Disciplina de Biologia Molecular Aplicada

Prticas 1 e 2: Extrao de DNA plasmidial

Protocolo:
-

Adicionar a um tubo de 1,5ml (Eppendorf) de suspenso de bactrias.

Centrifugar a 6.000g por 5 minutos.

Descartar o sobrenadante.

Adicionar 100 l da soluo I. Homogeneizar.

Adicionar 200 l da soluo II. Homogeneizar.

Adicionar 150 l da soluo III. Homogeneizar

Centrifugar a 12.000g por 5 minutos.

Aspirar a fase superior (contm o DNA diludo). Transferir para um tubo novo.

Adicionar 2 volumes de etanol absoluto. Agitar fortemente.

Descansar por 2 minutos temperatura ambiente.

Centrifugar a 12.000g por 5 minutos.

Descartar o sobrenadante.

Adicionar 500 l de etanol 70%.

Centrifugar a 12.000g por 5 minutos.

Descartar o sobrenadante.

Deixar descansar por 10 minutos.

Ressuspender com 50 l de RNase.

Soluo I
- 50 mM glicose
- 25 mM Tris-HCl (pH 8,0)
- 10 mM EDTA (pH 8,0)

Soluo II
- 0,2 N NaOH
- 1% SDS (p/v)

Soluo III
- 5M acetato de potssio
- cido actico glacial
- H2O

60,0ml
11,5ml
28,5ml

Digesto de DNA com enzimas de restrio

Determine o volume da reao final:

DNA
ENZIMA
TAMPO
BSA(Prot.
Albumina bovina)estabiliza enzima
GUA MILLI Q

ESTOQUE
REAO
500ng/L(quantificado Vou usar 1g de
por espectofometria)
DNA
Ver definio de
10U/L
unidade
10X
Vou usar 1X
10ng/L que equivale
a 10X concentrado
-

Volume da Reao
final

Vou usar 1X
20L

OBS: Se pedir MIX, por exemplo vai digerir 5 amostras , ento multiplique os reagentes
por 5, menos o DNA, nesse caso o volume final seria 100uL. O que est escrito na reao
na maioria das vezes protocolado, mas isso o que se pede e que se usa normalmente no
Lab.
Exerccios:
1. Calcule as concentraes finais dos componentes das reaes I e II.
2. Calcule os volumes das seguintes solues-estoque necessrios para se obter a
soluo II (concentraes das solues-estoque: NaOH 1,0N; SDS 10% (p/v)).

Disciplina de Biologia Molecular Aplicada

P3 Southern blotting
Gel de agarose
-Tampo TBE 5X (1L) Tris (108g); cido brico (55g); EDTA (83g).
-Agarose 1% (p/v)
Solues:
-Despurinizante:
HCl 0,2 N
-Desnaturante:
NaCl 1,5 M
NaOH 0,5 N
-Neutralizante:
Tris-HCl 0,5 M pH 7,0
NaCl 1,5 M
-SSPE 10X:
NaCl 1,5 M
NaH2PO4 0,1 M
EDTA 0,01 M, pH 7,4
Procedimento:
-Submergir o gel por
-15 minutos em soluo despurinizante;
-15 minutos em soluo desnaturante;
-15 minutos em soluo neutralizante;

Material:
-Colorao do gel:
-bacia;
-pipetador automtico;
-transiluminador;
-descarte;
-tubos de 1,5mL;
-estantes para tudos
-Southern blotting:
-Papel-filtro;
-Papel absorvente;
-Membrana de nilon;
-Tesoura ou guilhotina;
-Rgua;
-Pipeta volumtrica;
-Suporte para a transferncia de DNA;
-Pinas

Disciplina de Biologia Molecular Aplicada

P4 e P5: Reao em cadeia da polimerase PCR
1. Amplificao de repeties de Trypanosoma cruzi e Trypanosoma rangeli.
Utilizaremos DNA genmico extrado de formas epimastigotas dos protozorios T. cruzi e T.
rangeli.
2. Componentes da reao.
DNA (molde)...............................................................
Tampo (10X) ............................................................
MgCl2 (50 mM) ..........................................................
dNTPs (2,5 mM cada) .................................................
Iniciadores
Rep_tel-1 (5,0 pmoles/uL) ...............
Rep_tel-2 (5,0 pmoles/uL) ................
Taq DNA polimerase (1U/uL) ..................................
H2O.............................................................................
Total............................................................................

Volume por tubo (uL) Para ... tubos

2,0
...............................
3,0
...............................
3,0
...............................
3,0
...............................
4,0
...............................
4,0
...............................
1,0
...............................
10,0
...............................
30,0
...............................

3. Sequncia e Tm dos iniciadores:

Rep_tel-1 5-TCC AGA CGC TCC CAT GGC-3 (Tm=59o C)
Rep_tel-2 5-GCT ATC CCT CTG CAG ACG-3 (Tm=55o C)

Clculos de Tm:
- Mtodo de Wallace (iniciadores menores que 18mers):
Tm = 2 x (A + T) + 4 x (G + C)
- Mtodo %GC:
Tm = 81,5 + 16,6(log10[Na+] + 0,41[%GC] [625/N],
onde N = nmero de nucleotdeos do iniciador).
4. Programa do termociclador:

Exerccio:

Considere o seguinte protocolo para a preparao de uma reao de PCR:

Constituinte
Volume
-Amostra (5ng/L)............................. 1,0 L
-Taq DNA polimerase (5U/L)........... 1,0 L
-Cloreto de sdio (100mM)................ 5,0 L
-Cloreto de magnsio (50mM)............ 2,0 L
-Tris-base (100mM).......................... 10,0 L
-Iniciador 1 (5p/L)............................ 6,0 L
-Iniciador 2 (5p/L)............................ 6,0 L
-dNTPs (200M)................................. 5,0 L
-gua deionizada............qsp..............50,0 L

Considerando as concentraes das solues fornecidas e o volume final da reao:

a. Fornea as quantidades de cada reagente em 50,0 L da reao. D a sua resposta
em massa (gramas e derivados) ou nmero de moles ou unidades enzimticas,
dependendo do caso.
b. Fornea a concentrao final de cada componente da reao.