Mtodos de Reconocimiento, Identificacin e Individualizacin de manchas de semen Parte II

Por: Iris Catherine Carma Lcda. En Biologa (UCV), Esp. En Criminalstica (IUPOLC).

La Reaccin en Cadena de la Polimerasa en Transcripcin Reversa PCR-TR (Reverse transcription polymerase chain reaction RT-PCR, en ingls) es una variante de la PCR, una tcnica de laboratorio comnmente usada para generar una gran cantidad de copias de ADN, en un proceso llamado "amplificacin", mediante el empleo de un equipo llamado termociclador (ver figura 1). En la PCR-TR, una hebra de ARN es retro-transcrita a su ADN complementario (ADNc) usando una enzima llamada transcriptasa reversa, y el resultado, se amplifica en En la siguiente seccin se describen las nuevas tcnicas emergentes empleadas para la deteccin de manchas marcadores de semen, y la estas que son de casi ellas todas implican pueden confirmatorias, mayora una PCR tradicional. La PCR en Transcripcin Reversa no debe ser confundida con el PCR en tiempo real o la PCR cuantitativa PCR-Q, la cual a veces de manera errnea se abrevia PCR-TR.

inmunolgicos

tambin

sealar si la mancha pertenece a la especie humana. Bauer en el ao 2007 sugiere el uso del ARN mensajero (ARNm) para detectar manchas de semen en casos forenses. El mismo mtodo es descrito anteriormente por lvarez y sus colaboradores en el ao 2004, empleando adems, el co-aislamiento de ADN y ARN. La Protamina 1 (PRM1) fue el primer marcador especfico del semen utilizado. El mtodo propuesto por Juusola y Ballantyne en el ao 2005 empleando la Reaccin en Cadena de la Polimerasa en Transcripcin Reversa PCR-TR tambin se aplica a la investigacin de manchas de semen, y consiste en la deteccin de dos genes especficos de la esperma; la PRM1 y Protamina 2 (PRM2).
Fig. 1 Termociclador: equipo que se utiliza para amplificar el ADN

Los marcadores que se usan en estos ensayos que emplean la PCR-TR son especficos, no producen ningn falso positivo ni negativo, solamente puede ocurrir la inhibicin o degradacin del material gentico por agentes qumicos, fsicos o microbiolgicos presentes en la muestra. Una versin actualizada de este experimento fue presentada en el ao 2007 por Juusola y Ballantyne, ellos usaron un sistema de tres marcadores, los genes implicados son PRM1 y PRM2 para el semen, junto con el gen GAPDH. Un estudio similar se realiz en el ao 2008 por Haas, Klesser, Kratzer y Bar con los genes PRM1 y PRM2, ellos verificaron que se pueden obtener resultados positivos en manchas de hasta 15 meses

Reaccin en cadena de la polimerasa

de antigedad.

La XRF es una tcnica de muestreo relativamente nueva, verstil, rpida y no destructiva, que reconoce un gran nmero de elementos qumicos y presenta los resultados en tiempo real, permitiendo decidir un muestreo adicional ante resultados analticos no concluyentes. Logra alcanzar unos lmites de deteccin de hasta 0.002% (20 p.p.m.). La tcnica XRF utiliza la emisin secundaria o fluorescente de radiacin X que se genera al excitar Otro enfoque de la PCR-TR desarrollado por Nussbaumer y sus colaboradores en el ao 2006 se basa en la deteccin de la Calicrena (KLK), un marcador til para identificar el semen (tambin conocido como el marcador de la PSA). En este ensayo se ha demostrado que no existe reaccin cruzada con otros fluidos como la sangre, secreciones vaginales y saliva, ni hubo un falso positivo. Adems, este marcador de ARNm, especfico del semen a demostrado gran estabilidad y se puede detectar a los 10 das de almacenamiento de la muestra a temperatura ambiente sin bfer de estabilizacin. Esta tcnica demostr ser ms sensible que los populares ensayos a base de anticuerpos que detectan la PSA. una muestra con una fuente emisora de rayos X. La radiacin X incidente o primaria expulsa electrones de capas interiores del tomo. Entonces, los electrones de capas ms externas ocupan los lugares vacantes, y el exceso energtico resultante de esta transicin se disipa en forma de fotones: la llamada radiacin X fluorescente o secundaria. Esta radiacin de fluorescencia es caracterstica para cada elemento. Por lo tanto, es posible identificar un elemento qumico dentro del espectro de la muestra si se conoce la energa entre los orbitales atmicos implicados. La concentracin de cada elemento se detecta midiendo la intensidad de la energa asociada a cada transicin de electrones. Es decir, la salida de un anlisis de XRF es un espectro que muestra la intensidad de radiacin en funcin de la energa.

Trombka y sus colaboradores, en el ao 2008 introdujeron un mtodo no destructivo para la identificacin presuntiva de manchas de semen. El mtodo consiste en el empleo de una tecnologa nica desarrollada por la NASA que utiliza un dispositivo porttil que emite Fluorescencia de Rayos X (XRF), capaz de detectar la abundancia de cinc (Zn) presente en las manchas de semen.
Fig.2.- Espectro de fluorescencia de rayos X mostrando la presencia de diversos elementos.

Las energas de unin de un elemento, se utilizan como una huella dactilar en la tcnica de XRF. Cuando se cambia la energa y se observa un pico en una energa particular, se sabe que el elemento est presente.

almacenamiento de la muestra por tres y cinco semanas no mostro diferencias en los resultados. Para detectar el semen se recomienda usar una radiacin de 415 a 490 nm con lentes color naranja o rojo (Ver figura 4).

Este mtodo puede ser muy til en casos asociados a delitos que afectan las buenas costumbres y el buen orden de las familias, ya que en ellos se requieren ensayos rpidos y no destructivos que permitan posteriormente individualizar la mancha de semen mediante ensayos de biologa molecular. Tambin tiene la ventaja de identificar manchas de semen en el sitio del suceso, ya que el dispositivo es porttil. El proceso slo toma un minuto, y tiene una precisin de ms del 10% en la medicin de 1 mL de esperma distribuida en un rea de 40 cm2.
Fig 4.- Mancha de semen irradiada con la lmpara Lumatec Superlight 400

Identificacin confirmatoria y no destructiva de varios fluidos del cuerpo:

La tecnologa emergente que utiliza marcadores del ARNm es muy especfica y sensible, pero ocasiona la destruccin de la muestra, y a menos que se analice simultneamente el ADN, tal como seala lvarez y sus colaboradores, se necesitar material adicional para la individualizacin de la mancha de semen. La habilidad de identificar los fluidos del cuerpo en el sitio del suceso de manera no destructiva es importante para conservar la evidencia, ahorrar tiempo y practicar posteriormente la prueba de ADN. En este contexto, existen dos tcnicas; la espectroscopa de fluorescencia y la espectroscopa de Raman, que

Fig. 3.- Analizadores XRF porttiles con pequea zona de anlisis

podran ser la solucin a esta problemtica. La expectativa es que estas tcnicas sean aceptadas por la comunidad forense. Al principio puede haber una necesidad de comprobacin en el laboratorio criminalstico para demostrar que los resultados son fiables y convenientes como testimonio en un juicio, pero en el futuro estos mtodos podrn producir resultados aceptables para que el investigador pueda tener resultados rpidos y confiables. La espectroscopa de fluorescencia

Por ltimo, una prueba de presuncin desarrollada recientemente para detectar manchas de semen es una fuente de luz UV llamada Lumatec Superlight 400. sta emite luz de 320 hasta 700 nm y se ha probado en muestras de semen humano y jabal, as como en diferentes tipos y colores de las telas (ver figura 4). La Superlight es capaz de detectar manchas, tanto en la oscuridad como en presencia de luz, en un ensayo realizado usando esta tecnologa, el

La espectroscopa de fluorescencia es una tcnica sensible que se basa en la deteccin en la muestra de un fluorforo, un grupo qumico que absorbe radiacin (por lo general en la regin ultravioleta) y que emite luz a mayor longitud de onda. Esta tcnica no utiliza reactivos y no hay un contacto con la muestra, pero su carcter no destructivo es cuestionable debido a la posibilidad de foto-degradacin del ADN por la exposicin a la luz ultravioleta. La espectroscopa de fluorescencia es un tipo de espectroscopa electromagntica que analiza la fluorescencia de una muestra. En esta tcnica se utiliza un haz de luz, por lo general ultravioleta, que excita los electrones de las molculas de ciertos compuestos y provoca que emitan luz de una menor energa, generalmente luz visible (aunque no necesariamente). Los dispositivos que miden la fluorescencia se llaman fluormetros o fluormetros. En la espectroscopa de fluorescencia, primero se excita la muestra mediante la absorcin de un fotn de luz, desde su estado electrnico basal a uno de los distintos estados vibracionales del estado electrnico excitado. Las colisiones con otras molculas causan que la molcula excitada pierda energa vibracional hasta que alcanza el estado vibracional ms bajo del estado electrnico excitado. La molcula desciende a uno de los distintos niveles de vibracin del estado electrnico basal, emitiendo un fotn en el proceso. Como las molculas pueden caer a cualquiera de los diferentes niveles de vibracin en el estado basal, los fotones emitidos tendrn diferentes energas y, por lo tanto, frecuencias. As pues, mediante el anlisis de las diferentes frecuencias de se de luz emitida con determinar por sus la espectroscopia intensidades fluorescencia, puede junto

conjeturas acerca de lo que podra ser una mancha desconocida. Muchos de los componentes que se encuentran en los fluidos corporales pueden presentar fluorescencia; como los cidos nuclecos, protenas y lpidos, el grupo hemo en la sangre, productos de la degradacin de metabolitos en la orina y el semen seco. La composicin individual de cada uno de estos componentes qumicos en los fluidos del cuerpo es nico y su huella qumica corresponder a un espectro de emisin caracterstico, en la figura 5 se muestran los espectros de emisin por espectroscopia de fluorescencia del semen, sangre, saliva y orina medidos con una longitud de onda de excitacin de 260 nm. La longitud de onda de excitacin ms baja utilizada fue de 260 nm, y an no est claro si esta puede daar el ADN presente en la muestra. Esta tcnica es ideal, ya que puede explorar rpidamente el material y es muy sensible. El uso de mltiples longitudes de onda y la deteccin de la fluorescencia en una amplia gama de longitudes de onda permite la identificacin de un fluido corporal particular.

Fig. 5.- Espectros de emisin de fluorescencia del semen ( ), sudor ( ), sangre (- - -), saliva ( ) y orina ( ) a 260 nm. Esta tcnica no es destructiva. La muestra debe analizarse a varias longitudes de onda para que no sean confundidas con otros fluidos del cuerpo. No est disponible ningn dato sobre la posible fotodegradacin del ADN por la exposicin prolongada a 260-nm la luz de UV.

relativas,

estructura de los diferentes niveles de vibracin. Powers y Lloyd (2004), han demostrado que la espectroscopia de fluorescencia se puede usar para identificar varios fluidos del cuerpo. La capacidad que tiene este ensayo de aplicarse a diferentes fluidos es una caracterstica muy valiosa, ya que elimina las

Otro estudio independiente presenta un aparato de espectroscopia de fluorescencia porttil que podra usarse en el sitio del suceso para identificar el el fluido. ao El instrumento para pero su fue alta en 2003 descubrir instantneamente diseado contaminaciones

microbianas,

sensibilidad lo convierte en un accesorio ideal para la identificacin de fluidos del cuerpo cuando se acopla con el software adecuado.

La espectroscopia de Raman La espectroscopia de Raman es otra tcnica Bioanaltica no destructiva que tiene un gran potencial para la identificacin confirmatoria de semen en el sitio del suceso. La espectroscopia de Raman en comparacin con la espectroscopia de fluorescencia, exhibe una alta selectividad y especificidad, a pesar de tener baja sensibilidad, esta tcnica podra ser til en la investigacin de mezclas de mltiples fluidos del cuerpo. La espectroscopa de Raman es una tcnica que proporciona en pocos segundos informacin qumica y estructural de casi cualquier material o compuesto orgnico y/o inorgnico permitiendo as su identificacin, el anlisis mediante espectroscopa de Raman se basa en el anlisis de la luz dispersada por un material al hacer incidir sobre l un haz de luz monocromtico. Una pequea porcin de luz es dispersada inelsticamente experimentando ligeros cambios de frecuencia que son caractersticos del material analizado e independiente de la frecuencia de luz incidente. Se trata de una tcnica de anlisis que se realiza directamente sobre el material a analizar sin necesitar ste ningn tipo de preparacin especial y que no conlleva ninguna alteracin de la superficie sobre la que se realiza el anlisis, es decir, es nodestructiva. La cantidad requerida de muestra para anlisis con un espectrmetro de Raman puede ser tan baja como 100 pg. Un espectro tpico de Raman proporciona una firma nica de la frecuencia vibracional del material analizado. La mancha podra estudiarse en el campo y seguir disponible para su uso en el laboratorio de anlisis de ADN, y eso es muy importante para los investigadores criminalistas. El diseo de un espectrmetro de Raman porttil es un escenario qu facilita la habilidad de hacer identificaciones en el campo. La figura 6 muestra una fotografa de un dispositivo porttil de espectroscopia de Raman. En cada fluido del cuerpo la composicin qumica es diferente (tabla 1) y esto hace nico a cada fluido.
Fig. 7.- Espectros de Raman para semen humano, semen canino, fluido vaginal, saliva, sudor y sangre con la excitacin en una longitud de onda ( ) de 785 nm. Este es un mtodo no-destructivo y altamente especfico que produce un espectro nico para cada fluido corporal. Fig.6.- Dispositivo porttil de espectroscopa de Raman

El dispositivo porttil de espectroscopia de Raman fue diseado para identificar narcticos, explosivos, polvos blancos, armas qumicas y productos qumicos industriales que se encuentran en una escena del crimen. Siempre y cuando se disponga del software adecuado y una base de datos, este dispositivo porttil puede ser utilizado para la deteccin de fluidos corporales en el campo. Es una tcnica no destructiva que ha permitido el anlisis de sangre, semen, saliva, fluido vaginal y sudor. Los resultados reportados son muy prometedores y muestran que los espectros obtenidos por espectroscopa de Raman para cada fluido corporal es diferente y nico (Fig. 7).

sangre humana entre las de gato y perro, mediante el Tabla 1: Composicin qumica de los fluidos del cuerpo
Sangre
Hemoglobina Fibrinogeno Eritrocitos Glucosa

empleo de la espectroscopia Raman. Se necesitan ms estudios para determinar la capacidad de este mtodo para identificar especies. Existen numerosas tcnicas, tanto nuevas como antiguas, que pueden ser aplicadas en la identificacin de manchas de semen en el sitio del suceso. Algunas son confirmatorias y pueden ser concluyentes al identificar la presencia de semen, y otras pueden ser utilizadas como pruebas presuntivas o de deteccin. La mayora de estas tcnicas son destructivas e

Semen
Fosfatasa acida Antgeno prosttico Espermato zoides Colina

Saliva
Amilasa Lisozymas Mucina Clulas epiteliales Bucales

Fluido vaginal
Fosfatasa Acida Acido Lctico Acido ctrico Urea

Orina
Urea Creatinina Acido rico Colina

Sudor
Urea Acido Lctico Colina Sodio

Inmunoglobulinas

Espermina

Tiocianato

Pptidasa vaginal

Glico protena TammHorsfall

Potasio

Semenogelina

Potasio

Clulas epiteliales glicogenad as

Inmunoglobulina

impiden el anlisis posterior del ADN presente en la mancha. Adems, algunos mtodos slo pueden llevarse a cabo en el laboratorio, retrasando la obtencin de los resultados. La aplicacin de la bioespectroscopa no destructiva podra ser la solucin a la identificacin universal y rpida de los fluidos corporales y tambin puede ser de gran ayuda a los investigadores criminalistas para identificar al sospechoso de cometer un delito ya que permite el posterior anlisis del ADN de las muestras. Actualmente los expertos de la Polica Estadal de Investigacin Forense y el Instituto Forense (NERFI) en Nueva York estn realizando estudios para desarrollar un nuevo mtodo que emplea la espectroscopa de Raman para la identificacin automtica de fluidos del cuerpo en el sitio del suceso, pero se necesita ms investigacin en esta rea. Adems, se encuentran trabajando en el empleo de herramientas estadsticas para distinguir las diferentes especies de animales a partir de una muestra de sangre, incluyendo los seres humanos, los gatos y los perros. Con el desarrollo de dispositivos porttiles la fluorescencia de rayos X y la espectroscopa de fluorescencia y la espectroscopa de Raman, as como la aplicacin de herramientas estadsticas avanzadas y el desarrollo del software necesario, la tcnica de bio-espectroscopa tiene el potencial de ser una herramienta muy valiosa en la investigacin de fluidos corporales.

Zinc Acido ctrico Acido Lctico Fructosa Urea Acido Ascrbico Inmunoglobulinas

Bicarbonato Fosforo Glucosa Inmunoglobulinas

Acido actico Piridina Escualeno Inmunoglobulinas

En el futuro ser necesario evaluar el uso de la espectroscopa de Raman para el anlisis de mezclas de fluidos corporales, as como para el anlisis de manchas en diferentes substratos. Potencialmente, las mezclas de varios fluidos del cuerpo se pueden caracterizar con espectroscopia de Raman mediante diferentes herramientas estadsticas, incluyendo la significancia estadstica (SFA) y mnimos cuadrados alternados (ALS) utilizando un software como MATLAB 7.0. Cada fluido del cuerpo contiene picos en el espectro de Raman correspondientes a determinados componentes biolgicos, y una mezcla de fluidos producir un espectro que es la combinacin de dos o ms picos de los espectros, que se pueden analizar matemticamente en forma individual. Adems, la espectroscopia de Raman es capaz de distinguir el semen humano del canino. La capacidad de distinguir la especie a la cual corresponde un fluido corporal en el sitio del suceso tambin es muy importante. Otro estudio no fue capaz de diferenciar las muestras de