Machine Translated by Google

obat-obatan laut

Artikel

Studi Perbandingan Reduksi Asimetris

Keton Menggunakan Sel Tumbuh dan Istirahat dari
Jamur yang Berasal dari Laut

Hui Liu 1, Bi-Shuang Chen 1,2,3,* ID 4 dan Lan Liu 1,2,3 ID

, Fayene Zeferino Ribeiro de Souza
1
Sekolah Ilmu Kelautan, Universitas Sun Yat-Sen, Guangzhou 510275, Tiongkok;
liuh229@mail.sysu.edu.cn (HL); cesllan@mail.sysu.edu.cn (LL)
2
Laboratorium Utama Sumber Daya Kelautan dan Teknik Pesisir Provinsi Guangdong,
Guangzhou 510275, Cina 3 Pusat Inovasi Kolaborasi Eksploitasi dan Pemanfaatan Bio-
Sumber Daya Laut Cina Selatan,
Universitas Sun Yat-Sen, Guangzhou 510275,
4
China Departamento de Química, Faculdade de Ciências, UNESP, Bauru 17033-360,
Brasil; faylittlefay@yahoo.com.br * Korespondensi: chenbsh23@mail.sysu.edu.cn;
Telp.: +86-20-84725459

Diterima: 16 Januari 2018; Diterima: 3 Februari 2018; Diterbitkan: 14 Februari 2018

Abstrak: Biokatalis seluruh sel menawarkan rute yang sangat enantioselektif, polusi minimal ke alkohol
yang aktif secara optik. Saat ini, sebagian besar kinerja katalitik seluruh sel melibatkan sel-sel istirahat
daripada pertumbuhan biotransformasi sel, yang merupakan proses satu langkah yang diuntungkan dari
pertumbuhan simultan dan biotransformasi, menghilangkan kebutuhan untuk persiapan katalis. Dalam
makalah ini, reduksi asimetris dari 14 keton aromatik ke alkohol murni enansiomer yang sesuai berhasil
dilakukan menggunakan sel-sel jamur yang berasal dari laut yang tumbuh dan beristirahat dalam kondisi
yang dioptimalkan. Hasil yang baik dan enantioselektivitas yang sangat baik dicapai dengan kedua metode.
Meskipun penghambatan substrat mungkin menjadi faktor pembatas untuk menumbuhkan biotransformasi
sel, strain yang dipilih masih dapat sepenuhnya mengubah substrat 10-mM menjadi produk yang diinginkan.
Biotransformasi sel istirahat menunjukkan kapasitas untuk didaur ulang sembilan kali tanpa penurunan
aktivitas yang signifikan. Ini adalah studi pertama yang melakukan reduksi asimetris keton dengan
biotransformasi sel pertumbuhan satu langkah.

Kata kunci: sel tumbuh; sel istirahat; pengurangan asimetris; jamur laut; alkohol kiral

1. Perkenalan

Pembuatan alkohol sekunder murni enansiomer semakin penting karena zat antara ini
merupakan bahan penyusun penting untuk produksi obat kiral, perasa, bahan kimia pertanian,
dan bahan fungsional [1,2]. Misalnya, (S)-1-(3,4-dichlorophenyl)ethan-1-ol (2n) adalah zat
antara serbaguna dalam sintesis sertraline [3,4], yang digunakan untuk mengobati depresi,
gangguan obsesif-kompulsif , gangguan panik, gangguan kecemasan, gangguan stres pasca-
trauma, dan gangguan dysphoric pramenstruasi. Alkohol aktif optik lainnya, etil (S)-4-kloro-3-
hidroksibutanoat, adalah perantara kunci untuk sintesis penghambat 3-hidroksi-3-metilglutaril
koenzim A (HMG-CoA) reduktase, yang merupakan bahan aktif dari obat penurun kolesterol
Lipitor [5], sedangkan 2-bromo-1-feniletanol (2a) merupakan prekursor untuk sintesis
antidepresan dan obat - atau -adrenergik , seperti fluoxetine, tomoxetine, dan nisoxetine [6, 7].

Meskipun ada banyak pendekatan sintetik yang memberikan alkohol kiral dalam kelebihan enansiomer
tinggi, reduksi asimetris katalitik dari senyawa karbonil prokiral menawarkan beberapa keuntungan karena

Mar. Narkoba 2018, 16, 62; doi:10.3390/md16020062 www.mdpi.com/journal/marinedrugs

Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 2 dari 15

itu dapat dengan mudah diterapkan pada berbagai substrat, pemanfaatan material tinggi, dan limbah dan
produk sampingan dapat dikurangi secara drastis [8,9]. Metode kimia menggunakan katalis logam-kompleks
telah digunakan [10-12]. Namun demikian, karena adanya logam, sebagian besar metode yang dijelaskan
memerlukan penggunaan persiapan katalis yang rumit atau kimia tindak lanjut reduktif/oksidatif . Reduksi
enantioselektif katalitik bebas logam dari keton prokiral tetap menantang.
Biokatalisis dalam sintesis asimetris, sebagai akibat dari konstitusi kiral kompleks mereka, sebagian
besar cocok untuk pembuatan stereoisomer murni optik [13-17]. Memang, bioreduksi keton menggunakan
karbonil reduktase menjadi alkohol kiral telah ditemukan dan dimurnikan, seperti S1 dari Candida
magnoliae [18], KaCR dari Kluyveromyces aestuarii [19], dan PsCR I dari Pichia stipitis [20].
Namun, tingginya harga kofaktor (sekitar 1 g/485 euro), termasuk Nicotinamide adenine dinucleotide
(NADH) atau Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate (NADPH), merupakan hambatan untuk
penerapan pendekatan ini. Oleh karena itu, sistem regenerasi kofaktor yang efisien dan hemat biaya
seperti sistem berpasangan enzim dan substrat harus dikembangkan [21]. Format dehidrogenase (FDH)
atau glukosa dehidrogenase (GDH) dapat digunakan sebagai sistem berpasangan enzim untuk daur
ulang NAD+ atau NADP+ [22], dan 2-propanol dapat digunakan sebagai ko-substrat karena biayanya
yang rendah dan kelayakannya. memaksa reaksi menuju penyelesaian dengan menghilangkan produk
bersama aseton di bawah tekanan tereduksi [23,24].
Metode yang mudah dioperasikan dan sistem sel utuh yang dapat beradaptasi dianggap sebagai
pendekatan sintetik alternatif “hijau” yang layak [25,26] karena keunggulannya yang unik seperti kondisi
reaksi ringan, ramah lingkungan, regenerasi kofaktor in situ, produksi mudah dan relatif harga rendah ;
metode ini karena itu telah menarik perhatian besar dan telah diselidiki secara ekstensif dalam beberapa
tahun terakhir [27]. Namun, sebagian besar studi katalitik sel utuh melibatkan sel-sel istirahat daripada
pertumbuhan biotransformasi sel [28-30]. Sel-sel istirahat disuspensikan kembali dalam larutan buffer
dalam kondisi tidak tumbuh dan digunakan sebagai biokatalis untuk produksi senyawa target, yang
diuntungkan dari pemisahan produk hilir yang nyaman. Menumbuhkan biotransformasi sel adalah proses
satu langkah di mana sejumlah substrat ditambahkan ke media dan produk target disintesis melalui satu
atau beberapa reaksi enzimatik dari substrat selama kultur sel. Biotransformasi sel yang sedang tumbuh
mirip dengan fermentasi mikroba dalam potensinya untuk produksi skala industri dan menunjukkan
keuntungan yang signifikan dibandingkan biotransformasi sel istirahat karena kemudahan pelaksanaannya,
yang merupakan hasil dari fitur seperti langkah operasi sederhana, tidak perlu persiapan sel, dan kesiapan
produksi skala industri.
Oleh karena itu, dalam penelitian ini, kami melaporkan hasil studi komparatif tentang reduksi asimetris
dari berbagai keton aromatik menggunakan sel yang tumbuh dan beristirahat dari jamur yang berasal dari
laut yang menawarkan rute alternatif, sangat enantioselektif dan polusi minimal menuju enansiomer murni
yang penting. alkohol.

2. Hasil

Untuk menilai sepenuhnya potensi jamur yang berasal dari laut sebagai biokatalis untuk reduksi
enantioselektif keton prokiral, miselia utuh dari 13 jamur laut (Penicillium citrinum GIM 3.458, Penicillium
citrinum GIM 3.251, Penicillium citrinum GIM 3.100, Aspergillus sclerotiorum AS 3.2578sydowiig AS
3.2578sydowiig AS. 3.7839, Aspergillus sydowii AS 3.6412, Geotrichum candidum GIM 2.361, Geotrichum
candidum GIM 2.616, Rhodotorula rubra GIM 2.31, Rhodotorula mucilaginosa GIM 2.157, Geotrichum
candidum AS 2.1183, Geotrichum candidum AS 2.498 dan Rhodotorula rubra disaring untuk 1 stereotorula
rubra AS- (3-bromofenil)etan-1-satu 1b. Reaksi penyaringan awalnya dilakukan dengan 10 mL buffer
Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 6,0) yang mengandung glukosa (0,5 g), 5 mM 1-(3-bromofenil)etan-1-
satu (1b), dan 3 g istirahat sel pada 30 C, karena sering digunakan untuk dijelaskan biotransformasi sel
istirahat [31-34]. Hasilnya ditunjukkan pada Tabel 1. Konfigurasi absolut (S)-2b ditentukan dengan
membandingkan tanda-tanda rotasi tertentu yang diukur dengan yang dilaporkan dalam literatur [35].
Dalam reaksi kontrol yang dilakukan secara paralel dan hanya melibatkan (1b), glukosa dan buffer (tanpa
sel istirahat), tidak ada hasil produk yang diinginkan (S)-1-fenilpropan-1-ol
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 3 dari 15

Mar. Drugs 2018, 16, x FOR PEER REVIEW [(S)-2b] 3 dari 15

terdeteksi, menunjukkan bahwa tidak terjadi reaksi yang dikatalisis secara kimia; jadi, reaksinya adalah

dilakukan
jamur. oleh
Harus enzim aktif
ditekankan yanggenom
bahwa ada dalam jamur
lengkap galuryang berasal dari
Rhodotorula rubralaut.
AS Harus
2.2241ditekankan bahwa
memiliki genom lengkap galur
Rhodotorula rubra AS 2.2241 telah diurutkan dan dijelaskan dalam
telah diurutkan dan dijelaskan di laboratorium kami. Mengambil konversi, enantioselektivitas, dan laboratorium.
Mengambil
ketersediaankonversi, enantioselektivitas,
urutan genom diperhitungkan,dan
kamiketersediaan
memutuskanurutan genom
untuk terus menjadi
menggunakan akun strain R. rubra AS ,
kami memutuskan
2.2241 untuk
untuk semua studi terus
lebih menggunakan strain R. rubra AS 2.2241 untuk semua studi lebih lanjut.
lanjut.

Tabel 1. Bioreduksi 1-(3-bromofenil)etan-1-satu (1b) oleh jamur yang berasal dari laut.
Tabel 1. Bioreduksi 1-(3-bromofenil)etan-1-satu (1b) oleh jamur yang berasal dari laut.

Masuk Strain Masuk Strain Hasil (%) [a] Ee (%) [a] Urutan Genom Tersedia di Laboratorium Kami
Urutan Genom
P. citrinum GIM 3.458 Hasil (%) [a] Ee (%) [a]
1 25.3 99 (S) No
Tersedia di Laboratorium Kami
21 P. citrinum GIM
GIM 3.251
3.458 P.5.5 P. citrinum
citrinum GIM 53,7 (S) 25,3 99 (S ) 5,5 nd 39,2 nd nd Tidak
99 (S) Tidak
32 3.100 39.2 P. citrinum AS
sclerotiorum GIM3.2578
3.251 P.
4 A. Tidak
Tidak
53,7 (S)
citrinum GIM 3.100 nd 99 (S)
Tidak Tidak

34 sydowiiA.AS
sclerotiorum
3.7839 nd AS 3.2578 A. tidak Tidak Tidak

55 A. sydowiind
sydowii AS 3.6412 AS 3.7839 A. ada Tidak Tidak

6 6 7 75.9
candidum A. sydowii
7 G. candidum
GIM GIM
2.361 AS 3.6412
G.2.361 G. 8
8 75.1
candidum 99 (S) Tidak Tidak
G. candidum GIM99 92.616 9 R.GIM
R. rubra rubra GIM
2.31 102.31
R. 75,9 Tidak
mucilaginosa GIM 2.157 10 R. mucilaginosaGIM
GIM 2.616 99 (S) 99 (S) Tidak
2.157 11 G. candidum
candidum ASAS2.1183
2.498111212
13G.
R. 75,1 99 (S) Tidak
rubra AS 2.2241 13 kontrol kontrol 99 (S) Tidak
99 99 (S) Tidak
82 99 (S) Tidak
82 99 (S) Tidak
44.3
G. candidum AS 2.1183 77.7 99 44,3
(S) Tidak
99 (S) Tidak
candidum AS 2.498 99 R.G. 99 77,7
(S)
99 (S)
Tidak
Tidak
rubra AS 2.2241 nd 99 (S
99) Ya [b] Ya [b]
99 (S)
nd - -
Tidak
Tidak dan
[a] Hasil
[a] Hasildan
dannilai
nilai
ee ee ditentukan
ditentukan dengan
dengan HPLCHPLC yang dilengkapi
yang dilengkapi dengan
dengan kolom kiralkolom kiral OD-H
OD-H Chiracel; [b] Chiracel; [b] Genom
sekuens
Urutan genomtersedia didilaboratorium
tersedia kami,
laboratorium kami, di mana
di mana perpustakaan
perpustakaan DNAuntuk
DNA genom genom untuk dan
dihasilkan platform Illumina
diurutkan di BGI berada
(Shenzhen, Cina). nd = tidak ditentukan.
Platform Illumina dihasilkan dan diurutkan di BGI (Shenzhen, China). nd = tidak ditentukan.

2.1. Pengurangan dengan Sel Tumbuh

2.1. Pengurangan dengan Sel Tumbuh

2.1.1. Optimalisasi Biotransformasi Sel Tumbuh

2.1.1. Optimalisasi Biotransformasi Sel Tumbuh
Substrat 1b ditambahkan pada saat inokulasi. Dari Tabel 2 terlihat bahwa R. rubra AS
Substrat 1b ditambahkan pada saat inokulasi. Dari Tabel 2, terlihat bahwa R. rubra AS 2.2241 dapat tumbuh
dengan adanya substrat 1b dan dapat mereduksi substrat 1b menjadi substrat yang sesuai.
2.2241 dapat tumbuh dengan adanya substrat 1b dan dapat mereduksi substrat 1b menjadi alkohol (S)-2b.
Pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 dengan adanya substrat 1b (entri 1-5) lebih sedikit
alkohol yang sesuai (S)-2b. Pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 dengan adanya substrat 1b dibandingkan dengan
media kontrol tanpa keton (entri 20 ). Pertumbuhan tiga puluh lima persen lebih sedikit diamati di
(entri 1-5) kurang dari pada media kontrol tanpa keton (entri 2ÿ). Tiga puluh lima persen lebih sedikit media
dengan substrat 5 mM 1b. Dengan 10 mM, 11,6 mM dan 13,3 mM keton dalam budidaya
pertumbuhan diamati dalam media dengan 5 mM substrat 1b. Dengan 10 mM, 11,6 mM dan 13,3 mM medium, 60%,
84% dan 93% pertumbuhan lebih sedikit diamati, masing-masing. Tidak ada pertumbuhan R. rubra
keton dalam media budidaya, 60%, 84% dan 93% lebih sedikit pertumbuhan diamati, masing-masing. Ada AS
2.2241 dengan 15 mM keton 1b dalam medium. Tampaknya keton 1b memiliki efek penghambatan
tidak ada pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 dengan 15 mM keton 1b dalam medium. Tampaknya keton terhadap
pertumbuhan R. rubra AS 2.2241, dan penghambatannya meningkat dengan meningkatnya konsentrasi
1b
1b.memiliki efek
Tidak ada penghambatan
transformasi ketonpada pertumbuhan
1b yang R. rubra
diamati dalam labuAS 2.2241,
yang tidak dan penghambatan meningkat dengan keton
diinokulasi
peningkatan konsentrasi keton 1b. Tidak ada transformasi keton 1b yang diamati dalam labu dengan R. rubra AS
2.2241 (kontrol 10 ). Hal ini menunjukkan bahwa keton 1b tidak dapat direduksi menjadi alkohol
yang tidak diinokulasi dengan R. rubra AS 2.2241 (kontrol 1ÿ). Ini menunjukkan bahwa keton 1b tidak bisa tanpa
organisme. Kontrol kedua hanya berisi media RM1 tanpa keton 1b, dan
direduksi menjadi alkohol tanpa organisme. Kontrol kedua hanya berisi labu RM1 yang
diinokulasi (kontrol 20 ). Tidak ada alkohol 2b yang sesuai yang diamati, menunjukkan bahwa alkohol
medium tanpa keton 1b, dan labu diinokulasi (kontrol 2ÿ). Tidak ada alkohol yang sesuai 2b
2b adalah produk metabolisme-independen, dan reaksi ini adalah reduksi enzim-katalitik.
diamati, menunjukkan bahwa alkohol 2b adalah produk metabolisme-independen, dan reaksi ini persiapan sel panas-
denaturasi dalam percobaan kontrol (kontrol 30 ) jelas menunjukkan bahwa tidak ada bahan kimia
adalah reduksi enzim-katalitik. Preparat sel yang didenaturasi panas dalam eksperimen kontrol mengkatalisis reaksi,
sehingga memberikan dukungan lebih lanjut untuk fakta bahwa reaksi dilakukan
(kontrol 3ÿ) dengan jelas menunjukkan bahwa tidak ada reaksi yang dikatalisis secara kimia, sehingga
menyediakan lebih lanjut oleh enzim aktif. Meskipun pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 dengan adanya keton 1b adalah
mendukung fakta bahwa reaksi dilakukan oleh enzim aktif. Meskipun pertumbuhan R. lebih rendah, ia dapat tumbuh
dengan adanya keton 1b dan mereduksi keton 1b menjadi alkohol (S)-2b.
rubra AS 2.2241 dengan adanya keton 1b lebih rendah, bisa tumbuh dengan adanya keton 1b
dan mereduksi keton 1b menjadi alkohol (S)-2b.
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 4 dari 15

Mar. Narkoba 2018, 16, x UNTUK PEER REVIEW 4 dari 15

Tabel 2. Reduksi 1b dengan menumbuhkan sel R. rubra AS 2.2241 dalam medium RM1 [a].
Tabel 2. Reduksi 1b dengan pertumbuhan sel R. rubra AS 2.2241 dalam media RM1 [a].

jam 2b pada 24 jam 2b pada

jam 48 48 jam
2b pada 2b jam
pada
2b72
pada 72 jam 2b pada 962b pada 96 jam
jam Massa Sel Kering
( Massa(Dry
Entri 1b pada
Entri01b
jam (mM)
pada 0 jam (mM) [c]
(mM) [b] (mM) [b] (mM) [b]
(mM) [b] (mM) [b] (mM) [b] (mM)(mM)
[b] [b] berat,
L) berat, g/L)g/
[c]
1 1 5 2,3699)
(eeS = 99)
3,06 3,06
(eeS (eeS
= 99) = 99)
4,95 4,95
(eeS (eeS
= 99) = 99)
4,07 2,36
(eeS (eeS
= 99) = (eeS =(99)
4,07 eeS0,42
= 99) 8,33 4.61 4.61
2 2 5 10 (eeS = 99) 9,9 (eeS = 99)
99) 6,21
6,21 (eeS
(eeS == 99)
99) 0,42
0,93=(eeS
(eeS
99) 0,93
== 99)
99)
(eeS
8,33
8,41=(eeS
(eeS
99) 8,41
4,96
== 99)
99)
(eeS
9,9
4,96(eeS
= (eeS
99)= 2.81 2.81
3
3 10 11.6 nc nc 1.12 1.12
4 11.6 nc nc nc nc 0,46
4 13.3 nc nc nc nc 0,46
5 13.3 15 nc nc nc nc 0
5 15 nc nc nc nc 0
Kontrol
Kontrol

1ÿ (tanpa 10 (tanpa 10 0 00 0 0
01 0 00 0 0
inokulasi)inokulasi)
[d] [d] 0
0
2 2 (kosong)[e]
[e]10
0 (kosong)
(dengan 5 0 0 00 0 0 0 0 7.16 7.16

3
0
3ÿ10sel
g kering
kering (dengan
mati) [f]5sel
g
0 0 00 0 0 0 0 dan dan
mati) [f] [a] 200
media RM1,mL
satu loop dari satu koloni R. rubra AS 2.2241, jumlah yang diberikan 1b, dikultur pada 28 C,
[a] 200 mL media RM1, satu loop koloni tunggal R. rubra AS 2.2241, jumlah yang diberikan 1b, 220 rpm untuk waktu tertentu; [b]
konsentrasi 2b ditentukan
dikultur dengan
pada 28 °C, analisis
220 rpm untukHPLC
waktuyang dilengkapi
tertentu; dengan Chiracel
[b] konsentrasi 2b ditentukan oleh kolom kiral HPLC OD-H; [c] Sel dipanen
dengan sentrifugasi pada 4000
analisis dilengkapi rpm kolom
dengan dan padakiral4OD-H
C selama 20 menit;
Chiracel; [c] Sel[d]dipanen
Ini adalah
dengan digunakan sebagai kontrol positif untuk 1-(3-
bromofenil)etan-1-satu (1b); [e] Hal ini dilakukan untuk mengetahui pertumbuhan R. rubra
sentrifugasi pada 4000 rpm dan pada 4 °C selama 20 menit; [d] Ini digunakan sebagai kontrol positif untuk AS 2.2241 dengan
tidak adanya 1b; [f] Ini digunakan untuk menentukan enzim aktif oleh sel; nc = tidak ada konversi;
1-(3-bromofenil)etan-1-satu (1b); [e] Hal ini dilakukan untuk memeriksa pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 pada nd = tidak
ditentukan.
tidak adanya 1b; [f] Ini digunakan untuk menentukan enzim aktif oleh sel; nc = tidak ada konversi; nd = tidak ditentukan.

Percobaan selanjutnya dilakukan untuk menentukan pertumbuhan minimum R. rubra AS 2.2241 yang dibutuhkan
transformasiPercobaan selanjutnya
keton 1b. Di dilakukan
sini, konsentrasi untuk
keton yangmenentukan pertumbuhan
berbeda (5–15 minimum R. rubra AS 2.2241 untuk
mM) ditambahkan
diperlukan untuk transformasi keton 1b. Di sini, konsentrasi keton
dan diinokulasi dengan R. rubra AS 2.2241. Labu dikocok (220 rpm) pada 28 C, yang berbeda (5–15 mM) ke media RM1
ditambahkan ke media RM1 dan diinokulasi dengan R. rubra AS 2.2241. Labu dikocok dan sampel dianalisis
pada interval 24 jam. Ditemukan bahwa ketika konsentrasi substrat
(220 rpm) pada 28 °C, dan sampel dianalisis pada interval 24 jam. Ditemukan bahwa ketika lebih kecil dari
13,3 mM, laju reaksi bioreduksi menunjukkan tren yang jelas menuju peningkatan
konsentrasi substrat lebih kecil dari 13,3 mM, laju reaksi bioreduksi menunjukkan pembentukan produk yang
jelas dari waktu ke waktu
kecenderungan selama 72 pembentukan
peningkatan jam pertama reaksi.
produkKecepatan
dari waktu reaksi jugaselama 72 jam pertama reaksi.
ke waktu
Pembentukan
kecepatanproduk as serta
reaksi rendah pada tahap awal
pembentukan produkkarena
rendahekspresi karbonil
pada tahap reduktase
awal yang rendah
karena karbonil rendah dan
kemudian
ekspresi
meningkat pada reduktase dan kemudian
tahap selanjutnya, meningkat
meskipun pada tahap
pembentukan selanjutnya,
produk meskipun
yang diinginkan pembentukan
menurun selama 72produk
jam yang
pada 96 jam. Penurunan ini mungkin karena dehidrasi alkohol, seperti yang juga ditemukan oleh Chandran seperti
diinginkan menurun selama 72 jam hingga 96 jam. Penurunan ini mungkin karena dehidrasi alkohol,
jugadan
atas 99%) ditemukan oleh
Das [36]. Chandran
Tidak dan Dassignifikan
ada perubahan [36]. Tidak ada perubahan
dalam signifikan
produk ee (hampir di pada produk
atas 99%) ee (hampir
dalam di ini
penelitian
dalam studi yang diamati. Ketika konsentrasi substrat di atas 13,3 mM, pertumbuhan sel diamati. Ketika
konsentrasi substrat di atas 13,3 mM, pertumbuhan sel dan produksi yang diinginkan
dan produksi alkohol yang diinginkan tidak diamati, menunjukkan keberadaan alkohol substrat tidak diamati,
menunjukkan adanya penghambatan substrat selama sel tumbuh
penghambatan selama transformasi sel tumbuh. Oleh karena itu, konsentrasi substrat optimal dalam
transformasi.
medium Oleh karena
adalah itu, konsentrasi
10 mM. Sampai saat substrat yang
ini, ragi, optimal
bakteri, dalam
jamur, danmedium
bahkan adalah
jaringan10tanaman
mM. Saat ini, menjadi
telah
ragi, bakteri, jamur, dan
digunakan bahkan biokatalis
sebagai jaringan tanaman
untuktelah digunakan
proses sebagai biokatalis
bio-reduksi [28-30].untuk bio-reduksi.
Namun, sebagian
besarbiotransformasi
proses ini [28-30]. Namun,
dilakukan sebagian
dengan sel-sel besar
istirahat biotransformasi
mikroorganisme ini dilakukan
ini. Penambahan substratdengan sel-sel istirahat
secara langsung
ke media
Penambahan (satu pot)
substrat memiliki
langsung potensi(satu
ke media yangpot)
signifikan
memilikiuntuk produksi
potensi yang skala industri mikroorganisme ini.
signifikan
bahan kimia skala industri karena persiapan sel yang disederhanakan. Lebih-lebih lagi, adalah untuk produksi
kimia karena persiapan sel yang disederhanakan. Selain itu, total waktu inkubasi
relatif pendek karena pertumbuhan dan biotransformasi terjadi secara bersamaan. Meskipun total waktu
inkubasi relatif singkat karena terjadi pertumbuhan dan biotransformasi
substrat menunjukkan efek penghambatan pada pertumbuhan R. rubra AS 2.2241, sel yang tumbuh ini
secara bersamaan. Meskipun substrat menunjukkan efek penghambatan pada pertumbuhan R. rubra AS
biotransformasi masih menunjukkan produktivitas yang baik dalam reduksi asimetris keton yang
diuji. 2.2241,Substrat
biotransformasi sel yang pada
1b ditambahkan sedang tumbuh
fase ini masihyang
pertumbuhan menunjukkan produktivitas yang
berbeda. Penambahan baikpada
substrat dalam reduksi asimetris
awalnya
diuji keton.
fermentasi menyebabkan terhambatnya pertumbuhan; oleh karena itu, pemberian makan substrat (10 mM)
dilakukan. Substrat
setelah induksi. 1b ditambahkan
Seperti pada fase
yang diilustrasikan pertumbuhan
pada Gambar 1, yang
sel-selberbeda.
R. rubraPenambahan substrat
AS 2.2241 yang di awal
tumbuh 24 jam
mereduksi
fermentasi keton 1bpenghambatan
menyebabkan menjadi alkohol (S)-2b dalamoleh
pertumbuhan; 24 jam inkubasi,
karena sementara
itu, pemberian sel yang
makan tumbuh
substrat (10 48
mM)jamdilakukan
, setelah
induksi. Seperti yang diilustrasikan pada Gambar 1, sel-sel R. rubra AS 2.2241 yang tumbuh 24 jam mereduksi keton
1b menjadi alkohol (S)-2b dalam waktu 24 jam inkubasi, sementara sel yang tumbuh 48 jam juga membutuhkan waktu 24 jam untuk
menyelesaikan transformasi. Dalam kasus sel yang tumbuh 72 jam, transformasinya sedikit
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 Mar. 5 dari 15

Narkoba 2018, 16, x FOR PEER REVIEW 5 dari 15

juga
jam, yang membutuhkan
lebih waktu
kecil, dan 84% dari24 jam 1b
keton untuk menyelesaikan
yang ditambahkan transformasi.
diubah setelahDalam kasus
24 jam sel tumbuh
inkubasi. Hanya 72
74% dari keton
transformasi sedikit lebih kecil, dan 84% dari keton 1b yang ditambahkan diubah setelah 24 jam 1b
ditransformasikan oleh sel-sel yang tumbuh selama 96 jam setelah 24 jam inkubasi. Tidak ada transformasi lebih lanjut
inkubasi. Hanya 74% dari keton 1b yang diubah oleh sel yang tumbuh selama 96 jam setelah 24 jam terlihat
dengan sel yang tumbuh
inkubasi. Tidak selama 96 jam dengan
ada transformasi lebih masa
lanjut inkubasi yangdengan
yang terlihat lama. Dalam semua
sel yang kasus,
tumbuh 96inisial
jam dengan konsentrasi
keton 1b periode yang berkepanjangan adalah 10 mM. Dengan demikian, jelas dari percobaan ini bahwa 24- dan 48-jam-tumbuh
inkubasi. Dalam semua kasus, konsentrasi awal keton 1b adalah 10 mM. Dengan demikian, terlihat jelas dari sel-
sel yang tumbuh paling
percobaan aktif mengubah
ini bahwa keton
sel tumbuh 24- 1b
danmenjadi
48-jam alkohol (S)-2b.
paling aktif Ini mungkin
dalam mengubahkarena
keton 1b menjadi alkohol (S)-2b.
Ini mungkin karena
48 jam pertumbuhan. adanya
Juga telah enzim aktif
dilaporkan bahwasetelah 24 dan 48 jam pertumbuhan. adanya enzim aktif setelah 24 dan
maksimum
Juga telah dilaporkan bahwa aktivitas karbonil reduktase maksimum
karbonil reduktase diperoleh dalam waktu 45-50 jam budidaya Acetobacter diperoleh dalam waktu 45-50 jam aktivitas
pasteurianus
budidaya Acetobacter pasteurianus GIM1.158 [37]. Aktivitas enzim yang buruk diamati pada GIM1.158 [37].
Aktivitas enzim yang buruk diamati pada kultur yang tumbuh 72 jam dan 96 jam, membuat
Kultur yang tumbuh 72 jam dan 96 jam, membuat transformasi keton 1b tidak efisien. Miskin transformasi keton
aktivitas
1b tidak efisien. enzim
Aktivitas mungkin
enzim karena
yang buruk produksi
mungkin beberapa
disebabkan metabolit
oleh produksi yang menonaktifkan enzim.
beberapa
metabolit yang menonaktifkan enzim. Transformasi keton 1b dengan sel yang tumbuh banyak digunakan
Transformasi keton 1b dengan sel yang sedang tumbuh menggunakan lebih banyak enzim daripada dengan
enzim yang sistem
larutenzim, tetapi waktu
lebih banyak yang
daripada diperlukan
dengan untuk
sistem transformasi
enzim yang larut,dengan sel-sel
tetapi waktu yang
yang tumbuh tidak
dibutuhkan lebih
untuk pendek.
transformasi
Hal ini dimungkinkan karena sistem enzimatik dengan sel-sel yang tumbuh bekerja di tempat
dengan sel-sel yang tumbuh tidak lebih pendek. Hal ini dimungkinkan karena sistem enzimatis semakin berkembang yang tidak bersih
lingkungan (dengan sel, substrat dan metabolit yang tidak digunakan,
dll.). sel bekerja di lingkungan yang tidak bersih (dengan sel, substrat dan metabolit yang tidak digunakan, dll.).

100

80

60

40

20

0
-1 4 9 14 19 24

Waktu Transformasi (h)

Gambar 1. Pengaruh
Gambar umur
1. Pengaruh umur pertumbuhan
pertumbuhan sel R. rubrasel R. rubra
AS 2.2241 AS
terhadap 2.2241keton
transformasi terhadap
1b transformasi keton 1b
(transformasi dilakukan dengan sel tumbuh R. rubra AS 2.2241, dan keton 1b (transformasi dilakukan dengan sel tumbuh R.
rubra AS 2.2241, dan ditambahkan keton 1b )
ditambahkan pada fase pertumbuhan yang berbeda: biru mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 24 jam
pertumbuhan; merah pada fase pertumbuhan yang berbeda: biru mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 24 jam pertumbuhan; merah mewakili
mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 48 jam pertumbuhan; hijau mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada
72 jam dari data untuk 1b yang ditambahkan pada 48 jam pertumbuhan; hijau mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 72 jam pertumbuhan;
pertumbuhan; ungu mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 96 jam
pertumbuhan). ungu mewakili data untuk 1b yang ditambahkan pada 96 jam pertumbuhan).

2.1.2. Menumbuhkan Biotransformasi Sel Keton 1a–1n

2.1.2. Menumbuhkan Biotransformasi Sel Keton 1a–1n
Kami selanjutnya mengalihkan perhatian kami ke ruang lingkup substrat dan batasan sel yang tumbuh dari
strain R. rubra AS 2.2241 untuk pengurangan keton prokiral 1a-1n. 13 keton aromatik lainnya Kami selanjutnya
mengalihkan perhatian kami ke ruang lingkup substrat dan batasan sel-sel strain yang tumbuh
yang secara struktural terkait erat dengan substrat uji utama 1b diuji (Gambar 2) di bawah R. rubra
AS 2.2241 untuk reduksi keton prokiral 1a–1n. 13 keton aromatik lainnya yang
kondisi yang dioptimalkan (penambahan substrat 10 mM pada awal fermentasi dan
secara inkubasi
struktural terkait erat dengan substrat uji utama 1b diuji (Gambar 2) di bawah kondisi optimal
selama 72 jam pada suhu 28 °C dalam medium buffer RM1 pada pH 7,0, dengan hasil yang disajikan
pada Tabel 3. kondisi
Karena produk(penambahan substrat
reduksi rasemat yang 10sesuai
mM pada awal fermentasi
(±)-ÿ-fenilalkohol dan (kecuali
2a–2m inkubasi2b)
selama
tidak72 jam pada
tersedia secara komersial,
28 C dalam bufferdiperoleh
mereka medium dengan
RM1 pada pH 7.0),keton
mereduksi dengan hasil yang
aromatik disajikan pada Tabel 3. Karena sesuai
1a, 1c-1m
analisis dengan natriumrasemat
produk reduksi borohidrida dalam metanol
(±)-ÿ-fenilalkohol [38] dan
2a–2m digunakan
(kecuali sebagai
2b) tidak senyawa
tersedia secarastandar untuk
komersial,
produk bioreduksi melalui HPLC kiral. Spektrum NMR sesuai dengan yang
dilaporkan diperoleh dengan reduksi keton aromatik 1a, 1c-1m dengan natrium borohidrida dalam
literatur [35,39-43].
metanol [38] dan digunakan sebagai senyawa standar untuk analisis produk bioreduksi melalui kiral
Untuk substrat (1a–1i) dengan gugus penarik elektron seperti –Br, –NO2, –CF3 dalam HPLC. Spektrum
NMR sesuai dengan
orto-, yang dilaporkan
atau meta-, atau posisidalam literatur3,[35,39-43].
para (Tabel entri 1–9), reaksi berjalan lancar dalam semua kasus Untuk substrat
untukdengan
(1a–1i) menghasilkan produkelektron
gugus penarik reduksi yang sesuai
seperti dengan– hasil
–Br, –NO2, CF3 lebih dari 99% dan 99% ee. Sebaliknya, tidak ada
di keduanya
substrat (1j, 1k, 1l) dengan gugus pelepas elektron pada
para (Tabel 3, entri 1–9), reaksi berlanjut lancar dalam semua kasus posisi para yang diterima posisi orto-, atau meta-, atau
oleh enzim (Tabel 3, entri 10-12), menunjukkan bahwa kelompok penarik elektron mungkin bermain untuk
menghasilkan produk reduksi yang sesuai dengan hasil lebih dari 99% dan 99% ee. Sebaliknya,
peran penting untuk orientasi yang tepat dari keton di situs aktif enzim. Namun, tidak
ada substrat (1j, 1k, 1l) dengan gugus pelepas elektron pada posisi para yang diterima
ketika substrat dengan gugus penarik elektron pada posisi orto dan para (1m) atau oleh enzim (Tabel 3, entri
10-12), menunjukkan bahwa gugus penarik elektron mungkin berperan
peran penting untuk orientasi yang tepat dari keton di situs aktif enzim. Namun,
ketika substrat dengan gugus penarik elektron pada posisi orto dan para (1m) atau keduanya
meta- dan para-posisi (1n) digunakan, tidak ada produk reduksi yang diinginkan diperoleh, yaitu:
mungkin karena strukturnya yang lebih besar. Konfigurasi absolut dari produk reduksi
(2a-2i) ditentukan dengan membandingkan tanda-tanda rotasi spesifik yang diukur dengan yang dilaporkan dalam
literatur [35,39-43].
Machine TranslatedMar.
byNarkoba
Google2018, 16, x UNTUK PEER REVIEW 6 dari 15

baik meta- dan para-posisi (1n) digunakan, tidak ada produk reduksi yang diinginkan diperoleh, yang mungkin karena
strukturnya yang lebih besar. Konfigurasi absolut dari produk reduksi (2a-2i) ditentukan dengan membandingkan tanda-tanda
Mar. Narkobarotasi
2018, tertentu
16, 62 yang diukur dengan yang dilaporkan dalam literatur [35,39-43]. 6 dari 15

Gambar 2. Keton aromatik terkait struktural yang digunakan untuk bioreduksi dengan menumbuhkan sel R.
rubra AS Gambar 2. Keton aromatik terkait struktural yang digunakan untuk bioreduksi dengan menumbuhkan sel R. rubra AS
2.2241.
2.2241.

Tabel 3. Pengurangan stereoselektif keton prokiral dengan sel yang tumbuh dari R. rubra AS 2.2241 [a].
Tabel 3. Reduksi stereoselektif keton prokiral dengan pertumbuhan sel R. rubra AS 2.2241 [a] .
Substrat Masuk Hasil (%) [b] Ee (%) [b] Konfigurasi. [c]
1 1a 99 Substrat 1b 99 S
1a 1c [c]
Pintu masuk 2 Hasil99(%) [b] 99 Ee (%) [b] S Konfigurasi

1 3 99
99 99 99 S S
2 4 1b 1d 99
99 99 99 S S
3 5 1c 1e
1d 99
99 99 99 S S
4 6 1f 99
99 99 99 S S
5 7 1e 99
99 99 99 S S
1g
6 1f 1h 99 99 S
8 1g 99 99 S
7 99 99 S
9 1i 1h1j 99 99 S
8 1i 1k 99 99 S
10 nc nc dan
1j
9 11 1l 1k
nc99 nc 99 dan S
1m
10 nc nc dan
12 1l 1n1m nc nc nc dan
11 nc nc dan
13 nc nc nc dan
12 _ nc dan
14 nc dan
13 nc dan
[a] Kondisi14
reaksi: 200 mL medium
1n RM1, satu loop koloni
nc tunggal R. rubrancAS 2.2241, 10 dan
mM substrat 1a–1n, diinokulasi pada 28 °C, 220 rpm selama 72 jam; [b] Hasil dan ee ditentukan oleh [a]
Kondisi reaksi: 200HPLC
analisis mL media RM1,
kiral satu loopdengan
dilengkapi koloni tunggal
kolomR.kiral
rubra AS 2.2241,
OD-H 10 mM
kiral; [c] Konfigurasi absolut substrat
1a–1n, diinokulasi pada 28 C, 220 rpm selama 72 jam; [b] Hasil dan ee ditentukan dengan analisis HPLC kiral
dari produk reduksi ditentukan dengan membandingkan tanda-tanda spesifik yang diukur
dari rotasi yang dilengkapi dengan kolom kiral OD-H Chiracel; [c] Konfigurasi absolut dari produk reduksi adalah
dengan yang dilaporkan dalam literatur [35,39-43]; nc = tidak ada konversi; nd = tidak ditentukan. ditentukan dengan
membandingkan tanda-tanda spesifik yang diukur dari rotasi dengan yang dilaporkan dalam literatur [35,39-43];
nc = tidak ada konversi; nd = tidak ditentukan.
2.2. Pengurangan dengan Sel Istirahat

2.2. Pengurangan dengan Sel Istirahat

2.2.1. Optimalisasi Biotransformasi Sel Istirahat

Transformasi keton 1b menggunakan sel istirahat dari berbagai usia menunjukkan jenis yang berbeda 2.2.1.
Optimalisasi Biotransformasi Sel Istirahat
dari pola transformasi. Di sini, sel-sel ditumbuhkan di bawah kondisi pertumbuhan dalam
nutrisi . Transformasi keton 1b menggunakan sel-sel istirahat dari berbagai usia menunjukkan berbagai jenis
pola transformasi. Di sini, sel-sel ditumbuhkan dalam kondisi pertumbuhan dalam media nutrisi
selama 24, 48, 72 dan 96 jam, dan sel-sel dipanen dari setiap fase dan dicuci beberapa kali dengan
buffer fosfat (0,1 M, pH 7,0). Pemisahan ketat pertumbuhan mikroba dan biotransformasi
menawarkan banyak keuntungan: sel yang dicuci disuspensikan ke buffer (100 mM, pH 7,0) untuk berubah
keton 1b (10 mM) pada 28 C dalam pengocok orbital (220 rpm). Efek suhu (dalam
kisaran 20-35 C) dan nilai pH (pH 6-8) pada biotransformasi dievaluasi menggunakan istirahat
sel dikumpulkan setelah 48 jam pertumbuhan. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 4, sel istirahat yang tumbuh 24 jam memberikan
konversi (89% hasil, 99% ee) pada 25 C dengan pH 7,0 buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM) setelah
24 jam. Oleh karena itu, kondisi reaksi ini digunakan untuk menguji lebih lanjut aktivitas sel-sel yang beristirahat
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 7 dari 15

ditanam selama 48 jam, 72 jam dan 96 jam. Yang memuaskan, dalam setiap kasus, keton 1b direduksi menjadi (S)-2b dengan
hasil yang baik dan enantioselektivitas yang sangat baik. Sel istirahat yang tumbuh selama 48 jam menunjukkan sedikit lebih baik
aktivitas daripada yang diperoleh untuk sel istirahat yang tumbuh 72 jam dan 96 jam, dan sel yang tumbuh 48 jam
sel istirahat dipilih untuk semua studi lebih lanjut dari biotransformasi sel istirahat.

Tabel 4. Reduksi 1b dengan sel istirahat R. rubra AS 2.2241 dari berbagai usia
[sebuah]
.

Pintu masuk Jenis Sel Istirahat Kondisi Reaksi Hasil 2b (%) [b] Ee dari 2b (%) [b]
1 25 C, pH 6, 24 jam 59 99 (S)
2 25 C, pH 7, 24 jam 89 99 (S)
3 24 jam-tumbuh 25 C, pH 8, 24 jam 52 99 (S)
4 20 C, pH 7, 24 jam 63 99 (S)
5 35 C, pH 7, 24 jam 41 99 (S)

6 48 jam 25 C, pH 7, 24 jam 99 99 (S)

7 tumbuh 72 25 C, pH 7, 24 jam 81 99 (S)
8 jam tumbuh 25 C, pH 7, 24 jam 77 99 (S)

96 jam tumbuh [a] Kondisi reaksi: 3 g sel istirahat R. rubra AS 2.224 dari usia yang dibutuhkan, 10 mM substrat 1b, dan 0,5 g
glukosa dalam 10 mL buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, diberikan nilai pH), diinokulasi pada suhu tertentu, 220 rpm
selama 24 jam; [b] Hasil dan ee ditentukan menggunakan instrumen HPLC kiral yang dilengkapi dengan kiral OD-H kiral
kolom; [c] Konfigurasi absolut dari produk reduksi ditentukan dengan membandingkan tanda-tanda spesifik
rotasi diukur dengan yang dilaporkan dalam literatur [35,39-43].

Salah satu pertimbangan penting untuk produksi industri adalah kapasitas untuk mendaur ulang katalis.
Oleh karena itu, percobaan dilakukan untuk menguji daur ulang sel istirahat R. rubra AS
2.2241 untuk pengurangan 1b sebagai contoh. Untuk hasil yang dirangkum dalam Gambar 3, setiap reaksi
dilakukan dalam 10 mL buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 7,0) dengan 3 g sel basah, 10 mM
substrat dan 0,5 g glukosa dan dikocok pada suhu 25 C selama 23 jam. Pada akhir reaksi, sel-sel
disentrifugasi, dicuci dua kali dengan buffer yang sama [buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 7.0)] dan
digunakan kembali untuk siklus berikutnya di bawah kondisi reaksi yang sama. Sel istirahat strain R. rubra AS 2.2241
menunjukkan aktivitas tinggi dan konversi lengkap selama sembilan siklus (Gambar 3). Hanya sedikit penurunan
diamati pada siklus 10, sedangkan hampir tidak ada aktivitas (hasil 2,6% dari produk yang diinginkan) ditemukan
pada siklus 11. Hebatnya, produk reduksi ee tidak menunjukkan variasi yang signifikan dan tetap
di atas 99%. Penggunaan kembali yang tinggi dari seluruh sel strain R. rubra AS 2.2241 dapat dikaitkan
terhadap ekspresi keton reduktase yang diimobilisasi secara alami dalam sel, yang saat ini sedang
Mar. Drugs 2018, 16, x FOR PEER REVIEW dilaksanakan 8 dari 15
di laboratorium kami.

120 100
90
100
80
70
80
60
(%)
ee

60 50
Menghasilkan
(%)

40
40
30
20
20
10
0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Siklus

Gambar 3. Reusabilitas sel istirahat R. rubra AS 2.2241 dari 48 jam usia dewasa dalam transformasi
Gambar 3. Reusabilitas sel istirahat R. rubra AS 2.2241 dari 48 jam usia dewasa dalam transformasi
keton
keton 1b
1b (dalam
(dalam setiap
setiap kasus
kasus konsentrasi
konsentrasi awal
awal 1b
1b adalah
adalah 10
10 mM).
mM). Batang mewakili
Bar mewakili hasil,
hasil, persegi
persegi
mewakili
mewakili nilai
nilai ee.
ee .Hasil
Hasildan
dannilai
nilaiee
eeditentukan
ditentukanoleh
olehHPLC
HPLCkiral.
kiral.

2.2.2. Biotransformasi Sel Istirahat dari Keton 1a–1n

Di bawah kondisi yang dioptimalkan untuk biotransformasi sel istirahat, 14 substrat yang ditunjukkan pada Gambar 2
digunakan lagi untuk menguji cakupan dan batasan substrat. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5, untuk sebagian besar
substrat (1a–1l, Tabel 5, entri, 1-12), hasil yang sama diperoleh seperti yang diperoleh dengan
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 8 dari 15

2.2.2. Biotransformasi Sel Istirahat dari Keton 1a–1n

Di bawah kondisi yang dioptimalkan untuk biotransformasi sel istirahat, 14 substrat ditunjukkan pada
Gambar 2 kembali digunakan untuk menguji ruang lingkup dan batasan substrat. Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 5, untuk sebagian besar
substrat (1a-1l, Tabel 5, entri, 1-12), hasil yang sama diperoleh seperti yang diperoleh dengan
biotransformasi sel yang sedang berkembang. Anehnya, substrat 1m dan 1n juga diubah dengan istirahat
sel, dan produk yang sesuai diperoleh dalam hasil 63% dengan 28% ee dan hasil 55% dengan 99%
ee, menunjukkan bahwa mungkin ada enzim berbeda yang ada di sel istirahat yang bisa
untuk menerima substrat dengan struktur besar. Produksi beberapa metabolit selama pertumbuhan
biotransformasi sel menonaktifkan enzim; oleh karena itu, tidak ada konversi untuk substrat 1m
dan 1n, seperti yang ditemukan oleh Banerjee [44] untuk perbandingan aktivitas oksidase Curvularia lunata di
biotransformasi sel tumbuh dan biotransformasi sel istirahat.

Tabel 5. Reduksi stereoselektif keton prokiral dengan sel istirahat R. rubra AS 2.2241 [a] .

[c]
Pintu masuk
Substrat Hasil (%) [b] Ee (%) [b] Konfigurasi

1 1a 99 99 S
2 1b 99 99 S
3 1c 99 99 S
4 1d 99 99 S
5 1e 99 99 S
6 1f 99 99 S
7 1g 99 99 S
8 1h 99 99 S
9 1i 99 99 S
10 1j nc nc dan
11 1k nc nc dan
12 1l nc nc dan
13 1m 63 28 S
14 1n 55 99 S
[a] Kondisi reaksi: 10 mL buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 7,0), 3 g sel basah berumur 48 jam, 10 mM
berbagai keton aromatik, 0,5 g glukosa, 25 C, 24 jam; [b] Hasil dan ee ditentukan dengan instrumen HPLC kiral
dilengkapi dengan kolom kiral OD-H Chiracel; [c] Konfigurasi absolut dari produk reduksi adalah
ditentukan dengan membandingkan tanda-tanda spesifik dari rotasi yang diukur dengan yang dilaporkan dalam literatur [35,39-43];
nc = tidak ada konversi; nd = tidak ditentukan.

3. Diskusi

Pengembangan biokatalisis membutuhkan biokatalis baru dalam bentuk enzim yang diisolasi
atau seluruh sel [45], yang menyebabkan meningkatnya permintaan untuk biokatalis yang kuat dan efisien. jamur dari
lingkungan laut secara menyeluruh disesuaikan untuk bertahan hidup dan tumbuh di bawah kondisi yang keras [46].
Karakteristik terkait habitat seperti itu adalah fitur yang diinginkan dari perspektif bioteknologi umum
dan merupakan kunci penting untuk mengeksploitasi potensi enzimatik mikroorganisme [47-50]. Memang, jamur
inang enzim baru yang menunjukkan aktivitas optimal pada nilai ekstrim konsentrasi garam, pH dan
suhu, dibandingkan dengan enzim yang diisolasi dari asal terestrial [51-53]. Keunggulan tersebut, dalam
Selain sifat kimia dan stereokimia mereka dan sumber yang tersedia (misalnya, sumber laut)
enzim yang diwakili oleh mikroorganisme atau jamur, tumbuhan atau hewan; kemudahan pertumbuhan), membuat laut
enzim biokatalis ideal untuk kimia halus dan sektor farmasi; enzim ini harus
dieksplorasi secara luas [28-30,48,54-56].
Sel yang tumbuh berada di bawah kondisi pertumbuhan sel yang berproliferasi dan aktif secara metabolik,
yang tersuspensi dalam media nutrisi penting. Tumbuh biotransformasi sel mirip dengan
fermentasi mikroba, di mana sejumlah substrat ditambahkan pada saat inokulasi
atau pada fase pertumbuhan reguler dan diubah menjadi produk yang diinginkan melalui satu atau beberapa enzimatik
reaksi selama kultur sel. Biotransformasi stabil karena lingkungan tumbuh yang cocok untuk
sel. Biotransformasi satu langkah ini menunjukkan keuntungan substansial seperti
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 9 dari 15

pertumbuhan dan biotransformasi, dan langkah-langkah operasi sederhana, tetapi biasanya substrat memiliki efek
penghambatan pada pertumbuhan sel yang mungkin menjadi faktor pembatas untuk pertumbuhan biotransformasi sel.
Oleh karena itu, pendekatan langsung untuk bioreduksi senyawa karbonil menjadi alkohol kiral enansiomer yang
diinginkan menggunakan biotransformasi sel yang sedang tumbuh masih belum dijelaskan.
Sel istirahat mengacu pada kelompok sel aktif yang disediakan dalam larutan buffer di bawah kondisi non-
tumbuh tanpa nutrisi dan hanya digunakan sebagai biokatalis untuk menghasilkan banyak senyawa [57].
Biotransformasi sel istirahat menunjukkan keunggulan tertentu dibandingkan biotransformasi sel yang sedang
tumbuh, termasuk tidak ada batasan konsentrasi substrat dan pemisahan produk hilir yang nyaman. Selain itu,
pemodelan dan simulasi proses biotransformasi sel istirahat telah berhasil digunakan untuk memahami proses yang
diselidiki, mengidentifikasi parameter pembatas, dan mengoptimalkan kondisi reaksi. Namun, untuk aplikasi industri,
biotransformasi sel yang sedang tumbuh menunjukkan efisiensi yang lebih tinggi daripada biotransformasi sel yang
beristirahat karena persiapan dan penyimpanan katalis yang rumit.

Jadi, kami membandingkan produktivitas jamur laut R. rubra AS 2.2241 dari biotransformasi sel
pertumbuhan satu langkah dan biotransformasi sel istirahat dua langkah dalam alkohol murni enansiomer.
Kedua sistem reaksi dioptimalkan dengan hati-hati untuk sintesis skala 10 mM, menghasilkan konversi yang
baik dan enantioselektivitas yang sangat baik. Di bawah kondisi yang dioptimalkan, R. rubra AS 2.2241 dapat
tumbuh dengan adanya keton 1a-1i dan dapat mengubahnya menjadi alkohol yang sesuai (S)-2a-2i,
menawarkan alternatif yang menarik untuk sintesis alkohol enantiopure. Sel istirahat dari berbagai usia juga
sangat efektif dalam mengubah keton 1a-1i, termasuk 1m dan 1n. Sel istirahat yang tumbuh selama 48 jam
dapat digunakan kembali selama sembilan siklus tanpa kehilangan aktivitas yang signifikan sambil mempertahankan hingga 99%
Pekerjaan lebih lanjut akan difokuskan pada penghapusan penghambatan substrat untuk meningkatkan produksi dan
pertumbuhan sel dalam biotransformasi sel yang sedang tumbuh.

4. Bahan dan Metode

4.1. Umum

Semua bahan kimia dibeli dari Sigma-Aldrich (Schnelldorf, Jerman) dan digunakan tanpa pemurnian lebih
lanjut kecuali ditentukan lain. Komponen media kultur diperoleh dari BD (Becton, Dickinson and Company, Bremen,
Jerman).
Spektrum 1H dan 13C NMR direkam menggunakan Bruker Advance 400 (Karlsruhe, Jerman)
(400 MHz dan 100 MHz, masing-masing) instrumen dan secara internal direferensikan ke sinyal pelarut sisa.
Data untuk 1H NMR dilaporkan sebagai pergeseran kimia (d ppm), multiplisitas (s = singlet, d = doublet, t = triplet, q
= quartet, m = multiplet), integrasi, konstanta kopling (Hz) dan penugasan. Data untuk 13C NMR dilaporkan dalam
hal pergeseran kimia. Rotasi optik diperoleh pada 20 C menggunakan polarimeter PerkinElmer 241 (Shanghai, Cina)
(garis natrium D). Kromatografi kolom dilakukan dengan silika gel (0,060-0,200 mm, diameter pori sekitar 6 nm) dan
campuran petroleum eter (PE) dan etil asetat (EtOAc) sebagai pelarut. Kromatografi lapis tipis (KLT) dilakukan pada
pelat silika gel 60-F 0,20 mm. Larutan organik dipekatkan di bawah tekanan tereduksi dengan rotavapor.

4.2. Sintesis Kimia Rasemat Standar -Phenylalcohols 2a –2f, 2m dan 2n

Sepuluh mmol NaBH4 ditambahkan ke larutan dingin (0 C) 2,5 mmol dari setiap substrat spesifik (1a-1f,
1m dan 1n) dalam 50 mL metanol. Setelah diaduk selama 10 menit, campuran dihangatkan sampai suhu
kamar dan diaduk selama 3-4 jam lagi untuk menyelesaikan reduksi. Setelah pendinginan dengan 2 M HCl
hingga pH 7,0, campuran diekstraksi dengan EtOAc (50 mL × 3). Fasa organik dicuci dengan air garam,
dikeringkan di atas Na2SO4, disaring dan dipekatkan dalam vakum. Residu dimurnikan dengan kromatografi
flash pada silika gel (eluen: EtOAc/PE 1:20) untuk menghasilkan alkohol rasemat 2a–2f, 2m dan 2n (lihat
Bahan Tambahan untuk data spektroskopi NMR).
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 10 dari 15

4.3. Mikroorganisme

Jamur laut strain Penicillium citrinum GIM 3.458, Penicillium citrinum GIM 3.251, Penicillium
citrinum GIM 3.100, Aspergillus sclerotiorum AS 3.2578, Aspergillus sydowii AS 3.7839,
Aspergillus sydowii AS 3.641612, Geotrichum candidum GIM 2.361tordo GIM 2.361
mucilaginosa GIM 2.157, Geotrichum candidum AS 2.1183, Geotrichum candidum AS 2.498
dan Rhodotorula rubra AS 2.2241 diisolasi dari berbagai koleksi isolat dari sedimen laut
dari Provinsi Guangdong, Cina. Semua galur yang digunakan dalam penelitian ini disimpan dan tersedia
secara komersial di Pusat Koleksi Budaya Guangdong atau Pusat Koleksi Budaya Mikrobiologi Umum
China .
Jamur laut dipelihara di piring agar pada 4 C dan disubkultur secara berkala.
Medium (RM1) yang digunakan untuk budidaya mengandung glukosa (15 g/L), pepton (5 g/L), ekstrak ragi
(grease, 5 g/L), dinatrium hidrogen fosfat (0,5 g/L), natrium dihidrogen fosfat ( 0,5 g/L), magnesium sulfat
(0,5 g/L) dan natrium klorida (10 g/L) dan pH akhir 7,0; media ini disterilkan pada suhu 115 C dalam autoklaf
selama 25 menit. Sebuah loop dari koloni tunggal dipotong dari kultur stok agar dan digunakan untuk
menginokulasi media tertentu dalam labu Erlenmeyer yang sesuai. Kultur ini dikocok secara timbal balik
(220 ppm) pada suhu 28 C untuk waktu tertentu.

4.4. Transformasi dengan Sel Tumbuh

Sel tumbuh R. rubra AS 2.2241 digunakan untuk transformasi 1-(3-bromofenil)etanon (1b). 1-(3-
bromofenil)etanon (1b) ditambahkan pada saat inokulasi media RM1 seperti dijelaskan di atas oleh R. rubra
AS 2.2241; dalam rangkaian percobaan lainnya, 1-(3-bromofenil)etanon (1b) ditambahkan ke sel yang
sedang tumbuh pada fase pertumbuhan yang berbeda, dan transformasi berlanjut.

4.4.1. 1b Ditambahkan pada Saat Inokulasi

Konsentrasi yang berbeda (5-15 mM) dari 1-(3-bromofenil)etanon (1b) ditambahkan secara aseptik ke
dalam labu Erlenmeyer 500 mL yang berisi 250 mL media RM1 steril (pH 7,0). Tiga labu kontrol disiapkan.
Kontrol pertama dibuat dengan 10 mM 1-(3-bromofenil)etanon dalam 250 mL medium RM1, dan labu tidak
diinokulasi dengan R. rubra AS 2.2241. Ini digunakan sebagai kontrol positif untuk 1-(3-bromofenil)etanon
(1b). Kontrol kedua hanya berisi media RM1 tanpa 1-(3-bromofenil)etanon (1b), dan labu diinokulasi dengan
R. rubra AS 2.2241. Hal ini dilakukan untuk memeriksa pertumbuhan R. rubra AS 2.2241 tanpa adanya 1-(3-
bromofenil)etanon (1b).
Kontrol ketiga dibuat dengan 5 g sel mati (berat kering) R. rubra AS 2.2241 dalam media RM1 dengan 10
mM 1-(3-bromofenil)etanon (1b). Ini digunakan untuk menentukan enzim aktif oleh sel. Labu ini tidak
diinokulasi. Semua labu disimpan dalam pengocok orbital yang dikontrol suhu (28 C) pada kecepatan
pengocokan 220 rpm. Sampel dianalisis setelah 24 jam. Sel-sel telah dihapus dengan sentrifugasi pada
4000 rpm dan pada 4 C selama 20 menit. Sel-sel yang dikumpulkan digunakan untuk analisis massa sel.
Supernatan (2 mL) dijenuhkan dengan NaCl diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen HPLC (n-
heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan di
atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.

4.4.2. 1b Ditambahkan pada Fase Pertumbuhan yang Berbeda

Beberapa labu Erlenmeyer 500 mL yang mengandung 250 mL medium RM1 (pH 7,0)
diinokulasi dengan R. rubra AS 2.2241 dan dikultur pada 28 C pada pengocok orbital (220
rpm). Selanjutnya, 10 mM 1-(3-bromofenil)etanon (1b) ditambahkan ke sel yang tumbuh setelah
24, 48, 72, 96 jam inokulasi dalam labu terpisah. Untuk reaksi transformasi, labu diinkubasi lagi
dalam kondisi yang sama. Sampel diambil secara berkala dan disentrifugasi, dan supernatan
(2 mL) dijenuhkan dengan NaCl diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen HPLC.
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 11 dari 15

(n-heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan di
atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.

4.5. Metode Umum untuk Menumbuhkan Biotransformasi Sel

Semua substrat 1a-1n ditambahkan pada saat inokulasi, dan pengaturan reaksi sama dengan "1b
ditambahkan pada saat inokulasi". Setelah inokulasi 72 jam, reaksi dihentikan dengan sentrifugasi pada 4000
rpm dan pada 4 C selama 20 menit untuk menghilangkan sel. Supernatan (2 mL) dijenuhkan dengan NaCl
diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen HPLC (n-heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan
selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan di atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil
dan ee.

4.6. Transformasi dengan Sel Istirahat

R. rubra AS 2.2241 dibudidayakan pada media RM1 (pH 7.0) pada suhu 28 C dengan kecepatan 220 rpm.
Sel dalam kultur umur 24 jam, 48 jam, 72 jam dan 96 jam dipanen dengan sentrifugasi dan dicuci dua kali dengan
100 mM buffer Na2HPO4-KH2PO4 (pH 7,0). Sekitar 3 g sel istirahat berumur 24 jam disuspensikan dalam 10 mL
buffer Na2HPO4-KH2PO4 dengan pH yang dibutuhkan (pH 6,0, 7,0 dan 8,0) yang mengandung 0,5 g glukosa dan
10 mM 1-(3-bromofenil) etanon (1b). Campuran reaksi dikocok (220 rpm) pada suhu tertentu (20 C, 25 C dan 35
C) selama 24 jam dan dihentikan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm dan pada 4 C selama 20 menit untuk
menghilangkan sel. Supernatan (2 mL) dijenuhkan dengan NaCl diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen
HPLC (n-heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan
di atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.
Sel istirahat dari 48 jam, 72 jam dan 96 jam juga disuspensikan dalam 10 mL buffer Na2HPO4-
KH2PO4 (pH 7,0, 100 mM) yang mengandung 0,5 g glukosa dan 10 mM 1-(3-bromofenil)etanon (1b).
Campuran reaksi dikocok (220 rpm) pada 25 C selama 24 jam dan dihentikan dengan sentrifugasi pada 4000
rpm dan pada 4 C selama 20 menit untuk menghilangkan sel. Supernatan (2 mL) dijenuhkan dengan NaCl
diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen HPLC (n-heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan
selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan di atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.

4.7. Dapat didaur ulang

Reaksi dilakukan dengan 10 mM substrat 1b dalam 10 mL buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 7,0)
yang mengandung 0,5 g glukosa dan 3 g sel istirahat berumur 48 jam, dikocok pada suhu 25 C selama 24
jam. h. Pada akhir reaksi, sel disentrifugasi dengan kecepatan 4000 rpm selama 20 menit untuk dipisahkan
dari campuran reaksi, kemudian dicuci dengan buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH 7,0) dan disuspensikan
kembali dalam 10 mL buffer yang sama yang mengandung substrat dan glukosa yang sama. Campuran reaksi
(2 mL supernatan dipisahkan dari sel) dijenuhkan dengan NaCl diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen
HPLC (n-heksana/i-PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan selama 5 menit. Lapisan organik gabungan
dikeringkan di atas Na2SO4 dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.

4.8. Metode Umum untuk Biotransformasi Sel Istirahat

Reaksi dilakukan dalam botol kaca berpenutup ulir 50 mL untuk mencegah penguapan substrat/produk.
Pengocokan dilakukan dalam pengocok ground-top yang dipanaskan pada suhu 25 C dengan 220 rpm.
Kira-kira 3 g sel istirahat berusia 48 jam (sel basah) disuspensikan kembali dalam 10 mL buffer Na2HPO4-
KH2PO4 (100 mM, pH 7,0) yang mengandung 0,5 g glukosa dan 10 mM 1a-1n. Setelah 24 jam, reaksi
dihentikan dengan sentrifugasi pada 4000 rpm dan pada 4 C selama 20 menit untuk menghilangkan sel.
Supernatan (2 mL) dijenuhkan dengan NaCl diikuti dengan ekstraksi dengan 2 × 2 mL eluen HPLC (n-heksana/i-
PrOH = 95/5, v/v) dengan pengocokan selama 5 menit. Lapisan organik gabungan dikeringkan di atas Na2SO4
dan diukur dengan HPLC untuk hasil dan ee.
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 12 dari 15

4.9. Sintesis Skala Preparatif Enansiomer -Phenylalcohols (S)-2a–2i, (S)-2m dan (S)-2n oleh Sel
Istirahat

Untuk isolasi dan karakterisasi produk bioreduksi, reaksi dilakukan pada skala preparatif: 300 g sel
istirahat R. rubra AS 2.2241 disuspensikan kembali dalam 1000 mL buffer Na2HPO4-KH2PO4 (100 mM, pH
7,0) dengan 50 g glukosa dan 10 mM masing-masing substrat (1a-1i, 1m dan 1n). Campuran reaksi diinkubasi
pada 25 C dan dikocok pada 220 rpm selama 24 jam. Sel-sel dihilangkan dengan sentrifugasi dan supernatan
dijenuhkan dengan NaCl. Supernatan diekstraksi dengan EtOAc (1000 mL × 3). Fasa organik dicuci dengan
air garam, dikeringkan di atas Na2SO4, disaring dan dipekatkan dalam vakum. Residu dimurnikan dengan
kromatografi flash pada silika gel (eluen: EtOAc/PE 1:20) untuk menghasilkan alkohol murni enansiomer 2a–
2i, 2m, 2n. Hasil terisolasi dan ee skala persiapan sebanding dengan yang diperoleh dari skrining
biotransformasi.
Data spektroskopi (1H dan 13 C NMR, dan waktu retensi HPLC) dari alkohol enansiomer 2a–2i, 2m dan 2n
sesuai dengan yang diperoleh untuk bentuk rasemat, seperti yang dijelaskan dalam Bahan Tambahan.

4.10. Metode Pengujian

Produk reaksi dianalisis dengan analisis HPLC kiral menggunakan seri Shimadzu LC-10AT VP
(Tokyo, Jepang) dan detektor susunan dioda foto Shimadzu SPD-M10Avp (190–370 nm) dengan
kolom Chiralcel AD-H [eluen: n-heksana /i-PrOH (95:5, v/v), laju aliran: 0,5 mL/menit, suhu kolom 25 C].
Hasil (diukur dengan menggunakan kurva kalibrasi) dan nilai produk ee analit ditentukan oleh analisis HPLC
kiral menurut data waktu retensi berikut: 1-(2-bromofenil)etanon (1a) [1a, 11,85 menit; (R)-2a, 12,71 menit
(S)-2a, 13,23 menit], 1-(3-bromofenil)etanon (1b) [1b, 10,66 menit; (S)-2b, 16,39 menit; (S)-2b, 17,26 menit], 1-
(3-bromofenil)etanon (1c) [1c, 11,21 menit; (S)-2c, 16,83 menit; (R)-2c, 17,99 menit], 1-(2-nitrofenil)etanon (1d)
[1d, 12,54; (R)-2d, 21,33 menit; (S)-2d, 22,63 menit], 1-(3-nitrofenil)etanon (1e) [1e, 21,14 menit; (R)-2e, 26,25
menit; (S)-2e, 27,06 menit], 1-(3-nitrofenil)etanon (1f) [1f, 20,24 menit; (S)-2f, 35,54 menit; (R)-2f, 38,20 menit],
1-(2-(trifluorometil)fenil)etanon (1g) [1g, 12,49 menit; (R)-2g, 11,83 menit; (S)-2g, 12,34 menit], 1-(3-
(trifluorometil)fenil)etanon (1 jam) [1 jam, 11,13 menit; (S)-2j, 14,06 menit; (R)-2h, 15,57 menit], 1-(4-
(trifluorometil)fenil)etanon (1i) [1i, 11,68 menit; (S)-2i, 16,55 menit; dan (R)-2i, 17,79 menit], 1-(2,4-
diklorofenil)etanon (1m) [1m, 15,09 menit; (R)-2m, 19,09 menit; (S)-2m, 21,26 menit], 1-(3,4-diklorofenil)etanon
(1n) [1n, 12,39 menit; (R)-2n, 12,79 menit; dan (S)-2n, 13,67 menit].

Rotasi optik produk yang diisolasi dari reaksi biokatalitik ditentukan dalam kuvet 1-dm menggunakan
polarimeter model 241 Perkin-Elmer dan dirujuk ke Na-D
20
garis. Data eksperimental dan yang dilaporkan tercantum di bawah ini: (S)-2a, [ÿ] D = 62.4 (c 1.00, CHCl3)
27 20
{(S)-1-(2-bromofenil)etanol [ÿ] H = 29,8 (c 0,68, CHCl3) [42]}; (S)-2b, [ÿ] D = 43.9 (c 1.00, CHCl3)
25 20
{(S)-1-(3-bromofenil)etanol [ÿ] D = 27,6 (c 1,00 dalam CHCl3) [35]}; (S)-2c, [ÿ] D = 17,3 (c 1,00, =
21 20
MeOH, {(S)-1-(4-bromofenil)etanol [ÿ] H = 20.6 (c 1,07, MeOH) [39]}; (S)-2d, [ÿ] H +64,9 (c 0,1,
25 20
MeOH) {(S)-1-(2-nitrofenil)etanon [ÿ] H = +18,5 (c 0,23, MeOH) [40]}; (S)-2e, [ÿ] H = 88,5 (c 0,1,
25 20
CHCl3) {(S)-1-(3-nitrofenil)etanon [ÿ] H = 20.5 (c 1.0, CHCl3) [40]}; (S)-2f, [ÿ] H = 67,2 (c 0,1, =
25 20
CHCl3) {(S)-1-(4-nitrofenil)etanon [ÿ] D = 20.5 (c 1.2, CHCl3) [40]}; (S)-2g, [ÿ] D 43.1 (c 0,1,
26 20 =
MeOH) {(S)-1-(2-Trifluoromethylphenyl) etanol [ÿ] 55.1 (c D = 37.7 (c 1.0, CH3OH) [42]}; (S)-2j, [ÿ] D
25
0.2, MeOH) {(S)-1-(3-(trifluoromethyl)phenyl)ethanol [ÿ] D= 21,9 (c 1,40, MeOH) [35]};
20 25
(S)-2i, [ÿ] =D62.2 (c 0.2, CHCl3) {(S)-1-(4-(trifluorometil)fenil)etanol [ÿ] D = 33.7 (c 5.52,
20 25 = 52,4
CHCl3) [35]}; (S)-2m, [ÿ] (c D = 75,05 (c 0,2, CHCl3) {(S)-1-(2,4-diklorofenil)etanol [ÿ] D
20
20
0,55, CHCl3) [43]}; (S)-2n, [ÿ] +35.8D = 30.0 (c 0,3, CHCl3) {(R)-1-(3,4-diklorofenil)etanol [ÿ] =
D
(c 1.00, CHCl3) [41]}.
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 13 dari 15

Bahan Tambahan: Berikut ini tersedia online di www.mdpi.com/1660-3397/16/2/62/s1. Spektrum NMR dan
spektrum HPLC dari semua senyawa ditampilkan.
Ucapan Terima Kasih: Studi ini didanai oleh Program Penelitian Dasar Universitas Sun Yat-Sen (Hibah No. 17lgpy58),
Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam Provinsi Guangdong (Hibah No. 2017A030310232), Yayasan Ilmu Pengetahuan Alam
Nasional China (Hibah No. 41706148) , Proyek Penelitian Persemakmuran Kelautan China (Hibah No. 201305017), dan
dana keuangan khusus untuk pengembangan inovatif proyek percontohan ekonomi kelautan (Hibah No. GD2012-
D01-001).
Kontribusi Penulis: B.-SC dan FZRdS merancang penelitian ini. B.-SC menulis makalah. HL melakukan eksperimen
enzimatik. B.-SC dan LL mengawasi penelitian. Semua penulis memberikan kontribusi substansial untuk pembahasan
data dan menyetujui naskah akhir.
Konflik Kepentingan: Para penulis menyatakan tidak ada konflik kepentingan.

Referensi
1. Lennon, LC; Ramsden, JA Rute asimetris katalitik yang efisien ke 1-aril-2-imidazol-1-il-etanol. Organisasi
Proses Rev. Dev. 2005, 9, 110-112. [CrossRef]
2. Syekh, NS; Entaler, S.; Jung, K; Beller, M. Hidrosilasi keton enantioselektif katalis besi.
Angew. Kimia Int. Ed. 2008, 47, 2497–2501. [CrossRef] [PubMed]
3. Barbieri, C.; Caruso, E.; D'Arrigo, P.; Fantoni, GP; Servi, S. Sintesis kemo-enzim dari (R)- dan (S)-3,4-
dichlorophenylbutanolide intermediate dalam sintesis sertraline. Tetrahedron Asimetri 1999, 10, 3931–3937.
[CrossRef]
4. Quallich, GJ; Woodall, TM Sintesis 4-(S)-(3,4-diklorofenil)-3,4-dihidro-1(2H)-naftalena dengan perpindahan cuprate
SN2 dari alkohol benzilik kiral yang diaktifkan. Tetrahedron 1992, 48, 10239-10248.
[CrossRef]
5. Bu, SK; Gruber, J.; Davis, C.; Newman, L.; Abu-abu, D.; Wang, A.; Parut, J.; Huisman, GW; Sheldon, RA
Proses biokatalitik desain hijau untuk zat antara atorvastatin. Kimia Hijau. 2010, 12, 81–86. [CrossRef]
6. Xie, Y.; Xu, JH; Xu, Y. Isolasi strain basil yang memproduksi keton reduktase dengan toleransi substrat yang tinggi.
Bioresour. teknologi. 2010, 101, 1054–1059. [CrossRef] [PubMed]
7. Zhu, D.; Chandrani, M.; Hua, L. 'Hijau' sintesis blok bangunan farmasi penting: Akses enzimatik ke -kloroalkohol murni
enansiomer. Tetrahedron Asimetri 2005, 16, 3275-3278. [CrossRef]
8. Bu, YP; Liu, H.; Chen, L.; Cui, X.; Zhu, J.; Deng, JG Hidrogenasi transfer asimetris dari keton prokiral dalam media
berair dengan diamina kiral kiral baru yang larut dalam air sebagai ligan. Organisasi Lett. 2003, 5, 2103–2106.
[CrossRef] [PubMed]
9. Sandoval, CA; Ohkuma, T.; Muñiz, K.; Noyori, R. Mekanisme hidrogenasi asimetris keton yang dikatalisis oleh kompleks
BINAP/1,2-diamina-ruthenium(II). Selai. Kimia Soc. 2003, 125, 13490–13503.
[CrossRef] [PubMed]
10. Noyori, R.; Ohkuma, T.; Kitamura, M.; Takaya, H.; Sayo, N.; Kumobayashi, H.; Akutagawa, S. Hidrogenasi asimetris
ester beta-keto karboksilat, akses kimia murni yang praktis ke ester beta-hidroksi dalam kemurnian enansiomer
tinggi. Selai. Kimia Soc. 1987, 109, 5856–5858. [CrossRef]
11. Noyori, R.; Ohkuma, T. Katalisis asimetris oleh rekayasa molekuler arsitektural dan fungsional: Hidrogenasi keton
kemo dan stereoselektif praktis. Angew. Kimia Int. Ed. 2001, 40, 40–73. [CrossRef]
12. Noyori, R. Katalisis asimetris: Ilmu dan peluang (Kuliah Nobel). Angew. Kimia Int. Ed. 2002, 41, 2008–2022. [CrossRef]

13. Brenna, E.; Fuganti, C.; Gatti, FG; Serra, S. Metode biokatalitik untuk sintesis bau yang diperkaya en
senyawa aktif. Kimia Wahyu 2011, 111, 4036–4072. [CrossRef] [PubMed]
14. Choi, JM; Han, SS; Kim, HS Aplikasi industri biokatalisis enzim: Status saat ini dan aspek masa depan. Bioteknologi.
Adv. 2015, 33, 1443–1454. [CrossRef] [PubMed]
15. Torrelo, G.; Hanefeld, U.; Hollmann, F. Biokatalisis. Katalis. Lett. 2015, 145, 309–345. [CrossRef]
16. Albarranvelo, J.; Gonzalezmartínez, D.; Gotorfernández, V. Biokatalisis stereoselektif: Sebuah teknologi matang untuk
sintesis asimetris dari blok bangunan farmasi. Biokatalis. Biotransformasi. 2018, 36, 102–130.
[CrossRef]
17. Sheldon, RA; Woodley, JM Peran Biocatalysis dalam kimia berkelanjutan. Kimia Wahyu 2018, 118, 801–838.
[CrossRef] [PubMed]
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 14 dari 15

18. Wada, M.; Kataoka, M.; Kawabata, H.; Yasohara, Y.; Kizaki, N.; Hasegawa, J.; Shimizu, S. Pemurnian dan karakterisasi
karbonil reduktase yang bergantung pada NADPH, terlibat dalam reduksi stereoselektif etil 4-kloro-3-oksobutanoat, dari
Candida magnolia. Bioteknologi. Biokimia. 1998, 62, 280–285. [CrossRef]
19. Yamamoto, H.; Mitsuhashi, K.; Kimoto, N.; Esaki, N.; Kobayshi, Y. Regenerator NADH yang kuat: Peningkatan
format dehidrogenase tahan -haloketon. aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 2005, 67, 33–39. [CrossRef]
[PubMed]

20. Kamu, T.; Yan, M.; Xu, L.; Cao, H.; Li, ZJ; Chen, Y.; Li, SY; Ying, HJ Sebuah karbonil reduktase baru dari Pichia stipitis
untuk produksi etil (S)-4-kloro-3-hidroksibutanoat. Bioteknologi. Lett. 2009, 31, 537–542.
[CrossRef] [PubMed]
21. Yasohara, Y.; Kizaki, N.; Hasegawa, J.; Wada, M.; Kataokac, M.; Shimizu, S. Stereoselective reduksi alkil 3-oksobutanoat
oleh reduktase karbonil dari Candida magnolia. Tetrahedron Asimetri 2001, 12, 1713–1718.
[CrossRef]
22. Goldberg, K.; Schroer, K.; Lutz, S.; Liese, A. Reduksi keton biokatalitik—Alat yang ampuh untuk produksi alkohol kiral—
Bagian I: Proses dengan enzim yang diisolasi. aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 2007, 76, 237–248.
[CrossRef] [PubMed]
23. Goldberg, K.; Edegger, K.; Kroutil, W.; Liese, A. Mengatasi batasan termodinamika dalam reaksi transfer hidrogen asimetris
yang dikatalisis oleh sel utuh. Bioteknologi. Bioeng. 2006, 95, 192–198. [CrossRef]
[PubMed]
24. Inoue, K.; Makino, Y.; Itoh, N. Produksi alkohol (R)-kiral dengan bioreduksi transfer hidrogen dengan Leifsonia alkohol
dehidrogenase (LSADH) yang bergantung pada NADH. Tetrahedron Asimetri 2005, 16, 2539–2549.
[CrossRef]
25. Milner, SE Tren terbaru di seluruh sel dan enzim terisolasi dalam sintesis enantioselektif. Arkivoc 2012,
2012, 321–382.
26. Wachtmeister, J.; Rother, D. Kemajuan terbaru dalam teknik biokatalisis sel utuh yang menjembatani dari investigasi
hingga skala industri. Curr. pendapat. Bioteknologi. 2016, 42, 169–177. [CrossRef] [PubMed]
27. Wohlgemuth, R. Biocatalysis—Kunci kimia industri yang berkelanjutan. Curr. pendapat. Biol Sel. 2010, 21, 713–724.
[CrossRef] [PubMed]
28. Rocha, LC; Ferreira, HV; Pimenta, EF; Berlinck, RGS; Rezende, MOO; Landgraf, MD; Seleghim, MHR; Set, LD; Porto, ALM
Biotransformasi -bromoacetophenones oleh jamur laut Aspergillus sydowii. Mar. Bioteknologi. 2010, 12, 552–557.
[CrossRef] [PubMed]
29. Rocha, LC; Ferreira, HV; Luiz, RF; Set, LD; Porto, ALM Bioreduksi stereoselektif 1-(4-metoksifenil)etanon oleh seluruh sel
jamur turunan laut. Mar. Bioteknologi. 2012, 14, 358–362.
[CrossRef] [PubMed]
30. Rocha, LC; Seleghim, MHR; Comasseto, JV; Set, LD; Porto, ALM Bioreduksi stereoselektif keton -azido oleh seluruh sel
jamur yang berasal dari laut. Mar. Bioteknologi. 2015, 17, 736–742. [CrossRef]
[PubMed]
31. Chen, B.-S.; Yang, L.-H.; Kamu, J.-L.; Huang, T.; Ruan, Y.-P.; Fu, J.; Huang, P.-Q. Sintesis diastereoselektif
dan bioaktivitas rantai panjang anti-2-amino-3-alkanol. Eur. J. Med. Kimia 2011, 46, 5480–5486. [CrossRef]
[PubMed]
32. Chen, B.-S.; Hanefeld, U. Persiapan enantioselektif (R) dan (S)-3-hydroxycyclopentanone dengan resolusi kinetik. J. Mol.
Katalis. B. Enzim. 2013, 85–86, 239–242. [CrossRef]
33. Chen, B.-S.; Resch, V.; Sering, LG; Hanefeld, U. Enantioselective Michael adisi air. Kimia Eur. J.
2015, 21, 3020–3030. [CrossRef] [PubMed]
34. Chen, B.-S.; Liu, H.; de Souza, FZR; Liu, L. Mikroorganisme laut toleran pelarut organik sebagai katalis untuk resolusi kinetik
dari keton -hidroksi siklik. Mar. Bioteknologi. 2017, 19, 351–360. [CrossRef] [PubMed]
35. Kantam, ML; Lah, S.; Yadav, J.; Likhar, Humas; Sreedhar, B.; Jha, S.; Bhargava, S.; Udayakiran, M.; Jagadeesh, B.
Katalis hidrotalsit tembaga-aluminium yang efisien untuk hidrosilasi asimetris keton pada suhu kamar. Organisasi Lett.
2008, 10, 2979–2982. [CrossRef]
36. Chandran, P.; Das, N. Peran plasmid dalam degradasi minyak diesel oleh spesies ragi yang diisolasi dari tanah yang
terkontaminasi hidrokarbon minyak bumi. Mengepung. teknologi. 2012 , 33,645–652. [CrossRef] [PubMed]
37. Du, PX; Wei, P.; Lou, WY; Zong, MH Biocatalytic anti-Prelog reduksi keton prokiral dengan seluruh sel Acetobacter
pasteurianus GIM1.158. Mikrob. Fakta Sel. 2014, 13, 84. [CrossRef] [PubMed]
Machine Translated by Google

Mar. Narkoba 2018, 16, 62 15 dari 15

38. De Oliveira, JR; Seleghim, MHR; Porto, ALM Biotransformasi methylphenylacetonitriles oleh strain jamur laut Brasil Aspergillus
sydowii CBMAI 934: Reaksi ramah lingkungan. Mar. Bioteknologi. 2014, 16, 156–160. [CrossRef] [PubMed]

39. Adachi, S.; Harada, T. Reaksi aldol mukaiyama asimetris dari keton nonaktif yang dikatalisis oleh oxazaborolidinone turunan
allo-treonin. Organisasi Lett. 2008, 10, 4999–5001. [CrossRef] [PubMed]
40. Barros-Filho, BA; de Oliveira, MCF; Lemo, TLG; de Mattos, MC; de Gonzalo, G.; Gotor-Fernandez, V.; Gotor, V. Lentinus
strigellus: Biokatalis stereoselektif serbaguna baru untuk bioreduksi keton prokiral. Tetrahedron Asimetri 2009, 20, 1057–
1061. [CrossRef]
41. Cheemala, MN; Gayral, M.; Coklat, JM; Rossen, K.; Knochel, P. Parasiklofan fosfina baru untuk hidrogenasi keton prokiral
yang dikatalisis ruthenium sangat enansioselektif. Sintesis 2007, 24, 3877–3885.
[CrossRef]
42. Martins, JED; Morris, DJ; Wills, M. Hidrogenasi keton asimetris menggunakan kompleks Ir(III) ligan N-alkil-N'-tosil-1,2-
etanediamine. Lett tetrahedron. 2009, 50, 688–692. [CrossRef]
43. Salvi, NA; Chattopadhyay, S. Reduksi asimetris arilalkanon tersubstitusi halo dengan Rhizopus
arrhizus. Tetrahedron Asimetri 2008, 19, 1992–1997. [CrossRef]
44. Banerjee, UC Transformasi rifamycin B dengan sel-sel Curvularia lunata yang sedang tumbuh dan beristirahat. enzim.
Mikrob. teknologi. 1993, 15, 1037–1041. [CrossRef]
45. Liu, Z.; Weis, R.; Gliede, A. Enzim dari eukariota yang lebih tinggi untuk biokatalisis industri. Teknologi Pangan.
Bioteknologi. 2004, 42, 237–249.
46. Burton, SG; Cowan, DA; Woodley, JM Pencarian biokatalis yang ideal. Nat. Bioteknologi. 2002, 20, 37–45.
[CrossRef] [PubMed]
47. Trincone, A. Potensi biokatalis yang berasal dari lingkungan laut. J. Mol. Katalis. B. Enzim. 2010, 66, 241–256.
[CrossRef]
48. Trincone, A. Biokatalis kelautan: Fitur dan aplikasi enzimatik. Mar. Narkoba 2011, 9, 478–499. [CrossRef]
[PubMed]
49. Trincone, A. Proses enzimatik dalam bioteknologi kelautan. Mar. Narkoba 2017, 15, 93. [CrossRef] [PubMed]
50. Nishiyama, R.; Inoue, A.; Ojima, T. Identifikasi 2-keto-3-deoxy-D-gluconate kinase dan 2-keto-3-deoxy-D-phosphogluconate
aldolase pada bakteri pengasimilasi alginat Flavobacterium sp. Saring UMI-01. Mar. Narkoba 2017, 15, 37. [CrossRef]
[PubMed]
51. Antranikian, G.; Vorgias, CE; Bertoldo, C. Lingkungan ekstrim sebagai sumber jamur dan novel
biokatalis. Adv. Biokimia. Ind. Bioteknologi. 2005, 96, 219–262. [PubMed]
52. Dionisi, HM; Lozada, M.; Olivera, NL Bioprospeksi jamur laut: Aplikasi bioteknologi dan
metode. Pdt. Argent. Mikrobiol. 2012, 44, 46–90.
53. Ferrer, M.; Golyshina, OV; Beloqui, A.; Golyshin, PN Menambang enzim dari lingkungan ekstrem.
Curr. pendapat. Mikrobiol. 2012, 10, 207–214. [CrossRef] [PubMed]
54. Liu, H.; de Souza, FZR; Liu, L.; Chen, B.-S. Penggunaan jamur yang berasal dari laut untuk pembuatan alkohol murni secara
enansiomer. aplikasi Mikrobiol. Bioteknologi. 2018. [CrossRef] [PubMed]
55. De Vitis, V.; Guidi, B.; Konten, ML; Granato, T.; Conti, P.; Molinari, F.; Crotti, E.; Mapelli, F.; Borin, S.; Daffonchio, D.; dkk.
Jamur laut sebagai sumber esterase stereoselektif dan ketoreduktase: Resolusi kinetik dari zat antara prostaglandin. Mar.
Bioteknologi. 2015, 17, 144-152. [CrossRef] [PubMed]
56. Sarkar, S.; Pramanik, A.; Mitra, A.; Mukherjee, J. Data bioproses untuk produksi enzim laut.
Mar. Narkoba 2010, 8, 1323–1372. [CrossRef] [PubMed]
57. De Carvalho, CC Katalisis enzim dan sel utuh: Menemukan strategi baru untuk proses lama. Bioteknologi. Adv.
2011, 29, 75–83. [CrossRef] [PubMed]

© 2018 oleh penulis. Penerima Lisensi MDPI, Basel, Swiss. Artikel ini adalah artikel akses terbuka
yang didistribusikan di bawah syarat dan ketentuan Creative Commons Attribution
(CC BY) lisensi (http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/).