ilmu PENENTUAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)

BAB I
PENENTUAN ANGKA LEMPENG TOTAL (ALT)
Metode penentuan angka lempeng total ini digunakan untuk menentukan jumlah total
mikroorganisma aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik) pada produk 
perikanan.
Istilah dan definisi :
Angka lempeng total aerob : Jumlah mikroorganisma hidup yang membutuhkan oksigen
yang terdapat dalam suatu produk yang diuji.
Inkubasi : Pengkondisian mikroorganisma untuk tumbuh dan berkembang biak sesuai
dengan suhu dan waktu yang diperlukan.
Koloni : Sel mikroba yang tumbuh pada media agar dan dapat dilihat secara visual.
Mikroorganisma : Kelompok organisma yang berukuran kecil dan hanya dapat dilihat
dibawah mikroskop.
Media Agar : Media padat yang digunakan untuk pertumbuhan mikrorganisme.
Psikofilik : Kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu kurang dari 20°C.
Mesofilik : Kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu 20 °C-40°C.
Termofilik : Kelompok mikroorganisme yang hidup pada suhu lebih besar dari 40°C.
Pertumbuhan mikroorganisme aerob dan anaerob (psikrofilik, mesofilik dan termofilik)
setelah contoh diinkubasikan dalam media agar pada suhu 35°C ± 1°C selama 24 jam 48 jam
± 1 jam mikroorganisme ditumbuhkan pada suatu media agar, maka mikroorganisma tersebut
akan tumbuh dan berkembang biak dengan membentuk koloni yang dapat langsung dihitung.
Penentuan Angka Lempeng Total dapat dilakukan dengan dua cara. Pertama, metoda cawan
agar tuang/pour plate yaitu dengan menanamkan contoh ke dalam cawan petri terlebih dahulu
kemudian ditambahkan media agar. Kedua, metode cawan agar sebar/spread plate yaitu
dengan menuangkan terlebih dahulu media agar ke dalam cawan petri kemudian contoh
diratakan pada permukaan agar dengan menggunakan batang gelas bengkok.

 Peralatan

1. Timbangan dengan ketelitian 0,0001 g;

2. Autoclave;
3. Inkubator 35 °C ± 1°C
4. Anaerobic jar;
5. Cawan petri 15 mm x 90 mm;
6. Botol pengencer 20ml;
7. Alat penghitung koloni;
8. Blender beserta Jar yang dapat disterilisasi atau stomacher;
9. Batang gelas bengkok diameter 3 mm–4 mm, dengan panjang tangkai 15 cm-20 cm;
10. Pipet gelas atau pipetor : 0,1 ml, 1 ml, 5 ml dan 10 ml.

 Media dan pereaksi

o Plate Count Agar, sesuai lampiran A (normatif);
o Larutan Butterfield’s phosphate buffered, sesuai lampiran B (normatif);
o Gas pack dan indikator air anaerob.

 Kondisi
Pada metode cawan agar tuang, untuk menghindari berkurangnya populasi bakteri akibat
panas yang berlebihan maka media agar yang akan dituang mempunyai suhu
45°C ±1°C.

 Preparasi contoh

Berat contoh yang akan diuji diambil dengan ketentuan sebagai berikut:
a) Contoh dengan berat lebih kecil dari 1 kg
Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil-kecil hingga
beratnya mencapai 100 g.
b) Contoh dengan berat 1 kg–4,5 kg
Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil kecil hingga
beratnya mencapai 300 g.
c) Contoh dengan berat lebih besar dari 4,5 kg
Dengan menerapkan teknik aseptis, ambil contoh secara acak dan potong kecil kecil hingga
beratnya mencapai 500 g.
Timbang contoh secara aseptik sebanyak 25 g untuk contoh dengan ketentuan a) dan b) dan
50 g untuk contoh dengan ketentuan c) diatas, kemudian masukkan dalam wadah atau plastik
steril. Untuk contoh 25 g tambahkan 225 ml larutan butterfield’s phosphate buffered dan
untuk contoh 50 g tambahkan 450 ml larutan butterfield’s phosphate buffered, homogenkan
selama 2 menit. Homogenat ini merupakan larutan pengenceran 10-1. Dengan menggunakan
pipet steril, ambil 1ml homogenat diatas dan masukkan ke dalam 9ml larutan butterfield’s
phosphate buffered untuk mendapatkan pengenceran 10-2. Siapkan pengenceran selanjutnya
(10-3) dengan mengambil 1 ml contoh dari pengenceran 10-2 ke dalam 9 ml larutan
butterfield’s phosphate buffered. Pada setiap pengenceran dilakukan pengocokan minimal 25
kali. Selanjutnya lakukan hal yang sama untuk pengenceran 10-4, 10-5 dst sesuai kondisi
contoh.

 Langkah Kerja :

1.Teknik Dilusi (Pengenceran)

Teknik dilusi sangat penting di dalam analisa mikrobiologi. Karena hampir semua metode
perhitungan jumlah sel mikroba mempergunakan teknik ini, seperti TPC (Total Plate Count).
Cara Kerja :

 Dari larutan kultur kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml air  steril atau
larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10 bagian.
 Dari larutan dilusi 1/10 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml air  steril
atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/100 bagian.
 Dari larutan dilusi 1/100 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml air  steril
atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/1000 bagian.
 Dari larutan dilusi 1/1000 kita ambil 1 ml dan kita masukkan ke dalam 9 ml air  steril
atau larutan buffer pepton untuk memperoleh dilusi 1/10.000 bagian.
 Dst

Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang apabila pada
tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung,
maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara :
Maksud dari 1/10, 1/100, 1/1000, 1/10.000 dst adalah suatu rasio dilusi yang apabila pada
tiap dilusi ditumbuhkan ke dalam suatu media dan koloninya yang tumbuh dapat dihitung,
maka jumlah sel mikroba dapat diketahui dengan cara :
Jumlah koloni x   1
Pengenceran
Misal :
Apabila pada dilusi 1/100 tumbuh sebanyak 20 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel
adalah :      20 koloni x   1            = 2000 sel
1/100
Apabila pada dilusi 1/1000 tumbuh sebanyak 3 koloni, maka dapat diketahui jumlah sel
adalah :       2 koloni  x   1            = 3000 sel
1/1000
Oleh karena itu, dengan metode dilusi kita dapat memperkirakan jumlah sel mikroba pada
suatu benda atau produk.
2.Metode Pour Plate
Teknik pour plate (lempeng tuang) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara mencampurkan media agar yang masih
cair dengan stok kultur bakteri. Teknik ini biasa digunakan pada uji TPC (Total Plate Count).
Kelebihan teknik ini adalah mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada media
agar.
Pada cara ini dilakukan pengenceran dengan menggunakan sejumlah botol pengencer yang
diisi aquadestilata steril.Agar cair didinginkan sampai suhu sekitar 440 C dan baru kemudian
dituangkan ke cawan petri(gambar 7.2).Setelah agar membeku cawan dieramkan selama 24 –
48 jam (370C).Lempengan yang digunakan dalam perhitungan bakteri ialah lempengan yang
mengandung 30 – 300 coloni. Jumlah bakteri perml ialah jumlah koloni dikalikan factor
pengencer.
Cara kerja:
Hari pertama

1. Tandailah botol A,B dan C yang berisi aquadestilata steril.Tandai pula masing –
masing cawan petri dengan nilai pengencerannya .
2. Kocok suspensi kuman yang akan dihitung jumlah bakterinya dan pindahkan 1ml
suspensi ke botol A.
3. Kocok botol A sehingga bakteri tersebar dan terlepas dari kelompok atau rantainya
(gambar 7.1)
4. Pindahkan 1ml dari botol A ke botol B,kemudian kocok.Dari botol B dipindahkan
0.1ml ke cawan petri yang bertanda 10-5 dan 1.0ml ke cawan petri yang bertanda 10-
4.Pindahkan 1ml dari botol B ke botol C,kemudian kocok.Dari botol C dipindahkan
0.1ml ke cawan petri yang bertanda 10-7 dan 1ml ke cawan petri yang bertanda 10-6.
5. Tuangkan agar nutrien bersuhu 500C ke dalam setiap cawan petri,putar –putar cawan
tersebut sehingga suspensi tercampur dengan baik.
6. Setelah agar membeku,baliklah cawn petri dan masukan ke dalam lemari pengeram
selama 24 – 48 jam(370 C)

Hari kedua
1.  Hitung jumlah koloni pada lempengan agar.gunakan lempengan agar yang       mempunyai
30-300 koloni.
Bila tidak ada lempengan yang mempunyai kisaran jumlah koloni tersebut        gunakan
lempengan agar yang mempunyai koloni 300 koloni.
2.  Tentukan jumlah mikroorganisme hidup dengan cara mengalihkan jumlah      koloni
dengan faktor pengeceran.
3. Metoda cawan agar sebar /spread plate method
Teknik spread plate (lempeng sebar) adalah suatu teknik di dalam menumbuhkan
mikroorganisme di dalam media agar dengan cara menuangkan stok kultur bakteri atau
mengapuskannya di atas media agar yang telah memadat. Bedanya dengan pour plate adalah,
pencampuran stok kultur bakteri dilakukan setelah media agar memadat sedangkan pour plate
kultur dicampurkan ketika media masih cair (belum memadat). Kelebihan teknik ini adalah
mikroorganisme yang tumbuh dapat tersebar merata pada bagian permukaan media agar.
Cara kerja :

1. Tuang 12 ml – 15 ml PCA ke dalam cawan-cawan petri steril dan dinginkan. Pipet 1

ml dari setiap pengenceran (10-1,10-2, dst) ke dalam cawan petri yang telah berisi
media PCA diatas dan ratakan dengan menggunakan batang gelas bengkok. Lakukan
secara duplo untuk setiap pengenceran.

CATATAN Untuk pengujian bakteri termofilik, media PCA yang dituang kedalam cawan
sebanyak 40 ml – 50 ml.

1. Setelah contoh meresap kedalam agar (diamkan sekurang-kurangnya 1 jam); Untuk

penentuan mikroorganisme aerob inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi
terbalik dalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22°C ±1°C (psikrofilik);
35°C (mesofilik); 45°C (termofilik). Untuk penentuan mikroorganisme anaerob,
inkubasi cawan-cawan tersebut dalam posisi terbalik dalam anaerobik jar dan
masukkan kedalam inkubator selama 48 jam ± 2 jam pada suhu 22°C ± 1°C
(psikrofilik); 35°C (mesofilik); 45°C (termofilik).
2. Lakukan kontrol tanpa contoh dengan mencampur larutan pengencer dengan media
PCA.

 Pembacaan dan perhitungan koloni pada cawan petri

a. Cawan yang mengandung jumlah 25 koloni–250 koloni dan bebas spreader

Catat pengenceran yang digunakan dan hitung jumlah total koloni. Perhitungan Angka
Lempeng Total sebagai berikut :
N= Σ C
[(1 x n 1) + (0,1 x n2)] (x d)

dengan :
N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni per ml atau koloni per g;
ΣC adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung;
n1 adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung;
n2 adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung;
d adalah pengenceran pertama yang dihitung.
CONTOH:
Pengenceran    : 1:100                         1:1000
Jumlah koloni : 232 dan 244               33 dan 28
N = (232 +244 +33+ 28)
[(1 x 2) + (0,1x 2)]10 −2
=   537/0,022
=   24.409
=   24.000
b.Cawan dengan jumlah koloni lebih besar dari 250
Bila jumlah koloni per cawan lebih besar dari 250 pada seluruh pengenceran maka laporkan
hasilnya sebagai terlalu banyak untuk dihitung (TBUD), tetapi jika salah satu pengenceran
mempunyai jumlah koloni mendekati 250 laporkan sebagai perkiraan ALT.

CONTOH:
Pengenceran : 1 : 100 1 :1000
Jumlah koloni : TBUD 640
Perkiraan ALT koloni per ml atau per g : 640.000
Spreader
Koloni spreader dibedakan menjadi 3 tipe :

1. Rantai koloni, antara koloni saling menyambung yang disebabkan karena bakteri yang
saling mengelompok.
2. Spreader berasal dari lapisan air antara agar dan dasar cawan.
3. Spreader berasal dari lapisan air pada sisi/pinggir cawan atau pada permukaan agar.

Jika cawan ditumbuhi spreader lebih besar dari 25% maka laporkan sebagai spreader:
•  Spreader tipe 1, jika hanya ada 1 rantai maka nyatakan sebagai 1 koloni.
•  Jika 1 atau lebih rantai terlihat berasal dari sumber yang berbeda, laporkan
masing-masing sumber sebagai 1 koloni.
• Spreader tipe 2 dan 3 umumnya berasal dari koloni yang berbeda dan laporkan
masing-masing sebagai 1 koloni.

1. Jumlahkan spreader dan koloni untuk menghitung “ Angka Lempeng Total”.

c. Jumlah koloni semua cawan kurang dari 25 koloni atau cawan tanpa koloni.
Bila pada kedua pengenceran yang digunakan diperoleh koloni kurang dari 25, catat koloni
yang ada, tetapi nyatakan perhitungan sebagai kurang dari 25 dan dikalikan dengan 1/d,
dimana d adalah faktor pengenceran pertama yang digunakan dan dilaporkan sebagai
perkiraan ALT.

CONTOH:
Pengenceran : 1:100 1:1000
Jumlah koloni : 18 dan 0 2 dan 0
Perkiraan ALT koloni per ml atau koloni per g : lebih kecil dari 2.500 lebih kecil dari 2.500.

 Pelaporan
 Untuk menghasilkan perhitungan yang akurat dan teliti, maka laporkan hasilnya     
dengan   dua angka (digit) pertama sebagai hasil pembulatan.
 Bulatkan keatas dengan cara menaikkan angka kedua menjadi angka yang lebih tinggi
bila angka ketiga adalah 6, 7, 8 atau 9 dan gunakan angka 0 untuk masing-masing
angka pada digit berikutnya.
 Bulatkan ke bawah bila angka ketiga adalah 1, 2, 3 atau 4. Bila angka ketiga 5,
bulatkan keatas bila angka kedua ganjil dan bulatkan kebawah bila angka kedua itu
genap.

CONTOH:
Hasil perhitungan            ALT
12.700                            13.000
12.400                            12.000
15.500                            16.000
14.500                            14.000

 Beri tanda bintang (*) untuk cawan yang kurang dari 25 koloni.

CONTOH:
Pengenceran                              : 1:100                                           1:1000
Jumlah koloni                            : 18 dan 0                                       2 dan 0
Perkiraan ALT koloni               : lebih kecil dari 2.500*    lebih kecil dari 2.500*
per ml atau koloni per g

 Jika seluruh cawan berisi spreader atau cawan terkontaminasi oleh sesuatu yang tidak
diketahui, maka laporkan hasil sebagai ’Kegagalan dalam pengujian’.

Contoh perhitungan :
1.   Cawan dengan jumlah koloni 25-250
Perhitungan Angka Lempeng Total sebagai berikut :

N= ΣC
[(1 x n 1) + (0,1 x n2)] (x d)
dengan :
N adalah jumlah koloni produk, dinyatakan dalam koloni per ml atau koloni per g;
ΣC adalah jumlah koloni pada semua cawan yang dihitung;
n1 adalah jumlah cawan pada pengenceran pertama yang dihitung;
n2 adalah jumlah cawan pada pengenceran kedua yang dihitung;
d adalah pengenceran pertama yang dihitung.
CONTOH:
Pengenceran : 1:100 1:1000
Jumlah koloni : 232 dan 244 33 dan 28
N = (232 +244 +33+ 28)
[(1 x 2) + (0,1x 2)]10 −2
=   537/0,022
=   24.409
=   24.000
2.   Seluruh cawan berisi spreader dan atau Kegagalan dalam pengujian. Laporkan hasil
sebagai “Spreader” (SPR) atau kegagalan dalam pengujian
3.   Seluruh cawan berisi lebih dari 100 koloni/cm2 . Perkiraan jumlah angka lempeng total
adalah lebih besar dari (>) 100 dikalikan pengenceran tertinggi dan kalikan dengan luas
cawan. Contoh dibawah berdasarkan pada penghitungan rata-rata 110/cm2.
CONTOH:
Perkiraan ALT/ml (g)
Pengenceran          :   1 : 100                                  1:1000
Jumlah koloni        :   tak hingga        7.150a lebih besar dari 6.500.000 b
tak hingga        6.490c lebih besar dari 5.900.000
•  a berdasarkan luas area 65 cm2
•  Perkiraan jumlah ALT
•  c berdasarkan luas area 59 cm2
CATATAN : Untuk perhitungan koloni yang menggunakan metode cawan agar sebar/spread
plate, jumlah koloni yang dihitung dikalikan dengan 10 dari pengenceran yang digunakan.
Skema penentuan angka lempeng total (ALT)
6.Total Count
Dimaksud dengan total count  yaitu kalau perhitungan jumlah tidak berdasarkan kepada jenis,
tetapi secara kasar terhadap golongan atau kelompok besar mikroorganisme umum seperti
bakteri, fungi mikroalge ataupun terhadap kelompok bakteri tertentu.
Total count bacteria misalnya ditentukan berdasarkan penanaman bahan dalam jumlah dan
pengenceran tertentu ke dalam media yang umum untuk bacteria. Setelah melalui masa
inkubasi pada temperature kamar selama waktu maksimal 4 x 24 jam, perhitungan koloni
dilakukan. Dianggap bahwa tiap koloni berasal dari sebuah sel, maka jumlah koloni dapat
diperhitungkan sebagai jumlah sel mewakili dan terdapat di dalam bahan yang dianalisis.
Juga terdapat total count fungi dilakukan metoda yang sama, kecuali temperature inkubasi
28   10 C. Di dalam pelaksanaan agar selama pertumbuhan tidak diganggu oleh koloni bakteri
maka kepada permukaan media sebelum diberi bahan yang akan dianalisis, ditambahkan
terlebih dahulu larutan asam laktat 3%.
Terhadap mikroalge, media yang digunakan harus bersifat semisolid atau cair, yaitu dengan
penambahantepung agar 50% dari yang diperlukan. Karena kalau penggunaan tepung agar
sesuai untuk bacteria ataupun fungi, pertumbuhan mikroalge akan lambat atau terhambat
sama sekali. Berbeda dengan biakan bakteri ataupun fungi, maka biakan mikroalge harus
ditempatkan pada tempat yang terang atau dikenai oleh cahaya matahari, selama 5- 15 hari.
Jenis media yang digunakan untuk perhitungan total count kelompok lain, pada dasarnya
berbentuk media selektif atau pengaya. Karena sifat selektifitas dari media, pada akhirnya
kalaupun ada bacteria yang tidak diharapkan dapat tumbuh dan berkembang didalamnya,
selain memerlukan waktu yang cukup lama (diatas 10 x 24 jam) juga koloni yang kemudian
terbentuk tidak dapat menjadi besra dan mudah hilang dari pengamatan dengan menggunakan
mata biasa. Pada umumnya karena kelompok bacteria tertentu memerlukan masa adaptasi/
aklimatisasi terlebih dahulu, inkubasi di dalam temperature kamar memerlukan waktu antara
4-6 x 24 jam baru koloni akan tampak jelas pertumbuhannya.
Misal, total count bakteri-pereduksi-sulfat, bakteri belerang dan bakteri-besi, dsb. Dari hasil
perhitungan ini akan diketahui sampai berapa jauh kandungan bakteri yang mempunyai
kemampuan untuk melakukan deteriosasi, korosi, dan degradasi terhadap benda (khususnya
benda-benda logam) di dalam perairan. Dapat juga ditentukan hubungan nilai antara
kehadiran kelompok bakteri di atas dengan nilai korosi pada benda-benda logam yang
berhubungan langsung dengan perairan.
Total count terhadap bakteri pathogen, khususnya untuk penyebab penyakit perut, seperti
tifus, paratifus, kolera, disentri, dsb, yang disebabkan oleh Salmonella, shigella dan Vibrio,
juga memerlukan media pengaya dan media selektif.
Total count terhadap bakteri penghasil racun, khususnya yang menyebar melalui air dan
mengenai bahan makanan dan disebabkan oleh bakteri aerobic
(Pseudomonas,Staphylococcus) dan anaerob (Clostridium) serta total count dan identifikasi
jenis-jenis fungi penghasil mikotoksin khususnya yang termasuk kelompok Aspergillus,
Penicillium, dan fusarium, juga sama seperti untuk golongan pathogen.
Dari hasil/data sementara ternyata bahwa pada lingkungan yang jelek populasi dan jumlah
jenis mikroorganisme tersebut sangat tinggi, sehinga kasus atau gejala penyakit dan
keracunan  juga sangat tinggi. Khusus untuk fungi penghasil mikotoksin sangat ditakuti
pertumbuhannya pada bahan makanan, karena akan menghasilkan racun jamur (mikotoksin)
yang bersifat karsinogenik (dapat merangsang terjadinya kanker, terutama pada kanker hati).
Keberhasilan analisi terhadap kelompok pathogen dan penghasil toksin, baru dapat berhasil
kalau menggunakan media pengaya dan selektif. Hal ini mengingat pula bahwa kemungkinan
besar kehadiran kelompok tersebut di dalam substrat sagat sedikit atau jarang jumlahnya.
Penghitungan Jumlah Bakteri
Untuk menentukan jumlah bakteri dapat dilakukan beberapa cara:

1. Jumlah bakteri secara keseluruhan (total cell count).

2. Jumlah bakteri yang hidup (viable count).

Cara in hanya menggambarkan sel yang hidup,sehingga lebih tepat dibandingkan teknik pada
butir 1.
1) PENGHITUNGAN BAKTERI SECARA KESELURUHAN

1. a. Menghitung Langsung Secara Mikroskopis

Pada cara ini dihitung jumlah bakteri dalam satuan isi yang sangat kecil.Untuk ini digunakan
kaca objek khusus yang bergaris berbentuk bujur sangkar.Jumlah cairan yang terdapat antara
kaca obyek dan kaca penutup mempunyai volume tertentu,sehingga satuan isi yang terdapat
dalam satu bujur sangkar juga tertentu.
Pembesaran yang digunakan untuk melihat bakteri membatasi volume cairan yang
diperiksa.Hanya cairan yang mengandung bakteridalam jumlah tinggi yang dapat
menggunakan cara ini.Selain menghitung secara langsung dengan mata,dapat pula
menggunakan alat penghitung elektronik Coulter counter.Dengan alat ini dihitung semua
benda yang memiliki ukuran diameter 30 um,sehingga cairan yang akan dihitung jumlah
bakterinya haruslah benar-benar hanya mengandung bakteri.

1. b. Menghitung Dengan Cara Kekeruhan

Cara ini menggunakan spektrofotometer atau nefelometer.Dasar teknik ini adalah banyaknya
cahaya yang diabsorsi sebandig dengan banyaknya baktri pada batas- batas tertentu.
Cara ini akan diterangkan pada  akhir bab ini, karena diperlukan keterampilan teknik
menghitung junlah hidup.
2.      MENGHITUNG BAKTERI DENGAN METODE KERAPATAN OPTIK
Jumlah mikroorgamisme dalam suspensi dapat di tentukan dengan kerapatan
optik(OD=OPTIKAL DENSITY).Pengukuran kerapatan optik menggunakan kolorimeter yang
membiaskan cahaya dengan gelombang tertentu.Gelombang cahaya melewati suspensi
bbiakan dan banyaknya yang ditransmisikan setela melewati suspensi diukur jumlah cahaya
yang ditransmisikan setelah melewati suspensi biakan berbanding terbalik dengan jumlah
mikroorganisme dan jumlah cahaya yang diabsorpsi.Jumlah cayaha yang diabsorpi
tergantung pada bentuk dan besar sel.
Spektropotometer dapat mengukur kepekatan sel dalm suspensi dalam % T
(transmittance )atau OD(jumlah cahaya yang di absorpsi dan di sebarkan.)
Dalam mikrobiolog i di gunakan OD sebagai satuan hitungan,karena OD sebanding dengan
kepekatan sel dalam suspensi biakan.
Dalam menggunaannya,penentuan jumlah sel dan penggunaan  OD memerlukan 2
tahap(gambar 7.3 dan 7.4).Pada tahap pertama spektropotometer dikalibrasi mempunyai daya
absorpsi 0 bila tidak ada sel.Ini dilakukan dengan memasukan kuvet yang berisi larutan
pengencer yang digunakan dalam perhitungan sel.Lazimnya larutan pengencer yang
digunakan adalah aquadestillata,nutrient broth,atau NaCl faali.
Kekeruhan biakan diukur dan nilai absorpsi dibaca.Nilai absorpsi sebanding dengan jumlah
mikroorganisme dalam sampel dan dapat digunakan untuk menduga jumlah mikroorganisme
dalam sampel.
Kerapatan optik suatu suspensi tidak langsung menunjukan jumlah sel dalam suatu
populasi,namun menunjukan jumlah cahaya yang disebarkan oleh populasi tersebut.untuk
memperoleh jumlah mikroorganisme,maka nilai kerapatan optik harus disetarakan terlebih
dahulu dengan jumlah mikroorganisme(CFU/ml).untuk memperoleh nilai ini dilakukan
berbagai pengenceran sampel yang digunakan dalam OD.jumlah mikroorganisme ditentukan
dengan cara jumlah hitung mikroorganisme hidup(viable count).setalah diperoleh nila ini
dibuat kurva kalibrasi dengan sumbu X sebagai jumlah hidup(viable count) dan sumbu Y
sebagai nilai OD.
a.Penentuan Jumlah Hitung Dengan Mengukur Kerapatan Optik (OD).
Hari pertama

1. buat pengenceran bertingkat dari biakan E.coli.Pengenceran yang digunakan adalah

½,1/4 ,1/8 ,1/16,dan 1/32.

-          Tndai tabung yang mengandung 5ml TSB dengan faktor pengenceran (1/2-1/32)
-          Campur biakan E.coli dengan baikm dengan cara menggoyang bagian dasar tabung
beberapa kali dengan jari telunjuk sedangkan tangan lainnya memegang ujung tabung
(gambar 6.7)
-          Pindahkan 5ml suspensi biakan E.coli ke dalam tabung dengan pengenceran
½,kemudian campur dengan baik.
-          Pindahkan 5ml dari pengenceran ½ kedalam tabung pengenceran ¼ kemiudian campur
dengan baik.
-          Lakukan hal yang sama untuk memperoleh pengenceran 1/8,dan 1/16,dan 1/32.

1. Kalibrasi spektrofotometer untuk nilai absorpsi 0.0 dengan larutan pengencer TSB
(Trypticase Soy Broth)

-          Atur panjang gelombang pada 686 nm.

-          Nyalakan kolorimeter dan biarkan selama 20 menit.
-          Atur  kolorimeter sehingga jarum menunjukan absorpsi 0.0 dengan mengutar tombol
pengatur.
-          Pipet 5ml TSB dan masukan kedalam kuvet.Perhatikan bahwa kuvet tetap
bersih.Kuvet yang tidak bersih menggangu jalannya cahaya sehingga membiarkan hasil yang
menyimpang.
-          Buka tempat penutup sampel,kemudian masukan kuvet yang mengisi TSB.
Tutup penutup tempat sampel.
-          Atur absorpsi sehingga jarum menunjukan 0.0 dengan memutar tombol.
-          Keluarkan kuvet yang berisi TSB.

1. Baca nilai absorpsi dari biakan E.coli.

-          Pipet 5ml biakan E.coli dan masukan kedalam kuvet yang bersih gunakan teknik
aseptis sewaktu pemindahan biakan sehingga tidak mencemari peralatan yang digunakan.
-          Masukan kuvet,tutup penutup temap sampel dan baca nilai absorpsi.
-          Tulis hasil pembacaan pada kertas yang telah disiapkan.
-          Keluarkan kuvet,dan bung biakan dalam pembuangan yang disediakan.
-          Lakukan hal yang sama untuk memperoleh nilai absorsi dari pengenceran suspensi ½-
1/32.

1. laporkan hasil perapatan optik dari biakan E.coli serta pengenceran suspansi1/2-1/32.
Hari kedua
1.buat kurva kalibrasi dengan OD pada sumbu Y dan jumlah hidup pada sumbu X.
2. laporkan hasil pengukuran.

BAB II
MPN

Metode MPN (Most Probable Number) untuk uji kualitas mikrobiologi air dalam praktikum
digunakan kelompok Coliform sebagai indikator. Kelompok Coliform mencakup bakteri
yang bersifat aerobik dan anaeorobik fakultatif, batang gram negatif dan tidak membentuk
spora. Coliform memfermentasikan laktosa dengan pembentukkan asam dan gas dalam waktu
48 jam pada suhu 35°C (Hadioetomo, 1993).
Dalam metode MPN digunakan medium cair, berbeda dengan metode cawan yang
menggunakan medium padat (Agar). Perhitungan dilakukan berdasarkan jumlah tabung yang
positif, yaitu yang ditumbuhi oleh mikroba setelah inkubasi pada suhu dan waktu tertentu.
Pengamatan tabung positif dapat dilihat dengan timbulnya kekeruhan atau terbentuk gas
dalam tabung durham (Sutedjo, 1991).
Mikroorganisme sebagai indicator kualitas air :
Panda pemeriksaan microbiologist yang rutin terhadap air untuk menentukan aman tidaknya
unstuck diminum, tidaklah cukup bila mendasarkan uji-uji yang digunakan hanya terhadap
adanya (terisolasinnya) mikroorganisme patogenik karena alasan sebagai berikut :

1. Kemungkinan besar pathogen masuk ke dalam air secara sporadic, tetapi karena tidak
dapat bertahan hidup lama mungkin saja tidak terdapat di dalam contoh air  yang
dikirimkan ke laboratorium.
2. Bila terdapat jumlahnya amat sedikit, maka besar kemungkinan pathogen-patogen
tersebut ridak terdeteksi olah prosedur laboratories yang digunakan.
3. Hasil pemeriksaan laboratorium  baru dapat diketahui setelah 24 jam atau lebih.
Arabia ternate ditemukan adanya pathogen sementara itu tentunya banyak orang telah
mengkonsumsi air tersebut dan telah tereksposi terhadap infeksi sebelum dapat
dilakukan usaha untuk mengatasi situasu tersebut.

Mikroorganisme indicator
Istilah “mikroorganisem indicator” sebagaimana digunakan dalam analisi air mengacu pada
sejenis mikroorganisme yang kehadirannya di dalam air merupakan bukti bahwa air tersebut
terpolusi oleh tinja dari manusia atau hewan merdarah panas. Artinya, terdapat peluang bagi
berbagai macam mikroorganisme patogenik, yang secara berkala terdapat dalam saluran
pencernaan, untuk masuk ke dalam ait tersebut.
Beberapa ciri penting suatu organisme indicator adalah :

1. teradpat dalam air tercemer dan tidak ada dalam air yang tidak tercemar.
2. terdapat dalam air bila ada patogen.
3. jumlah mikroorganisme indikator berkorelasi dengan kadar polusi.
4. mempnyai kemampuan bertahan hidup yang lebih besar daripada patogen.
5. mempunyai sifat yang seragam dan mantap.
6. tidak berbahaya bagi manusia dan hewan.
7. terdapat dalam jumlah yang lebih banyak daripada patogen (hal ini membuatnya
mudah terdeteksi).
8. mudah dideteksi dengan teknik-teknik laboratorium yang sederhana.

Beberapa spesies atau kelompok bakteri telah dievaluasi untuk menentukan sesuai tidaknya
untuk digunakan sebagai oeganisme indikator. Di antara organisme-organisme yang
dipelajari, yang hampir memenuhi semua persyaratan suatu organisme indikator yang ideal
ialah Escherichia coli dan kelompok bakteri koli lainnya. Bakteri-bakteri tersebut dianggap
sebagai indikator polusi tinja yang dapat diandalkan.
Escherichia coli dan bakteri koliform lain
Escherichia coli adalah penghuni normal saluran pencernaan manusia dan hewan nerdarah
panas. Biasanya tidak patogenik, anggota lain kelompok koliform ialah Klebsiella
pneumoniae, yang tersebar luas di alam; terdapat dalam tanah, air, dan padi-padian, dan juga
dalam saluran penceranaan manusia dan hewan. Eterobacter aerogenes, sejenis bakteri
koliform yang terdapat dalam saluran pencernaan manusia dan hewan juga terdapat dalam
tanah, air. Koliform sebagai suatu kelompok dicirikan sebagai bakrei berbentuk batang gram
negative, tidak membentuk spora, aerobic dan anaerobic fakultatif yang memfermentasi
lactose dengan menghasilkan asam dan gas dalam waktu 48 jam pada suhu 35 0C.
Kelompok koliform mempunyai beberapa cirri yang juga dimiliki oleh anggota-anggota
genus Salmonella dan Shigella, yaitu duagenera yang mempunyai spsies-spesies enteric
patogenik. Namun, ada perbedaan biokimiawi utama yangn nyata yaitu bahwa koliform dapat
memfermentasikan lactose dengan menghasilkan asam dan gas, sedangkan Salmonella dan
Shigella tidak memfermentasikan lactose.
Pemeriksaan bakteriologis untuk menentukan potabilitas air
Hal-hal yang harus diperhatikan dalam pengambilan sampel air :

1. contoh air harus ditempatkan dalam botol yang steril.

2. contoh tersebut harus dapat mewakili sumbernya.
3. contoh air tidak boleh terkontaminasi selama dan setelah pengambilan.
4. contoh tersebut harus diuji segera setelah pengmbilan.
5. apabila ada penundaan pemeriksaan maka contoh tersebut harus disimpan pada suhu
antara 0 sampai 10 0C.

Prosedur yang biasa digunakan adalah hitungan cawan (plate count) untuk menetapkan
jumlah bakteri yang ada dan uji-uji untuk menepakkan adanya bakteri koliform.
Pengujian bakteri Coliform yang berasal dari cemaran tinja (faecal coliform) secara serentak
dengan uji penegasan yang menggunakan media BGLB, maka dilakukan juga hal yang sama
yaitu 1 ose kultur yang positif dari LST Broth atau LB, dipindahkan ke dalam tabung EC
medium yang baru. Semua tabung MC medium yang telah diinokulasikan oleh kultur dari
LST-Broth, kemudian diinkubasikan pada suhu 45,5°C selama 24 jam dan hasil pembentukan
gas dicatat. Kerapatan bakteri faecal coliform diperkirakan dengan tabel MPN. Diferensiasi
bakteri coliform dapat diarahkan ke dalam reaksi IMVIC (Buckle, 1987).
Berbagai macam uji mokrobiologis dapat dilakukan terhadap bahan pangan, meliputi uji
kuantitatif mikroba untuk menentukan daya tahan suatu makanan, uji kualitatif bakteri
patogen untuk menenetukan tingkat keamanan dan uji indikator untuk menentukan tingkat
sanitasi makanan tersebut. Pengujian yang dilakukan terhadap tiap bahan pangan tidak sama
tergantung berbagai faktor, seperti jenis dan komposisi bahan pangan, cara pengepakan dan
penyimpanan serta komsumsinya, kelompok konsumen dan berbagai faktor lainnya (Djide,
2003).

BAHAN DAN CARA

1. Jenis sampel yang diteliti
Bahan-bahan yang diperiksa dalam penelitian ini adalah air  minum untuk para pasien
maupun petugas rumah sakit yaitu air  putih matang dan air teh, air mandi pasien yang ada di
bangsal-bangsal perawatan, air untuk keperluan masak di dapur umum, air cud alat-alat serta
air cuci tangan perawat. Sedangkan jenis makanan dan minuman yang diperiksa adalah
nasi/bubur, sayur/ lauk, daging/telur, roti dan susu dalam bentuk minuman.
2. Cara pengambilan sampel
Pengambilan sampel dilakukan secara aseptis. Untuk sampel air diambil sebanyak 200 ml
dari tiap-tiap jenis air yang diteliti dan ditempatkan pada botol steril. Untuk sampel makanan
di-ambil kira-kira sebanyak 10 gram untuk tiap jenis makanan yang diteliti dan dimasukkan
ke dalam wadah yang steril pula. Transportasi sampel dari rumah sakit ke laboratorium di-
lakukan dengan menempatkan sampel-sampel tersebut ke dalam box es dengan suhu sekitar
4° C.
3. Idenfikasi mikrobiologis
Identifikasi mikrobiologis dilakukan dengan menggunakan metode yang telah dibakukan oleh
WHO (1987)
Dalam identifikasi mikrobiologis ini terutama untuk sampel makanan dan
minuman pertama-tama dilakukan kultur terhadap masing-masing sampel dengan media
spesifik. Dari tahap kulturisasi kemudian dilakukan pemeriksaan lanjutan yang meliputi pe-
meriksaan mikroskopis setelah terlebih dahulu dilakukan penawaran Gram dan pemeriksaan
yang lain seperti uji biokimia dan uji serologi untuk identifikasi jenis mikroba tertentu.
Identifilcasi mikrobiologi ini ditujukan untuk deteksi beberapa jenis bakteri yang dapat
menyebabkan infeksi nosokomial
seperti : Staphylococcus sp, Pseudomonas, E. coil Salmonella, Shigella, Streptococcusm
Klebsiella, Proteus dan kuman-kuman gram negatip maupun gram positip lainnya.
Identifikasi mikrobiologi terhadap sampel air dilakukan dengan metode MPN (Most Probable
Number) per 100 ml air. Metode ini ditujukan untuk mendeteksi adanya pencemaran air oleh
tinja manusia. Sebagai indikator terhadap pencemaran tinja manusia adalah adanya bekteri E.
coli/coliform dalam sampel air yang diperiksa.