisitas sekitar

64.3%/68.7%. Semakin rendah kadar Fetuin-A semakin cepat kematian terjadi

 49

dan peningkatan kadarnya 0.1 g/L mengurangi semua penyebab kematian

sebanyak 13% (Bláha et al, 2009).

7. Genetik

Peranan genetik pada penyakit ginjal meliputi rentang yang luas mulai

dari gangguan ginjal monogenik simpel seperti sindroma Alport dan penyakit

polikistik ginjal dominan autosomal sampai penyakit ginjal multigenik komplek

seperti nefropati diabetik dan nefropati IgA. Bukti adanya hubungan gen

dengan penyakit ginjal telah terbukti dan dapat direplikasi di beberapa lokus

pada kromosom 3q, 10q, dan 18q (Satko et al, 2005).

Faktor genetik ini juga berpengaruh pada outcome klinis pasien PGK

tahap akhir. Sejumlah variasi genetik yang dikenal dengan single nucleotide

polymorphism (SNPs) diketahui memiliki pengaruh pada fenotipe dan outcome

PGK (Nordfors et al, 2005; Axelsson et al, 2006; Luttropp et al, 2008).

Contohnya adalah masih ada 30% pasien PGK dan 15% pasien dialisis yang

tidak mengalami kalsifikasi vaskular meskipun prevalensinya sangat tinggi

(Qunibi, 2007). Hal ini diduga karena adanya peranan faktor genetik yaitu gen

AHSG yang menyandi Fetuin-A.

Perubahan genetik  memiliki pengaruh terhadap jumlah protein sirkulasi. 

Stenvinkel et.al (2005) memperlihatkan bahwa SNP Thr256Ser (alel G) pada

gen AHSG yang menyandi Fetuin-A, menyebabkan fungsi Fetuin-A sebagai

penghambat kalsifikasi vaskular dan inflamasi terganggu oleh karena kadarnya

yang rendah sehingga meningkatkan resiko kalsifikasi vaskular, inflamasi, dan

mortalitas akibat PKV ataupun penyakit lainnya pada pasien HD di Swedia.

 50

Penelitian lain oleh Verduijn et al (2010) di Belanda juga memperlihatkan

pengaruh polimorfisme Thr256Ser (alel G) gen AHSG pada mortalitas pasien

HD {HR 0.99 (95%CI 0.81-1.21)}.

2.3. α-2 heremans schmid glycoprotein (AHSG)

2.3.1. Defenisi

α2-Heremans Schmid Glycoprotein (AHSG) yang dikenal dengan

Fetuin-A adalah protein yang dikodekan oleh gen AHSG. Pertama kali diisolasi

dari sapi pada tahun 1944. Fetuin-A merupakan glikoprotein kaya histidin

(HRG) dan kininogen (KNG) yang termasuk pada superfamili cystatin,

kelompok dari cysteine protease inhibitor. Famili fetuin merupakan seperangkat

protein plasma ortolog yang ditemukan pada manusia, domba, babi, sapi dan

hewan pengerat. AHSG manusia ditemukan oleh Heremans dan Schmid yang

kemudian diubah namanya menjadi Fetuin-A setelah Fetuin-B ditemukan.

Selama perkembangan janin, Fetuin-A diproduksi banyak jaringan seperti

osteoblast, lidah dan plasenta sehingga kadarnya lebih banyak pada janin

dibanding dewasa. Meskipun setelah dewasa Fetuin-A disintesis terutama oleh

hepatosit lalu disekresi ke pembuluh darah, tetapi keberadaan molekul AHSG di

sirkulasi tidak selalu berasal dari hati. Penelitian sebelumnya melaporkan bahwa

kadar AHSG sirkulasi berhubungan dengan turnover tulang yang tinggi,

sehingga diperkirakan beberapa molekul AHSG yang berada di sirkulasi berasal

dari matriks tulang yang terserap (Kazama, 2007).

Hasil translasi utama Fetuin-A manusia adalah asam amino sepanjang

367, yang terdiri dari dua rantai yaitu rantai berat dan rantai ringan yang
 51

digabung oleh jembatan disulfida rantai tunggal (Mehrotra, 2007). N-terminal

rantai berat terdiri dari 2 domain seperti cystatin (D1 dan D2) yang tersusun

secara tandem dan domain terminal-C (D3) yang unik dimana kaya dengan

prolin dan glisin, yang tidak dapat dijumpai pada cystatin mamalia lain (Döring

et al, 2010). Kedua rantai ini dihasilkan melalui pemecahan  posttranslational

dari polipeptida tunggal (proprotein) yang dikodekan mRNA oleh enzim

proteolitik   (Suliman et al, 2008).

Gambar 10. Struktur skematik Fetuin-A.

Model molekuler cystatin memperlihatkan negative charge pada merah dan

positive charge pada biru.

Fetuin-A merupakan rantai α2 terbesar pada elektroforesis serum. Ditemukan

pada cairan ekstraseluler dengan konsentrasi serum berkisar antara 0.4 to 1.0 g/liter

dan berat molekul kira-kira 60-kDa (Ketteler et al, 2003; Kuzniar et al, 2008).
 52

Meskipun AHSG adalah glikoprotein sirkulasi yang terlokalisasi terutama

pada jaringan kalsifikasi seperti tulang, gigi dan lesi kalsifikasi ektopik sebagai

protein nonkolagen selama proses mineralisasi oleh karena afinitasnya yang tinggi

terhadap hidroksiapatit, tetapi sintesis fetuin di jaringan kalsifikasi belum dapat

ditunjukkan, sehingga disangkakan fetuin dibawa kesana melalui darah (Suliman et

al, 2008; Zeidan et al, 2012).

Gambar 11. Kartun dari Fetuin-A manusia

2.3.2. Fungsi AHSG

Meskipun peranan Fetuin-A secara in vivo masih dalam penelitian,

beberapa laporan telah membuktikan bahwa Fetuin-A dalam tabung reaksi

dapat mengikat beberapa ligan sehingga dikatakan protein multifungsi, seperti

bekerja sebagai penghambat sistemik kalsifikasi ektopik dengan menghambat

pembentukan produk kalsium pospat (kristal hidroksiapatit)   (Schaver et al,

 53

2003; Heiss et al, 2003; Cozzolino et al, 2005), regulator osteogenesis, aktivasi

faktor pertumbuhan hepatosit dan respon terhadap peradangan sistemik

serta regulator fagositosis dan kekebalan bawaan (Döring et al, 2010). Fetuin-A

berperan penting dalam perkembangan beberapa organ seperti sumsum tulang,

otak, gonad dan liver. Bekerja sebagai inhibitor matrix metalloproteinase

(MMP) dan inhibitor protease (Zeidan et al, 2012).

Peranan AHSG pada proses kalsifikasi vaskular

Westenfeld et al (2007) membuktikan bahwa diet tinggi pospat dan defisiensi

Fetuin-A pada PGK secara sinergis berperan terhadap patogenesis kalsifikasi vaskular

pada tikus percobaan. Hal ini dibuktikan juga oleh Schaver et.al (2003) bahwa

defisiensi Fetuin-A pada tikus dapat menyebabkan kalsifikasi pada berbagai organ,

dimana derajat keparahan dan lokasi kalsifikasi tergantung pada genetiknya. Peran

Fetuin-A sebagai inhibitor utama kalsifikasi vaskular yaitu dengan cara mengikat

BMP2a dan transforming growth factor β (TGF-β) (Suliman et al, 2008), dapat

menghambat kira-kira 50% (Ketteler, 2005) pembentukan hidroksiapatit sehingga

dapat menghambat pengendapan ion CaxPO4 ektopik (Heiss et al, 2003).

Diperkirakan bahwa Fetuin-A  memiliki dua fungsi pada permukaan koloid mineral,

yaitu mengurangi difusi ion pada inti mineral dan mencegah agregasi partikel (Zeidan

et al, 2012). Peran fetuin-A diperantarai oleh calciprotein, yaitu bentuk sementara

dari koloid stabil sebagai hasil interaksi  fetuin-A dengan inti mineral di    dalam

aliran darah. Meskipun mekanismenya belum jelas, diyakini bahwa

partikel calciprotein ini berfungsi seperti “vacuum cleaner” yaitu membersihkan

plasma dengan mengikat kelebihan molekul kalsium dan pospat (Moe et al, 2008).
 54

Partikel calciprotein ini juga bekerja sebagai “homing pigeon” yaitu mengangkut

endapan mineral yang tidak larut tersebut dari lokasi diluar tulang ke dalam jaringan

tulang (Moe et al, 2005) dan jika memungkinkan memfagositosis endapan tersebut

(Schoppet et al, 2008). Dengan kata lain fetuin-A menghambat presipitasi basic

calcium phosphate (BCP) yaitu bentuk inti mineral baru yang tidak larut pada

sirkulasi  dan jaringan  yang tidak diinginkan  tanpa menghambat mineralisasi tulang

(Heiss et al, 2003).

Pada level selular Fetuin-A menghambat apoptosis VSMC dan dilepaskan oleh

VSMC ke dalam matrik vesikel untuk mencegah pembentukan inti BCP. Fetuin-A

juga membantu mengikatkan apoptotic bodies ke sel-sel tetangga agar dibersihkan

sehingga mengurangi kemampuan mereka untuk nukleasi BCP (Ford et al, 2010).

Peranan AHSG pada inflamasi

Meskipun kalsifikasi vaskular terutama disebabkan peningkatan produk CaPO4

serum dan diet tinggi kalsium, bukti terbaru menunjukkan bahwa kalsifikasi di luar

tulang pada pasien dialisis bukan hanya suatu proses degeneratif pasif

tetapi juga melibatkan inflamasi aktif (Stenvinkel et al, 2005). Sehingga dapat

diambil kesimpulan bahwa inflamasi yang ditandai dengan rendahnya kadar Fetuin-

A sebagai faktor inhibitor dapat memperburuk proses kalsifikasi vaskular pada

pasien PGK (Suliman et al, 2008; Metry et al, 2008).

Merx et al (2005) menyatakan bahwa Fetuin-A memiliki aktivitas antifibrotik.

Meskipun tidak menarik kesimpulan kausalitas, tetapi laporan ini mampu

menunjukkan hubungan penurunan kadar Fetuin-A dengan kondisi inflamasi. 

 55

Tintut dkk memperlihatkan diferensiasi osteogenik VSMC mengikuti

rangsangan TNF-α dan ko-inkubasi dengan makrofag-monosit yang teraktivasi

(Ketteler et al, 2005).

Fetuin-A dinyatakan juga berperan sebagai protein fase akut negatif, oleh

karena kadarnya di sirkulasi mengalami penurunan saat terjadi peradangan akut,

seperti yang ditemukan oleh LeBreton et al lebih dari 25 tahun yang lalu (Suliman et

al, 2008). Namun pada kondisi peradangan kronis seperti pada pasien dialisis kadar

Fetuin-A juga mengalami penurunan (Ketteler, 2003; Stevinkel et al 2005). Sifat anti

peradangan fetuin-A ini ditunjukkan dengan membatasi produksi sitokin

proinflamasi seperti menekan pelepasan TNF-α dari lipopolisakarida (LPS) akibat

rangsangan makrofag (Ombrellino, 2001) dan mencegah perburukan inflamasi

(Suliman et al, 2008; Zeidan et al, 2012).

2.3.3. Faktor-faktor yang mempengaruhi kadar AHSG

Inflamasi dan protein energy wasting (PEW) merupakan penyebab utama rendahnya

kadar Fetuin-A sirkulasi pada pasien PGK (Stenvinkel et al, 2005; Wang et al, 2005;

Cozzolino et al, 2006; Jung et al, 2010). Hal ini juga terbukti oleh Porazko et al

(2009) yang mendapatkan hubungan terbalik antara kadar Fetuin-A dengan IL-6.

Bahkan Daveau et al melaporkan bahwa IL-1β dapat menurunkan kadar mRNA

hepatik...... (Stenvinkel et al, 2005).

Secara epidemiologi, faktor-faktor lain dapat juga berkontribusi seperti

pertambahan usia dan diabetes (Stenvinkel et al, 2005; Verduijn et al, 2010), jenis

terapi pengganti ginjal, dimana kadar Fetuin-A pasien HD lebih rendah dibanding
 56

pasien PD (Hermans, et al 2007) serta lama HD, yaitu semakin lama seseorang

menjalani HD semakin rendah kadar Fetuin-Anya (Ketteler et al, 2003; Oikawa et al,

2007).

Derajat PGK juga disangkakan mempengaruhi kadar Fetuin-A. Hal ini

dibuktikan oleh Ix dkk (2006) yang mendapatkan kadar fetuin-A serum tidak

berkurang pada PGK derajat 1, tetapi mulai menurun dari derajat 2 sampai PGK

tahap akhir. Faktor lain yang mungkin berpengaruh adalah ras. Wang dkk (2005)

mendapatkan kadar Fetuin-A serum pasien ras Cina lebih rendah dibanding ras

Kaukasia.

Caglar dkk (2008) mendapatkan bahwa pemberian sevelamer hidroklorida,

suatu pengikat pospat bebas kalsium dapat meningkatkan kadar Fetuin-A serum

meskipun bagaimana mekanismenya belum dapat dibuktikan. Namun diperkirakan

akibat antiinflamasi nonspesifik dan antiatherogenic dari sevelamer, seperti yang

dinyatakan oleh Ferramosca dkk (2005) serta Phan dkk (2005).

Faktor lain yang juga diperkirakan berperan adalah polimorfisme Thr256Ser

pada gen AHSG yang mengkode Fetuin-A. Stenvinkel et.al (2005) memperlihatkan

bahwa SNP Thr256Ser (alel serin) gen AHSG berhubungan dengan penurunan kadar

Fetuin-A pada pasien HD di Swedia, begitu juga pada pasien HD di Belanda

(Verduijn et al, 2010). Bahkan pengaruh polimorfisme Thr256Ser (alel serin) gen

AHSG terhadap penurunan kadar Fetuin-A ini juga terlihat pada pasien dengan fungsi

ginjal normal (Roos et al, 2009).

 57

2.3.4. Metode pemeriksaan AHSG serum

Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) adalah teknik

pemeriksaan utama untuk menganalisis Fetuin-A serum,  sangat sensitif dan

spesifik untuk protein serta tidak mengalami crossreactivity dengan

sera dari spesies hewan lain (tikus, kelinci, domba, kambing, sapi, babi, dan

kuda). Tes ELISA ''sandwich'' yang tersedia misalnya dari Epitop

Diagnostics, Inc (San Diego, Amerika Serikat) dan BioVendor Laboratorium

Kedokteran, Inc (Modrice, Republik Ceko). Sebanyak 96  piring dilapisi

dengan antibodi poliklonal anti - manusia fetuin - A - spesifik. Fetuin-A

yang muncul dalam sampel (diperlukan10-100 l ) ditangkap oleh antibodi ini

dan protein yang tidak terikat akan terbuang. Lalu antibodi poliklonal anti-

manusia fetuin-A horseradish peroksidase (HRP)   terkonjugasi  di

tambahkan ke dalam  piring diikuti dengan larutan substrat. Absorbansi pada

450 nm sebanding dengan konsentrasi fetuin-A dalam sampel (Suliman et al,

2008).

Pilihan metode analisis yang lain adalah Nephelometry (misalnya,

Dade Behring BN II, Newark, DE) yaitu sistem otomatis penentuan protein

plasma yang memiliki memiliki kehandalan dan sensitivitas  tinggi serta

kinerja yang cepat dengan biaya efektif. Pada Dade Behring assay, sampel

serum yang disentrifugasi akan terpapar dengan antibodi poliklonal anti-

manusia fetuin-A     kelinci  sama dengan yang digunakan dalam metodologi

ELISA. Rentang nilai yang dilaporkan adalah 0,05-3,5 g/liter (CV<10%).

Untuk meminimalkan kekeruhan nonspesifik, yang sering terjadi pada

 58

sampel uremik, maka untuk analisis ini dipilihlah serum segar dibandingkan

plasma (Suliman et al, 2008).

 59

Tabel 9. Beberapa penelitian yang menghubungkan Fetuin-A dan outcome pasien diálisis

Judul Peneliti Tempat Disain Populasi Hasil Keterbatasan

(tahun) (ras) (lama penelitian

follow up)

Association of Low Ketteler et Kaukasia Potong 312 pasien - Konsentrasi Fetuin-

Fetuin-A (AHSG) al., 2003 lintang; HD A serum lebih rendah

Concentrations in Prospektif pada pasien HD

Serum with (32 bulan) dibandingkan

Cardiovascular ex vivo kelompok kontrol.

Mortality in Patients - Defisiensi Fetuin‐A

on Dialysis: a Cross- berhubungan dengan

Sectional Study. inflamasi dan

merupakan prediktor

semua penyebab
 60

kematian.

Associations of Wang et Cina Potong 238 pasien - Konsentrasi Fetuin-

serum fetuin-A with al., 2005 lintang; PD A yang rendah

malnutrition, Prospektif berhubungan dengan

inflammation, (rerata 32 inflamasi. Setiap

atherosclerosis and bulan) peningkatan 0.01

valvular calcification g/liter Fetuin-A serum

syndrome and menurunkan resiko

ourcome in kalsifikasi vaskular

peritoneal dialysis sebanyak 6%

patients. independen terhadap

CRP dan produk

CaxPO4.

- Konsentrasi Fetuin-

A yang rendah juga

berhubungan dengan
 61

tingginya semua

penyebab kematian

dan kejadian

kardiovaskular fatal

maupun non fatal.

Serum fetuin-A and Odamaki Potong 141 pasien - Kalsifikasi vaskular

aortic calcification in et al., 2005 lintang HD lebih luas pada pasien

hemodialysis HD dengan kadar

patients. Fetuin-A yang rendah.

 62

Serum Fetuin-A Cozzolino Potong 115 pasien Kadar Fetuin-A yang

Levels Link et al., 2006 lintang HD rendah berhubungan

Inflammation and dengan CRP yang

Cardiovascular tinggi, fibrinogen, dan

Calcification in skor kalsifikasi

Hemodialysis kardiovaskular.

Patients.

Cardiac Coen et Potong 132 pasien Kadar Fetuin-A yang

calcifications: al., 2006 lintang HD rendah berhubungan

Fetuin-A and other dengan skor CAC

risk factors in yang tinggi.

hemodialysis

patients.

Inflammation, Jung et al., Prospektif 40 pasien Inflamasi kronik dan

mineral metabolism 2006 (2 tahun) HD gangguan metabolism

and progressive mineral berkontribusi

 63

coronary artery pada perkembangan

calcification in CAC, tetapi tidak

patients on berhubungan dengan

haemodialysis. kadar Fetuin-A.

Study on the Hermans Potong 98 pasien Kadar Fetuin-A pada

relationship of serum et al., 2006 lintang HD, 33 pasien dialisis tidak

fetuin-a pasien PD) berbeda dengan

concentration kontrol.

withaortic stiffness Fetuin-A bukan

in patients on prediktor kekakuan

dialysis. aorta pada pasien

dialisis dengan

aktivitas inflamasi

yang rendah.

Association of Hermans Kaukasia Potong 664 pasien Kadar Fetuin-A yang

Serum Fetuin-A tinggi berhubungan

 64

Levels with et al., 2007 lintang; HD dan 323 dengan CRP yang

Mortality in Dialysis Prospektif pasien PD) rendah dan kadar

Patients. 34 bulan kalsium yang tinggi.

(median) Fetuin-A lebih rendah

pada laki-laki dan HD

dibandingkan wanita

dan pasien PD. Setiap

peningkatan 0.1 g/liter

Fetuin-A serum

menurunkan 9%

semua penyebab

kematian dan

17% mortalitas non

kardiovaskular.

Study on the Hermans Potong 103 pasien Fetuin-A yang rendah

relationship of serum berhubungan dengan

 65

fetuin-a et al., 2007 lintang HD, 31 ketebalan intima‐

concentration pasien PD) media.

withaortic stiffness

in patients on

dialysis.

Association of El- Mesir - Konsentrasi Fetuin-

fetuin-A and cardiac Shehaby et A serum lebih rendah

calcification and al, 2010 pada pasien HD

inflammation levels dibandingkan

in hemodialysis kelompok kontrol.

patients. - Kadar Fetuin-A yang

rendah berhubungan

dengan skor kalsium

dan kalsifikasi

vaskular yang tinggi.

 66

Is fetuin-A a Verduijn Belanda Cohort Pasien HD - Makin tinggi kadar -

mortality risk factor et al. (kaukasia) & PD baru Fetuin-A maka makin

in dialysis patients or (2010) rendah resiko

a mere risk marker? kematian

A Mendelian - Inflamasi dan DM

randomization berpengaruh terhadap

approach penurunan kadar

Fetuin-A dan

peningkatan

mortalitas
 67

2.2.5. Gen AHSG

Gen AHSG pada manusia terletak pada kromosom 3q27, terdiri dari 7

exon yang terentang sepanjang 8.2 kb (Osawa et al, 2001).

Gambar 12. Lokasi genom gen AHSG

2.3.6. Polimorfisme gen AHSG

Sampai saat ini telah diketahui 319 SNP pada gen AHSG. Ada yang

terletak di promoter (rs2248690, rs2077119), di intron (rs2593813,

rs2518136) dan di ekson (rs4831, rs4917, rs4918). SNP rs4918 terletak pada

exon ke-7 dan mengkodekan asam amino Thr256Ser (NCBI, 2013)

merupakan SNP yang paling banyak dianalisis dalam hubungannya dengan

kadar Fetuin-A serum di berbagai populasi. Ada 3 kemungkinan genotipe

pada SNP Thr256Ser ini yaitu Thr/Thr (alel C), Thr/Ser (heterozigot) dan

Ser/Ser (alel G).

2.3.7. Metode pemeriksaan polimorfisme gen AHSG

Reaksi polimerase berantai atau dikenal sebagai polymerase chain

reaction (PCR) merupakan suatu proses sintesis enzimatik untuk penggandaan

untai DNA (nukleotida) pada fragmen tertentu secara in vitro dengan

 68

menggunakan enzim DNA polimerase dimana prinsip kerjanya mirip dengan

proses replikasi didalam sel (invivo). Tehnik ini pertama kali ditemukan oleh

Kary dan kawan-kawan pada tahun 1984.

PCR mempunyai 3 tahap yang berulang, yakni denaturasi, pengenalan

primer (annealing) dan elongasi (polymerization). Pada tahap denaturasi suhu

dinaikkan pada kisaran 92-950C sehingga satu untai ganda DNA cetakan akan

terdenaturasi menjadi dua untai tunggal. Selanjutnya pada tahap annealing,

primer akan menempel pada DNA cetakan sesuai dengan urutan

komplemennya. Penempelan DNA primer akan diikuti dengan sintesis DNA

pada tahap berikutnya yaitu elongasi. Sehingga pada akhir setiap siklus, satu

untai DNA digandakan menjadi dua untai. Jumlah siklus dalam setiap reaksi

PCR biasanya 30-35 siklus. Waktu yang diperlukan untuk setiap siklus sangat

pendek yaitu sekitar 3-4 menit, sehingga dalam beberapa jam sudah didapat

jumlah fragmen DNA yang diinginkan (Saiki, 1989).

Pada proses PCR selain cetakan DNA, diperlukan juga enzim DNA

polimerase yang termostabil, sepasang primer (forward dan reverse) spesifik,

nukleotida (dNTP), bufer PCR, ion Mg++ dan gene cycler. DNA yang

digunakan dalam reaksi PCR merupakan DNA hasil isolasi dari sampel sel.

Berbagai tehnik isolasi DNA telah banyak dikembangkan dari berbagai jenis

sampel, sehingga memungkinkan untuk mengisolasi DNA dari sampel arsip

yang sudah lama disimpan. Pada sampel darah, presipitasi dilakukan dengan

salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari protein atau debris sel dengan

pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi (Fatchiyah, 2011).

 69

Polimerisasi DNA (replikasi DNA) hanya dapat dimulai jika tersedia

molekul primer, yaitu suatu molekul yang digunakan untuk mengawali proses

polimerisasi untaian DNA. Selain itu, polimerisasi DNA juga mutlak

memerlukan cetakan (template) yang dapat berupa untaian DNA. Fungsi

primer adalah menyediakan ujung 3’-OH yang akan digunakan untuk

menempelkan molekul DNA pertama dalam proses polimerisasi (Yuwono,

2005).

Primer yang terdiri dari oligonukleotida pendek (15-30 pb) untai

tunggal selain sebagai pelacak, juga sebagai pembatas fragmen untai DNA

yang akan digandakan.

Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

Salah satu cara untuk mengenali urutan nukleotida pada titik tertentu adalah

dengan menggunakan tehnik RFLP, yaitu tehnik pemotongan segmen DNA pada titik

tertentu sehingga menghasilkan panjang fragmen yang spesifik dengan menggunakan

enzim endonuklease atau disebut juga sebagai enzim restriksi (Fatchiyah, 2011).

Segmen DNA yang akan di analisis didigesti dengan enzim restriksi,

hibridisasi dengan probe yang terdiri dari molekul DNA untai tunggal berkomplemen

ke satu atau lebih nukleotida dari fragmen hasil restriksi, sehingga gambaran

fragmen-fragmen DNA tersebut merupakan profil DNA bagi setiap individu

(Fatchiyah, 2011).

Enzim endonuklease merupakan enzim yang diisolasi dari bakteri dan mampu

memotong untaian DNA pada atau dekat dengan urutan nukleotida yang spesifik
 70

untuk setiap jenis enzim. Urutan spesifik tersebut dikenal dengan nama situs

pengenalan atau situs restriksi. Situs pengenalan biasanya antara empat atau enam

nukleotida dan biasanya bersifat palindromik. Kemampuannya yang unik yaitu

memotong DNA hanya jika ada situs pengenalannya, maka enzim ini banyak

digunakan untuk mendeteksi adanya polimorfisme urutan DNA pada tempat tertentu

dengan melihat terjadi atau tidaknya pemotongan oleh enzim restriksi (Micklos,

1989).

RFLP merupakan metode yang mempunyai akurasi yang tinggi dan mudah

ditransfer antar laboratorium. Selain itu, RFLP jauh lebih sederhana, murah dan cepat

untuk mendeteksi polimorfisme titik dibandingkan dengan tehnik sekuensing DNA,

meskipun tehnik sekuensing DNA kadang-kadang masih diperlukan sebagai

konfirmasi maupun untuk mendeteksi kemungkinan terjadinya polimorfisme baru

(Fatchiyah, 2011).

Kekurangan RFLP diantaranya adalah; (1) dibutuhkannya DNA dengan

kemurnian tinggi dalam jumlah banyak, (2) tidak mungkin dilakukan otomatisasi, (3)

pada beberapa spesies mempunyai level polimorfisme yang rendah, (4) sedikit lokus

yang terdeteksi, (5) memerlukan pustaka probe yang sesuai, (6) membutuhkan waktu

yang banyak, dan (7) membutuhkan biaya yang besar (Fatchiyah, 2011).
 71

Tabel 10. Beberapa penelitian yang menghubungkan polimorfisme gen AHSG, kadar fetuin dan mortalitas pasien

dialisis

Judul Peneliti Tempat Populasi Disain Hasil Keterbatasan

(Thn) (ras) penelitian

Low fetuin-A levels are Stenvink Swedia Pasien HD Cohort - Pasien dengan alel AHSG

assaciated with el et al., (kaukasia) & PD baru 256Ser memiliki kadar

cardiovascular death: Impact (2005) Fetuin-A yang rendah dan

of variations in the gene resiko kematian yang tinggi

encoding fetuin. akibat apapun.

- Kadar Fetuin-A dipengaruhi

malnutrisi, inflamasi

Gene Polymorphisms and Cozzolin Italia Pasien HD Case - Polimorfisme Thr256Ser

Serum AHSG Levels in o et al,. (kaukasia) lama control tidak berhubungan dengan

Italian Hemodialysis (2007) penurunan kadar Fetuin-A

Patients
 72

Is fetuin-A a mortality risk Verduijn Belanda Pasien HD Cohort - Polimorfisme Thr256ser

factor in dialysis patients or et al., (kaukasia) & PD baru memiliki pengaruh yg lemah

a mere risk marker? A (2010) terhadap peningkatan

Mendelian randomization mortalitas sehubungan

approach penurunan kadar Fetuin

- Inflamasi dan DM lebih

berpengaruh terhadap

penurunan kadar Fetuin-A

dan peningkatan mortalitas

Visfatin and Fetuin-A: Zeidan et Mesir Pasien Case - Polimorfisme Thr256ser

Novel Markers for al., PGK tetapi control tidak berhubungan dengan

Endothelial Dysfunction in (2012) belum penurunan kadar Fetuin-A

Chronic Kidney Disease dialisis

 73

2.4. Kerangka Teori

PGK Stadium 5 dengan HD

ROS

Fosfat Homosistein NADPH oksidase

Hormon Paratiroid Stress oksidatif

Osteoklast IKB NfKβ

IL-6
Demineralisasi

GEN

Hepatosit
Kalsium
↓↓
Ca. Fospat FETUIN A

Kalsifikasi Vaskular

Aterosklerosis

Mortalitas
 74

Keterangan:

: variabel yang diperiksa

: menaikkan

: menurunkan

: mengaktivasi

Keterangan kerangka teori:

Gagal ginjal adalah suatu kondisi klinis yang ditandai dengan penurunan fungsi

ginjal yang irreversibel, pada suatu derajat memerlukan terapi pengganti ginjal yang

tetap, berupa diálisis atau transplantasi ginjal (Suwitra, 2009).

Penurunan fungsi ginjal pada PGK akan disertai peningkatan kadar fosfat di

darah (hiperfosfatemia) akibat penurunan ekskresinya di urin. Hiperfosfatemia

mengakibatkan hiperparatiroidisme sekunder sehingga…

Pada pasien PGK dan diálisis juga terjadi peningkatan stres oksidatif dan

inflamasi kronis (Obergetal, 2004; Silverstein, 2009; Nanayakkara and Gaillard,

2010; Fontanet and Lavin, 2011). Salah satunya adalah jalur NfKẞ, dimana jalur ini

akan memicu inflamasi dan fibrogenesis melalui pelepasan sitokin pro inflamasi (…).
 75

2.5. Kerangka Konsep

Kerangka konsep pada penelitian ini menggunakan model etiologik, dimana

kedudukan variabel bebas yang diteliti tidak sama. Pada kerangka konsep etiologik,

variabel bebas terdiri dari variabel utama dan variabel perancu berupa konfounder

atau interaksi. Tujuan kerangka konsep etiologik adalah untuk memperoleh hubungan

yang murni antara variabel bebas utama dengan variabel terikatnya (Dahlan, 2012).

Kadar fetuin-A Mortalitas

Polimorfisme
Thr256Ser Gen Lama harapan hidup
AHSG Kalsifikasi vaskular
Kalsifikasi vaskular

(var. bebas) (var. antara) (var. terikat)

-Data Klinis
1. Inflamasi (IL-6)
2. Produk Ca.PO4
3. Status gizi (IMT)
4. Penyakit ginjal primer
5. Albumin
-Data demografi
1. Usia memulai HD
2. Lama HD

(var. perancu)

Keterangan: pengaruh utama yang dicari

pengaruh tambahan
 76

Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui pengaruh polimorfisme Thr256Ser

gen AHSG terhadap mortalitas akibat penyakit kardiovaskular dan lama harapan

hidup pada pasien HD kronik. Menurut literatur, adanya polimorfisme Thr256Ser

pada gen AHSG akan menurunkan kadar Fetuin-A, sehingga fungsinya sebagai

inhibitor kalsifikasi vaskular akan terganggu. Adanya kalsifikasi vaskular akan

meningkatkan resiko kematian akibat penyakit kardiovaskular maupun penyakit lain

melalui inflamasi, sehingga lama harapan hidup pasien HD kronik menjadi lebih

singkat.

Selain akibat polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG, penurunan kadar

Fetuin-A dan mortalitas serta lama harapan hidup pasien HD kronik juga dipengaruhi

oleh faktor lain. Untuk mengontrol variabel yang berpotensi sebagai perancu terhadap

kadar fetuin-A dan lama harapan hidup pada pasien HD kronik dilakukan analisis

multivariat.

2.6. Hipotesis Penelitian

Dari pertanyaan penelitian diatas dirumuskan hipotesis penelitian sebagai berikut:

2.6.1. Hipotesis mayor

Adanya polimorfisme Thr256Ser pada gen AHSG menurunkan lama

harapan hidup pasien HD kronik di Indonesia.

2.6.2. Hipotesis minor

A. Adanya polimorfisme Thr256Ser gen AHSG menurunkan kadar Fetuin-A

pada pasien HD kronik di Indonesia.

 77

B. Adanya polimorfisme Thr256Ser gen AHSG meningkatkan resiko

terjadinya kalsifikasi vaskular pada pasien HD kronik di Indonesia.

C. Kadar Fetuin-A meningkatkan resiko terjadinya kalsifikasi vaskular pada

pasien HD kronik di Indonesia.

D. Kadar Fetuin-A meningkatkan lama harapan hidup pada pasien HD

kronik di Indonesia.

E. Kadar IL-6 menurunkan lama harapan hidup pada pasien HD kronik di

Indonesia.

E. Kadar Il-6 meningkatkan resiko terjadinya kalsifikasi vaskular pada pasien

HD kronik di Indonesia.

g. Kadar IL-6 menurunkan kadar Fetuin-A pada pasien HD kronik di

Indonesia.
 78

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1. Rancangan Penelitian

Penelitian ini merupakan suatu studi analitik-observasi longitudinal yang

menggunakan desain khusus yaitu analisis kesintasan (survival analysis). Analisis

kesintasan ini dipilih oleh karena penelitian ini bertujuan menentukan lama harapan

hidup pasien HD kronik, sehingga hal yang terpenting dalam penelitian ini adalah

kapan terjadinya event, bukan terjadinya event atau tidak (Dahlan, 2009). Pada

rancangan yang menggunakan mix-cohort (retro-prospektif) ini, data dikumpulkan

lebih dari satu kali yaitu semenjak subjek menjalani HD pertama kali (data dari rekam

medik) kemudian diikuti sampai penelitian dihentikan pada waktu yang ditentukan

peneliti (Sastroasmoro, 2011).

3.2. Waktu dan Tempat penelitian

Penelitian ini akan dilakukan dalam dua tahap. Tahap pertama adalah

data diambil secara retrospektif dari rekam medik, yaitu data dari pasien yang telah

menjalani HD minimal selama 27 bulan. Tahap kedua adalah data diambil secara

prospektif selama 3 bulan, dengan mengikuti perkembangan pasien tersebut atau

sampai tercapainya median survival. Lama penelitian 30 bulan ini ditetapkan karena

pada penelitian sebelumnya didapatkan median survival pasien HD kronik di

Indonesia adalah 24 bulan (Muzasti et al, 2011). Oleh karena harapan hidup pasien

HD kronik semakin baik maka diasumsikan median survival pada penelitian ini lebih
 79

lama yaitu 30 bulan. Penelitian ini direncanakan dilakukan di beberapa lokasi antara

lain:

1. RS H. Adam Malik, RS Ginjal Rasyida dan RS Pirngadi, Medan untuk

mendapatkan data demografi dan klinis serta pengambilan darah sampel

penelitian. Pemilihan tempat penelitian berdasarkan pertimbangan bahwa ketiga

RS tersebut sebagai pusat pelayanan HD yang memiliki jumlah pasien terbanyak

dibanding pusat pelayanan HD lainnya yang ada di Propinsi Sumatera Utara.

2. Laboratorium Terpadu FK-USU untuk melakukan isolasi DNA, pemeriksaan

PCR dan RFLP.

3. Laboratorium Prodia untuk melakukan pemeriksaan Fetuin-A dan IL-6.

Laboratorium ini dipilih berdasarkan pertimbangan bahwa telah memiliki

sertifikat akreditasi dari Komite Akreditasi Nasional (KAN).

3.3. Populasi dan Sampel Penelitian

3.3.1. Populasi

1. Populasi target

Populasi target merupakan pasien HD kronik.

2. Populasi terjangkau

Populasi terjangkau pada penelitian ini adalah pasien HD kronik yang

menjalani HD di RS H. Adam Malik, RS Ginjal Rasyida dan RS Pirngadi,

Medan.
 80

3.3.2. Sampel dan teknik pemilihan sampel

1. Sampel

Sampel penelitian merupakan sebagian dari populasi terjangkau yang

memenuhi kriteria penerimaan dan penolakan.

2. Teknik pemilihan sampel

Pada penelitian ini tidak tersedia sampling frame karena subjek penelitian

adalah pasien HD kronik yang telah menjalani HD dengan kurun waktu yang

berbeda sehingga tidak mungkin dilakukan randomisasi. Oleh karena itu

teknik pemilihan sampel pada penelitian ini adalah consecutive sampling yaitu

memilih sampel berdasarkan kriteria penerimaan dan penolakan sampai besar

sampel terpenuhi (Sastroasmoro, 2011)..

3.3.3. Kriteria penerimaan dan penolakan

1. Kriteria penerimaan

a. Pasien PGK baik laki-laki maupun perempuan yang telah menjalani HD

selama minimal 27 bulan.

b. Rutin menjalani HD 2-3 kali seminggu.

c. Bersedia diambil sampel darahnya untuk pemeriksaan laboratorium

d. Memiliki data no. telp/hp dan alamat yang lengkap

e. Bersedia menjalani pemeriksaan foto polos abdomen

f. Bersedia di follow up selama penelitian ini berlangsung yang dinyatakan

secara
 81

tertulis setelah mendapatkan penjelasan mengenai penelitian ini

(informed consent).

2. Kriteria penolakan

a. Sampel darah rusak

b. Menolak melanjutkan penelitian

3.3.4. Besar sampel

Berdasarkan lama penelitian dan rekrutmen subjek, terdapat empat

rumus besar sampel pada penelitian kesintasan. Pada penelitian ini rumus

yang digunakan adalah rumus yang ke empat karena rekrutmen harus sudah

selesai selama periode waktu tertentu selama penelitian dan penelitian

dihentikan pada waktu tertentu sehingga subjek diikuti hanya sampai waktu

penelitian selesai (Dahlan, 2009).

n = (Zα + Zβ)2 {Φ(λ2) + Φ(λ1)}

(λ2 - λ1)2

Φ(λ1,2 ) = (λ1,2) 2

1- (e- λ1,2(T-T0) – e –λ1,2T) / λ1,2 To

λ1,2 = - In (0,5) / TM1,2

n = besar sampel
 82

Zα = deviat baku alfa, dimana α = 10% → 1,64

Zβ = deviat baku beta, dimana β = 20% → 0,84

λ2 = hazard (kecepatan terjadinya event) kelompok yang sudah

diketahui

λ1 = hazard kelompok yang akan diuji

TM2 = median survival kelompok yang sudah diketahui (Muzasti et al, 2011)

= 24 bulan

TM1 = TM2 + efek size, dimana efek size = 6 bulan → 30 bulan

T = lama penelitian = 30 bulan

To = lama rekrutmen = 1 bulan

Perhitungan besar sampel:

λ1 = - In (0,5) / TM1 = - In (0,5) / 30 = 0,02

λ2 = - In (0,5) / TM2 = - In (0,5) / 24 = 0,03

Φ(λ1) = (λ1) 2 = (0,02) 2

- (e- λ1(T-T0) – e –λ1T) / λ1 To 1- (e- 0,02 (30-1) – e –0,02.30) / 0,02.1

= 0,0008

Φ(λ2) = (λ2) 2 = (0,03) 2

1- (e- λ2(T-T0) – e –λ2T) / λ2 To 1- (e- 0,03 (30-1) – e –0,03.30) / 0,03.1

= 0,001

n = (Zα + Zβ)2 {Φ(λ2) + Φ(λ1)} = (1,64 + 0,84)2 {0,0008+ 0,001}

(λ2 - λ1)2 (0,02 - 0,03)2

= 110.7 ~ 111
 83

Dari perhitungan besar sampel diatas, didapat besar sampel minimal 111 orang.

3.4. Identifikasi variabel dan Definisi Operasional

3.4.1. Identifikasi Variabel

Variabel penelitian ini terdiri:

a. Variabel terikat yaitu lama harapan hidup pasien HD kronik

b. Variabel bebas yaitu polimorfisme gen α-2 Heremans Schmid

Glycoprotein (AHSG).

c. Variabel antara yaitu kadar Fetuin-A serum dan kalsifikasi vaskular

d. Variabel perancu yaitu data klinis (produk Ca.PO4, penyakit ginjal primer,

status inflamasi, IMT dan albumin) serta data demografi (usia memulai HD,

jenis kelamin dan lama HD)

3.4.2. Definisi Operasional

Defenisi operasional menjelaskan cara pengukuran dari variabel

dependen, antara, independen dan variabel perancu. Defenisi operasional dari

seluruh variabel akan dijelaskan secara sistematis yaitu dengan menerangkan:

definisi, cara ukur, alat ukur, hasil ukur dan skala ukur.
 84

Tabel 11. Defenisi operasional setiap variabel penelitian

Jenis Variabel Defenisi Cara Ukur Alat Ukur Skala Hasil ukur

variabel Ukur

variabel Lama Rentang waktu observasi Tanggal kalender Numerik Bulan

terikat harapan pengamatan mulai dari

hidup awal pengamatan (HD

pertama setelah

menjalani HD reguler

selama 3 bulan)

sampai dengan akhir

pengamatan

(terjadinya kematian

akibat apapun, hilang

dari pengamatan atau

sampai dengan
 85

penelitian di

hentikan).

Status Status pasien pada observasi Kuesioner Nominal 1. Event: jika pasien

akhir pengamatan. meninggal

0. Sensor: jika

pasien masih hidup

saat penelitian

dihentikan atau

hilang dari

pengamatan

Penyebab Penyebab pasien observasi Modifikasi kriteria Nominal 1.kardio-serebro-

kematian meninggal IRR vaskular

2. non kardio-

serebro-

variabel

Polimor Suatu bentuk variasi Pemeriksaan Mesin Esco Swift Nominal 1.Ada
 86

bebas fisme genetik, yaitu PCR-RFLP TM

Maxi Thermal

Thr256Ser perbedaan pada satu Cycler, Esco 2.Tidak ada

gen AHSG urutan basa nukleotida Technologies, Inc

gen dari satu individu

dengan yang lainnya.

a. Jika alel tidak

terpotong dengan

enzim SacI (alel

mengalami

polimorfisme)

dikatakan

polimorfisme

Thr256Ser ada atau

SNP(+). Pada

gambaran

elektroforesis
 87

terletak pada 405 bp

b. Jika alel terpotong

dengan enzim SacI

(alel normal)

dikatakan

polimorfisme

Thr256Ser tidak ada

atau SNP(-). Pada

gambaran

elektroforesis

terletak pada 193 bp

dan 212 bp

variabel Fetuin-A Glikoprotein yang Enzyme-linked Alat Bio numerik mg/dL

antara berfungsi sebagai immunosorbent Vendor

protein fase akut assay (ELISA) No. Katalog

negatif dan
 88

penghambat proses RD191037100

kalsifikasi, dinilai

kadarnya di dalam

serum.

Kalsifikasi Kalsifikasi pada aorta skoring X-ray polos nominal 1. Ya

vaskular abdominalis kalsifikasi aorta abdomen posisi 2. Tidak

abdominalis lateral

variabel Jenis perbedaan gender observasi Kuesioner nominal 1.Laki-laki

perancu Kelamin pasien 2.Perempuan

Usia saat HD usia pasien saat wawancara Kuesioner ordinal tahun

1x menjalani HD pertama

kali, yang dihitung

menurut tanggal lahir

Lama HD Lama pasien Observasi Kuesioner numerik bulan

menjalani HD,
 89

dihitung mulai dari

pasien pertama kali

menjalani HD sampai

pasien exitus atau

penelitian dihentikan

Penyakit penyakit ginjal dasar Wawancara dan Kriteria IRR nominal 1. DM

ginjal primer yang menyebabkan RM 2. Non DM

pasien menjalani HD

Status Kondisi pasien yang di Mengukur kadar Alat Archi-tect numerik mg/dL

inflamasi nilai dari kadar IL-6. IL-6 dengan No. Katalog 6K26-

metode 30

Turbidimetri

(Abbott)

Indeks massa keadaan gizi pasien Menimbang BB Timbangan ordinal 1. overweight

tubuh menurut rumus berat dan mengukur merek ... dan (≥ 23 kg/m2)

badan (dalam kg) 2.normoweight

 90

dibagi tinggi badan TB meteran merek... (18,5-22,5 kg/m2)

kuadrat (dalam meter). 3. underweight

(<18,5 kg/m2)

Kalsium Konsentrasinya di Metode CPC Alat ADVIA numerik mg/dL

dalam serum (Advia(R) (No. Katalog

Chemistry 03932883 Rev A)

Sistems, Produk

Bayer

HealthCare

Phospat Konsentrasinya di Metode Alat ADVIA numerik mg/dL

dalam serum Phosphomolybda (No. Katalog

te/UV (Advia(R) 04220623 Rev A)

Chemistry

Sistems, Produk

Bayer
 91

HealthCare

Albumin Kadarnya di dalam Metode Alat Archi-tect numerik gr/dL

serum Bromcresol No. Katalog 7D53-

Green (Abbott) 22
 92

3.5. Kerangka Penelitian

Persetujuan Komite Etik Penelitian Bidang Kesehatan FK-USU

(1)

Kriteria penerimaan Identifikasi subjek penelitian Kriteria penolakan

Memenuhi kriteria

(2a) (2b) (2c)

Anamnesa & Rekam medik Pengambilan sampel darah Foto lateral abdomen

(2b.1) (2b.2) (2b.3)

Polimorfisme Gen AHSG Kadar fetuin-a Parameter biokimia lain

(3)

Follow up

(4)

Penelitian selesai/dihentikan

Analisa Data
 93

3.6. Prosedur Kerja Penelitian

Setelah mendapat persetujuan dari Komite Etik Penelitian Bidang Kesehatan FK-USU,

maka penelitian dapat dilakukan dengan prosedur sebagai berikut:

3.6.1. Identifikasi Subjek Penelitian

Langkah ini dilakukan dengan memenuhi kriteria inklusi dan eksklusi.

3.6.2. Pengumpulan Data

a. Anamnesa dan rekam medik

Setelah dinyatakan layak menjadi subjek penelitian, peneliti mulai

mengumpulkan data dari anamnesa, pemeriksaan fisik dan rekam medik untuk

mendapatkan beberapa data yaitu jenis kelamin, tanggal lahir, BB, TB, usia

menjalani HD pertama kali dan penyebab utama PGK.

b. Pengambilan, penyimpanan dan persiapan sampel darah

Sampel darah (whole blood) diambil pada pagi hari setelah pasien berpuasa

semalaman (10-12 jam) menggunakan dispossible syringe 10 cc pada v. mediana

kubiti sebanyak 10 cc dengan terlebih dahulu dilakukan tindakan aseptik dengan

alkohol 70% dan dibiarkan kering, 5-10 menit sebelum proses HD dimulai. 2 ml whole

blood dipisahkan kedalam tabung eppendorf yang mengandung ethylenediamine

tetraacetic acid (EDTA) 5% untuk pemeriksaan polimorfisme gen AHSG. Sisanya

dibagi ke dalam 2 tabung eppendorf dengan dan tanpa EDTA untuk pemeriksaan

Fetuin-A dan parameter biokimia lainnya.

 94

c. Pemeriksaan foto polos abdomen posisi lateral

Pembacaan hasil dilakukan oleh satu orang dokter spesialis radiologi yang tidak

mengetahui klinis pasien.

3.6.3. Follow up

Follow up yang dilakukan untuk mengetahui penyakit penyerta serta terapi

yang didapatkan dan memastikan status pasien. Jika pasien meninggal harus

ditentukan tanggal dan penyebab kematian. Semua data selama follow up tercatat

dalam log book pasien yang dilakukan oleh tim tambahan setiap pasien menjalani HD

dan dievaluasi oleh peneliti setiap minggunya.

3.6.4. Penelitian selesai atau dihentikan

Penelitian ini direncanakan berlangsung sampai follow up 3 bulan terhadap

semua pasien selesai, namun jika median survival telah tercapai (50% pasien telah

meninggal) maka penelitian ini dapat dihentikan.

3.7. Pengolahan Data

Data yang telah dikumpulkan selanjutnya diolah dengan tahap sebagai berikut:

3.7.1. Editing

Editing dilakukan untuk memeriksa ketepatan dan kelengkapan data.

 95

3.7.2. Coding

Data yang telah diperiksa ketepatan dan kelengkapannya kemudian diberi

kode oleh peneliti secara manual sebelum diolah dengan komputer.

3.7.3. Entry

Data yang telah diedit dan diberi kode dimasukkan ke dalam program

komputer.

3.7.4. Cleaning Data

Pemeriksaan semua data yang telah dimasukkan ke dalam komputer guna

menghindari terjadinya kesalahan dalam pemasukan data. Salah satu cara yang

dilakukan adalah dengan melihat distribusi frekuensi dari variabel-variabel dan

menilai kelogisannya.

3.8. Analisis Data

Data pada penelitian ini dianalisis menggunakan komputer program

Statistical Product and Science Service (SPSS). Analisis data dilakukan dalam 3

tahap, yaitu univariat, bivariat dan multivariat.

3.8.1. Analisis Univariat

Analisis ini dilakukan untuk menjelaskan karakteristik masing-masing

variabel yang diteliti baik variabel dependen, variabel independen maupun variabel

antara. Analisis ini menggunakan ukuran sentral (mean, median atau proporsi) dan
 96

ukuran variasi sebarannya (standar deviasi atau kisaran). Untuk menilai distribusi data

numerik digunakan uji Kolmogorov-Smirnov satu sampel. Bila nilai p<0.05, maka

sebaran distribusi data termasuk tidak normal, bila nilai p>0.05, maka sebaran

distribusi data termasuk normal. Variabel yang terdistribusi normal dinyatakan sebagai

mean ± SD, sedangkan variabel yang tidak terdistribusi normal dinyatakan sebagai

median (minimum-maksimum). Untuk mengetahui lama harapan hidup digunakan life

table. Data akan disajikan dalam bentuk tabel dan diagram.

3.8.2. Analisis Bivariat

Analisis ini dilakukan untuk mengetahui hubungan dan besarnya hubungan

antara variabel independen dan variabel dependen, variabel independen dan variabel

antara serta variabel antara dan variabel dependen.

Metode Kaplan-Meier digunakan untuk menganalisis asumsi proporsional

hazard (PH) pada uji kesintasan. Jika hubungan variabel dengan lama harapan hidup

memenuhi asumsi PH maka dilakukan analisis cox regression. Untuk melihat

kemaknaan digunakan uji log rank.

Apabila variabel kategorik dihubungkan dengan variabel numerik, maka uji

beda rerata yang digunakan tergantung pada kelompok kategoriknya. Oleh karena

polimorfisme, penyebab kematian dan kalsifikasi vaskular dinyatakan dalam 2

kelompok maka digunakan Uji T independen jika data numeriknya (kadar fetuin-A)

berdistribusi normal atau uji U Mann whitney jika data numeriknya tidak berdistribusi
 97

normal. Namun apabila kedua variabel merupakan variabel kategorik digunakan uji

Chi Kuadrat atau uji fischer bila tidak memenuhi kriteria uji Chi Kuadrat.

Dikatakan ada pengaruh/hubungan/perbedaan yang bermakna secara statistik

jika nilai p<0,05 dan nilai confidence interval (CI) adalah 95%, dengan CI tidak ada

angka 1 pada perbandingan proporsi atau angka 0 pada perbedaan rerata. Untuk

melihat kekuatan hubungan antara variabel dependen dan independen mayor/minor

maka dilihat nilai Rasio Prevalens (RP). Bila nilai RP = 1 artinya tidak ada hubungan

antara variabel independen mayor/minor dengan variabel dependen. Jika nilai RP < 1

artinya variabel independen mayor/minor merupakan faktor protektif terhadap variabel

dependen dan jika nilai RP > 1 artinya variabel independen mayor/minor merupakan

faktor resiko terhadap variabel dependen.

3.8.3. Analisis multivariat

Analisis multivariat adalah analisis yang mencari hubungan atau pengaruh

antara banyak variabel bebas dengan satu variabel tergantung. Dalam analisis ini,

dapat diketahui variabel yang paling besar pengaruhnya, bentuk hubungan antar

variabel, berhubungan langsung atau tidak langsung dengan variabel lainnya.Variabel

yang masuk analisis multivariat adalah variabel yang pada analisis bivariat

mempunyai nilai p<0.25. Selain itu, variabel yang tidak memenuhi asumsi PH tetapi

secara teoritis penting, harus dimasukkan ke dalam analisis multivariat.

a. Menentukan faktor-faktor yang mempengaruhi lama harapan hidup. Analisis ini

dilakukan untuk mendapatkan suatu persamaan yang dapat digunakan untuk

 98

memprediksi kemungkinan suatu subjek bisa bertahan hidup pada suatu waktu

tertentu (survival function) serta untuk mengetahui kecepatan terjadinya kematian

pada waktu tertentu (hazard function). Bila semua variabel yang masuk pada analisis

ini memenuhi asumsi PH maka digunakan analisis time independen cox regression.

Apabila terdapat variabel yang tidak memenuhi asumsi PH maka dilakukan analisis

cox regression full model atau cox regression reduced model. Setelah menyelesaikan

analisis survival, selanjutnya dilakukan interpretasi hasil. Dikatakan variabel

berhubungan dengan variabel tergantung jika nilai p<0,05 dengan interval

kepercayaan dari HR tidak ada angka 1.

Rumus survival function adalah:

S(t) = harapan hidup pada waktu tertentu = S0(t)(e^y)

S0(t) = baseline survival pada waktu tertentu

Y = β1X1+ β2X2+…..+βnXn

Rumus hazard function adalah:

H(t) = kecepatan kematian pada waktu tertentu = H0(t) ey

H0(t) = baseline hazard pada waktu tertentu

Y = β1X1+ β2X2+…..+βnXn

b. Menentukan faktor-faktor yang mempengaruhi kadar Fetuin-A.

Oleh karena variabel independen mayor/minor merupakan data numerik dan

nominal, sedangkan variabel dependen (kadar Fetuin-A) adalah variabel numerik

maka digunakan analisis regresi linier.

 99

3.9. Etika Penelitian

Untuk memperoleh persetujuan etik dari Komisi Etika Penelitian Kesehatan FK USU,

sebelum melakukan pengumpulan data, peneliti terlebih dahulu harus membuat lembar

penjelasan yang jujur dan terbuka tentang prosedur, tujuan, keuntungan dan kerugian yang

dapat terjadi selama penelitian berlangsung. Selain itu dijelaskan juga bahwa segala

pembiayaan adalah tanggung jawab peneliti dan tidak membebani pasien. Apabila pasien

bersedia maka pasien menandatangani surat persetujuan mengikuti penelitian.

Sebagai pertimbangan etik, peneliti meyakini bahwa responden akan terlindungi

hak-haknya dengan memperhatikan aspek-aspek sebagai berikut:

1. Self Determination

Dalam penelitian ini responden diberi kebebasan untuk menentukan apakah akan ikut

berpartisipasi atau tidak. Responden juga diberi kebebasan untuk mengundurkan diri

dari penelitian ini jika responden menghendaki.

2. Informed Consent

Sebelum menyatakan bersedia menjadi responden, pasien terlebih dahulu diberikan

informasi tentang tujuan penelitian dan manfaatnya, kemudian responden yang bersedia

untuk ikut serta dalam penelitian ini diminta untuk menandatangani lembar persetujuan

subjek penelitian.

3. Privacy

Semua informasi pasien yang diperoleh selama penelitian dijamin kerahasiaannya dan

hanya digunakan untuk kepentingan penelitian.

 100

4. Anonymity and Confidentiality

Lembar pengumpulan data dalam penelitian ini menggunakan kode responden, sehingga

informasi yang didapatkan dalam penelitian hanya digunakan untuk keperluan analisis

data, dan tidak dapat diketahui secara luas untuk publikasi.

5. Protection from Discomfort

Sebelum penelitian berlangsung, peneliti menekankan kepada responden bahwa apabila

selama penelitian responden merasa tidak aman dan tidak nyaman, maka responden

diberi kebebasan untuk menyampaikan ketidaknyamanannya selama proses penelitian

berlangsung dan dapat memilih untuk melanjutkan atau menghentikan partisipasinya

dalam penelitian.
 101

DAFTAR PUSTAKA

Axelsson J, Devuyst O, Nordfors L, et al. 2006. Place of genotyping and phenotyping in

understanding and potentially modifying outcomes in peritoneal dialysis patients.

Kidney International;70: S138–S145. doi:10.1038/sj.ki.5001931

Beddhu S, Pappas LM, Ramkumar N, Samore M. 2003. Effects of body size and body

composition on survival in hemodialysis patients. J Am Soc Nephrol; 14:2366.

Bláha V, Mistrík E, Dusilová-Sulková S et al. 2009. Circulating fetuin-A predicts early

mortality in chronic hemodialysis patients. Clinical Biochemistry;42: 996–1000

doi:10.1016/j.clinbiochem.2009.03.021

Block GA, Klassen PS, Lazarus JM, et al. 2004. Mineral metabolism, mortality, and

morbidity in maintenance hemodialysis. J Am Soc Nephrol; 15:2208.

Caglar K, Yilmaz MI, Saglam M, Cakir E, Kilic S, Eyileten T, et al. 2007. Endothelial

dysfunction and fetuin A levels before and after kidney transplantation.

Transplantation; 83(4):392–397.

Caglar K, Yilmaz MI, Saglam M, Cakir E, Kilic S, Eyileten T, et al. 2008. Short-Term

Treatment with Sevelamer Increases Serum Fetuin-A Concentration and

Improves Endothelial Dysfunction in Chronic Kidney Disease Stage 4 Patients.

Clin J Am Soc Nephrol; 3:61-68.

Coen G, Ballanti P, Balducci A, Grandi F, Manni M, Mantella D, et al. 2006. Renal

osteodystrophy: Alpha2 Heremans Schmid glycoprotein/fetuin-A, matrix GLA

 102

protein serum levels, and bone histomorphometry. Am J Kidney Dis; 48(1):106–

113.

Coen G, Manni M, Agnoli A, Balducci A, Dessi M, De Angelis S, et al. 2006. Cardiac

calcifications: Fetuin-A and other risk factors in hemodialysis patients. ASAIO J;

52(2):150–156.

Coresh J, Selvin E, Stevens LA, et al. 2007. Prevalence of chronic kidney disease in the

United States. JAMA.;298(17):2038-2047

Cozzolino M, Brancaccio D, Gallieni M. 2005. Pathogenesis of vascular calcification in

chronic kidney disease. Kidney Int;68:429-36

Cozzolino M, Galassi A, Biondi M.L, Turri O, Papagni S, Mongelli, Civita L, Gallieni M,

Brancaccio D. 2006. Serum Fetuin-A Levels Link Inflammation and

Cardiovascular Calcification in Hemodialysis Patients. Am J Nephrol;26(5):423–

429. DOI: 10.1159/000095782

Cozzolino M, Galassi A, Biondi ML, Butti A, Russo M, Longhini C, et al. 2007. Decreased

serum fetuin-A levels after a single haemodialysis session. Nephrol Dial

Transplant;22(1):290–291.

Cozzolino M, Biondi M.L, Galassi A, Gallieni M, Brancaccio D. 2007. Gene

Polymorphisms and Serum Alpha-2-Heremans-Schmid Levels in Italian

Haemodialysis Patients. Am J Nephrol;27:639-642. DOI:10.1159/000108360

 103

Cozzolino M, Mazzaferro S, Pugliese F, Brancaccio D. 2008. Vascular Calcification and

Uremia: What Do We Know? Am J Nephrol;28:339–346 DOI:

10.1159/000111827

Cheung AK, Sarnak MJ, Yan G, et al. 2004. Cardiac diseases in maintenance hemodialysis

patients: results of the HEMO Study. Kidney Int; 65:2380.

Chung SH, Lindholm B, Lee HB. 2000. Influence of initial nutritional status on continuous

ambulatory peritoneal dialysis patient survival. Perit Dial Int; 20:19.

Dahlan, M.S. 2009. Evidence Based Medicine Seri 2: Besar Sampel dan Cara Pengambilan

Sampel dalam Penelitian Kedokteran dan Kesehatan. Edisi 2. Jakarta: Salemba

Medika.

Dahlan, M.S. 2010. Evidence Based Medicine Seri 3: Langkah-langkah membuat proposal

penelitian bidang kedokteran dan kesehatan. Edisi 2. Jakarta: Sagung Seto.

Dahlan, M.S. 2010. Evidence Based Medicine Seri 7: Mendiagnosis dan Menata Laksana

13 Penyakit Statistik: Disertai Aplikasi Program Stata. Edisi 1. Jakarta: Sagung

Seto.

Dahlan, M.S. 2011. Evidence Based Medicine Seri 1: Statistik untuk Kedokteran dan

Kesehatan. Edisi 5. Jakarta: Salemba Medika.

Dahlan, MS., 2009. Evidence Based Medicine Seri 4: Analisis Survival. Edisi 1. Jakarta:

Sagung Seto.

Dahlan, M.S. 2010. Evidence Based Medicine Seri 6: Membaca dan Menelaah Jurnal Uji

Klinis. Jakarta: Salemba Medika.

 104

de Mutsert R, Snijder MB, van der Sman-de Beer F, et al. 2007. Association between body

mass index and mortality is similar in the hemodialysis population and the

general population at high age and equal duration of follow-up. J Am Soc

Nephrol; 18:967.

Devereaux PJ, Schünemann HJ, Ravindran N, et al. 2002. Comparison of mortality

between private for-profit and private not-for-profit hemodialysis centers: a

systematic review and meta-analysis. JAMA; 288:2449.

Döring Y, Zechner U, Roos C et al. 2010. Accelerated Evolution of Fetuin-A (FETUA, also

AHSG) is Driven by Positive Darwinian Selection, not GC-Biased Gene

Conversion. Gene; 463:49–55 doi:10.1016/j.gene.2010.04.018

Dwyer JT, Larive B, Leung J, et al. 2005. Are nutritional status indicators associated with

mortality in the Hemodialysis (HEMO) Study? Kidney Int; 68:1766.

El-Shehaby AM, Zakaria A, El-Khatib M, Mostafa N. 2010. Association of fetuin-A and

cardiac calcification and inflammation levels in hemodialysis patients. Scand J

Clin Lab Invest;70(8):575-82.

Eisenstein EL, Sun JL, Anstrom KJ, et al. 2009. Do income level and race influence

survival in patients receiving hemodialysis? Am J Med; 122:170.

Foley R, Parfrey P, Sarnak M. 1998. Clinical epidemiology of cardiovascular disease in

chronic renal disease. Am J Kidney Dis;32:S112-119

 105

Ford ML, Tomlinson LA, Smith ER et al. 2010. Fetuin-A is an independent determinant of

change of aortic stiffness over 1 year in non-diabetic patients with CKD stages 3

and 4. Nephrol Dial Transplant; 25: 1853–1858 doi: 10.1093/ndt/gfp723

Heiss A, DuChesne A, Denecke B, Grotzinger J, Yamamoto K, Renne T, et al. 2003.

Structural basis of calcification inhibition by alpha 2-HS glycoprotein/fetuin-A.

Formation of colloidal calciprotein particles. J Biol Chem; 278(15):13333–

13341.

Hermans MMH, Brandenburg V, Ketteler M et al. 2006. Study on the relationship of serum

fetuin-a concentration withaortic stiffness in patients on dialysis. Nephrol Dial

Transplant;21 (5);1293-1299

Hermans MMH, Brandenburg V, Ketteler M, Kooman JP, Sande FMVD, Boeschoten EW,

Leunissen KML, Krediet RT, Dekker FW. 2007. Association of Serum Fetuin-A

Levels with Mortality in Dialysis Patients. Kidney International;72: 202–207;

doi:10.1038/sj.ki.5002178

Hermans MM, Kooman JP, Brandenburg V, Ketteler M, Damoiseaux JG, Cohen Tervaert

JW, et al. 2007. Spatial inhomogeneity of common carotid artery intima-media is

increased in dialysis patients. Nephrol Dial Transplant; 22(4):1205–1212.

Honda H, Qureshi AR, Heimburger O, Barany P, Wang K, Pecoits-Filho R, et al. 2006.

Serum albumin, C-reactive protein, interleukin 6, and fetuin a as predictors of

malnutrition, cardiovascular disease, and mortality in patients with ESRD. Am J

Kidney Dis;47(1):139–148.
 106

Indonesian Renal Registry . 2011. 3rd Report of Indonesian Renal Registry 2010. Bandung.

Ix JH, Chertow GM, Shlipak MG, Brandenburg VM, Ketteler M, Whooley MA. 2006.

Fetuin-A and kidney function in persons with coronary artery disease: Data from

the Heart and Soul Study. Nephrol Dial Transplant; 21: 2144–2151.

Johansen KL, Young B, Kaysen GA, Chertow GM. 2004. Association of body size with

outcomes among patients beginning dialysis. Am J Clin Nutr; 80:324.

Jung HH, Kim SW, Han H. 2006. Inflammation, mineral metabolism and progressive

coronary artery calcification in patients on haemodialysis. Nephrol Dial

Transplant; 21(7):1915–1920.

Jung JY, Hwang YH, Lee H et al. 2010. Association of AHSG Gene Polymorphisms and

Aortic Stiffness in Peritoneal Dialysis Patients. Am J Nephrol;31:510–517 DOI:

10.1159/000309789

Kakiya R, Shoji T, Tsujimoto Y et al. 2006. Body fat mass and lean mass as predictors of

survival in hemodialysis patients. Kidney Int; 70:549.

Kazama JJ. 2007. What does the circulating AHSG/fetuin-A level tell us? Clin Exp

Nephrol; 11:336–337 DOI 10.1007/s10157-007-0513-4

Ketteler M, Bongartz P, Westenfeld R et al. 2003. Association of Low Fetuin-A (AHSG)

Concentrations in Serum with Cardiovascular Mortality in Patients on Dialysis: a

Cross-Sectional Study. The Lancet; 361, 9360; ProQuest pg. 827

 107

Ketteler M, Wanner C, Metzger T et al. 2003. Deficiencies of calcium-regulatory proteins

in dialysis patients: A novel concept of cardiovascular calcification in uremia.

Kidney Int Suppl; 84:S84–S87.

Ketteler M, Westenfeld R, Schlieper G, Brandenburg V. 2005. Pathogenesis of vascular

calcification in dialysis patients. Clin Exp Nephrol 9:265–270 DOI

10.1007/s10157-005-0385-4

Ketteler M, Westenfeld R, Schlieper G, Brandenburg V, Floege J. 2005. “Missing”

inhibitors of calcification: general aspects and implications in renal failure.

Pediatr Nephrol 20:383–388 DOI 10.1007/s00467-004-1614-x

Kovesdy CP, Regidor DL, Mehrotra R et al. 2007. Serum and dialysate potassium

concentrations and survival in hemodialysis patients. Clin J Am Soc Nephrol;

2:999.

Kuzniar J, Porazko T, Linger M. 2008. Relationship between fetuin-A concentration,

elevated levels of inflammatory markers, and arterial wall stiffness in end-stage

kidney disease. J Ren Nutr;18;83-86

Leavey SF, McCullough K, Hecking E et al. 2001. Body mass index and mortality in

'healthier' as compared with 'sicker' haemodialysis patients: results from the

Dialysis Outcomes and Practice Patterns Study (DOPPS). Nephrol Dial

Transplant; 16:2386.

Levin A. 2003. Clinical epidemiology of cardiovascular disease in chronic kidney disease

prior to dialysis. Semin Dial ; 16(2):101-5.

 108

Luttropp K, Stenvinkel P, Carrero JJ et al. 2008. Understanding the role of genetic

polymorphisms in chronic kidney disease. Pediatr Nephrol;23(11):1941–1949.

Mailloux LU, Henrich WL. 2011. Patient survival and maintenance dialysis. Up ToDate.

Version 19.1.

Marshall MR, Byrne BG, Kerr PG, McDonald SP. 2006. Associations of hemodialysis dose

and session length with mortality risk in Australian and New Zealand patients.

Kidney Int; 69:1229.

Mehrotra R, Westenfeld R, Christenson P, BudoV M, Ipp E, Takasu J et al. 2005. Serum

fetuin-A in nondialyzed patients with diabetic nephropathy: Relationship with

coronary artery calcification. Kidney Int; 67(3):1070–1077.

Mehrotra R. 2007. Emerging role for fetuin-A as contributor to morbidity and mortality in

chronic kidney disease. Kidney International;72:137–140.

doi:10.1038/sj.ki.5002355

Merx MW, Schafer C, Westenfeld R, Brandenburg V, Hidajat S, Weber C, et al. 2005.

Myocardial stifness, cardiac remodeling, and diastolic dysfunction in

calcification-prone fetuin-A deficient mice. J Am Soc Nephrol; 16(11):3357–

3364.

Metry G, Stenvinkel P, Qureshi AR et al. 2008 Low serum fetuin-A concentration predicts

poor outcome only in the presence of inflammation in prevalent haemodialysis

patients. Eur J Clin Invest; 38 (11): 804–811 DOI: 10.1111/j.1365-

2362.2008.02032.x
 109

Micklos, D.A., Freyer, G.A., Crotty, D.A. 1989. A laboratory introduction to DNA

restriction analysis. Biotechnology Education 1(1):16-22

Moe SM, Reslerova M, Ketteler M et al. 2005. Role of calcification inhibitors in the

pathogenesis of vascular calcification in chronic kidney disease (CKD). Kidney

Int;67(6);2295-2304.

Moe SM, Chen NX. 2008. Mechanisms of Vascular Calcification in Chronic Kidney

Disease. J Am Soc Nephrol 19: 213–216. doi: 10.1681/ASN.2007080854

Muzasti RA, Wahyuni AS, Lubis AR R, Lubis HR. 2011. Phase Angle as Predictor of

Survival in Indonesian Chronic Hemodialysis Patients: A Single Center

Experience. Nephrology; 16 (Suppl 1):

National Kidney Foundation. 2002. KDOQI clinical practice guidelines for cardiovascular

disease in dialysis patients: evaluation, classification, and stratification. Am J

Kidney Dis. ;39(Suppl 1):S1-327.

National Kidney Foundation. 2002. KDOQI clinical practice guidelines for cardiovascular

disease in dialysis patients: overview of epidemiology of cardiovascular disease

in children

Noordzij M, Korevaar JC, Boeschoten EW et al. 2005. The Kidney Disease Outcomes

Quality Initiative (K/DOQI) Guideline for Bone Metabolism and Disease in

CKD: association with mortality in dialysis patients. Am J Kidney Dis; 46:925.

 110

Noordzij M, Korevaar JC, Bos WJ et al. 2006. Mineral metabolism and cardiovascular

morbidity and mortality risk: peritoneal dialysis patients compared with

haemodialysis patients. Nephrol Dial Transplant; 21:2513.

NordforsL, Lindholm B, Stenvinkel P. 2005. End-stage renal disease – not an equal

opportunity disease: the role of genetic polymorphisms. J Intern Med;258:1-12

Odamaki M, Shibata T, Takita T, Kumagai H. 2005. Serum fetuin-A and aortic

calcification in hemodialysis patients. Kidney Int; 68(6):2915–2916.

Oh J, Wunsch R, Turzer M, Bahner M, Raggi P, Querfeld U et al. 2002. Advanced

coronary and carotid arteriopathy in young adults with childhood onset chronic

renal failure. Circulation; 106(1):100–105.

Oikawa O, Higuchi T, Yamazaki T et al. 2007. Evaluation of serum fetuin-A relationships

with biochemical parameters in patients on hemodialysis. Clin Exp Nephrol

11:304–308 DOI 10.1007/s10157-007-0499-y

Ombrellino M, Wang H, Yang H, Zhang M, Vishnubhakat J, Frazier A, et al. 2001. Fetuin,

a negative acute phase protein, attenuates TNF synthesis and the innate

inflammatory response to carrageenan. Shock; 15(3):181–185.

Osawa, M., et al. 2001. Haplotype analysis of the human alpha2-HS glycoprotein (fetuin)

gene. Ann Hum Genet;65:27–34.

O'Seaghdha CM, Foley RN. 2005. Septicemia, access, cardiovascular disease, and death in

dialysis patients. Perit Dial Int; 25:534.

 111

Ossareh S. 2011. Vascular Calcification in Chronic Kidney Disease Mechanisms and

Clinical Implications. IJKD;5(5):285-99

Porażko T, Kuźniar J, Kusztal M, et al. 2009. Increased Aortic Wall Stiffness Associated

with Low Circulating Fetuin A and High C-Reactive Protein in Predialysis

Patients. Nephron Clin Pract;113:c81–c87 DOI: 10.1159/000228539

Pillon L, Piccoli A, Lowrie EG, et al. 2004. Vector length as a proxy for the adequacy of

ultrafiltration in hemodialysis. Kidney Int; 66:1266.

Price PA, Williamson MK, Nguyen TM, Than TN. 2004. Serum levels of the fetuin-

mineral complex correlate with artery calcification in the rat. J Biol Chem;

279(3):1594–1600.

Qunibi W. 2007. Cardiovascular disease in patients with chronic and end stage renal

disease. Diunduh dari: http://www.uninet.edu/cin2007/

Rahardjo P, Susalit E, Suharjono. 2009. Hemodialisis. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam.

Dalam: Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, penyunting. Edisi V. Jilid II. Jakarta:

InternaPublishing: 1050-2

Ramkumar N, Pappas LM, Beddhu S. 2005. Effect of body size and body composition on

survival in peritoneal dialysis patients. Perit Dial Int; 25:461.

Reynolds JL, Skepper JN, McNair R, Kasama T, Gupta K, Weissberg PL,

et al. 2005. Multifunctional roles for serum protein fetuin-a in inhibition of human

vascular smooth muscle cell calcification. J Am Soc Nephrol; 16(10):2920–2930.

 112

Robinson BM, Joffe MM, Pisoni RL, et al. 2006. Revisiting survival differences by race

and ethnicity among hemodialysis patients: the Dialysis Outcomes and Practice

Patterns Study. J Am Soc Nephrol; 17:2910.

Roos M, Richarrt T, Kouznetsova T, et al. 2009. Fetuin-A and arterial stiffness in patients

with normal kidney function. Regulatory Peptides; 154:39-43

Russo D, Corrao S, Miranda I, Ruocco C, Manzi S, Elefante R, et al. 2007. Progression of

coronary artery calcification in predialysis patients. Am J Nephrol; 27(2):152–

158.

Saiki, RK. 1989. The design and optimization of the PCR. In PCR Tecnology: Principle

and Application for DNA Amplification. H.A.Erlich, ed:7-16

Salahudeen AK. 2003. Obesity and survival on dialysis. Am J Kidney Dis; 41:925

Saran R, Bragg-Gresham JL, Levin NW, et al. 2006. Longer treatment time and slower

ultrafiltration in hemodialysis: associations with reduced mortality in the DOPPS.

Kidney Int; 69:1222.

Sastroasmoro, S, Ismael, S., 2011. Dasar-dasar Metodologi Penelitian Klinis. 4th ed.

Jakarta. Sagung Seto.

Satko SG, Freedman BI, Moossavi S. 2005. Genetic factors in endstage renal disease.

Kidney Int; 67(Suppl. 94): S46–9.

Schafer C, Heiss A, Schwarz A, Westenfeld R, Ketteler M, Floege J, Ester WM, Schinke T,

Dechent WJ. 2003. The Serum Protein α2-Heremans –Schmid Glycoprotein /

 113

Fetuin-A is a Systemically Acting Inhibitor of Ectopic Calcification. Journal of

Clinical Investigation;112:3; ProQuest pg. 357-366

Schoppet M, Shroff RC, Hofbauer LC, Shanahan CM. 2008. Exploring the biology of

vascular calcification in chronic kidney disease: What’s circulating? Kidney

International;73:384–390; doi:10.1038/sj.ki.5002696

Slinin Y, Foley RN, Collins AJ. Calcium, phosphorus, parathyroid hormone, and

cardiovascular disease in hemodialysis patients: the USRDS waves 1, 3, and 4

study. J Am Soc Nephrol 2005; 16:1788.

Stack AG, Murthy BV, Molony DA. 2004. Survival differences between peritoneal dialysis

and hemodialysis among "large" ESRD patients in the United States. Kidney Int;

65:2398.

Stankuviene A, Ziginskiene E, Kuzminskis, Bumblyte IA. 2010. Impact of hemodialysis

dose and frequency on survival of patients on chronic hemodialysis in Lithuania

during 1998-2005. Medicina (Kaunas);46(8):516-21

Stenvinkel P, Ketteler M, Johnson RJ et al. 2005. Interleukin-10, IL-6 and TNF-a:

important factors in the altered cytokine network of end-stage renal disease – the

good, the bad and the ugly. Kidney Int; 67: 1216–33

Stenvinkel P, Wang K, Qureshi A.R, et al. 2005. Low fetuin-A levels are associated with

cardiovascular death: Impact of variations in the gene encoding fetuin. Kidney

International;67: 2383–92
 114

Stenvinkel P, Carrero JJ, Axelsson J, Lindholm B, Heimburger O, Massy Z. 2008.

Emerging Biomarkers for Evaluating Cardiovascular Risk in the Chronic Kidney

Disease Patient: How Do New Pieces Fit into the Uremic Puzzle? Clin J Am Soc

Nephrol 3: 505-521, doi: 10.2215/CJN.03670807

Stompor T, Pasowicz M, Sullowicz W, Dembinska KA, Janda K, Wojcik K, et al. 2003. An

association between coronary artery calcification score, lipid profile, and selected

markers of chronic inflammation in ESRD patients treated with peritoneal

dialysis. Am J Kidney Dis; 41(1):203–211.

Suliman M, Garcia-Lopez E, Anderstam B et al. 2008. Vascular calcification inhibitors in

relation to cardiovascular disease with special emphasis on fetuin-A in chronic

kidney disease. Advances in clinical chemistry. In: Makowsky GS, ed. USA.

Elsevier Inc:223-239

Suwitra, K. Penyakit Ginjal Kronik. 2009. Buku Ajar Ilmu Penyakit Dalam. Dalam:

Sudoyo AW, Setiyohadi B, Alwi I, penyunting. Edisi V. Jilid II. Jakarta.

InternaPublishing: 1035-7

Tanna MM, Vonesh EF, Korbet SM. 2000. Patient survival among incident peritoneal

dialysis and hemodialysis patients in an urban setting. Am J Kidney Dis;

36:1175.

Tentori F, Blayney MJ, Albert JM, et al. 2008. Mortality risk for dialysis patients with

different levels of serum calcium, phosphorus, and PTH: the Dialysis Outcomes

and Practice Patterns Study (DOPPS). Am J Kidney Dis; 52:519.

 115

United States Renal Data System. 2010. Excerpts from the USRDS 2009 annual data

report: Atlas of end-stage renal disease in the United States. Am J Kidney Dis;

1(Suppl 1):S1.

U.S. Renal Data System. 2005. Annual Data Report: Atlas of End Stage Renal Disease in

the United States, Section I. Patient survival. Bethesda. MD: National Institutes

of Health. National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney

Diseases;:575-652.

USRDS. 2010. Volume one: Atlas of chronic kidney disease in the United States.

In: United States Renal Data System 2010 Annual Data Report. Bethesda, MD:

National Institutes of Health, National Institute of Diabetes and Digestive and

Kidney Diseases;1-187

USRDS. Incidence, Prevalence, Patient Characteristics, and Treatment

Modalities.In: United States Renal Data System 2011 Annual Data Report.

http://www.usrds.org/2011/view/v2_01.asp

Unruh ML, Evans IV, Fink NE, et al. 2005. Skipped treatments, markers of nutritional

nonadherence, and survival among incident hemodialysis patients. Am J Kidney

Dis; 46:1107.

Verduijn M, Prein RA, Stevinkel P et al. 2010. Is fetuin-A a mortality risk factor in dialysis

patients or a mere risk marker? A Mendelian randomization approach. Nephrol

Dial Transplant;1-6. Doi:10.1093/ndt/gfq402

 116

Wang AY, Woo J, Lam CW, Wang M, Chan IH, Gao P, Lui SF, Li PKT, Sanderson JE.

2005. Associations of serum fetuin-A with malnutrition, inflammation,

atherosclerosis and valvular calcification syndrome and outcome in peritoneal

dialysis patients. Nephrol Dial Transplant;20;1676-1685

Wang M, Wang AY, Gan LY et al. 2009. Vascular calcification in maintenance

hemodialysis patients. Blood Purif;28;15-20

Westerfeld R, Jahnen-Dechent W, Ketteler M. 2007. Vascular calcification and fetuin-A

deficiency in chronic kidney disease. Trends Cardiovasc Med;17;124-128

Yao Q, Lindholm B, Stenvinkel P. 2004. Inflammation as a cause of malnutrition,

atherosclerotic cardiovascular disease, and poor outcome in hemodialysis

patients. Hemodial Int;8: 118–29.

Yang W, Israni RK, Brunelli SM, et al. 2007. Hemoglobin variability and mortality in

ESRD. J Am Soc Nephrol; 18:3164.

Young EW, Albert JM, Satayathum S, et al. 2005. Predictors and consequences of altered

mineral metabolism: the Dialysis Outcomes and Practice Patterns Study. Kidney

Int; 67:1179.

Yuwono, T., 2005. Replikasi bahan genetik. Dalam: Yuwono, T. Biologi Molekuler.

Laboratorium Mikrobiologi, Fakultas Pertanian, Universitas Gajahmada: 94-132

Zeidan MA, Shahara GM, Suliman HS, et al. 2012. Visfatin and Fetuin-A: Novel Markers

for Endothelial Dysfunction in Chronic Kidney Disease. Life Sci J;9(2):227-243

 117

Lampiran 1.

LEMBAR PENJELASAN KEPADA CALON SUBJEK PENELITIAN

Assalamualaikum Wr Wb/ Salam Sejahtera,

Saya Dr. Riri Andri Muzasti, M.Ked (PD), Sp.PD, sedang menjalani pendidikan

Program Doktor (S3) Ilmu Kedokteran di Program Pascasarjana FK USU. Saya sedang

melakukan penelitian yang berjudul “Pengaruh Polimorfisme Thr256Ser pada Gen α-2

Heremans Schmid Glycoprotein Terhadap Lama Harapan Hidup Pasien Hemodialisis

Kronik”. Penelitian ini menganalisa pengaruh suatu gen terhadap lama harapan hidup

pasien HD kronik di Indonesia. Banyak faktor yang mempengaruhi lama harapan

hidup pasien HD, diantaranya adalah gen atau faktor keturunan. Salah satu gen atau faktor

keturunan yang mempengaruhinya adalah gen α2-Heremans-Schmid-Glycoprotein

(AHSG). Adanya variasi (polimorfisme) pada Thr256Ser gen AHSG ini akan mengganggu

produksi suatu protein yaitu Fetuin A; yang fungsinya menghambat proses pengapuran

pembuluh darah. Penurunan produksi ini kemungkinan akan meningkatkan resiko

kematian pada pasien HD akibat penyakit jantung dan pembuluh darah. Jadi penelitian ini

bertujuan untuk mengetahui apakah ada pengaruh variasi pada Thr256Ser gen AHSG

terhadap lama harapan hidup pasien HD kronik di Indonesia, melalui penurunan produksi

Fetuin A.

Adapun manfaat dari penelitian ini nantinya akan diketahui siapa yang lebih lama

bertahan hidup dan siapa yang tidak akibat variasi pada Thr256Ser gen AHSG tersebut.
 118

Diharapkan selain untuk keilmuan dan penelitian juga sebagai masukan bagi praktisi

medis dalam upaya memperbaiki prognosa pasien HD kronik dengan menentukan

penatalaksanaan yang tepat dan optimal seperti rekayasa genetika dan pemberian Fetuin A

sebagai terapi pencegahan terjadinya pengapuran pembuluh darah yang merupakan salah

satu penyebab kematian akibat penyakit jantung dan pembuluh darah. Apabila pengapuran

pembuluh darah ini dapat dicegah, maka kematian akibat penyakit jantung dan pembuluh

darah diharapkan dapat juga dicegah, sehingga lama harapan pasien HD dapat

ditingkatkan.

Adapun prosedur penelitian yang bapak/ibu/sdra/sdri akan ikuti dalam penelitian ini

yaitu:

Diawal penelitian kami akan mewawancarai bapak/ibu/sdra/sdri mengenai data

demografi seperti usia memulai HD, serta melakukan pemeriksaan fisik untuk mengetahui

kondisi fisik secara umum dan mengukur tinggi badan serta berat badan. Selain itu kami

juga akan melakukan pengambilan darah dengan jarum suntik sebanyak 10 cc ( 1 jarum

suntik penuh) untuk mengetahui variasi gen AHSG, nilai Fetuin-A dan beberapa parameter

kesehatan lainnya. Apabila dalam perlakuan diatas bapak/ibu/sdra/sdri mengalami efek

samping yaitu terjadinya robek pembuluh darah sehingga disekitar tempat suntikan akan

membengkak, maka peneliti wajib memberikan pengobatan yaitu dengan cara menekan dan

mengkompres dengan kain kasa yang diberikan air dingin atau alkohol 70%. Setelah itu

bapak/ibu/sdra/sdri akan menjalani pemeriksaan foto perut posisi samping untuk

mengatahui apakah bapak/ibu/sdra/sdri sudah mengalami pengapuran pembuluh darah atau

 119

belum. Selanjutnya perkembangan kesehatan bapak/ibu/sdra/sdri akan kami tanya dan catat

setiap kali menjalani HD dan melalui telp bilamana bapak/ibu/sdra/sdri tidak datang untuk

menjalani HD.

Partisipasi bapak/ibu/sdra/sdri bersifat sukarela dan tanpa paksaan. Setiap data

yang ada dalam penelitian ini akan dirahasiakan dan digunakan untuk kepentingan

bapak/ibu/sdra/sdri serta kepentingan penelitian. Untuk penelitian ini bapak/ibu/sdra/sdri

tidak akan dikenakan biaya apapun. Bila bapak/ibu/sdra/sdri membutuhkan penjelasan,

maka dapat menghubungi saya: Dr. Riri Andri Muzasti, M.Ked (PD), Sp.PD (HP.

081260556872)

Terimakasih saya ucapkan kepada bapak/ibu/sdra/sdri yang telah ikut berpartisipasi

pada penelitian ini. Keikutsertaan bapak/ibu/sdra/sdri dalam penelitian ini akan

menyumbangkan sesuatu yang berguna bagi ilmu pengetahuan.

Setelah memahami berbagai hal yang menyangkut penelitian ini diharapkan

bapak/ibu/sdra/sdri bersedia mengisi lembar persetujuan yang telah saya persiapkan.

Medan, 2017

Peneliti

(dr. Riri Andri Muzasti, M.Ked (PD), SpPD)

 120

Lampiran 2.

FORMULIR PERSETUJUAN SETELAH PENJELASAN

SURAT PERNYATAAN BERSEDIA IKUT PENELITIAN

Saya yang bertanda tangan dibawah ini:

Nama :

Umur :

Jenis Kelamin :

Alamat :

Telp/HP :

Setelah mendapat penjelasan yang sejelas-jelasnya dari peneliti tentang manfaat dan

resiko yang mungkin terjadi dari penelitian “Pengaruh Polimorfisme Thr256Ser Pada

Gen α-2 Heremans Schmid Glycoprotein Terhadap Lama Harapan Hidup Pasien

Hemodialisis Kronik di Indonesia” dan telah memahaminya, maka saya menyatakan

bersedia secara sukarela dan tanpa paksaan untuk ikut serta dalam penelitian ini dan patuh

akan ketentuan-ketentuan yang dibuat peneliti. Jika sewaktu-waktu ingin berhenti, saya

berhak untuk tidak melanjutkan mengikuti penelitian ini tanpa ada sanksi apapun.
 121

Demikian surat pernyataan bersedia ikut dalam penelitian ini saya buat untuk dapat

dipergunakan seperlunya.

Medan, 2017

Saksi Peserta

(…………………………..) (…………………………..)
 122

Lampiran 3. Draf log book subjek penelitian

BUKU LAPORAN PEMANTAUAN KESEHATAN SUBJEK PENELITIAN

No. ID:

I. Karakteristik pasien

Nama :

Jenis Kelamin : (1). Laki-laki

(2). Perempuan

Tanggal Lahir :

Tgl mulai HD 1x : → usia mulai HD:

Alamat/HP/Telp :

II. Data Penyakit dan Pengobatan

Vital sign : sens: , TD: mmHg, nadi: x/i, RR: x/i,

T: 0
C

BB/TB : kg/ cm → BMI:

Penyakit ginjal primer: (1). DM

(2). Non DM
 123

III. Data Laboratorium

Kadar Fetuin-A : ( )

IL-6 : ( )

Kalsium : ( )

Fosfor : ( )

Albumin : ( )

IV. Data Polimorfisme THR256SER gen AHSG

(1). Ada

(2). Tidak ada

V. Data Foto Abdomen Lateral

(1). Ada kalsifikasi

(2). Tidak ada kalsifikasi

VI. Data Follow up

Follow up Tahun: Bulan: 1

Minggu 1 Minggu 2 Minggu 3 Minggu 4 Minggu 5

Kehadiran

Tekanan darah
 124

pre/post

BB pre/post

Tgl exit → lama harapan hidup: bulan

Penyebab (1). kardio-serebro-vaskular (2). Non kardio-

kematian serebro-vaskular

Follow up Tahun: Bulan: 2

Minggu 1 Minggu 2 Minggu 3 Minggu 4 Minggu 5

Kehadiran

Tekanan darah

pre/post

BB pre/post

Tgl exit → lama harapan hidup: bulan

Penyebab (1). kardio-serebro-vaskular (2). Non kardio-

kematian serebro-vaskular

Follow up Tahun: Bulan: 3

Minggu 1 Minggu 2 Minggu 3 Minggu 4 Minggu 5

Kehadiran
 125

Tekanan darah

pre/post

BB pre/post

Tgl exit → lama harapan hidup: bulan

Penyebab (1). kardio-serebro-vaskular (2). Non kardio-

kematian serebro-vaskular

Lampiran . Prosedur pemeriksaan polimorfisme gen AHSG

1. Prosedur Ekstraksi DNA

Ekstraksi DNA merupakan tahap pertama dari pemeriksaan polimorfisme gen

AHSG. Untuk mengekstrak DNA, diperlukan langkah-langkah laboratorium untuk

memecah dinding sel dan membran inti yang disebut dengan homogenasi yaitu

penambahan bufer ekstraksi atau bufer lisis untuk mencegah DNA rusak. Proses

selanjutnya adalah pemisahan DNA dari komponen sel yang lain atau kontaminan yang

tidak diinginkan yaitu dengan sentrifugasi. Setelah itu dilanjutkan dengan presipitasi DNA,

dimana pada sampel darah dilakukan dengan salting-out yaitu supernatan dipisahkan dari

protein atau debris sel dengan pemberian larutan garam berkonsentrasi tinggi (Fatchiyah,

2011).
 126

Pengerjaan di laboratorium segera dilakukan oleh peneliti setelah sampel darah

diperoleh dibantu oleh asisten laboratorium yang sudah tersertifikasi dibawah pengawasan

peneliti senior Lab. Terpadu FK-USU

Metode : Salting-out menggunakan kit dari Wizard Genomic DNA Purification

(PROMEGA)

Bahan : serum 2 ml dengan antikoagulan EDTA

Reagen : 1. Larutan pelisis eritrosit (RBC lysis solution): 155 mM NH4Cl; 10

mM KHCO3; 0,1 mM Na2EDTA.

2. Larutan pelisis sel (Cell lysis solution): 10 mM Tris-Cl pH 8,0; 25 mM

EDTA pH 8,0; 20% SDS

3. Larutan untuk presipitasi protein (Protein precipitation solution): ambil

3,854 g NH4COOH

tambahkan dengan 10 ml aquades (untuk 10 ml)

4. Isopropanolol absolute

5. Ethanol 70%

6. DNA rehydration solution (Bufer Tris-EDTA (TE) 0,01 M pH 7,6): 10

mM Na2EDTA.2H2O pH 8,0

Alat : micro pipe, micro tube, mesin sentrifugasi biasa EBA 20, mesin

sentrifugasi dingin Universal 320 R,

mesin pendingin (kulkas), mesin Vortex.

 127

Prosedur : 1. Ambil 300 µl lapisan paling atas dari serum (untuk mendapatkan pellet

leukosit) dengan micro pipe

dan masukkan ke dalam micro tube steril ukuran 1.5 ml.

2. Tambahkan 900 µl cell lysis solution (EL buffer). Balikkan microtube,

sentil endapan pellet leukosit sampai turun lalu bolak-balikkan

microtube 5-6 kali supaya cairannya bercampur, kemudian inkubasi

dalam mesin pendingin (kulkas) selama 10 menit

3. Sentrifugasi micro tube dengan mesin sentrifugasi dingin selama 5

menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

4. Buka micro tube, lalu tuang untuk membuang supernatan sebanyak

mungkin tanpa mengganggu pellet

leukosit yang tampak sampai tidak ada yang mengalir (jangan di bolak

balik).

5. Apabila pellet leukosit masih terlihat merah ulangi langkah nomor 2

sampai nomor 4 sehingga pellet leukosit terlihat jernih (biasanya 5-6

kali). Pellet yang berwarna putih menandakan adanya sel limfosit. Pellet

yang berwarna merah menandakan masih adanya sel darah merah.

6. Vortex micro tube dengan kuat sampai endapan nuclei lepas dan

tersuspensi kembali.

7. Tambahkan nuclei lysis solution 300 µl kedalam suspensi diatas, bolak

balik 5-6 kali sampai tercampur.

 128

8. Tambahkan protein precipitation solution 100 µl kedalam suspensi

diatas, bolak balik 5-6 kali sampai tercampur.

9. Vortex kembali micro tube dengan kuat selama 20 detik. Gumpalan

protein yang kecil mungkin akan terlihat.

10. Sentrifugasi micro tube dengan mesin sentrifugasi dingin pada suhu

40C selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm. Presipitat

protein yang berwarna coklat tua akan terlihat. Ulangi prosedur no 7

jika presipitat belum terbentuk.

11. Tambahkan isopropanol (pengikat DNA) 300 µl kedalam microtube

baru.

12. Pindahkan supernatant (bagian yang jernih) hasil no. 10 ke dalam

microtube baru yang berisi

isopropanol.

13. Microtube dikocok perlahan supaya larutan bercampur sampai benang-

benang DNA terlihat seperti

benang putih (DNA-strands).

14. Sentrifugasi microtube dengan mesin sentrifugasi dingin pada suhu

40C selama 5 menit dengan

kecepatan 13.000 rpm untuk mengendapkan DNA. DNA akan terlihat

sebagai pellet kecil yang putih.

 129

15. Buang supernatan (lapisan atas) lalu tambahkan ethanol 70 %

sebanyak 300 µl , kemudian bolak-balikkan microtube perlahan

beberapa kali untuk mencuci pellet DNA.

16. Sentrifugasi micro tube dengan mesin sentrifugasi dingin pada suhu

40C selama 5 menit dengan kecepatan 13.000 rpm.

17. Dengan hati-hati aspirasikan ethanol (gunakan micro pipe) sampai

lapisan yang jernih habis dan tinggal endapan (jangan sampai pellet

terbuang).

18. Letakkan micro tube secara terbalik diatas kertas absorben dan

keringkan di udara selama 10-15 menit.

19. Rehidrasi DNA dengan menambahkan DNA rehydration solution 100

µl kemudian inkubasikan pada suhu 4OC selama satu malam untuk

memperoleh DNA terlarut. Pastikan larutan homogen.

20. DNA disimpan pada kulkas dengan temperatur – 20OC.

2. Uji kuantitatif isolat DNA

Untuk mengukur kemurnian DNA digunakan spektrofotometri UV-Vis, dimana

cahaya ultraviolet (UV) akan diserap oleh pita ganda DNA pada panjang gelombang sinar

UV 260 nm sedangkan kontaminan akan menyerap cahaya pada 280 nm sehingga terukur

nilai absorbansinya. Kemurnian DNA diukur dengan membagi nilai absorbansi 260 nm

dengan nilai absorbansi 260 nm, dimana nilai kemurnian DNA berkisar 1,8-2,0 (Fatchiyah,

2011).
 130

Bahan : isolat DNA hasil ekstraksi

Alat : nanospektrofotometer

Prosedur :

3. Uji kualitatif isolat DNA

Metode standar yang digunakan untuk identifikasi, pemisahan dan purifikasi

fragmen DNA adalah elektroforesis gel agarosa. Pada uji kualitatif dengan gel agarosa,

konsentrasi gel agarosa yang digunakan berbanding terbalik dengan panjang/pendeknya

pita DNA atau bentuk struktur DNA. Makin pendek urutan basa DNA-nya maka

konsentrasi gelnya tinggi. Struktur DNA sirkuler lebih ringan dibanding DNA linear.

Prosedur ini dilakukan dengan prinsip kerja secara garis besar dapat dijelaskan sebagai

berikut. Sampel ditempatkan pada salah satu ujung media berupa gel, kemudian kedua

ujung gel tersebut diberi aliran listrik selama beberapa jam sehingga komponen-komponen

penyusun sampel akan bergerak menuju kutub yang muatan listriknya berlawanan.

Kecepatan gerakan tiap komponen ini akan berbeda-beda sesuai dengan ukuran

molekulnya. Makin besar ukuran molekul makin lambat gerakannya. Akibatnya, dalam

satuan waktu yang sama molekul berukuran besar akan menempuh jarak migrasi yang lebih

pendek daripada jarak migrasi molekul berukuran kecil (Fatchiyah, 2011).

Bahan : isolat DNA hasil ekstraksi, bubuk agarosa, pewarna etidium bromida (EtBr)

Reagen : 1. Bufer Tris-asam borat (TBE): 89 mM Tris-Cl; 89 mM borat; dan 2 mM

larutan EDTA.
 131

2. Loading dye: 0,4% bromo-phenol blue, 50% gliserol, 1mM EDTA pH 8.

Alat : piring cetakan agarosa yang dipasangi sisir pembuat sumuran sampel, GelDoc-

imaging, power supply

Prosedur : 1. Buat gel agarose 2% yaitu dengan memanaskan 1 gr bubuk agarosa + 50 ml

buffer TBE 0,5x hingga mendidih.

2. Setelah mendidih, dinginkan hingga suhu sekitar 8 0C dan tambahkan 1 L

EtBr, kemudian tuangkan

agarosa + EtBr pada piring cetakan yang telah dipasangi sisir pembuat

sumuran sampel.

3. Bila telah mengeras tuangkan buffer TBE sampai gel terendam. Masukkan

DNA hasil isolasi/PCR/RFLP dari masing-masing sampel dengan

micropipe sebanyak 5 µl + larutan loading dye (1:1) ke dalam sumur

gel. Dalam satu baris sumur disertakan satu sumur untuk tempat DNA

penanda.

4. Hubungkan elektroda dengan power supply dan nyalakan hingga 2 jam.

5. Matikan alat elektroforesis dan ambil gel dari alat tersebut.

6. Masukkan ke dalam GelDoc-imaging, lalu dijalankan selama 30 menit pada

voltase 100 volt (~50 mA)

7. Lihat hasilnya di layar monitor komputer

 132

4. Pemeriksaan PCR-RFLP

4.1. Amplifikasi (perbanyakan DNA)

Metode: Zeidan MA et al, 2012

Bahan : 1. DreamTaqTM Green PCR Master Mix (2x)

2. Fordward Primer: F5-GTCACCCCTCCTTGTAAC-3 (Tm = 45.60C)

3. Reverse Primer: R5-CCCCAATGAGACCACA-3 (Tm = 460C)

4. Isolat DNA hasil ekstraksi

Campuran reaksi: total volume 25µl, terdiri dari:

1. DreamTaqTM Green PCR Master Mix (2x): 12.5 µl

2. Fordward Primer: 1 µl

3. Reverse Primer: 1 µl

4. Isolat DNA hasil ekstraksi: 5 µl

5. water nuclease-free: 5.5 µl

Alat : micro pipe, micro tube, mesin sentrifugasi biasa EBA 20, mesin pendingin

(freezer), mesin PCR (Esco

Swift TM
Maxi Thermal Cycler, Esco Technologies, Inc)

Prosedur: 1. Campuran reaksi di sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500

rpm

2. Pindahkan ke dalam thermal cycler (Esco SwiftTM) dengan kondisi PCR

yaitu:

a. denaturasi awal pada suhu 950 C selama 5 menit

 133

b. denaturasi 94°C selama 1 menit, annealing 59°C selama 1 menit dan

elongasi 72°C selama 1 menit, sebanyak 35 siklus

c.elongasi akhir dengan 72°C selama 7 menit.

3. Jika pemeriksaan tidak dilanjutkan, hasil disimpan pada suhu -200C

(dalam freezer)

4.2. Elektroforesis

Prosedur yang sama dengan prosedur 3, dilakukan kembali untuk identifikasi,

pemisahan dan purifikasi fragmen DNA. Reaksi PCR akan menghasilkan produk PCR

(amplicon) gen AHSG yang ditandai dengan adanya pita DNA berukuran 405 bp.

Bahan : isolat DNA hasil amplifikasi

Reagen : sama seperti diatas

Alat : sama seperti diatas

4.3. Analisis polimorfisme Thr256Ser gen AHSG (c.766C>G)

Untuk menentukan apakah sampel membawa nukleotida C dan atau nukleotida G

pada posisi Thr256Ser gen AHSG dilakukan pemotongan isolat DNA hasil amplifikasi

dengan menggunakan enzim restriksi SacI yang mempunyai situs pengenalan.... Nuleotida

G memunculkan situs pengenalan SacI............. sehingga DNA akan dipotong oleh enzim

restriksi. Sementara nukleotida C tidak memunculkan situs pengenalan untuk enzim

restriksi SacI, tetapi urutannya menjadi .........sehingga enzim restriksi tidak mengenali dan

DNA tidak terpotong.

Bahan : isolat DNA hasil amplifikasi, enzim restriksi FastDigest® SacI

 134

Reagen : 10x FastDigest® buffer

Alat : micro pipe, micro tube, mesin sentrifugasi biasa EBA 20, inkubator

Campuran reaksi: total volume 30µl, terdiri dari:

1. water nuclease-free : 17 µl

2. 10x FastDigest® buffer : 2 µl

3. isolat DNA hasil amplifikasi : 10 µl

4. enzim FastDigest® SacI : 1 µl

Prosedur : 1. Campuran reaksi di sentrifugasi selama 1 menit dengan kecepatan 3500 rpm.

1. Inkubasi pada suhu 37o c minimal selama 1 jam sampai semalaman.

4.4. Elektroforesis

Prosedur yang sama dengan b.1.3 dilakukan kembali untuk identifikasi, pemisahan

dan purifikasi fragmen DNA. Alel C yang tidak mengandung bagian SacI ditunjukkan

dengan fragmen yang tidak terpotong (405 bp) sedangkan alel G ditunjukkan dengan

fragmen terpotong menjadi 2 sebesar 193 bp dan 212 bp.

Bahan : isolat DNA hasil restriksi

Reagen : sama seperti diatas

Alat : sama seperti diatas

Lampiran . Prosedur pemeriksaan Fetuin-a

Bahan :

Metode : Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)

 135

Reagen : BioVendor Human Fetuin-A ELISA Germany (No. Katalog

RD191037100)

Alat :

Prosedur :

a. Persiapan sampel

Sesaat sebelum sampel diperiksa, larutkan sampel dengan larutan buffer dengan

perbandingan 1:10000. Hal ini dilakukan melalui 2 tahapan:

1. Tambahkan 10 uL sampel ke dalam 990 uL larutan buffer, kocok perlahan sampai

homogen (ini dinamakan larutan A/larutan 1:100).

2. Pipet 10 uL larutan A tersebut ke dalam 990 uL larutan buffer untuk mendapatkan

larutan yang diinginkan yaitu larutan 1:10000 (larutan B), kocok sampai homogen.

Catatan: Larutan di atas tidak boleh disimpan kembali atau digunakan ulang

b. Prosedur pemeriksaan

1. Siapkan reagen, larutan kalibrator, kontrol dan sampel yang sudah disiapkan.

2. Pipet 100 uL dari setiap konsentrasi kalibrator, kontrol, sampel larutan B dan buffer

(=Blanko), ke dalam wells yang

telah tersedia, disarankan dilakukan duplo.

3. Inkubasi di suhu ruang (26o C) selama 1 jam, kemudian digetarkan di 300 rpm dengan

menggunakan microplate orbial shaker.

 136

4. Lakukan pencucian dengan larutan pencuci 3 kali (0.35 ml per well), kemudian

keringkan plate dengan menggunakan tissue, untuk menghilangkan sisa larutan

pencuci.

5. Tambahkan 100 uL larutan konjugat ke dalam setiap well.

6. Lakukan inkubasi, ulangi prosedur no. 3

7. Lakukan pencucian, ulangi prosedur no. 4

8. Tambahkan 100 uL larutan substrat, lindungi dari cahaya, tutup plate dengan

aluminium foil

9. Inkubasi 10 menit pada suhu ruang (jika inkubasi dilakukan pada suhu dibawah 20oC,

maka waktu inkubasi diperpanjang sampai dengan 20 menit).

10. Kemudian akan terjadi perubahan warna, stop perubahan warna dengan

menambahkan 100 uL larutan stop

11. Diukur intensitas perubahan warna, dengan membaca absorbansi pada panjang

gelombang 450 nm (dengan

selang waktu 15 menit setelah tahap 11)

Lampiran . Prosedur pemeriksaan parameter biokimia lain

Parameter biokimia lain yang diperiksa menggunakan teknik laboratorium standar

yaitu kalsium (Ca), fosfor (P), albumin dan IL-6 , seperti yang dijelaskan pada tabel definisi

operasional.
137
138
139