TUGAS RADIKAL BEBAS PERTEMUAN 8

PENGUJIAN IN VIVO ANTIOKSIDAN

Nama : Almira Azalia Fridayanti

Kelas : 6C
NIM : 1800023122

1. Apa saja Parameter Pengujian In vivo ?

Jawab : Parameter pengujian in vivo yaitu superoksida dismutase (SOD), katalase, dan
glutathione peroksidase.
2. Bagaimana Prinsip Pengujian masing-masing Parameter tesebut ?
Jawab :
 Superoksida Dismutase (SOD) yaitu dilakukan dengan menggunakan metode Uji aktivitas
dan Gel aktivitas. Prinsip pengujian parameter didasarkan pada kemampuan O2- untuk
berinteraksi dengan NBT yang mereduksi tetrazolium kuning di dalam gel menjadi endapan
biru. Metode tambahan yang dapat digunakan untuk menentukan aktivitas SOD adalah Uji
Sitokrom C atau Uji Langsung berbasis Kalium Superoksida. Analisis alternatif uji langsung
SOD berbasis Kalium Superoksida ditentukan pada pH yang mengubah aktivitas MnSOD.
 Katalase yaitu prinsip pengujian parameter yang didasarkan prosedur spektrofotometri yang
mengukur penghilangan peroksida. Dengan uji langsung dengan kinetika pseudo-first order
dan diukur dengan metode Beers and Sizer. Pada akhir pengujian, H2O2 ditambah dan
katalase menjadi tidak aktif.
 Glutathione Peroksidase (GPx) yaitu pengujian ini memanfaatkan glutathione disulfide
(GSSG) yang dibentuk oleh aksi enzimatik GPx dan diregenerasi oleh kelebihan glutathione
reductase (GR) dalam pengujian. Aksi GR dipantau dengan mengikuti hilangnya co-substrat
NADPH pada 340 nm seperti yang terlihat pada skema reaksi. Pencatatan uji kehilangan
NADPH mengukur reduksi H2O2 oleh GPx menjadi alkohol. Untuk menentukan aktivitas
GPx di dalam sampel.
3. Bagaimana Teknis Pengujian masing-masing Parameter tersebut ?
Jawab :
 Superoksida Dismutase (SOD) :
Metode gel aktivitas SOD WAKTU 24 jam :
1. Bersihkan pelat kaca dengan metanol atau etanol untuk membersihkan permukaan dari
kotoran, pastikan tidak ada retakan atau serpihan di pelat. Pasang pelat di peralatan penjepit gel
dan dudukan menggunakan spacer 1,5 mm, sehingga membuat gel "tebal".
2. Untuk gel bernoda SOD, jalankan sampel duplikat pada dua gel asli 12% (vol / vol).
Tambahkan semua reagen menjadi satu dalam tabung kerucut 50 ml dan aduk rata. Tambahkan
larutan ke unit pelat kaca sekitar 1 cm dari bagian atas peralatan menggunakan pipet Pasteur
kaca berukuran 5 3⁄4 ”. Perlahan tambahkan lapisan air di atas gel yang mengalir sampai
seluruhnya tertutup. Pastikan peralatan rata dan tunggu selama 20 hingga 30 menit polimerisasi
gel. Antarmuka dapat dengan jelas dilihat antara lapisan air dan gel saat polimerisasi selesai.
3. Persiapan gel susun : Setelah gel pemisah terpolimerisasi, siapkan susunan 5% (vol / vol).
Campur semua reagen menjadi satu dalam tabung kerucut 50 ml. Tambahkan ke permukaan gel
yang sedang mengalir, isi rakitan kaca ke atas dengan gel susun. Tambahkan 1,5 mm, dengan
sudut untuk menghindari gelembung udara di bawah permukaan sisir; ini penting untuk
menjalankan sampel Anda dengan benar. Letakkan peralatan gel di bawah lampu fluoresen atau
di atas kotak lampu untuk membantu reaksi polimerisasi. Di bawah cahaya, polimerisasi akan
terjadi dalam 15-30 menit.
4. Pra-Elektroforesis . Setelah gel dipolimerisasi, lepaskan sisir dan rakitan gel dari dudukan
pengecoran. Pasang rakitan gel ke rakitan elektroda dan tempatkan ke dalam peralatan
elektroforesis (boks). Tuang penyangga praelektroforesis ke dalam reservoir dan ruang peralatan
kotak dan tambahkan tutup sel peralatan. Pra-elektroforesis gel selama 1 jam, pada 40 mA pada
4 ° C. Untuk hasil terbaik, biarkan gel semalaman pada suhu 4 ° C. Langkah Kritis : Langkah
pra-elektroforesis menghilangkan sisa APS, TEMED, dan produk polimerisasi tidak lengkap
yang dapat menonaktifkan protein asli.
5. Mengisi gel. Biarkan gel dalam buffer pra-elektroforesis. Bersihkan sumur dengan pipet
Pasteur kaca berukuran 5 3⁄4 inci untuk menghilangkan sisa reagen gel. Siapkan sampel, dengan
mengencerkan stok sampel 1: 1 dalam memuat buffer gel dan menambahkan sampel ke sumur.
Untuk sampel yang disiapkan untuk kultur sel, muat 50 - 250 μg protein per Sampel. Biasanya
150 μg akan menghasilkan pita yang berbeda. Untuk homogenat jaringan, muat 50 - 100 μg
protein per sampel.
6. Elektroforesis. Jalankan sampel dalam buffer pra-elektroforesis selama 3 jam pada 40 mA
pada 4 ° C. Setelah 3 jam, lepaskan set-up gel dan tuangkan praelektroforesis penyangga.
PAUSE POINT Gel dapat dibiarkan pada suhu 4 ° C selama 18-24 jam.
7. Tambahkan buffer elektroforesis ke reservoir dan ruang peralatan. Lari gel selama sekitar 2-3
jam lebih (40 mA, 4 ° C). Untuk memastikan protein sudah masuk gel, perhatikan garis pewarna
di bagian atas bagian depan pewarna sampel. Begitu pewarna depan mencapai dasar gel,
jalankan gel selama 1 jam lagi.
8. Pewarna gel dengan pewarna gel asli SOD. Tempatkan satu gel dalam wadah plastik atau kaca
mengandung 40 ml pewarna SOD total dan gel lainnya dalam 40 ml pewarnaan MnSOD. Noda
selama 20 menit pada suhu kamar, goyangkan dalam gelap atau ditutup dengan foil.
9. Setelah inkubasi, bilas gel secara lembut dengan ddH2O dua kali. Tambahkan secukupnya
ddH2O untuk menutupi gel dan tempatkan di bawah lampu fluorescent dan di atas kotak lampu.
Itu gel akan mulai berubah menjadi biru / ungu dan pita bening akan muncul secara bertahap.
Meninggalkan di bawah lampu, dan di kotak lampu selama 15 menit hingga 2 jam pastikan gel
tidak menyala mengering.
10.Setelah pita muncul, cuci tiga kali selama 10 menit dengan air. Biarkan gelnya untuk duduk
pada suhu kamar selama 18-24 jam dalam air di bawah cahaya sekitar untuk memungkinkan
pengembangan band selanjutnya.
11. Matikan lampu. Band akan meningkat selama 4 hingga 24 jam ke depan. Akhromatis pita
menunjukkan adanya SOD.12. Gambar gel pada pemindai alas datar komputer dengan cahaya
dari atas dan bawah atau memanfaatkan sistem pencitraan lain yang tersedia.
B. Katalase :
Analisis katalase menggunakan uji aktivitas dalam gel TIMING 24 jam :
1. Untuk gel katalase, siapkan gel asli 8% (vol / vol). Hanya satu gel yang dibutuhkan untuk
setiap enzim antioksidan. Langkah Kritis : Jalankan gel pada suhu 4 ° C. Semua langkah
pewarnaan dilakukan pada suhu kamar.
2. Siapkan sample dengan mengencerkan stock 1: 1 pada loading gel buffer dan tambahkan
sampel ke sumur. Untuk sampel yang disiapkan untuk kultur sel, muat 50 -100 μg. Untuk
homogenat jaringan, memuat 50-100 μg protein per sampel. Muat kontrol positif untuk katalase
(katalase sapi, 10 mU) atau GPx (sapi atau GPx manusia, 50 mU).
3. Siapkan dan jalankan semua aspek lain dari pengujian untuk gel aktivitas SOD (lihat cara
pengujian SOD 1-7).
4. Keluarkan gel dari piring kaca dan taruh di piring pewarna kaca.
5. Cuci gel 3 × 10 menit dalam air suling.
6. Siapkan larutan 0,003% H2O2 dengan mencampurkan 10 μl H2O2 (larutan 30%, vol / vol)
dengan 100 ml ddH2O dalam gelas kimia dengan batang pengaduk. Inkubasi gel di dalam
0,003% H2O2 (vol / vol) selama 10 menit.7. Siapkan noda dalam dua tabung kerucut 50 ml;
dengan membuat 2% besi klorida (wt /vol, 0,6 gram dalam 30 ml air suling) dalam satu tabung
dan dalam tabung kedua disiapkan 2% potassium ferricyanide (wt / vol, 0.6 gm dalam 30 ml air
suling).
8. Bilas gel dari gel Langkah 6 dua kali dengan ddH2O dua kali selama 5 menit. Kemudian
Tuang air.
9. Tambahkan noda ke gel. PERHATIAN Ferric chloride dan potassium ferricyanide bersifat
kaustik dan akan pergi noda yang tak terhapuskan - GUNAKAN SARUNG TANGAN!
LANGKAH KRITIS : JANGAN CAMPUR 2 reagen sebelum pewarnaan, tuangkan bersama-
sama langsung di atas gel.
10.Saat pita akromatis mulai terbentuk, buang noda dan bilas secara ekstensif dengan ddH2O.
11. Gambar seperti yang dijelaskan dalam langkah SOD (Langkah 9-12).
C. Glutathione Peroksidase (GPx) :
Analisis Glutathione Peroksidase menggunakan uji aktivitas dalam gel :
1. Untuk gel aktivitas GPx, siapkan 8% gel asli. Hanya satu gel yang dibutuhkan untuk masing-
masingnya enzim antioksidan. LANGKAH Kritis : Jalankan gel pada suhu 4 ° C. Semua
langkah pewarnaan dilakukan pada suhu kamar.
2. Siapkan dan jalankan semua aspek lain dari pengujian untuk gel aktivitas SOD (Langkah 1 -
7). Untuk sampel yang disiapkan untuk kultur sel, muat 200-300 μg protein per Sampel. Untuk
homogenat jaringan, muat 100-200 μg protein per sampel.
3. Buat larutan GSH 1 mM dengan melarutkan 93 mg GSH dalam 300 ml ddH2O.
4. Keluarkan gel dari piring kaca dan taruh di piring pewarna kaca.
5. Cuci gel 3 × 10 menit dalam air suling yang mengandung GSH menggunakan sekitar 50 ml
per mencuci. LANGKAH Kritis : Mencuci gel dengan GSH yang mengandung air
memungkinkan gel untuk menyerap substrat ini yang diperlukan agar GPx berfungsi selama
bagian pewarnaan protokol.
6. Siapkan noda dalam dua tabung kerucut 50 ml dengan membuat 1% besi klorida (wt /vol, 0,3
gm dalam 30 ml ddH2O mengandung GSH) dalam satu tabung dan dalam tabung kedua
menyiapkan 1% kalium ferricyanide (wt / vol, 0,3 gram dalam 30 ml ddH2O yang mengandung
GSH).
7. Inkubasi gel dalam 100 ml ddH2O yang mengandung 0,008% cumene hidroperoksida (vol/
vol, 10 μl larutan 80%) selama 10 menit.
8. Bilas gel dua kali dengan ddH2O.
9. Tuang air.
10. Inkubasi gel dengan noda yang telah disiapkan pada langkah 6. JANGAN Campurkan 2
reagen sebelum pewarnaan, tuangkan bersama langsung di atas gel.
PERHATIAN Reagen ini bersifat kaustik dan akan meninggalkan noda yang tak terhapuskan –
GUNAKAN SARUNG TANGAN!
11. Saat pita akromatis mulai terbentuk (5 - 15 menit), buang noda dan bilas secara ekstensif
dengan ddH2O.
12. Pita akromatik mendemonstrasikan keberadaan aktivitas GPx. Gambar seperti SOD gel