DIRECT PCR

Oleh : Nama NIM Rombongan Kelompok Asisten : Nurhadi Eko Firmansyah : B1J009163 : II :1 : Indriawati

LAPORAN PRAKTIKUM BIOLOGI MOLEKULER

KEMENTERIAN PENDIDIKAN NASIONAL UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN FAKULTAS BIOLOGI PURWOKERTO 2011

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang Asam nukleat merupakan salah satu makromolekul yang

memegang peranan sangat penting dalam kehidupan organism karena di dalamnya tersimpan informasi genetik. Asam nukleat sering disebut juga polinukeotida karena tersusun dari sejumlah molekul nukleotida sebagai monomernya. Tiap nukleotida mempunyai struktur yang terdiri atas gugus fosfat, gula pentose dan basa nitrogen. Ada dua macam asam nukleat, yaitu asam deoksiribonukleat (DNA) dan asam ribonukleat (RNA). Secara alami DNA pada umumnya mempunyai struktur molekul tangga berpilin. Model tangga berpilin

menggambarkan struktur molekul DNA sebagai ddua rantai polinukleotida yang saling memilin membentuk spiral dengan arah pilinan ke kanan. Dalam hal ini, basa A pada satu rantai akan berpasangan dengan basa T, sedangkan basa G berpasangan dengan basa C. Secara klasik analisis molekuler protein dan materi lainnya dari kebanyakan organism ternyata sangat tidak mudah untuk dilakukan karena adanya kesulitan untuk memurnikannya dalam jumlah besar. Namun, sejak tahun 1970-an berkembang suatu teknologi yang dapat diterapkan sebagai pendekatan dalam mengatasi masalah tersebut melalui isolasi dan manipulasi terhadap gen yang bertanggung jawab atas ekspresi protein tertentu atau pembentukan suatu produk. setelah tahun 1970-an, tepatnya pada tahun 1987 telah ditemukan teknik PCR (Polymerase Chain Reaction). Teknik ini tidak hanya digunakan untuk membuat fragmen pelacak, tetapi secara umum teknik ini merupakan cara untuk menggandakan urutan basa nukleotida tertentu secara in vitro dengan menggunakan sepasang primer untuk mengapit daerah yang akan digandakan. Adanya teknik ini memungkinkan keberadaan DNA dalam suatu sampel walaupun dalam konsentrasi yang sangat kecil dapat diketahui. Sehingga teknik ini dapat digunakan untuk membantu di berbagai bidang seperti forensic, kesehatan, pertanian, dan lain-lain.

B. Tujuan Praktikum Direct PCR ini bertujuan untuk melakukan PCR koloni bakteri untuk mengamplifikasi gen penyandi 16s rRNA.

II. MATERI DAN METODE

A. Materi Alat yang digunakan adalah UV transimulator, tusuk gigi steril, mikro pipet, tabung mikro sentrifuse, hot plate, termocycler, alat elektroforesis sedangkan bahan yang digunakan antara lain koloni bakteri, akuades, buffer mix PCR, agarosa, buffer elektroforesis. B. Metode Cara kerja praktikum ini adalah sebagai berikut : Praktikum ini dilakukan melalui tahapan PCR koloni bakteri dari sampel lingkungan untuk mengamplifikasi gen penyandi 16s rRNA

Mengambil koloni bakteri dengan tusuk gigi

mencelupkan tusuk gigi pada tabung PCR yang sudah diisi 10 l akuades menginkubasi tabung PCR yang sudah diisi koloni putih padaa suhu 95 C selama 10 menit Mendinginkan pada es selama 3 menit Mengambil 1 l larutan dan menambahkan komponen PCR hingga volume 20 ml PCR elektroforesis

Komposisi larutan reaksi Komposisi DNA templat Buffer PCR dNTP mix Primer P Primer R Taq DNA pol ddH2O Total 10x 10 mM 10 pM/l 10 pM/l 5 U/ml 1x 0,2 mM 1 1 0,05 U/ml Larutan stock Konsentrasi Larutan kerja 1 2 l 0,4 l 1 l 1 l 0,2 l 14,3 l 20 l

III. HASIL DAN PEMBAHASAN

Kemajuan kimia DNA dan enzimologi pada tahun-tahun terakhir ini, memungkinkan untuk mensintesis gen-gen spesifik in vitro. Beberapa gen sintetik ini dapat mengekspresikan informasi genetic mereka in vivo dalam bentuk suatu produk akhir gen, yaitu molekul protein spesifik yang mempunyai fungsi sendiri. Beberapa gen ini telah di sintesis dengan menggunakan mRNA spesifik yang terdapat dalam alam yang dimurnikan dan suatu DNA polymerase yang memerlukan RNA yang menghasilkan gen komplementer utas rangkap DNA (cDNA) pada molekul mRNA. Gen sintetik lain telah disintesis secara kimia memakai informasi yang disimpan dalam rangkaian nukleotida gen alam (Mayes et al., 1984). Reaksi berantai polimerase atau lebih umum dikenal sebagai PCR (kependekan dari istilah bahasa Inggris polymerase chain reaction) merupakan suatu teknik atau metode perbanyakan (replikasi) DNA secara enzimatik tanpa menggunakan organisme. Dengan teknik ini, orang dapat menghasilkan DNA dalam jumlah besar dalam waktu singkat sehingga memudahkan berbagai teknik lain yang menggunakan DNA. Teknik ini dirintis oleh Kary Mullis pada tahun 1983 dan ia memperoleh hadiah Nobel pada tahun 1994 berkat temuannya tersebut. Penerapan PCR banyak dilakukan di bidang biokimia dan biologi molekular karena relatif murah dan hanya memerlukan jumlah sampel yang sangat kecil. Penggunaan metode PCR diperlukan empat komponen utama, yakni (1) DNA cetakan, (2) oligonukleotida primer, (3) deosiribonukleotida trifosfat (dNTP) yang terdiri dari dATP, dCTP, dGTP, dTTP, dan (4) enzim polimerase yang digunakan untuk mengkatalis reaksi sintesis rantai DNA (Susanto, 2002). Secara prinsip, PCR merupakan proses yang diulang-ulang antara 2030 kali. Setiap siklus terdiri dari tiga tahap. Berikut adalah tiga tahap bekerjanya PCR dalam satu siklus: 1. Tahap peleburan (melting) atau denaturasi. Pada tahap ini (berlangsung pada suhu tinggi, 9496C) ikatan hidrogen DNA terputus (denaturasi) dan DNA menjadi berberkas tunggal. Biasanya pada tahap awal PCR tahap ini

dil t i

l i

i i i

it

ti tidak stabil dan siap

menjadi templat ("pat kan") bagi primer. Durasi tahap ini 12 menit. 2. Tahap penempelan atau annealing. Primer menempel pada bagian DNA templat yang komplementer urutan basanya. Ini dilakukan pada suhu antara 4560C. Penempelan ini bersi at spesi ik. Suhu yang tidak tepat menyebabkan tidak terjadinya penempelan atau primer menempel di sembarang tempat. Durasi tahap ini 12 menit. 3. Tahap pemanjangan atau elongasi. Suhu untuk proses ini tergantung dari jenis DNA-polimerase (P pada gambar) yang dipakai. Dengan Taqpolimerase, proses ini biasanya dilakukan pada suhu 76C. Durasi tahap ini biasanya 1 menit. Dalam melakukan teknik PCR digunakan beberapa larutan diantaranya adalah H2O sebagai pelarut, Buffer sebagai mi PCR sebagai penyeimbang agar reaksi tetap berjalan, dNTPS sebagai penyusun DNA baru, primer opa 07 untuk mengawali proses polimerisasi, enzim taq polimerisasi sebagai pembangun DNA dan DNA template sebagai DNA cetakan.

Lepas tahap 3, siklus diulang kembali mulai tahap 1. Tahap 4 pada gambar menunjukkan perkembangan yang terjadi pada siklus-siklus selanjutnya. Akibat denaturasi dan renaturasi, beberapa berkas baru (berwarna hijau) menjadi templat bagi primer lain. Akhirnya terdapat berkas DNA yang panjangnya dibatasi oleh primer yang dipakai. Jumlah DNA yang dihasilkan berlimpah karena penambahan terjadi secara eksponensial. Sejak ditemukannya metode PCR, perkembangan dunia biologi molekular dan bioteknologi semakin pesat. Beberapa contoh penerapan PCR menurut Irawan (2003) antara lain: - studi arkeologi gen purba, seperti fragmen DNA kuno dari gajah purba (mammoth) yang telah membeku selama 400.000 tahun. - analisis tindakan kriminal dengan sedikit sampel darah, sperma, sidik jari atau jaringan. - deteksi virus papilloma pada kelamin manusia - deteksi DNA atau RNA virus yang sulit terdeteksi, seperti HIV - diagnosa kelainan genetik sebelum kelairan - peramalan hemofilia - isolasi DNA dari miselium jamur dan spora - pengujian kualitas air minum - analisis filogenetik dalam taksonomi - identifikasi polimorfisme DNA - identifikasi jenis kelamin - skrining pustaka gen gt11 - penentuan urutan nukleotida - pemetaan genom manusia - dan lain-lain.

IV. KESIMPULAN DAN SARAN

A.

Kesimpulan Berdasarkan pembahasan diatas maka dapat disimpulkan sebagai berikut :

1.

PCR merupakan teknik penggandaan DNA secara in vitro dengan menggunakan sepasang primer untuk mengapit daerah yang akan digandakan.

2.

Tahap-tahap PCR secara berurutan adalah denaturasi, annealing, polimerisasi.

3.

Teknik PCR dapat digunakan diberbagai bidang seperti forensik, kesehatan, pertanian, industri, dll.

B.

Saran Pada praktikum ini ada baiknya dibagi beberapa rombongan dalam

menjelaskan teknik PCR tidak hanya dalam dua rombongan agar efektif dan efisien dalam memperoleh informasi dan pengetahuan teknik PCR.

DAFTAR REFERENSI

Irawan, B. 2003. DNA fingerprinting pada Forensik, Biologi sebagai Bukti Kejahatan. Majalah Natural Ed..7/Thn. V/April 2003, Bandar Lampung. Mayes, et al. 1984. Biokimia. Penerbit buku kedokteran EGC, Jakarta. Susanto, A. H. 2002. Buku Ajar Biologi Molekuler. Fakultas Biologi Universitas Jenderal Soedirman, Purwokerto.