Departamento de Conservao e Restauro Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa

AVALIAO DA EFICCIA DE TRATAMENTOS CONVENCIONAIS E APLICAES ALTERNATIVAS PARA PREVENIR A BIODETERIORAO EM PATRIMNIO CULTURAL
Ana Josina Moreira Duarte Fonseca

Dissertao de Mestrado em Conservao e Restauro rea de especializao: Pedra

Orientador Cientfico: Professor Doutor Fernando Pina Co-orientador cientfico: Professora Doutora Maria Filomena Macedo Co-orientador Cientfico: Doutor Nuno Leal Monte da Caparica, 2009

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Agradecimentos
Em primeiro lugar agradeo ao Professor Doutor Fernando Jorge da Silva Pina, orientador deste trabalho, pela disponibilidade para colaborar comigo, pela apresentao e sugesto do tema, e pelos ensinamentos e esclarecimentos prestados ao longo do meu trabalho. Professor Doutora Maria Filomena Macedo, co-orientadora deste trabalho, pelo acompanhamento regular do meu trabalho, pelas sugestes dadas e pelo apoio que sempre demonstrou. Ao Doutor Nuno Leal, co-orientador deste trabalho, pela disponibilidade, quer para o esclarecimento das mais variadas dvidas, quer pelas sugestes oportunas e conselhos teis. Ao Departamento de Conservao e Restauro e ao Departamento de Qumica da Faculdade de Cincias e Tecnologia da Universidade Nova de Lisboa Ao Departamento de Cincias da Terra da FCT-UNL pela cedncia do espao para a incubao das amostras Parques de Sintra Monte da Lua, em particular ao Arq. Jos Maria de Carvalho e ao Dr. Jos Carneiro pela oportunidade de realizar o meu trabalho experimental neste maravilhoso monumento que o Palcio Nacional da Pena Ao Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia de Sevilha - Consejo Superior de Investigaciones Cientificas, projecto CSIC-FCT- 2007PT0041 , em particular Dr. Ana Miller, Dr. Leonila Laiz, Dr. Anna Romanowska-

Deskins e ao Doutor Cesareo Saiz-Jimenez pela disponibilidade na realizao das anlises por mtodos de
biologia molecular. s firmas Areipor e Soarvamil pela cedncia das areias utilizadas no fabrico das argamassas. Ao Sr. Rui Soares da empresa PEDRAMALBA pelo esclarecimento do mtodo de fabrico das argamassas Ao laboratoires Anios pela cedncia do biocida Anios D.D.S.H. s minhas colegas Isabel Ferreira e Mathilda Larsson pela ajuda e apoio no decorrer deste trabalho. ` minha famlia, namorado e amigos agradeo o apoio e amizade. minha me, um especial agradecimento pelo carinho, compreenso e incentivo prestado ao longo da minha vida. Obrigado a todos.

Em resultado do trabalho desta tese foi submetido um pedido provisrio de patente (Ttulo: Aplicao de um composto fotocatalisador em materiais de construo para prevenir, evitar e/ou eliminar a biodeteriorao e respectivos mtodos de preparao; Autores: Ana Josina Fonseca; Mathilda Larsson; Nuno Leal; Maria Filomena Macedo e Fernando Pina) Do presente trabalho resultou tambm uma apresentao oral que ser efectuada na conferncia The 2nd European Students Conference on Objects Conservation a realizar na Helsinki Metropolia University of Applied Sciences Faculty of Culture and Creative Industries de 1 a 3 de Outubro de 2009.

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ndice
Resumo ................................................................................................................................................... - 3 Introduo .................................................................................................................................................... 4 1.1 Objectivos da investigao ..................................................................................................................... 4 1.2 Estado Actual dos Conhecimentos ......................................................................................................... 4 1.2.1 Biodeteriorao dos materiais de construo ..................................................................................... 4 1.2.2 Mtodos convencionais de controlo da biodeteriorao................................................................. 5 1.3 Explorao de mtodos alternativos para o controlo da biodeteriorao.......................................... 7 1.3.1 - Processo fotocataltico dos semicondutores ..................................................................................... 7 1.3.2 - O dixido de titnio (TiO2) como fotocatalisador ............................................................................. 8 2. Materiais e mtodos ............................................................................................................................... 10 2.1 Produtos qumicos seleccionados......................................................................................................... 10 2.2 Materiais de construo seleccionados................................................................................................ 10 2.3 - Metodologia de aplicao dos tratamentos....................................................................................... 11 2.3.1- Testes em laboratrio ...................................................................................................................... 11 2.3.2- Testes in situ aplicados em patrimnio cultural ............................................................................... 12 2.4 - Caracterizao do TiO2 (P25-Degussa) puro e dopado com Fe+3 ..................................................... 13 2.5 Material Biolgico seleccionado ........................................................................................................... 14 2.5.1 - Inoculao e inubao dos provetes com microrganismos fotossintticos .................................... 14 2.6 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados ................................................................................. 14 2.6.2 Caracterizao Colorimtrica.......................................................................................................... 15 3.Resultados e Discusso ............................................................................................................................ 16 3.1- Identificao da comunidade biolgica presente nas paredes do Palcio da Pena ............................ 16 3.2 Caracterizao do TiO2 (P25 Degussa) puro e dopado com Fe+3 .................................................. 16 3.2.1 Espectroscopia de Raman ............................................................................................................... 16 3.2.2 Microscopia electrnica de varrimento (SEM) ............................................................................... 17 3.2.3 Caracterizao das propriedades dos filmes de TiO2, puros e dopados com Fe. .......................... 18 3.3 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados em laboratrio ..................................................... 18 3.3.1 Quantificao da clorofila, determinada por espectrofluorimetria com fibra ptica .................... 18 3.3.2- Quantificao da clorofila a, determinada pelo mtodo de extraco ........................................... 21 3.4 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados in situ em patrimnio cultural .............................. 25 3.4.1 Caracterizao colorimtrica .......................................................................................................... 25 4. Concluses .............................................................................................................................................. 27 5-Perspectivas Futuras................................................................................................................................ 27 Anexos ........................................................................................................................................................ 30

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Resumo
Recentemente, o desenvolvimento de mtodos eficazes para o controlo da biodeteriorao do patrimnio cultural tem chamado a ateno de investigadores na rea da Conservao e Restauro. neste contexto que surge esta investigao que tem como objectivo principal a avaliao e comparao da eficcia de tratamentos qumicos convencionais e aplicaes alternativas de modo a determinar a melhor forma de prevenir a biodeteriorao dos materiais. Foram testados dois biocidas de largo espectro, o Biotin T, frequentemente utilizado na limpeza do patrimnio cultural ptreo, e o Anios D.D.S.H, desinfectante utilizado em mbito hospitalar, nunca antes aplicado a patrimnio cultural. Ambos os produtos so derivados de sais de amnia quaternria. Como produto alternativo aos biocidas, seleccionou-se o dixido de titnio (TiO2), sob a forma de anatase (P25 da Degussa). O TiO2 (anatase) um poderoso agente redutor e oxidante, que quando activado pela radiao UV, consegue degradar a matria orgnica atravs de reaces redox com algumas molculas do meio ambiente (H2O e O2). Desta forma, as propriedades fotocatalticas e super-hidroflicas deste semicondutor possibilitam conferir aos materiais de construo excelentes propriedades de auto-limpeza os chamados self-cleaning materials, que, inibem o crescimento de microrganismos e mantm os materiais constantemente limpos. Alm disso, o facto de o TiO2 no ser um composto txico constitui a priori uma boa alternativa aos produtos biocidas convencionais. A avaliao e comparao da eficcia dos tratamentos foi estudada quer em laboratrio, atravs da inoculao de microrganismos fotossintticos em provetes de argamassas, quer in situ, atravs da aplicao de solues aquosas dos trs produtos em patrimnio cultural edificado, no Palcio Nacional da Pena, em Sintra. Nos testes laboratoriais, o TiO2 foi aplicado aos provetes por diferentes metodologias. O processo de dopagem do TiO2 com o Fe+3 foi tambm testado com o objectivo de desviar a sua aco fotocataltica da gama espectral UV para a gama de luz visvel, estendendo assim a sua performance. O TiO2 puro e dopado foi caracterizado por diferentes tcnicas de anlise, nomeadamente: Espectroscopia de Raman, SEM-EDX e Espectroscopia UV-VIS de Reflectncia difusa. Em laboratrio a metodologia de avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados foi realizada da seguinte forma: 1) Aplicao do TiO2 durante o processo de fabrico dos provetes de argamassa; 2) Inoculao dos provetes com uma cultura lquida de microrganismos fotossintticos; 3) Incubao dos provetes em ambiente exterior durante um perodo de 4 meses; 4) Monitorizao do crescimento biolgico atravs de tcnicas de quantificao da clorofila a; 5) Aplicao dos 2 biocidas (Anios D.D.S.H e Biotin T) aps o crescimento dos microrganismos; 6) Nova determinao do crescimento biolgico nos provetes onde se aplicaram os biocidas. Nos testes realizados in situ em patrimnio cultural, a avaliao da eficcia dos tratamentos foi realizada atravs de medies colorimtricas segundo o modelo CIELAB. Aps a avaliao da eficcia dos tratamentos, em laboratrio e in situ, conclui-se que a aplicao do TiO2 constitui uma excelente alternativa aplicao de biocidas. Palavras-chave: Preveno da biodeteriorao; Fotoqumica; Fotodegradao; Materiais Inteligentes

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Introduo
1.1 Objectivos da investigao
O objectivo principal desta investigao o estudo e a comparao de mtodos qumicos convencionais e mtodos alternativos para o controlo da biodeteriorao em argamassas, fenmeno que constitui um dos principais problemas para a manuteno e conservao do patrimnio cultural edificado. Para atingir este objectivo, recorreu-se seguinte metodologia: 12Seleco dos produtos qumicos a aplicar nos tratamentos: dois biocidas (Anios D.D.S.H e Biotin T) e um Avaliao da actividade anti-microbiana dos trs tratamentos em argamassas, quer em laboratrio, fotocatalisador, o dixido de titnio (TiO2). atravs da inoculao de provetes com microrganismos fotossintticos, quer in situ, aplicando os tratamentos, em soluo, em duas paredes do Palcio Nacional da Pena. 3Avaliao e comparao da aco dos tratamentos atravs de diversas tcnicas analticas: quantificao da clorofila a, atravs do mtodo espectrofluorimtrico e atravs do mtodo de extraco, e medies colorimtricas. 4Seleco do tratamento mais eficaz na preveno da biodeteriorao de argamassas

1.2 Estado Actual dos Conhecimentos

1.2.1 Biodeteriorao dos materiais de construo
Os materiais de construo utilizados em patrimnio cultural edificado, sejam materiais ptreos ou materiais artificiais, esto sujeitos a diversos factores de alterao, tais como factores fsicos, qumicos e biolgicos que, em conjunto, afectam a sua durabilidade. Esta investigao foca-se essencialmente na importncia do decaimento biolgico dos materiais de construo utilizados em patrimnio cultural edificado, processo este que, nos ltimos anos, representa uma preocupao sria para a manuteno e conservao da herana cultural, uma vez que se estima que aproximadamente 30% da alterao visvel em materiais de construo seja devida a factores biolgicos [1]. Os biofilmes presentes nas superfcies exteriores do patrimnio cultural edificado constituem um vasto ecossistema, resultante de uma sucesso ecolgica estabelecida ao longo de vrios anos. Estes microrganismos (fungos, bactrias, lquenes, microalgas e cianobactrias) desempenham um papel fundamental na deteriorao de vrios monumentos e edifcios histricos [2]. Contudo devido ao seu carcter fotoautotrfico e sua elevada capacidade de sobrevivncia em ambientes inspitos, os microrganismos fotossintticos, como as microalgas verdes (Chlorophyceae), as cianobactrias (Cyanophyceae), so os que mais ocorrem nas superfcies expostas do patrimnio cultural, provocando uma severa biodeteriorao [3, 4]. Os microrganismos fotossintticos so responsveis pelo desenvolvimento e crescimento da sucesso ecolgica que os precede pois o seu carcter autotrfico permite que produzam uma biomassa orgnica (derivada da sua actividade metablica) que serve de alimento aos organismos heterotrficos (por exemplo, fungos), promovendo assim o desenvolvimento de uma biocenose mais complexa [3, 5,6]. Em todos os tipos de substratos, existem espaos fsicos preferidos pelos organismos fotossintticos. Geralmente estes espaos so caracterizados por conterem uma elevada capacidade de reteno de gua e por serem zonas protegidas da radiao solar directa, mas com luz suficiente para que possam realizar a fotossntese (buracos, fissuras, poros). Os biofilmes produzidos por estes microrganismos so constitudos por uma matriz orgnica de polmeros extracelulares (Extracellular Polymeric Substances - EPS), que, por um lado, facilita a adeso ao substrato e, por outro, tem a capacidade de absorver gua e ret-la durante um longo perodo de

tempo, tornando-os resistentes a situaes de desidratao e exposio a radiao solar intensa [4, 7]. Normalmente, os EPS representam cerca de 50-90% da totalidade da matria orgnica presente nos biofilmes [8]. A aco destes microrganismos fotossintticos conduz a alteraes cromticas e alteraes das propriedades fsicas e qumicas do substrato que, em conjunto, aceleram a degradao biognica do material [5, 9]. De um ponto de vista esttico, a presena de patinas coloridas e de incrustaes provocadas pela aco biognica desfigura o aspecto original dos monumentos, o que coloca em risco o seu valor cultural. A biodeteriorao dos materiais devida a processos biogeoqumicos e biogeofsicos que actuam simultaneamente. [7]. Os processos biogeoqumicos envolvem a alterao das propriedades intrnsecas do substrato, atravs da aco qumica dos microrganismos. Esta alterao pode dever-se, por um lado, a aces dos prprios microrganismos, que utilizam o substrato como fonte de nutrientes e, por outro lado, sua actividade metablica [7, 9]. Os microrganismos fotossintticos conseguem obter alguns dos nutrientes necessrios para o seu metabolismo (Ca, Al, Fe, K) atravs da biossolubilizao de minerais presentes nos materiais de construo. Este processo denominado biocorroso, envolve a produo de cidos orgnicos derivados da aco metablica dos microrganismos. A biocorroso dos processos biogeoqumicos mais bem conhecidos, sendo um dos mais nefastos para os materiais [6, 10]. Os efeitos biogeoqumicos da aco biolgica so facilmente visveis atravs da presena de pigmentos e dos EPS, que influenciam a cor e a integridade estrutural da superfcie. A formao de filmes biognicos no interior dos poros do substrato induz stress mecnico devido ao facto de estes sofrerem alteraes de volume consoante existe mais ou menos gua, conduzindo a alteraes no tamanho dos poros, da sua distribuio e do sistema de circulao da gua, provocando fenmenos de desagregao do substrato, o que acelera a deteriorao biogeofsica dos materiais [11, 12]. O conhecimento da biodiversidade dos principais microrganismos colonizadores do patrimnio cultural edificado assume-se, assim, como uma etapa fundamental para compreender os mecanismos envolvidos na biodeteriorao dos materiais e, consequentemente, para propor tratamentos de conservao eficazes e adequados a cada tipo de material. A maior parte dos estudos relativos identificao da biocenose fotossinttica ocorrente em patrimnio cultural edificado em pedra, localizado na Bacia Mediterrnica, refere a existncia de uma elevada biodiversidade, no entanto podemos afirmar que a maioria das microalgas verdes pertence aos, gneros Chlorella e Stichococcus [2, 5, 13], enquanto que as cianobactrias mais frequentes pertencem aos gneros Gleocapsa, Phormidium e Chroococcus [5, 13-16].

1.2.2 Mtodos convencionais de controlo da biodeteriorao

A eficcia dos tratamentos que evitam a biodeteriorao depende dos produtos escolhidos e dos mtodos aplicados. Normalmente, de entre todos os mtodos de interveno (mecnicos, fsicos, biolgicos, bioqumicos e qumicos), a utilizao de mtodos qumicos, como a aplicao de biocidas, tem sido dos mtodos mais usados em tratamentos de conservao, nomeadamente de edifcios histricos e monumentos [17]. Os biocidas so produtos qumicos que inibem e/ou destroem a actividade metablica dos microrganismos, interferindo com as suas funes vitais, como por exemplo a fotossntese ou a respirao [15, 18]. Contudo, a escolha do biocida ideal uma tarefa difcil, pois requer uma profunda anlise do biocida, tendo em conta a sua natureza qumica (orgnica ou inorgnica), tipo de microrganismos a eliminar (algicida, fungicida, bactericida), o seu mecanismo de aco e tipo de formulao (p, liquido, gs). Relativamente ao mecanismo de aco, os biocidas podem ser classificados como: electroflicamente activos ou activos ao nvel da membrana ou compostos quelantes [8]. Os biocidas activos ao nvel da membrana ou quelantes incluem os seguintes compostos: lcoois, fenis, cidos salicilanilidas, dibenzamidas, sais de amnio, entre outros. Estes compostos actuam inicialmente por adsorver a parede celular dos microrganismos. Este processo de adsoro provoca alteraes na membrana exterior e ao longo da parede

celular, que vai perdendo a sua integridade, permitindo que as molculas dos produtos biocidas cheguem membrana citoplasmtica, onde actuam de forma letal [8]. Os biocidas classificados como electrofilicamente activos representam a maior parte dos biocidas actualmente usados, contando-se entre eles os aldedos e os compostos organo-metlicos. O efeito anti-microbiano destes produtos advm do facto de estes compostos procurarem substratos que contenham uma elevada densidade electrnica, como os componentes nucleoflicos da clula microbiana [8]. O conhecimento da natureza qumica do biocida a aplicar extremamente importante, sobretudo devido s interferncias que o produto biocida possa ter com o substrato. Quando mal seleccionados, os biocidas podero induzir reaces qumicas indesejveis no substrato e alteraes cromticas, como amarelecimento ou branqueamento, modificaes no brilho ou na diafaneidade da superfcie [18]. Contudo, o grau de interferncia do produto com o substrato relaciona-se tambm com a sua forma de aplicao. Os produtos podem ser aplicados por diferentes mtodos: spray, pincel/escovas, injeco, fumigao, p ou granulado. A escolha do mtodo de aplicao depende da concentrao que se queira aplicar, do tempo de contacto, da natureza qumica do produto, das condies atmosfricas no momento de aplicao e, por ltimo, mas no menos importante, das propriedades qumicas e fsicas do substrato e das condies de conservao do mesmo. A aplicao de solues diludas de biocidas atravs de pincel ou spray a forma mais comum de aplicao em patrimnio cultural edificado [7, 17]. Assim, antes de qualquer aplicao de um produto qumico, necessrio garantir a compatibilidade qumica e fsica entre o biocida e o substrato. Se no existir nenhuma informao relativa ao produto, fundamental recorrer inicialmente a testes laboratoriais, utilizando provetes do mesmo tipo de substrato, simulando as mesmas condies a que o material se encontra sujeito [7]. A anlise da natureza qumica do produto biocida facilitar o cumprimento dos principais requisitos a ter em conta: a eficcia do produto na eliminao dos microrganismos, a interferncia com o substrato, os riscos para o meio ambiente e sade publica (toxicidade) e os efeitos a longo prazo [19]. A eficincia do biocida definida tendo em conta trs parmetros: a dose do produto (quantidade de produto por rea de aplicao), o espectro de aco e a persistncia do produto. O biocida ideal dever actuar com eficcia no momento desejado e ser o menos txico possvel. Um produto de longa persistncia, aplicado em alta concentrao, ser mais eficaz contra os microrganismos a eliminar, mas pode causar srios danos ao meio ambiente e sade pblica. Analisando o mercado actual, podemos constatar que os produtos biocidas mais frequentemente aplicados so baseados em produtos antigos, que foram introduzidos no mercado h dcadas. Normalmente, estes biocidas so convencionalmente formulados para uso na agricultura e na medicina, existindo poucos registos ou recomendaes sobre formulaes comerciais especficas para uso em conservao do patrimnio cultural edificado, sendo a compatibilidade biocida/substrato raramente considerada. Contudo, aps uma pesquisa bibliogrfica sobre biocidas comerciais de largo espectro mais utilizados em tratamentos de conservao em patrimnio cultural edificado, foi possvel concluir que os biocidas considerados mais eficientes e mais adequados so os compostos de amnia quaternria [7, 8, 20-22]. Estes compostos de amnia quaternria (QACs) so agentes surfactantes catinicos que exibem elevada actividade e estabilidade a longo prazo, mesmo quando aplicados em baixas concentraes. Segundo certos autores, estes produtos exibem baixa interferncia com os minerais dos substratos [15].Os QAC`s so biocidas de largo espectro: algicidas, bactericidas e fungicidas. Como biocidas de superfcie activa catinica so classificados, segundo o mecanismo de aco, como activos ao nvel da membrana. Estes compostos so atrados pela superfcie carregada negativamente da clula do microrganismo. A parede celular vai perdendo a sua funo protectora e os agentes activos do biocida chegam membrana citoplasmtica, destruindo a sua integridade estrutural. A actividade antimicrobiana dos compostos de

amnia quaternrios depende da sua estrutura e tamanho (Fig. 1). Um grupo alquilo de cadeia longa, com 12 a 16 tomos de carbono essencial para a sua eficcia [8]. R2 N R3 C12-16alquilo R1 X
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Fig. 1- Estrutura qumica de um composto de amnia quaternrio; onde R representa um grupo alquilo e X um halogneo (Br, I, Cl) Adaptado de [8]

1.3 Explorao de mtodos alternativos para o controlo da biodeteriorao dos materiais de construo
Nos ltimos anos, a aplicao de biocidas tem sido alvo de um julgamento depreciativo. Por um lado, porque estes produtos no promovem uma proteco a longo prazo contra a biodeteriorao, muitas vezes devido ao desenvolvimento de mecanismos de resistncia por parte dos microrganismos, tendo que ser novamente reaplicados [23]. Por outro lado porque muitos destes produtos podem induzir problemas ambientais e de sade pblica, devido toxicidade e sobredosagem [17]. Desta forma, face importncia da conservao do patrimnio cultural, surge a necessidade de uma poltica de sustentabilidade do patrimnio que seja auto-sustentvel e compatvel com o meio ambiente. A exigncia de aplicaes cientficas cada vez mais sofisticadas que acompanhem o desenvolvimento tecnolgico actual levou a que esta investigao se focasse no desenvolvimento de materiais self-cleaning que exibam propriedades anti-microbianas e super-hidroflicas e que sejam simultaneamente compatveis com o meio ambiente e com o substrato. Uma das formas estudadas neste trabalho para conseguir o desenvolvimento deste tipo de materiais, partiu dos chamados Processos Avanados de Oxidao (PAO`s), em particular da fotocatlise heterognea dos semicondutores eficiente na degradao da matria orgnica. Apresenta-se em seguida a descrio detalhada do processo fotocataltico destes semicondutores.

1.3.1 - Processo fotocataltico dos semicondutores

Os semicondutores so caracterizados por possurem duas bandas de energia distintas: uma banda de valncia de baixa energia e uma banda de conduo de alta energia. A fotocatlise de um semicondutor activada atravs da radiao UV. A absoro de fotes de energia igual ou superior ao hiato de energia, (E Ebandgap), promove um electro (e ) da banda de valncia para o estado excitado (banda de conduo), gerando na banda de valncia uma lacuna positiva (h +) (Fig 2). Assim que os fotes so absorvidos, so formados pares de e/h+ (electres/lacunas). A este processo chama-se a fotocatlise de um semicondutor, sempre com uma energia de Gibbs negativa: G <O (reaco espontnea e termodinamicamente favorvel).
-

Fig. 2- Representao esquemtica do processo fotocataltico de um semicondutor (TiO2); (esquema retirado de [24])

O destino destes pares e /h varivel [25, 26]: 1. Podero ficar presos em armadilhas superficiais ou em armadilhas internas no cristal 2. Podero recombinar, no-radiativamente ou radiativamente, dissipando a energia excitada sob a forma de calor. 3. Podero migrar para a superfcie e reagir com aceitantes e doadores (oxignio e a gua) e formar radicais hidroxilo bastante reactivos, atravs de reaces redox com as molculas do meio ambiente. As seguintes equaes resumem os processos avanados de oxidao dos semicondutores, sendo a equao 4 responsvel pela degradao e mineralizao da matria orgnica. TiO2 + h
+

TiO2 + e e h e + O2 O2
..

[eq 1] [eq 2]
+

h + H2O HO + H
.

[eq 3] [eq 4]

HO + Matria orgnica xCO2 + yH2O

[eq 1]- Fotocatlise do TiO2; gnese de pares e /h
+

[eq 2] Reaco de Reduo O electro (e ) reage com o oxignio molecular presente na atmosfera e gera o anio superxido, que por sua vez uma espcie muito reactiva [eq 3]- Reaco de Oxidao: A lacuna fotogerada (h+) reage com a gua para formar o radical hidroxilo. [eq 4]- Degradao da matria orgnica

1.3.2 - O dixido de titnio (TiO2) como fotocatalisador

Em 1972, Fujishima e Honda [27], descobriram a diviso fotoelectroqumica da molcula da gua (H2O) nos elctrodos de TiO2, sob radiao UV: (H2O
Pt TiO2

H2 + O2) [5][19][45]. Este acontecimento marcou o incio

da era da fotocatlise heterognea do TiO2 [26]. Devido ao seu elevado poder oxidante e redutor (E=2,8 V; Egap= 3,2 eV), o TiO2 um dos fotocatalisadores mais eficientes usados em processos de limpeza ambiental (para a degradao de poluentes orgnicos e compostos aromticos), na converso e armazenamento de energia solar e tambm na rea da medicina (inactivao de bactrias, vrus e clulas cancergenas) [28,29]. Recentemente, as nanopartculas de TiO2 (< 100 nm) tm atrado a ateno dos investigadores das reas da nanocincia e da nanotecnologia. Quando o tamanho de partcula diminui, a razo rea/volume aumenta drasticamente e consequentemente a rea superficial relativa aumenta tambm. Para o caso em anlise, esta caracterstica bastante vantajosa, j que a maior parte das reaces fotoqumicas ocorrem na superfcie da estrutura cristalina do TiO2. Assim, as propriedades fsicas promovidas pelas nanopartculas elevam a energia de hiato (Egap) do TiO2, tornando-o mais fotoactivo e mais eficiente [25, 26,30]. De todas as formulaes de nanopartculas de TiO2 existentes, a formulao P-25 da Degussa Corporation das mais utilizadas em experincias descritas na literatura [30]. O TiO2 existe na natureza sob trs formas cristalinas: anatase, rtilo e brookite, sendo o rtilo a forma mais frequente. Contudo, apesar de esta forma ser a mais abundante, a anatase a forma que possui o potencial fotoactivo mais elevado de todas as fases cristalinas do TiO2 [31, 32]. No entanto, a sua aplicao tecnolgica dificultada, devido elevada energia de hiato (Egap 3,2 eV), que limita a fotoreactividade do TiO2 gama espectral UV ( 390 nm). Neste trabalho pretende-se estudar o processo fotocataltico do TiO2 sob a aco da luz solar, de forma a reproduzir as condies naturais a que os monumentos se encontram normalmente sujeitos. Assim, a energia necessria para a fotocatalse apenas utilizar a radiao UV-prxima (< 380 nm), sendo de esperar que a

capacidade fotocataltica do TiO2 em degradar a matria orgnica seja muito mais baixa que quando apenas sujeita aco de uma lmpada UV, j que a proporo e intensidade da radiao UV no espectro electromagntico da radiao solar pequena (5 10 %) em relao radiao visvel (45%) [26]. O ultrapassar da limitao da actividade fotocataltica do TiO2 gama espectral UV tem sido resolvido atravs de vrios mtodos de dopagem que modificam a superfcie do semicondutor: 1) dopagem do TiO2 com metais de transio; 2) dopagem do TiO2 com elementos no metlicos (por exemplo: N); 3) acoplamento de dois semicondutores (por exemplo: CdS e TiO2); 4) sintetizao da superfcie. De entre estes mtodos, a dopagem das partculas de TiO2 com caties metlicos (TiO2-M ) tem sido dos mtodos mais descritos e estudados. A adio de metais de transio estrutura cristalina do TiO2 permite estender a absoro para a regio da luz visvel modificando, assim, a sua eficcia fotocataltica, (Fig. 3) [26, 33]. A B
+

Fig. 3- Espectro de radiao solar; A) Gama espectral UV utilizada para a fotocatlise do TiO2 ( 5% da intensidade total do espectro electromagntico); B) Gama espectral utilizada para a fotocatlise do TiO2 dopado com um elemento metlico ( 45% da intensidade total do espectro electromagntico) [34].

A reactividade fotocataltica do TiO2-M depende de vrios factores, incluindo o mtodo de dopagem, a concentrao do io dopante, o tratamento trmico (calcinao da amostra) e a configurao electrnica do agente dopante na estrutura cristalina da anatase. Segundo Xiabo Chen (2005) [26], o aumento da actividade fotocatalitica, atravs de mtodos de dopagem com metais de transio, encontra-se j provado para os seguintes elementos metlicos: Fe(III), Mo (V), Ru (III), Re(V), V (IV) e Rh (III) a 0,5%. Em particular, a dopagem do TiO2 com Fe(III) (0,5 %) tem sido um dos principais tpicos de estudo de vrias investigaes [30, 35]. Apesar de o funcionamento do mecanismo de dopagem do TiO2 com ies metlicos ainda no ter sido estudado aprofundadamente, vrios autores referem que a utilizao de caties metlicos substitu intersticialmente as partculas de titnio, formando umas mistura dos dois xidos [25, 36]. Contudo, a dopagem do TiO2 com diferentes xidos metlicos tem conduzido a resultados algo controversos, principalmente devido s diferentes formas de dopagem, que conduzem a diferentes propriedades morfolgicas e cristalinas dos filmes dopados [36]. Certos estudos demonstraram tambm que o processo de dopagem pode induzir alguma instabilidade trmica nos materiais e que os ies metlicos podero funcionar como armadilhas internas para os pares e /h , diminuindo assim a actividade fotocataltica [26]. Novas aplicaes do TiO2 Na ltima dcada, a aplicao das propriedades fotocatalticas do TiO2 estendeu-se tambm a materiais como vidros, polmeros e a peas txteis de seda e l [31, 37 - 39]. O facto de estes materiais poderem incorporar ou ser revestidos por este composto no txico, que no altera a cor nem a textura do material, um benefcio. Contudo, existem poucas referncias na literatura cientfica relativas aplicao das propriedades fotocatalticas da anatase
+

para evitar a biodeteriorao dos materiais de construo e consequentemente a sua aplicao em patrimnio cultural edificado [32][40]. De facto, a maior parte dos estudos relativos aplicao de TiO2 para atribuir propriedades de auto-limpeza aos materiais, concentram-se mais na degradao de poluentes (NOx e SO2) que propriamente na descontaminao microbiana, sendo pouco conhecido o mecanismo de funcionamento da inactivao biolgica por parte do TiO2. Pretende-se, assim, neste trabalho, descrever os procedimentos necessrios para usufruir das potencialidades fotocatalticas do TiO2 eficientes na degradao da matria orgnica para o controlo da biodeteriorao em revestimentos do patrimnio cultural. Esta ideia, conceptualmente simples, pode vir a ser bastante promissora, uma vez que a suspenso ou imobilizao do TiO2 em materiais de construo, possibilitar constituir por si s um sistema de auto-limpeza, que funcionar ao nvel da conservao preventiva, inibindo o crescimento de microrganismos. Para alm da elevada actividade fotocataltica, as propriedades super-hidroflicas do TiO2, que facilitam a disperso da gua nas superfcies dos materiais, mantm os materiais constantemente limpos, facilitando o processo de descontaminao microbiana. Em alternativa utilizao dos biocidas convencionais, que apresentam sempre um certo grau de toxicidade, a ideia de utilizar o TiO2 como fotocatalisador nos materiais de construo permite uma utilizao eficiente de recursos naturais renovveis, como a energia solar, que constitui um mtodo de controlo da biodeteriorao perfeitamente compatvel com a existncia de um ambiente no poludo.

2. Materiais e mtodos
2.1 Produtos qumicos seleccionados
Para a aplicao dos tratamentos, seleccionaram-se dois biocidas, um biocida convencional, o Biotin T, frequentemente utilizado em operaes de limpeza do patrimnio cultural edificado, e um biocida usado em mbito hospitalar como produto desinfectante de superfcies hospitalares: o Anios DDSH. Por ltimo, como produto alternativo aos biocidas, seleccionou-se o TiO2 (P-25 da Degussa Corporation), proporo anatase:rtilo = 4:1 e com uma rea superficial especfica de 50 m2/g, correspondendo a um tamanho mdio de partcula de cerca de 21 nm. A Tabela 1 apresenta as principais caractersticas dos produtos qumicos seleccionados. A especificao tcnica dos produtos seleccionados encontra-se no Anexo I.
Tabela 1- Principais caractersticas dos produtos qumicos seleccionados

Nome Comercial Biotin T

Tipo de Produto
Biocida orgnico de largo espectro Desinfectante orgnico de mbito hospitalar

Princpio Activo
n-ottil-isotiazol + sal de amnia quaternria + cido frmico

Modo de Actuao
Biocida de superfcie activa catinica afecta a membrana citoplasmtica dos microrganismos Biocida de superfcie activa catinica afecta a membrana citoplasmtica dos microrganismos Formao de radicais OH reactivos, que degradam a matria orgnica

Anios D.D.S.H

Sal de amnia quaternria + guanidino acetato+ n-propanol 99,50 % TiO2 80% de Anatase

TiO2 (P25 Degussa)

Semicondutor Inorgnico

2.2 Materiais de construo seleccionados

Para a avaliao do efeito anti-microbiano dos trs produtos qumicos referidos anteriormente, foram seleccionados dois tipos de argamassas com o mesmo trao volumtrico mas com agregados diferentes. Optou-

10

se por uma mistura de ligantes (argamassa bastarda) por ser o tipo de argamassa que foi aplicada no Palcio Nacional da Pena e por as argamassas de cal area com misturas com teores reduzidos de cimento serem referidas por certos autores como as mais adequadas para revestimentos de paredes [49]. Os materiais seleccionados e siglas adoptadas so apresentados de seguida: 1. 2. Argamassa bastarda de areia de Corroios (AC), semelhante encontrada no reboco do Palcio Argamassa bastarda de areia de quartzo (AQz), a escolha deste tipo de argamassa deve-se ao facto Nacional da Pena, em Sintra de a slica (SiO2) ser considerada um suporte eficaz para a aplicao do TiO2, tendo-se optado tambm por uma argamassa de agregado predominantemente silicioso.

Fig. 4- Materiais de construo seleccionados. 1- Argamassa de areia de Corroios (AC); 2- Argamassa de areia de quartzo (AQz)

De modo a garantir a reprodutibilidade dos resultados, foram utilizados trs replicados do mesmo material para cada tipo de tratamento aplicado. As argamassas bastardas foram preparadas utilizando como ligantes a cal area hidratada em p e o cimento branco Portland de calcrio. Na argamassa de areia de Corroios, utilizou-se uma areia de pinhal de tonalidade amarelada, gomada (contm matria orgnica e minerais argilosos) e no lavada. Na argamassa de areia de quartzo, o agregado essencialmente composto por partculas de quartzo. Ambas as areias so comercializadas em saco, sujeitas a controlo das caractersticas. A metodologia de preparao de ambas as argamassas bastardas foi semelhante. O procedimento efectuado baseou-se em indicaes da Norma EN 1015-2: 1998. O procedimento de fabrico e composies das argamassas encontram-se no Anexo II. As principais caractersticas mineralgicas e propriedades fsicas dos componentes destes materiais bem como as descries microscpicas dos agregados so resumidas no Anexo III.

2.3 - Metodologia de aplicao dos tratamentos

A avaliao do efeito biocida dos trs produtos seleccionados foi verificada de duas formas: atravs da realizao de testes em laboratrio, usando provetes de argamassas, e atravs de testes in situ aplicados em patrimnio cultural edificado (nas paredes exteriores do Palcio Nacional da Pena).

2.3.1- Testes em laboratrio

Os testes em laboratrio demonstraram ser bastante teis, pois permitiram, por um lado, avaliar a possvel nocividade que os tratamentos poderiam induzir nos substratos, e, por outro lado, possibilitaram a imobilizao do TiO2 nas argamassas, aplicando-o de forma preventiva. O esquema seguinte (Tabela 2) ilustra a metodologia de aplicao dos tratamentos:

11

Tabela 2- Esquema da metodologia de aplicao dos tratamentos nos diferentes tipos de provetes.

De modo a obter um registo comparativo da aco dos tratamentos, foram utilizados 18 triplicados, distribudos em seis caixas Petri, sem nenhum tratamento aplicado, de cada tipo diferente de argamassa. Aps o perodo de incubao, avaliou-se o crescimento biolgico de trs conjuntos de triplicados sem tratamento aplicado. Os restantes dois conjuntos de triplicados sem tratamento destinaram-se aplicao dos dois produtos biocidas seleccionados: Anios D.D.S.H e Biotin T. Ambos os produtos foram aplicados em solues aquosas. O Anios D.D.S.H foi aplicado por spray e o Biotin T por pincel. Os biocidas ficaram a actuar durante 2 semanas, sendo posteriormente avaliada a eficcia dos tratamentos. A aplicao do TiO2 nos provetes das argamassas foi feita por duas metodologias diferentes. A primeira metodologia consistiu na mistura do TiO2 juntamente com os restantes componentes das argamassas (TiO2 misturado), de acordo com a seguinte proporo volumtrica: 12:4:4:1 areia : cal area hidratada em p: TiO2: cimento A segunda metodologia de aplicao do TiO2 consistiu na imobilizao do TiO2 nas partculas de areia e foi apenas experimentada para a argamassa de areia de quartzo (TiO2imobilizado). Em todos os materiais foi ainda experimentado um mtodo de dopagem do TiO2 (TiO2-Fe), contendo Fe+3 a 0,5 wt%. Esta metodologia foi efectuada atravs da impregnao aquosa do TiO2 numa soluo de nitrato de ferro nona-hidratado Fe(NO3)3.9H2O (Sigma-Aldrich), que continha j a quantidade de Fe+3 necessria para a dopagem (0,5 %) [43]. O produto obtido no processo de dopagem foi aplicado na AC, atravs da adio do TiO2-Fe na mesma proporo volumtrica que a cal, e na AQz atravs da imobilizao nas partculas da areia. A descrio dos procedimentos experimentais realizados bem como os clculos necessrios para a realizao das experincias encontram-se no Anexo IV.

2.3.2- Testes in situ aplicados em patrimnio cultural

Para a realizao dos testes aplicados em patrimnio cultural, seleccionaram-se duas zonas (paredes) do Palcio Nacional da Pena, em Sintra.

12

Fig 5 - Localizao da 1 zona seleccionada, no Ptio dos Arcos, no Palcio Nacional da Pena

A primeira zona seleccionada localiza-se no Ptio dos Arcos, encontrando-se numa parede orientada NW-SE, virada a SE. caracterizada como um reboco de tonalidade castanho-amarelada. Uma vez que se encontra numa zona de sombra pouco exposta radiao solar directa, bastante hmida, sendo colonizada sobretudo por lquenes de pequenas dimenses e bactrias (Fig. 5).

Fig 6- Localizao da 2 zona seleccionada no Terrao D. Carlos, no Palcio Nacional da Pena

A segunda zona localiza-se a NE do Terrao D. Carlos. O reboco aqui encontrado de tonalidade cor-de-rosa e, ao contrrio do anterior, recebe radiao solar directa durante grande parte do dia (Fig 6). Em ambas as paredes, foram aplicadas suspenses aquosas dos trs produtos em pequenas reas (10x 15 cm). O Biotin T foi diludo a 2% e aplicado a pincel. O Anios DDSH foi aplicado directamente por spray, sem nenhuma diluio adicional. Por ltimo, o TiO2 foi aplicado a 1%, por spray. Identificao da comunidade biolgica presente nas paredes do Palcio da Pena De modo a determinar a comunidade biolgica presente nas paredes seleccionadas para a realizao dos testes in situ foi realizada a identificao dos microrganismos por mtodos de biologia molecular As amostras biolgicas foram recolhidas para dentro de um Eppendorf utilizando um bisturi esterilizado. As anlises foram realizadas pela Dr Ana Miller, Dr Leonila Laiz e Dr Anna Romanowska-Deskins sob a orientao do Doutor Cesareo Saiz-Jimenez no Instituto de Recursos Naturales y Agrobiologia, Consejo Superior de Investigaciones Cientficas em Sevilha (Espanha).

2.4 - Caracterizao do TiO2 (P25-Degussa) puro e dopado com Fe+3

A caracterizao do p de TiO2, puro e dopado foi realizada atravs de Espectroscopia de Raman, utilizando um microscpio Raman Horiba Jobin-Yvon Labram (presente no laboratrio cientfico do departamento de conservao e restauro da FCT-UNL), com um laser vermelho de excitao He-Ne a 632,8 nm. As amostras foram

13

analisadas com uma objectiva de 100x. A potncia incidente na amostra foi de 2,5 mW, com um feixe de 200 micrmetros. Amostras do TiO2 imobilizado nas partculas de quartzo da AQz e amostras de TiO2 dopado com Fe
+3

foram

analisadas morfolgica, qualitativamente e semi-quantitativamente utilizando um microscpio electrnico de varrimento JEOL Scanning Microscope T330A, equipado com um espectrmetro de raios-X de energia dispersiva (presente no laboratrio do departamento de cincias da terra da FCT-UNL), (parmetros de aquisio: 20 kV, 4000 nA) De modo a caracterizar a fotossensibilidade derivada da dopagem do TiO2 com o Fe , na gama espectral da luz visvel, foram ainda realizadas anlises de Espectroscopia UV-VIS de Reflectncia difusa utilizando um espectrofotmetro UV-VIS Shimadzu UV-2501PC (presente no laboratrio da fotoqumica da FCT-UNL), utilizando BaSO4 como amostra padro.
+3

2.5 Material Biolgico seleccionado

A eficcia da aco anti-microbiana dos trs produtos foi avaliada atravs da inoculao artificial dos provetes com uma cultura mista de trs microrganismos fotossintticos: duas algas verdes (Sticococcus bacillaris e Chlorella ellipsoidea) e uma cianobactria (Gleocapsa dermochroa), em meio de cultura lquido BG11. Estas espcies foram escolhidas por os gneros a que pertencem serem os principais colonizadores de materiais ptreos na Bacia Mediterrnica [5, 13].

2.5.1 - Inoculao dos provetes com microrganismos fotossintticos

Antes da inoculao, os provetes foram esterilizados em autoclave (120C, 1 atm, durante 10 minutos), de modo a garantir que no havia presena de organismos antes da inoculao. Aps o arrefecimento, colocaram-se os provetes, em triplicado, em caixas de Petri (15 cm) de vidro. Em seguida, adicionaram-se 10 ml de gua esterilizada para manter uma humidade permanente no interior de cada caixa de Petri. Cada provete foi inoculado com 100 l de cada uma das culturas fotossintticas. O registo fotogrfico dos provetes logo aps a inoculao encontra-se no Anexo V. Pelas fotografias deste Anexo observa-se que no provete de argamassa de areia de quartzo as culturas inoculadas foram imediatamente absorvidas enquanto que na argamassa de areia de Corroios as culturas permaneceram superfcie do provete.

Incubao dos provetes

Aps a inoculao, os provetes foram incubados no terrao do Departamento de Cincias da Terra da FCT-UNL durante um perodo de 4 meses (23/01/09 a 23/05/09), ficando sujeitos s condies ambientais a existentes. De modo a garantir uma humidade permanente dentro das caixas de Petri, foi adicionada gua esterilizada(15 ml) pelo menos uma vez por semana.
Fig 7 Incubao dos provetes em ambiente exterior

2.6 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados

Neste trabalho, a metodologia de avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados baseou-se na monitorizao do crescimento fotossinttico presente nos provetes, relacionando-o com a aplicao dos diferentes tratamentos. Nos testes laboratoriais, a eficincia dos tratamentos foi avaliada atravs da quantificao da emisso de fluorescncia da clorofila a. Esta quantificao foi realizada por dois mtodos diferentes: medio da fluorescncia da clorofila a, in vivo, por espectrofluorimetria com fibra ptica e determinao da clorofila a pelo mtodo de extraco, utilizando dimetilsulfxido (DMSO) como solvente. Ambos os mtodos se baseiam na capacidade de

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emisso de fluorescncia da molcula de clorofila a, permitindo avaliar a presena ou no de biomassa fotossinttica nos provetes. A vantagem do mtodo de espectrofluorimetria com fibra ptica o facto de ser um mtodo que no obriga destruio das amostras como acontece com o mtodo de extraco da clorofila a. A principal desvantagem da espectrofluorimetria com fibra ptica que s permite determinar a quantidade de clorofila presente superfcie; isto , no caso de ocorrer crescimento endoltico, este mtodo subestima o valor da biomassa fotossinttica enquanto que com o mtodo de extraco este tipo de crescimento quantificado [44].

2.6.1- Medies de fluorescncia da molcula da clorofila a

Quantificao da clorofila atravs de espectrofluorimetria por fibra ptica A fluorescncia da clorofila a foi analisada sobre a superfcie dos provetes, utilizando um espectrofluormetro SPEX Fluorolog-3 Modelo FL3-22, com adaptador de fibra ptica F-3000, ligado a um computador para aquisio de dados (Fig 8). Todas as amostras foram excitadas a 430 nm, 0,300 s de tempo de integrao, com slits a 4,5 nm na emisso e excitao. De modo a avaliar possveis variaes de intensidade de radiao do espectrofluorimetro, o registo espectrofluorimtrico da Rodamina foi tambm recolhido sempre que se utilizava o aparelho. Este padro permite corrigir quaisquer alteraes de intensidade da lmpada (Anexo VI). Em todos os provetes, foram efectuadas medies de fluorescncia antes da inoculao, logo aps a inoculao e aps 4 meses de incubao. Foram efectuadas trs medies, em cada provete, percorrendo longitudinalmente a rea superficial do provete. O cabo de fibra ptica foi colocado perpendicularmente superfcie do provete (Fig 8). Entre a extremidade do cabo e a superfcie do provete colocou-se um O-ring de modo a garantir sempre a mesma distncia de irradiao. Para a monitorizao do crescimento biolgico presente nos provetes, todas as medies de fluorescncia foram realizadas excitando-se as amostras a 430 nm, comprimento de presena de um pico de emisso tpico a 680 nm. Determinao da clorofila atravs de mtodo de extraco com DMSO A clorofila a um pigmento presente em todos os organismos fotossintticos, sejam eles eucariotas (algas verdes) ou procariotas (cianobactrias), que se encontra nas membranas dos tilacides. O mtodo de extraco da clorofila utilizado para a quantificao da clorofila, usada como medida de biomassa de organismos fotossintticos. Com o objectivo de monitorizar e quantificar o crescimento fotossinttico no volume total de cada provete, determinou-se a concentrao de clorofila a inicial (logo aps a inoculao) e clorofila a presente nos provetes aps 4 meses de incubao. A clorofila a foi extrada utilizando dimetil sulfxido (DMSO) como solvente e sua concentrao determinada por espectrofluorimetria. Para tal, utilizou-se o espectrofluorimetro SPEX Fluorolog3 Modelo FL3-22. O procedimento seguido o descrito por Vollenweider (1974) [45]. A descrio deste procedimento encontra-se no Anexo VII, sendo o protocolo para a obteno da recta de calibrao do espectrofluormetro encontrado no Anexo VIII.
Fig. 8 Medio de fluorescncia por espectrofluorimetria com fibra ptica

onda ideal para a emisso de fluorescncia da molcula de clorofila a, sendo a sua presena confirmada pela

2.6.2 Caracterizao Colorimtrica A colorimetria uma tcnica de caracterizao bastante til na medida em que permite uma leitura rigorosa e
quantitativa dos parmetros colorimtricos que definem a cor do substrato. A determinao dos parmetros colorimtricos antes e aps a aplicao de um tratamento permitiu avaliar a eficcia do tratamento. Os tratamentos

15

tero sido eficazes se os parmetros colorimtricos analisados aps o tratamento se aproximarem o mais possvel aos exibidos para as coloraes originais das superfcies. Para a caracterizao colorimtrica, foi utilizado um espectrofotmetro porttil Minolta Spectrophotometer CM508i. O modelo colorimtrico usado neste trabalho foi o modelo CIELAB que constitudo por trs parmetros, a luminosidade L* e duas coordenadas cromticas, a* (componente vermelho - verde) e b* (componente amarelo azul). Utilizou-se o iluminante D65, que reproduz artificialmente a luz de dia, com um ngulo de observao de 10. Foram realizadas trs medies colorimtricas antes e aps a aplicao dos tratamentos, in situ, no Palcio Nacional da Pena.

3.Resultados e Discusso
3.1Identificao da comunidade biolgica presente nas paredes do Palcio da Pena
A identificao da comunidade biolgica, presente nas paredes do Palcio da Pena, por mtodos de biologia molecular encontra-se no Anexo IX. Aps a consulta destes dados verifica-se que os mtodos de biologia molecular permitiram identificar a alga verde Trentepohlia sp no Ptio dos Arcos. Esta identificao est de acordo com o observado macroscopicamente no Ptio dos Arcos, pois a alga Trentepohlia sp ocorre frequentemente associada a lquenes, organismos bastante abundantes nesta parede. No Terrao D. Carlos apenas se identificou a presena de Chlorophytas, no sendo possvel determinar qual o gnero. Relativamente s cianobactrias identificadas, observou-se uma maior biodiversidade destes microrganismos no Terrao D. Carlos do que no Ptio dos Arcos. No Terrao D. Carlos foi possvel identificar a cianobactria Nostoc puctioforme que tem a capacidade de fixar azoto directamente do ar. Na identificao de fungos e bactrias verifica-se uma maior biodiversidade destes microrganismos nas paredes do Ptio dos Arcos do que no Terrao D. Carlos. No Terrao D. Carlos identificaram-se apenas fungos do gnero Caloplaca e Xanthoria e a bactria Hymenobacter. Por fim, pode-se concluir que a comunidade biolgica mais diversificada e abundante nas paredes do Ptio dos Arcos do que no Terrao D. Carlos. Isto acontece porque o microclima das paredes do Ptio dos Arcos apresenta condies mais favorveis para o desenvolvimento biolgico, uma vez que esta zona se encontrara sombra, sem radiao solar directa, o que facilita a reteno de gua e humidade, factor limitante e fundamental para o desenvolvimento microbiano. No Terrao D. Carlos foi possvel identificar apenas uma maior biodiversidade de cianobactrias, microrganismos mais resistentes a ambientes mais inspitos.

3.2 Caracterizao do TiO2 (P25 Degussa) puro e dopado com Fe+3

3.2.1 Espectroscopia de Raman
As nanopartculas de TiO2 (P25 da Degussa) foram analisadas e aplicadas sem qualquer modificao superficial ou pr-tratamento. Este composto caracterizado como um p branco de elevada pureza cristalina (99,5 %). De modo a garantir que a aplicao dos tratamentos com TiO2 estava a ser realizada com a fase cristalina de maior aco fotocataltica, ou seja, com a anatase, efectuaram-se anlises por Espectroscopia de Raman ao p de TiO2 (P25- Degussa) puro, e dopado com Fe+3. A Fig 9 apresenta o espectro de Raman recolhido para as amostras de TiO2 (P25-Degussa) dopado e no dopado. Os trs picos presentes na regio dos 400-650 cm-1 so caractersticos para as estruturas cristalinas OTi-O, quer da anatase, quer do rtilo. Contudo, para a anatase existem tipicamente cinco picos activos por anlise de Raman: 144 cm 197 cm ; 397 cm ; 518 cm ; 640 cm , derivados da estrutura tetragonal (3Eg + 2B1-g + 1A2g). Todos estes cinco picos so visveis na Fig 9, confirmando a presena da anatase, quer nas amostras dopadas com Fe , quer nas amostras no dopadas. Nas amostras de TiO2 dopadas com Fe
+3 +3 -1; -1 -1 -1 -1

no so encontrados

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nenhuns picos (para alm da anatase) relacionados com compostos de ferro. Tal pode dever-se pequena quantidade adicionada do agente dopante, conduzindo elevada disperso deste na amostra ou eficaz substituio intersticial do Fe conseguido.
+3

na estrutura cristalina do TiO2, comprovando que o mtodo de dopagem foi bem

Fig. 9- Espectro de Raman do TiO2 P25 da Degussa dopado e no dopado, correspondendo anatase

3.2.2 Microscopia electrnica de varrimento (SEM)

A Slica (SiO2) um substrato inorgnico eficiente para a imobilizao da anatase. Este facto deve-se s maiores reas superficiais a grande capacidade de absoro do TiO2 por parte da slica (SiO2) [18]. A Fig 10 apresenta a microestrutura obtida por SEM de uma partcula de quartzo da areia da AQz com TiO2 imobilizado, onde se observa a presena de um fino e homogneo filme de TiO2 na superfcie do gro de areia. A anlise elementar por EDX, por seu lado confirma a presena de Ti.

Tabela 3 - Composio Elementar obtida por EDX

Elemento Ti Al Fe Si

Wt% 2.73 9.03 6.57 81.67

Fig. 10 Imagem obtida por SEM das partculas de quartzo com TiO2

A caracterizao micro-estrutural do processo de dopagem do TiO2 com Fe+3 (0,5 wt%) foi tambm realizada atravs de SEM, Na Fig. 11 possvel observar-se a presena de agregados, correspondentes presena de xidos mistos de Fe-TiO2. A anlise por EDX permitiu determinar e quantificar a composio elementar da amostra de TiO2 dopada (Tabela 4), confirmando que o processo de dopagem foi bem sucedido.

17

Tabela 4 - Composio Elementar obtida por EDX

Elemento Ti Fe

Wt% 76.37 23.63

Fig 11 Imagem obtida por SEM de uma amostra de TiO2 dopado com Fe.

3.2.3 Caracterizao das propriedades pticas dos filmes de TiO2, puros e dopados com Fe.
Aps o processo de dopagem do TiO2 com a soluo de nitrato de ferro, a cor do p muda de branco para amarelo claro. A alterao de cor verificada no espectro B da Fig 12, j que a absoro do filme TiO2-Fe se estende mais para a zona dos VIS, quando comparado com o filme de TiO2 no dopado. A mudana espectral da absoro do filme de TiO2-Fe estreita a band gap da estrutura electrnica do TiO2, o que faz aumentar a sua actividade fotocataltica para a gama espectral da luz visvel (400-700 nm).

Fig. 12 Espectroscopia UV-VIS dos filmes de TiO2 (P25-Degussa) puro e dopado (Fe+3). A) Medies de Reflectncia difusa; B) Medies de Absoro

A mudana de absoro dos filmes de TiO2-Fe para a zona do visvel, adoptando uma colorao amarelada, deve-se, por um lado, s transies d-d do catio trivalente do Fe (2T2g 2A processos de transferncias de carga entre os caties de Fe (Fe
+3 2g, +2 2

T1g) ou, por outro lado, a

+ Fe

+3

Fe

+4

+ Fe ) [46].

Segundo Asilturk et al [47], a banda gap (Egap) do novo composto TiO2-Fe pode ser estimada graficamente (h2 vs h, sendo o coeficiente de absoro), sendo que, para concentraes molares de 0,5%, (como as utilizadas neste processo de dopagem) a nova band gap, ter valores entre: 2,97 eV > Egap > 2, 88 eV.

3.3 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados em laboratrio

A avaliao da eficcia dos trs tipos de tratamentos aplicados em laboratrio foi realizada atravs de tcnicas de quantificao da clorofila a (por espectrofluorimteria com fibra ptica e pelo mtodo de extraco)

3.3.1 Quantificao da clorofila a, in vivo, determinada por espectrofluorimetria com fibra ptica
Fluorescncia inicial das amostras, antes da inoculao

18

De modo a garantir que no havia presena de clorofila antes da inoculao dos provetes, analisou-se a fluorescncia inicial da superfcie das argamassas, atravs do uso da fibra ptica.

Fig. 13 - Espectro de emisso de fluorescncia mdia dos provetes, antes da inoculao

A Fig 13 apresenta a fluorescncia mdia dos diferentes materiais de construo antes da inoculao. Como se pode verificar, no existe qualquer pico de emisso de fluorescncia na gama espectral entre os 650-700 nm, (gama espectral de emisso da molcula de clorofila), indicando a ausncia de microrganismos fotossintticos. Fluorescncia das amostras aps a inoculao Aps a inoculao, mediu-se novamente a fluorescncia dos provetes de modo a verificar a presena de clorofila a.

Fig. 14 Espectro de Fluorescncia aps a inoculao dos provetes.

A Fig 14 apresenta os espectros de emisso de fluorescncia dos materiais, logo aps a inoculao. Verificase, em ambas as argamassas, a presena de um pico de emisso entre os 650-700 nm, que corresponde presena da molcula de clorofila a. A presena deste pico prova que a inoculao foi bem sucedida. A Tabela 5, contm a gama de valores de intensidade a 683 nm dos diferentes materiais, antes e aps a inoculao.
Tabela 5 - Gama de intensidades mdias de fluorescncias dos materiais, a 683 nm

Material Argamassa de areia de Corroios (AC) Argamassa de areia de Quartzo (AQz)

Gama de intensidade mdia, antes da inoculao (683 nm) 7,2 x 104 1,1 x 105 9,5 x 104 1,0 x 105

Gama de intensidade mdia, aps a inoculao (683 nm) 5,4 x 105 5,5 x 105 1,6 x 105 - 4,2 x 105

19

Aps a observao da Tabela 5, verifica-se que a AQz apresenta valores de emisso de fluorescncia, aps inoculao, menores que a AC. Este facto deve-se provavelmente diferena de porosidades das duas argamassas. A observao dos registos fotogrficos efectuados logo aps a inoculao permitiu verificar as diferenas nas propriedades hdricas dos materiais (Anexo V). Quando foi efectuada a inoculao na AQz, as culturas lquidas foram absorvidas para o interior do provete (Anexo V, Fig 1). Na AC, observa-se a mistura das culturas sobre a superfcie do provete, sendo apenas parcialmente absorvida pelo material (Anexo V, Fig 2), confirmando uma menor porosidade desta argamassa. A diferena de porosidade entre as argamassas pode dever-se sobretudo diferente forma e dimenso dos agregados, j que a proporo volumtrica e os ligantes usados so iguais em ambas as argamassas. Segundo [51], a utilizao de agregados de forma arredondada (semelhante forma do agregado de AQz) (Anexo III) pode levar formao de poros de grandes dimenses, contrariamente utilizao de agregados de forma angulosa, semelhantes aos de AC (Anexo III). Tambm a utilizao de agregados mais finos (semelhantes aos de AQz) influenciam uma maior porosidade das argamassas, pois conseguem comportar uma maior quantidade de gua, que, por sua vez, faz aumentar a retraco durante o processo de secagem, conduzindo a uma maior formao de fissuras. Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico presente nos provetes Logo aps o primeiro ms de incubao, comeou a verificar-se a presena de uma fina e heterognea camada de biofilme verde na superfcie dos provetes sem tratamento aplicado. Nos provetes de AQz verificou-se igualmente, aps o primeiro ms, uma colonizao biolgica mais desenvolvida do que nos provetes de AC. O registo fotogrfico dos provetes durante o perodo de incubao apresentado no Anexo X. Fluorescncia das amostras aps o perodo de incubao Aps 4 meses de incubao, realizaram-se novamente medies de fluorescncia nos provetes. Os grficos seguintes dizem respeito s medies mdias de fluorescncia por espectrofluorimetria com fibra ptica, obtidas aps o perodo de incubao para as amostras sem tratamento, para as amostras com TiO2 e para as amostras aps a aplicao dos biocidas Biotin T e Anios D.D.S.H. Note-se que a fluorescncia mdia obtida aps a inoculao tambm se encontra traada nos grficos de modo a verificar a morte ou o crescimento dos microrganismos e, consequentemente, a eficcia dos tratamentos. Uma tabela com as gamas de intensidades de fluorescncia, obtidas a 683 nm, durante o perodo de incubao encontra-se no Anexo XI. Os grficos de emisso de fluorescncia, determinado por espectrofluorimetria com fibra ptica, durante o perodo de incubao para os diferentes tratamentos encontram-se no Anexo XII.

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Fig. 15 Espectro de emisso de fluorescncia (mdio) para os provetes de AC, aps o perodo de incubao

Fig 16 Espectro de emisso de fluorescncia para os provetes de AQz, aps o perodo de incubao

3.3.2- Quantificao da clorofila a, determinada pelo mtodo de extraco

A clorofila foi extrada utilizando DMSO como solvente. Aps o processo de filtragem e centrifugao, a quantificao foi feita por espectrofluorimetria. Atravs da calibrao do espectrofluormetro, efectuada anteriormente (Anexo VIII), foi possvel quantificar (l) a quantidade de clorofila a inicial (aps inoculao) e a clorofila a presente nos provetes aps 4 meses de incubao (Anexo XIII). As figuras 17 e 18 apresentam a quantidade de clorofila a (g/cm ) presente nos provetes de AC e AQz, aps inoculao e aps 4 meses de incubao.
3

21

Fig 17 Quantidade de clorofila a (g) presente nos provetes de AC, logo aps inoculao e aps 4 meses de incubao

Fig 18 Quantidade de clorofila a (g) presente nos provetes de AQz, aps inoculao e aps 4 meses de incubao

Discusso e avaliao dos tratamentos em laboratrio As tcnicas de quantificao da clorofila a permitiram avaliar a eficcia dos tratamentos aplicados, sendo que, tanto a espectrofluorimetria com fibra ptica como o mtodo de extraco apresentaram a mesma coerncia nos resultados (Tabela 6). Contudo, os resultados obtidos no mtodo de extraco, so mais rigorosos, j que esta tcnica permite determinar o crescimento biolgico que se desenvolveu no interior dos provetes, permitindo uma quantificao da clorofila a em todo o volume da amostra. Ao analisar as Figuras 17 e 18 verifica-se, aps 4 meses de incubao, que os provetes de AC apresentam uma quantidade de clorofila a significativamente menor (0,04 g) do que os provetes de AQz (0,15 g), facto que no se apresenta to explcito nas anlises por espectrofluorimetria por fibra ptica (Fig 15 e 16). Assim salienta-se a importncia do mtodo de extraco para a quantificao mais rigorosa da clorofila em toda a amostra, possibilitando verificar a existncia de crescimento endoltico nos provetes de AQz.

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Tabela 6 Valores de fluorescncia e quantificao da clorofila a para as duas argamassas, aps inoculao e aps 4 meses de incubao

Espectrofluorimetria por fibra ptica

Sem tratamento Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 2 semanas Aps Inoculao Aps 2 semanas

Mtodo de Extraco (g Chla/ cm ) 8,9 x 10 -2 3,7 x 10 1,2 x 10 5,0 x 10

-4 -5 3

5,6 x 10 6 5,5 x 10 5,5 x 10 7,7 x 10 5,6 x 10

5 4 5

TiO2 misturado TiO2-Fe Anios Biotin

1,2 x 10-4
-5

6,4 x 105 5,6 x 10 1,9 x 105 5,6 x 10

5 4 5

2,6 x 10-3 8,9x10-5 1,2 x 10-2 8,9 x 10

-5 -5

7,5 x 10 Espectrofluorimetria por fibra ptica

6,2 x 10 Mtodo de Extraco (g Chla / cm3) 6,9 x 10

-5

Sem tratamento

Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 4 meses Aps Inoculao Aps 2 semanas Aps Inoculao Aps 2 semanas

2,6 x 10

5,8 x 106 8,5 x 105 9,0x 10

4

1,5 x 10-1 1,6 x 10-4 1,2 x 10 3,9 x 10 1,1 x 10

-4

TiO2 misturado TiO2 imobilizado TiO2-Fe Anios Biotin

3,7 x 105 6,0 x 10 4,7 x 10

5

2,6 x 10-4
-2

5,5 x 105
5

1,1 x 10-4
-2

2,6 x 105 1,1 x 106 2,6 x 10

5

6,9 x 10-5 2,5 x 10-2 6,9 x 10

-5

1,1 x 105

3,4 x 10-3

Em ambas as argamassas sem tratamento verifica-se, aps quatro meses de incubao, um crescimento biolgico significativo, com valores de intensidade de fluorescncia com uma ordem de grandeza acima dos valores de fluorescncia obtidos logo aps inoculao e valores de quantidade de clorofila a (g/ cm3) com trs a quatro ordens de grandeza acima da quantidade determinada aps inoculao. Relativamente eficcia dos tratamentos, atravs da observao das Fig.17 e 18 conclui-se que todos os tratamentos foram eficazes, j que todos os provetes tratados apresentavam um quantidade de clorofila a significativamente menor, que os provetes sem tratamento aplicado (Tabela 6). Contudo, os melhores resultados foram obtidos nos provetes tratados com TiO2 misturado e com o biocida Biotin T. Verifica-se assim que no tratamento com TiO2, a metodologia de aplicao mais eficaz a aplicao do TiO2 atravs da mistura com os restantes componentes das argamassas (TiOmisturado), tendo-se verificado resultados bastantes satisfatrios, quer para os provetes de AC, quer para os provetes de AQz. Os valores de intensidade de fluorescncia obtidos por espectrofluorimetria de fibra ptica nos provetes com TiO2misturado so semelhantes aos exibidos pelos provetes antes da inoculao, provando que superficialmente os processos redox estabelecidos por este fotocatalisador com as molculas do meio ambiente foram eficazes na gerao de radicais hidroxilo reactivos

23

responsveis pela degradao da matria orgnica, pois verifica-se a morte das culturas inoculadas (Fig 2 e 8 do Anexo XII). Analisando os resultados obtidos pelo mtodo de extraco, aps o perodo de incubao, verifica-se uma diferena significativa na quantidade de clorofila presente nos provetes com TiO2misturado e nos provetes sem tratamento (Tabela 6). Tambm se verifica que a quantidade de clorofila presente nos provetes com TiO2misturado aps o perodo de incubao menor que a determinada logo aps inoculao, provando a eficcia deste fotocatalisador na degradao e mineralizao da matria orgnica (Tabela 6) O mtodo de dopagem do TiO2 com o Fe
+3

foi bem conseguido, contudo os resultados obtidos aps o perodo

de incubao so menos satisfatrios, quando comparados com o TiO2misturado. No processo da dopagem metlica do TiO2 fundamental manter a integridade electrnica na estrutura cristalina do semicondutor, ou seja, fundamental que as alteraes electrnicas produzidas pela adio do Fe caties, facilitada devido semelhana dos raios inicos Ti
4+ +3

na estrutura cristalina do TiO2 sejam

+3

favorveis, garantindo uma razo espacial correcta entre caties e anies. A substituio intersticial entre os (0,75 ) e Fe (0,79 ). Contudo, atravs da anlise das Fig 17 e 18 verifica-se que o TiO2-Fe no foi totalmente eficaz na degradao da matria orgnica, pois durante o perodo de incubao houve crescimento biolgico nestes provetes (Tabela 6). Tal poder dever-se a uma adio excessiva de Fe na matriz cristalina da anatase, conduzindo formao de agregados de hematite (Fe2O3) e/ou xidos de ferro e titnio mistos (Fe2TiO5) apenas na superfcie do TiO2, diminuindo assim a sua aco fotocatalitica [47]. Para alm disso, vrios autores referem a possibilidade de o catio metlico poder funcionar como um centro de recombinao dos pares e /h , no possibilitando a separao de cargas, e, consequentemente o processo de degradao da matria orgnica. Apesar de a aplicao do TiO2-Fe no ter sido muito eficaz na degradao da matria orgnica, pode afirmarse que este composto foi eficaz na preveno de um crescimento biolgico mais desenvolvido, j que a quantificao da clorofila nestes provetes apresenta unidades de grandeza, de uma ordem abaixo, aos exibidos pelos provetes sem qualquer tratamento aplicado (Tabela 6). A metodologia de aplicao do TiO2 atravs da imobilizao nas partculas de areia de quartzo (TiO2imobilizado) apresenta os resultados menos satisfatrios. Na Fig 18 possvel verificar que os provetes de AQz com este tratamento apresentam maiores quantidades de clorofila do que para qualquer outro tratamento aplicado. Tal pode dever-se pouca eficcia do processo de imobilizao, j que, por anlise elementar EDX, se verifica uma quantidade muito pequena de Ti na superfcie dos gros de quartzo da areia (Tabela 3). A quantidade esperada era muito maior, dado que o mtodo de imobilizao compreendia a imobilizao do TiO2 na superfcie especfica total da partcula de areia. Contudo, nos casos em que foi feita a aplicao do TiO2 por esta metodologia, as amostras apresentam valores de clorofila a menores do que nos provetes sem qualquer tratamento aplicado, comprovando, apesar de tudo, alguma eficcia do tratamento. Relativamente aplicao dos produtos biocidas, verifica-se para ambas as argamassas, uma maior eficcia na eliminao dos microrganismos para o tratamento com Biotin T. A aplicao do produto Anios D.D.S.H apresenta resultados muito pouco satisfatrios em ambas as tcnicas de quantificao de clorofila a, sendo desaconselhvel a sua aplicao como biocida em patrimnio cultural. Por ltimo, para uma fcil e simples compreenso da eficcia dos tratamentos testados apresenta-se de seguida um ndice de eficcia de tratamento (por ordem decrescente de eficcia). TiO2misturado > Biotin T > TiO2-Fe> Anios D.D.S.H > TiO2imobilizado O ndice apresentado referente aos valores obtidos para o mtodo de extraco.
+

24

3.4 Avaliao da eficcia dos tratamentos aplicados in situ em patrimnio cultural

3.4.1 Caracterizao colorimtrica
A caracterizao colorimtrica antes e aps a aplicao dos trs tratamentos permitiu avaliar a eficcia da aplicao directa dos produtos, em soluo, sobre as superfcies do Palcio Nacional da Pena. De modo a obter um registo comparativo e avaliar a eficcia dos tratamentos, as cores originais das paredes onde se realizaram os testes foram tambm caracterizadas, atravs de medies colorimtricas na mesma parede, mas em zonas que no se encontravam colonizadas biologicamente, representadas nos grficos seguintes como Referencia 1 e 2, respectivamente no Ptio dos Arcos e no Terrao D. Carlos Os dois primeiros grficos (Fig 19 e 20) apresentam os parmetros colorimtricos L* a* b* recolhidos para todos os trs tratamentos, no Ptio dos Arcos e no Terrao D. Carlos, respectivamente, aps 2 semanas de aplicao dos tratamentos. A anlise da eficcia dos tratamentos foi feita atravs da comparao entre os parmetros L*a*b* exibidos para cada tratamento e com a respectiva colorao original prpria da zona seleccionada, apresentada no grfico como Referencia 1 e 2. O ltimo grfico (Fig 21) diz respeito aos parmetros colorimtricos obtidos para o tratamento com TiO2 (por este ter sido mais eficaz), antes da aplicao e aps 2 semanas de aplicao e a respectiva comparao com a colorao original da zona seleccionada, Referncia 2. Os valores de L*a*b*, obtidos nas trs medies, para as duas paredes seleccionadas encontram-se presentes na Tabela 1 e 2 do Anexo XIV.

Fig. 19 Parmetros colorimtricos obtidos aps 2 semanas de aplicao dos tratamentos, no Ptio dos Arcos

Fig. 20 Parmetros colorimtricos obtidos aps 2 semanas de aplicao dos tratamentos, no Terrao D. Carlos

Como se verifica, em ambas as zonas seleccionadas (Fig 19 e 20), mas principalmente no Terrao D. Carlos (Fig 20), na aplicao do tratamento com TiO2, os parmetros colorimtricos, aps 2 semanas de aplicao aproximaram-se mais aos exibidos pela superfcie original da zona seleccionada (Referncia). No Ptio dos Arcos,

25

a aplicao do biocida convencional, Biotin T apresentou resultados satisfatrios, (Fig 19) enquanto que o biocida Anios D.D.S.H no revelou nenhuma alterao significativa dos parmetros L*a*b* antes e aps a aplicao do produto (Anexo XIV). Estes resultados esto de acordo com os resultados obtidos nos testes laboratoriais, tendo o biocida Biotin T sido muito mais eficaz na eliminao dos microrganismos do que o biocida Anios D.D.S.H.

Fig. 21 Parmetros colorimtricos obtidos antes da aplicao, aps 2 semanas de aplicao do TiO2 e para a colorao original das paredes do Terrao D. Carlos (Referncia 2).

Aps a anlise da Fig 21, verifica-se que a aplicao do tratamento com TiO2 fez com que o parmetro L* aumentasse (+6), traduzindo o ganho em luminosidade e brilho da superfcie, aps a aplicao do tratamento. O aumento da luminosidade deve-se sobretudo ao desaparecimento da matria orgnica, de tonalidade mais escura (bactrias e fungos), aproximando-se do valor de L* exibido pela colorao original da superfcie. O aumento do parmetro de croma a* (que varia de -60 verde, at +60, vermelho), aps a aplicao do tratamento, igualmente significativo e relaciona-se com a diminuio da tonalidade verde, correspondente eliminao de microrganismos fotossintticos, e o aumento da tonalidade rosa/avermelhada prpria da colorao original do reboco nesta zona. Relativamente ao parmetro b*, este diminui ligeiramente aps a aplicao do tratamento, no sendo contudo responsvel por nenhuma alterao cromtica significativa. O clculo da variao total de cor (E*), permitiu tambm analisar a eficcia dos tratamentos. A seguinte tabela apresenta os valores de E* para os diferentes tratamentos aplicados:
Tabela 7- Valores de E*, calculados a partir dos parmetros L*a*b*, antes e aps 2 semanas de aplicao dos

tratamentos nas diferentes zonas seleccionadas.

Local Ptio dos Arcos

Tratamento TiO2 Biotin T Anios D.D.S.H TiO2 Biotin T Anios D.D.S.H

E*=( L*)+( a*)+( b*) 12,19 7,76 5,08 7,78 5,42 3,70

Terrao D. Carlos

Como se pode observar nesta tabela, a maior variao de cor total, antes e aps a aplicao dos tratamentos, verificada para o tratamento com TiO2 em ambas as zonas seleccionadas, confirmando a eficcia deste tratamento. Pelo contrrio o tratamento com o biocida Anios D.D.S.H foi o menos eficaz, demonstrando uma menor alterao de cor. De acordo com os resultados da anlise de varincia ANOVA (p=0,05), os parmetros L* e a* so significativamente diferentes (p<0,05), antes e aps a aplicao do tratamento com TiO2 (Anexo XV). Esta

26

diferena significativa dos parmetros L* e a* verifica-se apenas para o tratamento com TiO2 em ambas as zonas seleccionadas. Desta forma pode concluir-se que o tratamento com TiO2 foi eficaz, sendo o produto qumico que maior variabilidade apresentou, antes e aps a aplicao dos tratamentos (Anexo XV), e maior proximidade com a colorao original das superfcies seleccionadas exibiu. O registo fotogrfico das reas onde foram aplicados estes tratamentos, antes e aps a sua aplicao, encontra-se no Anexo XVI.

4. Concluses
Ambas as tcnicas de quantificao da clorofila a (espectrofluorimetria com fibra ptica e mtodo de extraco) permitiram avaliar a eficcia dos tratamentos aplicados em laboratrio. Nos testes realizados in situ no Palcio Nacional da Pena, conclui-se que as medies colorimtricas, segundo o modelo CIELAB so eficazes na avaliao e comparao dos diferentes tratamentos. Aps a avaliao dos resultados obtidos quer em laboratrio, quer in situ, conclui-se que a aplicao do TiO2 a materiais de construo constitui um tratamento eficaz na preveno e/ou eliminao da biodeteriorao. Em laboratrio, a metodologia de aplicao do TiO2 atravs da adio deste fotocatalisador aos restantes componentes de fabrico das argamassas (TiO2misturado), foi a metodologia mais eficaz na eliminao dos microrganismos presentes nos provetes. Atravs das tcnicas de quantificao da clorofila a, verificou-se a eliminao das culturas inoculadas, comprovando a aco fotocataltica deste composto. Devido aos resultados controversos obtidos para o tratamento de TiO2 dopado com Fe+3, de esperar que as investigaes cientficas relativas aos mtodos de dopagem com caties metlicos prossigam at se encontrar um mtodo eficaz para a utilizao eficaz do TiO2 radiao da luz visvel. Relativamente aos produtos biocidas, quer nos testes laboratoriais, quer nos testes in situ, o produto Biotin T foi muito mais eficaz, na eliminao da colonizao biolgica presente, do que o produto Anios D.D.S.H. Conclui-se assim que o TiO2 apresenta resultados mais satisfatrios na preveno e/ou eliminao da biodeteriorao dos materiais que os produtos biocidas testados. Os resultados obtidos neste trabalho apresentam uma abordagem inovadora para o controlo da biodeteriorao em materiais de construo, na medida em que se pode agora comear a apostar em materiais inteligentes, autosustentveis e compatveis com o meio ambiente. Para alm dos benefcios anteriormente referidos, a aplicao de fotocatalisadores a/em materiais de construo, poupar tempo e dinheiro gasto em operaes de limpeza e manuteno dos revestimentos exteriores, uma vez que se trata de tratamentos preventivos e de baixo custo. Apesar dos estudos ainda necessrios para desenvolver aplicaes durveis e eficientes, o potencial da nanocincia aplicada conservao do patrimnio cultural assume-se como um compromisso tecnolgico promissor e industrialmente exequvel.

5-Perspectivas Futuras
Para o cumprimento de vrias exigncias requeridas, necessrio que as argamassas apresentem caractersticas e propriedades adequadas. Assim, para completar esse estudo ser necessrio investigar o comportamento fsico e mecnico destas argamassas incorporadas com TiO2 na sua composio. Dependendo da funo que a argamassa ir desempenhar e do local onde vai ser aplicada, fundamental o estudo pormenorizado deste tipo de argamassas, para que se estabeleam as exigncias requeridas para a sua aplicao. A aplicao do TiO2 em argamassas de diferentes composies e distribuies volumtricas permitir avaliar a influncia deste composto no comportamento das argamassas. O estudo de novos processos de incorporao do TiO2 puro ou dopado, a outros materiais de construo, tais como o beto e pedra artificial e natural durante um perodo de tempo considervel (de modo a determinar a durabilidade e necessidade de reaplicao do tratamento), assume-se tambm como uma perspectiva futura de continuao desta investigao.

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6-Bibliografia
[1]. Kurth, J. C., Mitigating biofilm growth through the modification of concrete design and practice MD, Georgia

Institute of Technology, 2008. [2]. Miller, A. Z., Laiz, L., Gonzalez, J. M., Dionsio, A., Macedo, M. F., Saiz-Jimenez, C., Reproducing stone monuments photosynthetic-based colonization under laboratory conditions Science of the total environment 405 (2008) 278-285. [3]. Tomaselli. L., Lamenti, G., Tiano, P., Bosco, M. Biodiverity of photosynthetic micro-organisms dwelling on stone monuments International Biodeterioration and Biodegradation 46 (2000) 251-258 [4]. Gaylarde, C., Gaylarde, P. M., A comparative study of the major microbial biomass of biofilms on exteriors of buildings in Europe and Latin America International Biodeterioration and Biodegradation 55 (2005) 131-139. [5]. Miller, A., Dionsio, A., Macedo, M. F., Primary bioreceptivity: A comparative study of different Portuguese lithotypes International Biodeterioration & Biodegradation, 57 (2006) 136-142. [6].Nuhoglu,Y., Oguz, E., Uslu, H., Ozbek, A., Ipekoglu, B., Ocak, I., Hasenkoglu, I. The aceelerating effects of the microorganisms on biodeterioration of stone monuments under air pollution and continental-cold climatic conditions in Erzurum, Turkey Science of the total environment (2005) [7]. Caneva, G.; Nugari, M. P., Biology in the conservation of Works of art, ICCROM, Roma (1991). [8] Paulus, W., (ed), Directory of Microbicides for the protection of materials, Springer, Dordrecht (2005). [9]. Gaylarde, C., Ribas Silva, M.,Warscheid, Th., Microbial impact on building materials: an overview Materials and Structures 36 (2003) 342-352. [10]. Herrera, L. K., Videla, H. A., The importance of atmospheric effects on biodeterioration of cultural heritage constructional materials International Biodeterioration & Biodegradation 54 (2004) 125-134 [11]. Saiz-Jimenez, C. Biogeochemistry of Weathering Processes in Monuments. Geomicrobiol J 16 (1999) 27-37. [12]. Crispim, C. A., Gaylarde, C. C. Cyanobacteria Biodeterioration of Cultural heritage : a review. Microbial Ecology 49 (2005) 1-9. [13]. Ortega, J, Arino, X., Hernandez, M., Saiz-Jimenez, C., Factores affecting the weathering and colonization of monuments by phototrophic microorganisms Science Total Environment 167 (1995) 329-341. [14]. Caneva, G., Di Stefano, D., Giampaolo, C., Ricci, S., (2004) Stone Cavity and Porosity as a limiting factor for biological colonisation: The travertine of lungotevere (Rome); Proceedings of the 10 Deterioration and Conservation of stone, Stockholm, 2004 [15]. Bartolini, M., Ricci, S., Del Signore, G., Release of photosynthetic pigments form epilithic biocenosis after biocide treatments Proceedings of the 10 International Congress on Deterioration and Conservation of Stone; 27 June- 2 July 2004; Stockholm ICOMOS; p 519-526. [16] Pereza Zurita, Y., Cultrone, G., Snchez Castillo, P., Sebastin, E., Bolvar F. C., Microalgae associated with deteriorated stonework of the fountain of Bibataun in Granada, Spain International Biodeterioration and Biodegradation 55 (2005) 55-61. [17]. Tiano, P., Biodeterioration of Cultural Heritage Sci Tech Cult Herit 7 (1998) 19-38. [18]. Caneva, G.; Nugari, M.P.; Pinna, D.; Salvadori, O. (1996) Il Controllo del degrado biolgico i biocidi nel restauro dei materiali lapidei. Nardini Editore: Fiesole [19]. Nugari, M. P.; SaIvadori, O., Biodeterioration control of cultural heritage: Methods and products, Swets & Zeitlinger, Lisse (2003)
th th

Int. Congress on

28

[20]. Ascaso, C., Wierzchos, J., Souza-Egipsy, V., De los Rios, A., Rodrigues, J. D., In situ evaluation of the biodeteriorating action of microrganisms and the effects of biocides on carbonate rock of the Jernimos Monastery (Lisbon) International Biodeterioration and Biodegradation 49 (2002) 1-12. [21]. Kumar, R & A, Biodeterioration of stone in Tropical Environments, Research in Conservation, The Getty Conservation Institute, USA (1999) [22]. Blazquez, A. B., Lorenzo, J., Flores, M., Gmez-Alarcn, G., Evaluation of the effect of some biocides against organisms isolated from historic monuments, Aerobiologia 16 (2000) 423-428. [23]. Russel, A. D, and Chopra, I. 1990 Understanding antibacterial action and resistance. Horwood Ltd. Chichester. [24]. Kelerher, J., Bashant, J., Heldt, N., Johnson, L., Li, Y.,Photo-catalytic preparation of silver-coated TiO2 particles for antibacterial applications, Journal of Microbiology & Biotechnology 18 (2002) 133-139 [25]. Fu, G., Vary, P. S., Lin, C., Anatase TiO2 Nanocomposites for Antimicrobial Coatings, Journal Phys. Chem B 109 (2005) 8889-8898. [26]. Chen, X., Synthesis and investigation of novel materials for improved photocatalysis, PhD Dissertation, Case Western Reserve University (2005). [27]. Fujishima, A., Honda, K., Electrochemical photolysis of water at semiconductor electrode Nature 238 (1972) 8-37. [28]. Beydoun, D., AMAL, R., LOW, G., MCEVOY, S., The role of nanoparticules on photocatalysis, Journal of Nanoparticule Research. (1999) 439-458. [29]. Sunada, K., Watanabe, T., Hashimoto, K., Bactericidal Activity of Copper Deposite TiO2 thin film under weak UV illumination Environmental Science Technology 37 (2003) 4785-4789. [30] Litter, M. I., Navo, J. A., Photocatalytic properties of iron-doped titania semiconductors Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 98 (1996) 171-181 [31]. K. QI,., X. Chen, Y. Liu, J. Xin, C. L. Mak, W. Journal of Materials Chemistry, 17 (2007) 3504-3508. [32]- Chen, J., Poon, C., Photocatalytic construction and building materials: From fundamentals to applications Building and Environment 44 (2009) 1899-1906. [33]. Yanfang, S., Xiong, T., Li, T., Yang, K., Tungsten and nitrogen co-doped TiO2 nanopowders with strong visible light response Applied Catalysis B: Environmental 83 (2008) 177-185. [34]- Claesson, S., Engstrom, L. (ed), Solar energy Photochemical conversion and storage, National Swedish board for Energy source development, Stockholm (1977). [35]- Kashif, N., Ouyang, F., Parameters effect on heterogeneous photocalysed degradation of phenol in aqueous dispersion of TiO2 Journal of Environmental Sciences 21 (2009) 527- 533 [36]. Carp, O., Huisman, C.L., Reller, A., Photoinduced reactivity of titanium dioxide Progress in Solid State Chemistry 32 (2004) 33-177. [37]. Zhang, X., Fujishima, A., Jin, M., Emeline, A. V., Murakami, T, Double-Layered TiO2-SiO2 Nanostructured films with self-cleaning and antireflective properties. Journal Phys. Chem B 110 (2006) 25142-25148. [38]. N. P. Mellott, C. Durucan, C. J. Pantano, M. Guglielmi, Thin solid films 50 (2006) 112-120. [39]. Romas, V., Pichat, P., Guillard, C., Chopin, T., Lehaut, C., Testing the efficacy and the potencial effect on indoor air quality of a transparent self-cleaning TiO2-coated glass through the degradation of a fluoranthene layer, Materials and Interfaces 38 (1999) 3878-3885. [40]. Diamanti, M. V., Brunella, M. F., Pedeferri, M. P., Pirotta, C., Manzocchi, P., Curtoni, S., Self-cleaning and antipolluting properties of TiO2-containing cementitious materials in Nanotech, May 2007.

29

[41]. Silva., S. Caracterizao de argamassas antigas - casos paradigmticos, in Cadernos edifcios 02Revestimentos de paredes em edifcios antigos. LNEC, Lisboa (2002). [42]. Haarstrick, A., Oemer, M., Heinzle, E and K., TiO2-Assisted Degradation of Environmentally Relevant Organic Compounds in Wasterwater Using a Nover Fluized Bed Photoreactor, Environ. Sci. Technol 30 (1996) 817-824. [43]. Nvio, J. A., Macias, M., Grcia-Gmez, M., Pradera, M.A., Functionalisation versus mineralisation of some N-heterocyclic compounds upon UV-illumination in the presence of un-doped and iron-doped TiO2 photocatalysts, Applied Cataysis B:Environmental 82 (2008) 225-232. [44]. Tomaselli. L., Lamenti, G., Tiano, P.,Chlorophyll fluorescence for evaluating biocide treatments against phototrophic biodeteriogens Ann Microbiol 52 (2002) 197-206. [45]. Vollenweider, R. A., A manual on methods for measuring primary production in aquatic environments, Blackwell Scientific Publications, Oxford (1974). [46]. Adn, C. Bahamonde, A., Frnandez, M., Martnez-Arias, A., Structure and activity of nanosized iron-doped anatase TiO2 catalysts for phenol photocatalytic degradation Appiled Catalysis B: Environmental 72 (2007)11-17. [47] Asilturk, M., Sayilkan, F., Arpa, E., Effect of Fe+3 dopping to TiO2 on the photocatalytic degradation of Malachite Green dye under UV and vis-irradiation, Journal of Photochemistry and Photobiology A: Chemistry 203 (2009) 64-71. [48]. Chuan, X., Hirano, M., Inagaki, M., Preparation and photocatalytic performance of anatase-mounted natural porous silica, pumice, by hydrolysis under hydrothermal conditions Applied Catal B: Environmental 51 (2004) 255260 [49]- Faria, P., Henriques, F.A., Rato, V.M., Argamassas Correntes: Influncia do Tipo de Ligante e do Agregado [50]- Veiga, R.M., As argamassas na Conservao in Actas das 1as Jornadas de Engenharia Civil da Universidade de Aveiro, LNEC, Lisboa 2003. [51]- Pereira, T. A. R., Optimizao das caractersticas de humedecimento e secagem de argamassas Dissertao de Mestrado, Faculdade de Cincias e Tecnologia Universidade Nova de Lisboa, Lisboa 2008.

30

Anexos
Anexo I Especificao tcnica dos produtos qumicos seleccionados
Produto Qumico: Dixido de Titnio, TiO2
Especificao: AEROXIDE TiO2 P25 da Degussa Corporation; Spec n 1261/1 Especificao tcnica Caractersticas fsico-qumicas rea especfica superficial (BET) Tamanho mdio de partcula Quantidade de TiO2 Quantidade de Al2O3 Quantidade de SiO2 Quantidade de Fe2O3 Quantidade de HCl % % % % % Unidades m /g nm > 99,50 < 0,300 < 0,200 <0,100 <0,300
2

Valores Tpicos 50 (35-65) 21

Produto Qumico: Biotin T

Especificao: Biotin T, C.T.S. Espaa - Productos y Equipos para la Restauracon Especificao tcnica Aspecto Densidade a 20C Viscosidade dinmica Ponto de solidificao Estabilidade Mistura Compatibilidade Lquido incolor a amarelo 0,94 g/ml 50mPa. s <-5C T (-5C/+80C) pH (5-9) Recomenda-se 2% em gua destilada Limitada com tensioactivos aninicos

Produto Qumico: Anios DDSH

Especificao: Anios DDSH- 1086000 Laboratories Anios Especificao tcnica Estado Fsico pH da substncia Densidade Hidrossolubilidade Ponto de inflamao Lquido Fluido neutro < 1 diluvel 41,5 1C

31

Anexo II Constituio e execuo dos provetes das argamassas

Para um entendimento mais simples da constituio de ambas as argamassas estudadas neste trabalho apresenta-se a seguinte tabela:
Tabela 1 Constituio das argamassas

Argamassa Tipo Sigla adoptada AC Bastardas de cal area hidratada e cimento AQz 12:4:1 Dosagem volumtrica 12:4:1

Composio Constituintes Areia de Corroios: cal area hidratada em p: cimento branco Areia siliciosa: cal area hidratada em p: cimento branco

Procedimento para a execuo das Argamassas Em primeiro lugar, executaram-se, em madeira, os moldes prismticos (4,5 x 4,5 x 2 cm) das argamassas. Para o fabrico das argamassas, a massa de todos os componentes foi determinada numa balana de laboratrio de modo a fazer a converso para traos volumtricos (apresentados na Tabela 1). Em seguida, a areia e os ligantes foram misturados a seco num recipiente metlico com uma colher de pedreiro, de modo a homogeneizar todos os componentes. O processo de mistura foi efectuado manualmente, com a colher de pedreiro, durante cerca de 2 minutos. Quando o processo de homogeneizao ficou concludo, adicionou-se gua e amassou-se a pasta at se obter um nvel de plasticidade considerado ideal. Por ltimo, foram preenchidos os moldes de madeira. Com a ajuda de uma pequena colher,compactaram-se as argamassas, alisando a superfcie e removendo os excessos Condies de cura das argamassas: O processo de cura muito importante para o desempenho das argamassas. Depois da moldagem dos provetes, estes foram acondicionados numa sala de ambiente controlado (T= 20 2C, HR=50 5%), durante 7 dias; depois, foram desmoldados e permaneceram a curar durante cerca de 50 dias.

32

Anexo III Caractersticas mineralgicas e propriedades fsicas dos materiais de construo seleccionados
Argamassas
1.1 Agregados Agregado- Ampliao 4x Descrio microscpica e principais caractersticas

A areia de Corroios/pinhal foi cedida pela empresa Grupo Soarvamil, com origem nas exploraes de Foros de Amora e Coina. Por anlise ao microscpio, observam-se partculas de areia gomada de gros subangulosos e subarredondados. Segundo as informaes tcnicas adquiridas pela empresa, os principais constituintes desta argamassa so: quartzo, quartzito, feldspato, xisto e Referncia: Areia Barreira 0/4 P. C Cunha 3 moscovite A areia de quartzo foi cedida pela empresa Areipor (Bucelas). Segundo as informaes tcnicas, este agregado bastante fino e predominantemente silicioso, contendo um teor de SiO2 > 96 %. As areias comercializadas pela firma so cuidadosamente lavadas. Por observao ao microscpio, verifica-se a presena de Referncia: Apas 20 1.2 Cal hidratada em p Ca(OH)2 M= 74,09 g/Mol partculas de areia no gomada, de gros arredondados de aparncia limpa e translcida

Riedel-de Haen 31219

Caractersticas Qumicas Cu 0,0005% Fe 0,05% Cl 0,005% SO4 0,05% Pb 0,0002% Zn 0,0005%

33

1.3- Cimento Cimento Branco de Portland (CEM II/ B-L 32,5 R (br) Caractersticas Qumicas Mtodo de Ensaio NP EN 196-2 NP EN 196-21

Propriedades Teor de Sulfatos (SO3) Teor de Cloretos

Valor Especificado <3,5% <0,10%

Resistncia aos primeiros dias 2 dias 7 dias 10 -

Caractersticas Mecnicas Resistncia Compresso Resistncia de referncia 28 dias > 32,5 e < 52,5

NP EN 196-1

Propriedades Princpio da Presa Expansibilidade

Caractersticas Fsicas Mtodo de Ensaio NP EN 196-3 NP EN 196-3

Valor Especificado 75 min < 10 min

Anexo IV - Clculos realizados para a aplicao dos tratamentos com TiO2

Imobilizao do TiO2 nas partculas de areia da argamassa siliciosa O procedimento para a imobilizao de TiO2 em partculas de areia foi anteriormente descrito na literatura cientfica [42], mas no foi, at agora feita qualquer referncia aplicao dessas partculas de areia no fabrico de argamassas. Clculos realizados De modo a imobilizar o TiO2 em toda a superfcie especfica da partcula de areia de quartzo realizaram-se os seguintes clculos: Dados da areia de quartzo: Raio de uma partcula de areia = 0,3 mm ; 3 x 105 nm Massa da areia (para 6 provetes) = 180 g Densidade da areia (quartzo) = 2,65 Volume de 1 partcula de areia =? Vesfera = 4/3 r3 5 3 Vparticula de areia = 4/3 (3 x 10 ) 17 Vparticula de areia = 1,13 x 10 nm3 Qual o volume total da areia (180 g)?

Vtotal= 68 cm3 = 6,8 x 1022 nm3 Qual o n total de partculas de areia? Vtotal das particulas/ Vparticula de areia: 6,8 x 1022 nm3 / 1,13 x 1017 nm3 = 6 x 105 partculas de areia Dados do TiO2 (P25 - anatase) Degussa

2,65 g 1 cm3 180g x

34

Tamanho mdio de partcula de TiO2= 21 nm Densidade da anatase = 3,8 Volume de TiO2 imobilizado na partcula de areia = ?

Vparticula areia=1,13 x 10 nm VTiO2 = ?

17

VrevestimentoTiO2 = v (TiO2+partcula de areia) v (partcula de areia)) VTiO2 = 4/3 ((300021)3 - (3 x 105)3) 13 VTiO2= 2,4 x 10

VTiO2 total? =

2,4 x 10

13

x (6 x 10 partculas de areia)= VTiO2 total = 1,42 x 1019 nm3

1,42 x 10

19

nm = 14, 2 mm

Qual a quantidade de TiO2 necessria para revestir 180 g de areia? 3,8 g 1000 mm x - 14, 2 mm3 x = 0,054 g = 54 mg de TiO2 Procedimento realizado Inicialmente adicionou-se 2-propanol areia de quartzo. Seguidamente juntou-se uma pequena quantidade de TiO2 e agitou-se a soluo. Aps filtragem da soluo deixou-se a areia a secar. No dia seguinte a areia foi aquecida a 400C durante 1 hora de modo a imobilizar o TiO2. Com a areia j revestida efectuaram-se as argamassas de areia de quartzo com TiO2imobilizado.
3

Dopagem metlica do TiO2

TiO2 P25 Degussa Fe(NO3)3.9H2O (Sigma-Aldrich) Clculos realizados: Para realizar o processo de dopagem do TiO2 com Fe TiO2 e a massa atmica do Fe Massa molar (Mm) TiO2 = 79,89 g/mol Massa atmica (ma) do Fe= 55,85 De modo a obter uma composio de Fe a 0,5wt% e TiO2 (99,5wt%) realizaram-se os seguintes clculos para determinar a massa molar (mm) do novo composto dopado (TiO2-Fe): 55,847 (ma Fe) x 0,005 =0,279 79,89 (mmTiO2) + 0,279 = 79,907 (mm TiO2-Fe)
+3

a 0,5 wt%, calculou-se inicialmente a massa molar do

35

Calculada a massa molar do composto TiO2-Fe com Fe a 0,5wt%, determinou-se a quantidade de Fe(NO3)3.9H2O necessria para o processo de dopagem: Mm (Fe(NO3)3.9H2O) = 403,9 g/mol %Fe = Ma (Fe) / Mm (Fe(NO3)3.9H2O) % Fe = 55,85 /403,9 = 13,82 % Para ter 0,5% de Fe: 13,82 % - 403 g 0,5 % - x gr Onde o valor de x= 14,616 / 100 = 0,14616 gr de Fe(NO3)3.9H2O para ter 79,907 g de TiO2-Fe Assim, para obter 15 g de TiO2-Fe (quantidade necessria para a realizao das argamassas): 79,907 g TiO2-Fe - 0,14616 g Fe(NO3)3.9H2O 15 g x g Fe(NO3)3.9H2O Onde o valor de x= 0,02744 g Fe(NO3)3.9H2O Procedimento Experimental O procedimento experimental realizado baseou-se nas indicaes descritas em [43]. Inicialmente impregnou-se o TiO2 (15 g) numa soluo aquosa de Fe(NO3)3.9H2O, que continha j a quantidade de Fe a 0,5 wt%. Esta soluo ficou a repousar durante 48 horas. Aps este perodo aqueceu-se a soluo a 110C, durante 12 horas de modo a evaporar toda a gua presente. O soluto obtido foi seguidamente aquecido a 500C durante 24h e posteriormente adicionado no fabrico das argamassas

36

Anexo V Registo Fotogrfico logo aps a inoculao dos provetes

Fig 1. Argamassa de areia de quartzo logo aps a inoculao

Fig 2. Argamassa de areia de Corroios, logo aps a inoculao

37

Anexo VI Espectros de emisso de fluorescncia da Rodamina, durante o perodo de incubao

Anexo VII Protocolo para a quantificao da clorofila a e feofitina a por espectrofluormetria

Materiais e reagentes necessrios: - martelo - pano de camura - frasco Schot - kitasatu - funil de filtrao (47 mm) - Copo de filtrao de solventes (usado em HPLC) - disco de filtrao - filtros Supelco (Nylon 66 membranes, 0,45 m x 47 mm) - mola e borracha de fixao do funil - pina - papel de alumnio - tubos de centrifuga (10 ml) - DMSO (dimetil sulfxido) - 1M HCl

38

Procedimento Experimental: 1. Fracturar o provete, envolvido num pano de camura, com um martelo at obter fragmentos pequenos (0,20-0,50 cm3). 2. Colocar os fragmentos em frascos Shot e adicionar DMSO (dependendo do peso do provete; aproximadamente 1 ml de DMSO por g de substrato) 3. Adicionar o mesmo volume de DMSO num frasco Schot (branco) 4. Incubar os frascos numa estufa a 65 durante 1 hora para eluir os pigmentos. 5. Filtrar a soluo contendo os pigmentos numa montagem de filtrao semelhante utilizada para solventes de HPLC. 6. Centrifugar o volume filtrado durante 10 m a 50 x100 rpm. 7. Efectuar leituras no espectrofluormetro a 670 nm da amostra branco, antes (Rb branco) e aps acidificao das solues (Ra branco), na clula de fluorescncia, com duas gotas de uma soluo concentrada HCl (1 M). 8. Efectuar leituras no espectrofluormetro a 670 nm, antes (Rb) e aps acidificao das amostras (Ra), na clula de fluorescncia, com duas gotas de uma soluo concentrada HCl (1 M). Frmula para o clculo da concentrao de clorofila a das amostras:

Chla (g/ml)= Fs*(/-1)*(Rb'-Ra')*(V1/V2)

em que: Rb'=Rb - Branco (Rb) (cps) Ra'= Ra-Branco (Ra) (cps) V1= Volume de extraco (ml)V2= Volume de amostra filtrado (ml) Chla= clorofila a Fs= factor de calibrao = razo de acidificao

Anexo XVIII - Protocolo para a obteno da recta de calibrao do Espectofluorimetro

O procedimento posteriormente descrito dever ser efectuado em condies de baixa ou nenhuma luminosidade. 1-Determinao da concentrao de Clorofila a (Chla) pura por espectrofotometria de absoro Soluo A Diluir 1 mg de Chla pura (extrada de folhas de espinafre) em 100 ml de DMSO: - Serrar a ampola de 1 mg de Chla pura - Colocar a chla pura num balo volumtrico de 100 ml com a ajuda de um funil - Lavar a ampola com DMSO e verter para o balo - Perfazer o volume do balo com DMSO - Homogeneizar a soluo A no banho de ultrassons (intensidade mxima) durante 2 minutos - Etiquetar e cobrir o balo com papel de alumnio Soluo B - 10 ml de soluo A em 100 ml de DMSO (isto , 1 g/ml) - Adicionar 10 ml da soluo A num balo volumtrico de 100 ml e perfazer at 100 ml com DMSO - Homogeneizar a soluo B no banho de ultrassons (intensidade mxima) durante 2 minutos - Etiquetar e cobrir o balo com papel de alumnio

39

2-Leitura da absoro das solues A e B no espectrofotmetro: - Adicionar DMSO numa clula de absoro (branco) - Adicionar Soluo A numa clula de absoro - Recolher o espectro entre 400 e 800 nm no espectrofotmetro - Anotar os valores de cps a 664 nm e 750 nm - Adicionar 2 gotas de HCl 5% clula com soluo A e obter o espectro aps acidificao - Anotar os valores a 665 e 750 nm - Repetir o mesmo procedimento para a soluo B Absoro a 664 nm 750 nm Calculo 664b (664- 750) Sol A Sol B Absoro a 665a nm 750a nm Calculo 665a (665a- 750) Sol A Sol B

3-Clculo da concentrao de clorofila a e feofitina a das solues A e B: Chla (g/ml) = 26.7 (664b - 665a) =_______________________________ Feo (g/ml) = 26.7 1.7 x (665a - 664b)=____________________________ 4 - Clculo da concentrao terica da soluo B (cv=cv): conc solA x vol solA (10 ml) = c (conc solB) x 100 5-Determinao da recta de calibrao no espectrofluormetro a. Preparao dos padres: i. 0.1 ml de sol. B em 10 ml de DMSO (padro 1) ii. 0,5 ml de sol. B em 10 ml de DMSO (padro 2) iii. 1 ml de sol. B em 10 ml de DMSO (padro 3) iv. 2 ml de sol. B em 10 ml de DMSO (padro 4) v. 3 ml de sol. B em 10 ml de DMSO (padro 5) vi. xii. 10 ml de sol. B (padro 12) xiii. 0 ml de sol.B e 10 ml de DMSO (padro 13) b. Etiquetar os bales volumtricos c. Homogeneizar as solues no banho de ultrassons durante 1 minuto d. Cobrir os bales volumtricos com papel de alumnio e etiquetar novamente e. Definir parmetros de medio do espectrofluormetro: f. Recolher o valor de emisso a 670 nm antes (Rb) e aps acidificao (Ra) para todos os padres. 6-Elaborao da recta de calibrao para Chla pura em funo da emisso de fluorescncia 6.1 Preencha a seguinte tabela:

40

Solues

Vol de Volume de Soluo B DMSO (ml) (ml)

Volume total (ml) VsolBxconcSolB /Vtotal

Concentrao terica (g/ml)

Rb

Rb - Branco (Rb)

Ra

Ra-Branco (Ra)

Branco Padro 1 Padro

10

10 10 10

6.2 Calculo do declive da recta (Fs) e da razo de acidificao (): Fs = declive da equao da recta de calibrao y = mx+b = Rb/Ra,

664b para a Chla pura = ________________________ 665a

/(-1)= _______________________________________

Recta de Calibrao obtida

Parmetros obtidos atravs da recta de calibrao Fs= 6E-0,9; =Rb/Ra; = (664b/665a) = 1,7; /(-1)=2.4

41

Anexo IX Identificao da comunidade biolgica presentes nas paredes do Palcio da Pena, por mtodos de biologia molecular
Taxa (n de acesso)* % de similitude Primer Algas Verdes
Trentepohlia sp. (DQ399592) Trentepohlia sp. (DQ399592) Trentepohlia sp. (DQ399592) Trentepohlia sp. (DQ399592) Cloropasto de Chlorophyta Chlorophyta Chlorophyta

Local

98 99 99 97 93 99 98

EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB 616F-1510R Cya 106F-Cya 781R Cya 106F-Cya 781R Cianobactrias

Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos

Cyanobacteria Cyanobacteria Cyanobacteria Cyanobacteria Nostoc punctiforme (DQ185258)

98 92 97 94 98

616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R Cya 106F-Cya 781R Cya 106F-Cya 781R Fungos

Ptio dos Arcos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos

Ascomycete (EU409872) Mycosphaerella strain (EU167605) Capnobotryella sp Ramichloridium strain (EU041798) Cercospora strain (AY840527) Ascomycete (EU409872) Zasmidium isolate (DQ681315)

97 98 99 97 99 96 96

EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB EukA-EukB

Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos

Xanthoria elegans/parietina (AF088254/AF241541) 97 Xanthoria elegans (AF088254) Caloplaca trachyphylla (DQ641412) Xanthoria parietina (AF241541) Xanthoria elegans (AF088254)

97 90 97 96

42

Bactrias
Bacterium (DQ532204) Bacterium (DQ532204) Bacterium (DQ532204) Sphingomonas sp. (FJ429181) Sphingomonadaceae endoltico (AB473921) Sphingomonadaceae (AM697066) Hymenobacter sp. (EU382214) Flexibacteraceae (EU155013) Bacterium (FJ790565) Hymenobacter (AF408296) Hymenobacter (AF408296)

93 93 94 94 94 97 96 95 93 94 96

616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R 616F-1510R

Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Ptio dos Arcos Terrao D. Carlos Terrao D. Carlos

*n de Acesso do homlgomo mais prximo do NCBI- data base

43

Anexo X Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico nos provetes durante o perodo de incubao
Tabela 1 Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico presente nos provetes de Argamassa de areia de quartzo (AQz) ao longo do perodo de incubao

Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico Tratamento Aps inoculao Aps 2 meses de incubao Aps 4 meses de incubao

Sem tratamento

TiO2misturado

TiO2imobilizado

44

TiO2 - Fe

Biocidas

Aps inoculao

Aps 4 meses de incubao

Aps 2 semanas de aplicao

Anios D.D.S.H

Biotin T

45

Tabela 2 Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico presente nos provetes de Argamassa de areia de Corrios (AC) ao longo do perodo de incubao

Tratamento Aps inoculao

Observao macroscpica do desenvolvimento biolgico Aps 2 meses de incubao Aps 4 meses de incubao

Sem tratamento

TiO2misturado

TiO2 - Fe

Biocidas

Aps inoculao

Aps 4 meses de incubao

Aps 2 semanas de aplicao

Anios D.D.S.H

46

Biotin T

Anexo XI Gama de Intensidades de fluorescncia mdia, obtidas a 683 nm, durante o perodo de incubao
Tabela 1 Gama de Intensidade de fluorescncia (mnima e mxima) mdias, obtida a 683 nm, durante o perodo de incubao, para os provetes de argamassa.

Material

Tratamento Aplicado

Antes da inoculao Gama de intensidade a 683 nm 7,2 x 10 - 1,1 x 10 7,7 x 104 - 9,2 x 104 6,7 x 10 - 7,8 x 10
4 4 4 5

Aps Inoculao Gama de Intensidade a 683 nm 5,4 x 10 - 5,5 x10

5 5

Aps 4 meses de incubao Gama de Intensidade a 683 nm 2,5 x 10 5,5 x 10

6 6

Aps 2 semanas de aplicao de Biotin Gama de Intensidade a 683 nm 7,0 x 10 7,7 x 10

4 4

Aps 2 semanas de aplicao de Anios Gama de Intensidade a 683 nm 9,1 x 10 2,7 x 10

4 5

Sem tratamento AC TiO2 TiO2-Fe Sem tratamento TiO2 AQz TiO2imb TiO2-Fe

4,6 x 105 - 6,5 x 105 5,4 x 10 - 6,2 x 10

5 5

6,6 x 104 8,7 x 104 8,2 x 10 1,2 x 10

4 6

9,5 x 104 1,0 x 105 1,1 x 10 - 1,2 x 10

5 5

1,6 x 105 4,2 x 105 6,0 x 10 - 1,0 x 10

5 6

3,3 x 106 5,8 x106 8,2 x 10 9,8 x 10

4 4

9,8 x 104 1,4 x 105

4,6 x 105 2,3 x 106

9,0 x 104 1,1 x 105 9,7 x 104 2,3 x 105

3,0 x 105 4,5 x 105 2,3 x 105 1,0 x 106

2,3 x 105 1,2 x 106 9,2 x 104 1,2 x 106

47

Anexo XII- Espectros de emisso de fluorescncia, por triplicado, durante o perodo de incubao

Argamassa de Areia de Quartzo (AQz)

Fig 1 Espectro de emisso de fluorescnica, por triplicado, para os provetes sem tratamento

Fig 2- Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AQz com TiO2

48

49

Fig 4 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes com AQz com TiO2-Fe

Fig 5 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes tratados com Anios D.D.S.H

50

Fig 6 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes tratados com Biotin T.

Argamassa de areia de Corroios

Fig 7 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AC sem tratamento

51

Fig 8 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AC com TiO2

Fig 9 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AC com TiO2-Fe

52

Fig 10 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AC tratados com Anios D.D.S.H

Fig 11 Espectro de emisso de fluorescncia, mdia por triplicado, para os provetes de AC tratados com Biotin T

53

Anexo XIII - Quantificao da clorofila a pelo mtodo de extraco aps inoculao e aps o perodo de incubao
Tabela 1 Quantificao da clorofila (g), mdia por triplicado, aps inoculao e aps perodo de incubao

Tratamento Aps Inoculao Sem tratamento 8,9 x 10-5

AC Aps perodo de incubao 3,7 x 10-2 Aps Inoculao 6,9 x 10-5

AQz Aps perodo de incubao 1,5 x 10-1

TiO2 misturado

1,2 x 10

-4

1,2 x 10

-4

1,6 x 10

-4

1,2 x 10

-4

TiO2 imobilizado

2,6 x 10

-4

3,9 x 10

-2

TiO2-Fe

5,0 x 10-5

2,6 x 10-3

1,1 x 10-4

1,1 x 10-2

Anios D.D.S.H

8,9 x 10-5

1,2 x 10-2

6,9 x 10-5

2,5 x 10-2

Biotin T

8,9 x 10-5

6,2 x 10-5

6,9 x 10-5

3,4 x 10-3

54

Anexo XIV Valores mdios de L*a*b* obtidos antes e aps a aplicao dos tratamentos, in situ, no Palcio da Pena
Tabela 1 Valores de L*a*b* obtidos para a colorao original e antes e aps a aplicao dos tratamentos da parede no Ptio dos Arcos

Ptio dos Arcos L* Colorao original a* b*

Parmetros colorimtricos 68,81 5,94 26,31 TiO2 66,31 5,32 26,58 70,01 5,09 27,75

Mdia 68,37 5,45 26,88

Antes da aplicao do tratamento

L* a* b*

40,47 0,42 20,44 50,62 4,11 18,07 Biotin T

38,55 1,60 22,44 49,86 3,28 15,56

39,41 0,13 25,88 49,44 4,71 19,39

39,48 0,72 22,92 49,97 4,03 17,67

Aps a aplicao do tratamento

L* a* b*

L* Antes da aplicao do tratamento a* b* L* a* b*

36,53 0,62 19,98 49,09 4,55 18,02

36,74 0,84 19,98 46,70 3,85 17,26

48,86 2.08 20,27 46,38 4,37 18,47

40,71 1,18 20,08 47,39 4,26 17,62

Aps a aplicao do tratamento

Anios D.D.S.H Antes da aplicao do tratamento L* a* b* Aps a aplicao do tratamento L* a* b* 39,99 0,94 22,66 32,68 3,08 18,33 38,77 1,48 25,14 36,69 2,11 17,87 32,78 1,46 23,53 40,39 2,71 20,56 37,18 1,29 23,78 36,59 2,63 18,92

55

Tabela 2 - Valores de L*a*b* obtidos para a colorao original e antes e aps a aplicao dos tratamentos no Terrao D. Carlos

Terrao D. Carlos L* Colorao original a* b*

Parmetros colorimtricos 49,12 25,15 15,14 TiO2 50,24 29,19 15,02 45,56 23,90 14,84

Mdia 48,31 26,08 15

Antes da aplicao do tratamento

L* a* b*

41,80 13,89 14,43 43,43 17,48 13,56 Biotin T

40,93 10,53 15,99 49,99 19,04 13,56

39,95 13,53 14,99 45,34 16,56 11,10

40,89 12,69 15,13 46,25 17,69 12,74

Aps a aplicao do tratamento

L* a* b*

L* Antes da aplicao do tratamento a* b* L* a* b*

36,61 8,80 13,80 41,31 15,21 11,05

36,59 11,02 13,90 41,03 13,75 13,06

37,05 10,91 13,41 37,98 13,73 11,99

36,75 10,24 13,70 40,01 14,23 12,03

Aps a aplicao do tratamento

Anios D.D.S.H Antes da aplicao do tratamento L* a* b* Aps a aplicao do tratamento L* a* b* 38,54 9,43 13,76 39,06 13,65 12,39 37,11 10,53 13,91 35,74 12,71 11,16 40,52 12,30 15,42 42,70 15,35 13,88 38,72 10,74 14,36 39,17 13,9 12,48

56

Anexo XV Anlise de Varincia (ANOVA) dos parmetros L*a*b* obtidos antes e aps a aplicao dos tratamentos no Palcio da Pena
Tabela 1 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro L*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Ptio dos Arcos

Anlise de Varincia ao parmetro L*

Antes da aplicao de TiO2 40,47 38,55 39,41 Anova: Factor nico Valor de p = 8,81 x 10-5 p< 0,05 Os valores so significativamente diferentes Aps a aplicao de TiO2 50,62 49,86 49,44

Tabela 2 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro a*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Ptio dos Arcos

Anlise de Varincia ao parmetro a*

Antes da aplicao de TiO2 0,42 1,6 0,13 Anova: Factor nico Valor de p = 0,005603 p< 0,05 Os valores so significativamente diferentes
Tabela 3 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro b*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Ptio dos Arcos

Aps a aplicao de TiO2 4,11 3,28 4,71

Anlise de Varincia ao parmetro b*

Antes da aplicao de TiO2 20,44 22,44 25,88 Aps a aplicao de TiO2 18,07 15,56 19,39

Anova Factor nico Valor de p = 0,05428

p > 0,05 Os valores no so significativamente diferentes

57

Tabela 4 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro L*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Terrao D. Carlos

Anlise de Varincia ao parmetro L*

Antes da aplicao de TiO2 41,8 40,93 39,95 Aps a aplicao de TiO2 43,43 49,99 45,34

Anova Factor nico Valor de p = 0,0500773 p< 0,05 Os valores so significativamente diferentes

Tabela 5 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro a*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Terrao D. Carlos

Anlise de Varincia ao parmetro a*

Antes da aplicao de TiO2 13,89 10,53 13,53 Anova Factor nico Valor de p =0,0173 p< 0,05 Os valores so significativamente diferentes
Tabela 6 Analise de Varincia (ANOVA) ao parmetro b*, antes e aps o tratamento com TiO2, no Terrao D. Carlos

Aps a aplicao de TiO2 17,48 19,04 16,56

Anlise de Varincia ao parmetro b*

Antes da aplicao de TiO2 14,43 15,99 14,99 Aps a aplicao de TiO2 13,56 13,56 11,1

Anova Factor nico Valor de p = 0,063036 p> 0,05 Os valores no so significativamente diferentes

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Anexo XVI - Registo Fotogrfico antes e aps a aplicao dos tratamentos, no Palcio da Pena
Ptio dos Arcos Aplicao de TiO2

Fig 1 e 2- Antes e Aps a Aplicao de TiO2

Aplicao de Biotin T

Fig 3 e 4 Antes e Aps a aplicao do tratamento com Biotin T

Aplicao de Anios D.D.S.H

Fig 5 e 6 Antes e aps a aplicao de Anios D.D.S.H

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 Terrao D. Carlos Aplicao de TiO2

Fig 7 e 8 Antes e aps a aplicao com TiO2

Aplicao de Biotin T

Fig 9 e 10- Antes e aps a aplicao do tratamento com Biotin T

Aplicao de Anios D.D.S.H

Fig 11 e 12- Antes e aps a aplicao do biocida Anios D.D.S.H

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61