Jurnal Primatologi Indonesia, Vol. 14, No. 2, Juli 2017, hlm.

21-25
ISSN 1410-5373

Deteksi Tuberkulosis pada Satwa Primata Berbasis Interferon Gamma

Releasing Assay (IGRA) dengan Enzyme-Linked Immunosorbent Spot
(ELISpot)
Detection of Tuberculosis in Non-Human Primates Based on Interferon Gamma
Releasing Assay (IGRA) using Enzyme-Linked Immunosorbent Spot (ELISpot)
Darmono GE1*, Pamungkas J2
1
Program Studi Primatologi, Program Multidisiplin, Sekolah Pascasarjana Institut Pertanian Bogor
2
Pusat Studi Satwa Primata, Lembaga Penelitian dan Pengabdian kepada Masyarakat Institut Pertanian Bogor

*Korespondensi : g.e.darmono@gmail.com

Abstract. Tuberculosis is a disease caused by the bacteria Mycobacterium tuberculosis complex. Tuberculosis
is a zoonotic disease that can attack humans and animals, such as non-human primates. Tuberculosis can be
controlled through proper and accurate detection. Detection of tuberculosis can be done with the examination
of skin and blood. Skin examination was performed with the tuberculin skin test (TST), whereas the blood
examination of the interferon gamma measurement based on interferon gamma releasing assay (IGRA)
was performed with enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) or enzyme-linked immunosorbent spot
(ELISpot) assay technique. ELISpot techniques have a higher level of sensitivity and specificity compared
to other techniques.

Key words: ELISpot, interferon gamma, non-human primate, tuberculosis

Pendahuluan monkey (M. fascicularis). TB pada orangutan

Tuberkulosis (TB) merupakan penyakit
yang disebabkan beberapa spesies dalam
kelompok Mycobacterium tuberculosis complex
(MTC) (Lecu dan Ball 2011). TB merupakan
penyakit zoonotik yang dapat menyerang
manusia dan hewan atau sebaliknya (Tjahajati
et al. 2007). MTC memiliki kemampuan untuk
menginfeksi satwa liar dengan kerentanan,
patogenisitas dan respon imunitas yang sangat
bervariasi antar MTC dan spesies satwa liar.
Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis)
dapat menginfeksi manusia dan satwa primata
(Lecu dan Ball 2011; Scanga dan Flynn
2017). Outbreak TB dilaporkan terjadi pada
monyet dunia lama, termasuk koloni tertutup
monyet rhesus (Macaca mulatta) dan koloni
semi tertutup monyet ekor panjang (Macaca
fascicularis) (Payne et al. 2011).
Tuberkulosis dapat menginfeksi
prosimian, monyet dunia baru dan monyet
dunia lama, seperti kera besar (Scanga dan
Flynn 2017). Monyet dunia lama lebih sensitif
dibandingkan great apes dan monyet dunia baru
(Matz-Rensing et al. 2015). TB sering terjadi
pada satwa primata dan umumnya karena
galur bakteri TB pada manusia. TB dilaporkan
terjadi pada pig-tailed macaque/beruk (Macaca
nemestrina/beruk), stumptailed macaque (M.
speciosa), squirrel monkey (Saimiri sciureus),
rhesus monkey (M. mulatta) dan cynomolgus
(Pongo pygmaeus) belum banyak dilaporkan
(Shin et al. 1995).
Tindakan kontrol TB diperlukan deteksi
yang akurat, pengobatan yang efektif dan isolasi
individu yang terinfeksi sangat penting. Deteksi
TB harus dilakukan secara akurat dan tepat,
sehingga diperlukan teknik deteksi TB dengan
sensitivitas dan spesifisitas tinggi. Deteksi TB
dapat dilakukan melalui pemeriksaan kulit dan
darah. Pemeriksaan kulit yang sering dilakukan
untuk deteksi TB melalui mantoux tuberculin
test (MTT) atau tuberculin skin test (TST). TST
dilakukan dengan injeksi intradermal 5 tuberculin
unit (TU) turunan protein murni PPD-S atau
protein purified derivate (PPD) atau 2 TU PPD
RT23. Antigen PPD akan menyebabkan respon
imunitas yang diperantarai sel (cell-mediated
immune response) dan menyebabkan reaksi
hipersensitivitas tipe delayed dalam 48-72
jam. Reaksi imunitas menyebabkan indurasi
lokal pada kulit, khususnya tempat suntikan.
TST dapat memberikan hasil false-negative
tergantung pada kepekaan individu (Pai et al.
2014).
Deteksi TB pada satwa primata selain
TST dapat dilakukan melalui pemeriksaan
darah berdasarkan interferon gamma (IFN-γ)
untuk mengukur reaksi sistem imunitas.
Pengukuran IFN-γ dapat dilakukan dengan
teknik interferon gamma releasing assay
(IGRA). IGRA merupakan pemeriksaan
22 Darmono dan Pamungkas, Deteksi Tuberkulosis pada Satwa Primata Berbasis IGRA
darah secara in vitro untuk mengetahui
respon imunitas yang diperantarai sel (cell-
mediated immune response) dengan mengukur
pelepasan IFN-γ sel limfosit T. Respon imunitas
diakibatkan stimulasi antigen spesifik M.
tuberculosis complex, yaitu early secretory
antigenic target 6 (ESAT-6) dan culture filtrate
protein 10 (CFP-10). Pengembangan deteksi
TB pada satwa primata menggunakan teknik
IGRA perlu dilakukan dan diterapkan sebagai
alternatif lain dari TST. Hal ini karena IGRA
memiliki spesivisitas untuk deteksi TB di atas
95% dan tidak terpengaruh vaksinasi dengan
vaksin bacillus calmatte-guerin (BCG) (Pai et
al. 2014). Pang et al. (2015) sensitivitas IGRA
dari cairan pleura dan darah sebesar 82% dan
80%, serta spesifisitas sebesar 87% dan 70%.
Interferon gamma releasing assay (IGRA)
yang tersedia di banyak negara dan digunakan
pada manusia, yaitu kit QuantiFERON-TB
Gold-in Tube (QFT) dan kit T-SPOT.TB Assay.
Kit T-SPOT.TB assay memiliki sensitivitas
lebih tinggi dibandingkan kit QFT assay atau
TST (Pai et al. 2014). T-SPOT.TB memiliki
sensitivitas sebesar 88,6% dan spesifisitas
sebesar 83,1%. IGRA yang digunakan pada
satwa primata selama ini kit PRIMAGAM
assay. Kit PRIMAGAM assay memiliki
sensitivitas rendah, namun spesivisitasnya
tinggi dibandingkan dengan TST. Kit T.SPOT.
TB merupakan IGRA yang dilakukan dengan
teknik enzyme-linked immunosorbent spot assay
(ELISpot). Deteksi TB dengan teknik ELISpot
yang digunakan pada satwa primata belum
banyak dilaporkan. Pemahaman mengenai
teknik ELISpot sebagai salah satu alternatif
deteksi TB berbasis IGRA perlu dijelaskan
lebih lanjut. Dengan demikian, penggunakan
IGRA dengan teknik ELISpot dapat digunakan
dalam deteksi TB pada satwa primata dengan
sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi.
Interferon Gamma Releasing Assay (IGRA)
Interferon gamma (IFN-γ) releasing
assay (IGRA) telah banyak digunakan dalam
deteksi beberapa penyakit, salah satunya TB.
Penggunaan IGRA dalam deteksi TB telah
banyak diterapkan pada manusia, dibandingkan
pada hewan. Beberapa metode IGRA yang
diterapkan dalam deteksi TB, diantaranya teknik
enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)
dan enzyme-linked immunosorbent spot assay
(ELISpot). Antigen spesifik TB yang digunakan
untuk menstimulasi pengeluaran IFN-γ oleh
sel limfosit T pada IGRA, yaitu early secretory
antigenic target 6 (ESAT-6) dan culture filtrate
protein 10 (CFP-10) yang berasal dari M.
tuberculosis complex, kecuali substrain bacillus
calmette-guerin (BCG) (Pai et al. 2014).
Early secretory antigenic target-6 (ESAT-
6) dan culture filtrate protein-10 (CFP-10)
merupakan dua antigen spesifik utama pada
M. tuberculosis dan memiliki peran utama
sebagai faktor virulensi M. tuberculosis dan
menyebabkan respon sel limfosit T yang kuat
(Li et al. 2016). Gen Rv3875 yang mengkode
ESAT-6 memiliki lokasi pada daerah region
of difference 1 (RD1), yang terdapat pada
semua Mycobacteria sp. patogenik, termasuk
M. tuberculosis dan M. bovis. Mohmoudi et
al. (2013) menyatakan ESAT-6 dan CFP-10
membantu proses translokasi M. tuberculosis
dari fagosom dalam sitoplasma sel hospes
pada tahap akhir infeksi. M. tuberculosis
juga menganggu ekspresi molekul major
histocompatibility complex (MHC) Kelas II
melalui ESAT-6. ESAT-6 akan berinteraksi
dengan Toll-receptor like 2 (TLR2) dan
menstimulasi respon imunitas pada hospes.
Pengenalan ESAT-6 oleh sel limfosit T yang
diisolasi dari hewan terinfeksi M. tuberculosis,
menunjukkan bahwa ESAT-6 merupakan
antigen bagi sel limfosit T selama respon
imunitas yang dimediasi sel (cell-mediated
immune response) (Rai et al. 2012). Sementara
itu, CFP-10 merupakan antigen target dominan
untuk sel CD4+ T-helper1 pada hewan model
tuberculosis dan manusia.
Secara normal, M. tuberculosis akan
menstimulasi respon imunitas selular, terutama
sel limfosit T untuk menghasilkan IFN-γ. IFN-γ
merupakan salah satu sitokin yang diproduksi sel
T-helper1. IFN-γ akan mengaktivasi makrofag
untuk memfagositosis M. tuberculosis,
sehingga apabila terjadi defisiensi IFN-γ yang
diproduksi sel limfosit T akan menyebabkan
TB (Fatah et al. 2017). IFN-γ berperan sebagai
imunomodulator dalam respon imunitas
selular, yaitu kemampuan dalam meningkatkan
kapasitas antimikrobial dalam makrofag
(Green et al. 2017). IFN-γ berperan penting
dalam mengeliminasi M. tuberculosis untuk
memperkuat potensi fagositosis dari makrofag
dengan cara menstimulasi pembentukan
fagolisosom. IFN-γ dapat digunakan untuk
identifikasi TB dengan metode IGRA (Pai
et al. 2014). IGRA dapat menjadi alternatif
dalam deteksi TB, selain TST dan pemeriksaan
radiografi thoraks.
Interferon gamma (IFN-γ) releasing
assay (IGRA) yang telah banyak digunakan
dalam deteksi TB pada manusia adalah dengan
teknik ELISA menggunakan kit QuantiFERON-
TB Gold In-Tube (QFT) assay pada manusia
atau kit PRIMAGRAM assay pada satwa
primata. Selain IGRA dengan teknik ELISA,
IGRA dengan ELISpot memiliki sensitivitas
 Jurnal Primatologi Indonesia, Vol. 14, No. 2, Juli 2017, hlm. 21-25
dan spesifisitas tinggi dalam deteksi M.
tuberculosis, seperti menggunakan kit T.SPOT-
TB assay. Secara umum, IGRA memiliki
spesifisitas untuk diagnosis TB diatas 95% dan
tidak terpengaruh vaksinasi BCG (Pai et al.
2014). Vaksinasi BCG akan menyebabkan hasil
negatif palsu (false negative). IGRA dengan
teknik ELISpot menggunakan kit T-SPOT. TB
assay memiliki sensitivitas yang lebih tinggi
dibandingkan dengan kit QFT assay atau TST,
yaitu sensitivitas secara berurutan sekitar 90,
80, dan 70% (Pai et al. 2014).
Interferon gamma (IFN-γ) releasing
assay (IGRA) pada satwa primata dilakukan
menggunakan kit PRIMAGAM assay dan
hanya khusus untuk cynomolgus monkey
(Macaca fascicularis) dan rhesus monkey (M.
mulatta). Kit PRIMAGAM assay memiliki
sensitivitas rendah, namun spesifisitasnya
tinggi dibandingkan dengan TST (Lin et al.
2008). Sensitivitas kit PRIMAGRAM sebesar
68% dan spesifisitas sebesar 97% (Thoen
et al. 2006). Penggunaan teknik ELISpot di
Indonesia terbatas pada diagnosis TB pada
manusia. Penelitian Adilistya et al. (2016) pada
48 pasien yang diduga TB di RSUPN Dr. Cipto
Mangunkusumo dari Mei-September 2015
menunjukkan sensitivitas sebesar 100% dan
spesifisitas sebesar 88,89%.
Enzyme-Linked Immunosorbent Spot
(ELISpot)
Enzyme-Linked Immunosorbent Spot
(ELISpot) assay merupakan pengujian yang
memungkinkan mengenali sel dengan jumlah
sedikit yang mensekresikan berbagai molekul.
ELISpot dapat digunakan dalam banyak bidang
penelitian, karena memiliki sensitivitas yang
tinggi dan berpotensi sebagai alat diagnostik
yang berharga. Deteksi TB menggunakan
teknik ELISpot telah banyak diterapkan pada
manusia. Sensitivitas dan spesifisitas teknik
ELISPot dalam deteksi TB pada manusia, yaitu
45.5% dan 81.0% (Wu et al. 2014). Adapun
penggunaan teknik ELISpot dalam deteksi TB
pada hewan, terutama satwa primata belum
pernah dilaporkan. Teknik ELISpot dengan kit
T.SPOT.TB secara komersial digunakan pada
manusia dan bukan merupakan kit komersial
untuk satwa primata (Lerche et al. 2008).
Teknik ELISpot menggunakan peripheral blood
mononuclear cell (PBMC) yang diinkubasi dan
distimulasi peptida ESAT-6 dan CFP-10. Hasil
pengukuran ELISpot dilaporkan dalam bentuk
spot forming cells (SFC) (Pai et al. 2014).
Prinsip kerja teknik ELISpot serupa
dengan prosedur ELISA, yaitu mendeteksi
aktivitas enzimatik dengan pemberian label
terhadap antibodi yang telah ditentukan
23
antigennya yang telah difiksasi pada plat
mikrotiter, sehingga hasil akhir adalah aktivitas
antigen early secretory antigenic target 6
(ESAT-6) dan culture filtrate protein 10 (CFP-
10), serta akan dapat dilihat sebagai titik
(spot) (Pratomo dan Setyanto 2013). Ikatan
tersebut akan divisualisasikan ELISpot dengan
ukuran dan densitas spot yang mengambarkan
produksi sitokin sel selama waktu pengukuran
(Kalyuzhny 2005).
Keuntungan teknik ELIspot dalam deteksi
TB antara lain, mudah dalam prosedur pengujian
dan pengukuran hasil. ELISpot merupakan
teknik yang masih memerlukan akurasi,
pilihan yang menyeluruh terkait antibodi dan
antigen, serta pemahaman mengenai prinsip-
prinsip analisis data (Kalyuzhny 2005). Hasil
ELISpot assay tergantung pada kualitas 4
(empat) komponen utama, yaitu (1) antibodi,
(2) enzim konjugat, (3) substrat kromogenik
dan (4) membran plate. Aktivitas sekresi
sel pada ELISpot ditentukan dengan adanya
spot-spot pada bagian bawah plate, sehingga
keempat komponen tersebut harus dioptimalkan
untuk memfasilitasi pembentukan spot-spot
(Kalyuzhny 2005).
Secara umum, bahan utama yang
diperlukan dalam deteksi TB berbasis IGRA)
adalah peripheral blood mononuclear cell
(PBMC), peptida early secretory antigenic
target-6 (ESAT-6) dan culture filtrate
protein-10 (CFP-10). PBMC merupakan sel
darah yang memiliki bentuk nukleus bulat,
yaitu limfosit, monosit atau makrofag. Sel-
sel darah ini merupakan komponen penting
dalam sistem imunitas sebagai pertahanan
terhadap infeksi dan adaptasi terhadap
antigen (Pourahmad dan Salimi 2015). PBMC
memberikan respon imunitas yang selektif dan
terdiri atas sel-sel yang utama dalam imunitas
tubuh, seperti limfosit, monosit atau makrofag.
PBMC dapat diekstraksi dari whole blood
dengan menggunakan medium ficoll, senyawa
polisakarida dan bersifat hidrofilik yang dapat
memisahkan lapisan whole blood dan diikuti
sentrifugasi berdasarkan gradien dengan
kecepatan 400 x g selama 30 menit pada suhu
15-25oC. Sentrifugasi akan memisahkan darah
menjadi 3 (tiga) bagian, yaitu plasma (bagian
atas), PBMC (tengah) dan sebagian kecil sel
polimorfonuklear (neutrofil dan eosinofil), serta
eritrosit pada bagian bawah. PBMC banyak
dipergunakan dalam penelitian dan aplikasi
pengujian toksikologi (Pourahmad dan Salimi
2015).
Tahapan pengukuran kadar IFN-γ dengan
teknik ELISpot secara umum dapat dilihat
pada Gambar 1. Secara khusus, pengukuran
kadar interferon gamma (IFN-γ) dengan teknik
24 Darmono dan Pamungkas, Deteksi Tuberkulosis pada Satwa Primata Berbasis IGRA
ELISpot menggunakan human T-SPOT.TB
assay (Oxford Immunotec, Oxford, UK) (Wu
et al. 2014) sebagai berikut: PBMC sebanyak
250.000 sel dimasukkan ke dalam 96 plate dan
diinkubasi selama 18-20 jam, dan plate telah
dilapisi dengan mouse anti-human IFN- γ.
PBMC dalam plate dibagi dalam 4 kelompok,
yaitu PBMC sebagai kontrol negatif (K-), PBMC
sebagai kontrol positif (K+) yang distimulasi
dengan PHA dan PBMC yang diaktivasi dengan
peptida M. tuberculosis, yaitu ESAT-6 dan CFP-
10. PBMCK+ distimulasi dengan PHA sebanyak
50 µL, sedangkan PBMC perlakuan distimulasi
dengan 50 µL ESAT-6 dan CFP-10. Jumlah spot-
forming cell (SFC) pada masing-masing plate
dihitung secara otomatis menggunakan CTL-
ImmunoSpot® S5 Versa Analyzer (Cellular
Technology Ltd, USA). Respon terhadap kultur
PBMC dinyatakan positif apabila dalam 1 (satu)
plate paling sedikit terdapat 6 (enam) spot atau
2 kali lipat SFC kontrol negatif.
Simpulan
Teknik ELISpot merupakan teknik
pemeriksaan darah berdasarkan pengeluaran
molekul tertentu sel. Teknik ELISpot dapat
digunakan dalam deteksi TB, baik pada
manusia atau hewan. Deteksi TB menggunakan
teknik ELISpot berdasarkan kadar IFN-γ yang
disekresikan sel limfosit T. Sampel teknik
ELISpot menggunakan PBMC yang diaktivasi
dengan antigen spesifik Mycobacterium
tuberculosis, yaitu early secretory antigenic
target 6 (ESAT-6) dan culture filtrate protein
10 (CFP-10). Hasil pengukuran kadar IFN-γ
ditampilkan dalam bentuk spot forming cell
(SFC).
Daftar Pustaka
Adilistya T, Astrawinata DAW, Nasir UZ.
2016. Use of pleural fluid interferon-
gamma enzyme-linked immunospot assay
in the diagnosis of pleural tuberculosis.
Acta Med Indones J Intern Med 48: 1.
 Jurnal Primatologi Indonesia, Vol. 14, No. 2, Juli 2017, hlm. 21-25
Fatah SRK, Juffrie M, Setyati A. 2017.
Perbedaan kadar interferon gamma pada
tuberkulosis anak. Sari Pediatri 18 (5).
Green DS, Young HA, Valencia JC. 2017.
Current prospects of type II interferon γ
signaling and autoimmunity. J Biol Chem
292(34):13925-13933.
Kalyuzhny AE. 2005. Handbook of ELISPOT:
Methods and Protocols. New Jersey (US):
Humana Press.
Lecu A, Ball R. 2011. Mycobacterial infections
in zoo animals: relevance, diagnosis and
management. Int Zoo Yb 45:183-202.
Lerche NW, Yee JL, Capuano SV, Flynn JL.
2008. New approaches to tuberculosis
surveillance of nonhuman primates. ILAR
J 49: 170–178.
Li F, Xu M, Zhou L, Xiong Y, Xia L, Fan
X, Gu J, Pu J, Lu S, Wang G. 2016.
Safety of recombinant fusion protein
ESAT6-CFP10 as a skin test reagent for
tuberculosis diagnosis: an open-label,
randomized, single-center phase I clinical
trial. Clin Vaccine Immunol 23:767-773.
Lin PL, Yee J, Klein E, Lerche NW. 2008.
Immunological concepts in tuberculosis
diagnostics for nonhuman primates: a
review. J Med Primatol, 37 (1): 44-51.
Mahmoudi S, Mamishi S, Ghazi M,
Sadeghi RH, Pourakbari B. 2013.
Cloning, expression and purification of
Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and
CFP-10 antigens. Iran J Microbiol 5(4):
374-378.
Matz-Rensing K, Hartmann T, Wendel
GM, Frick JS, Homolka S, Richter E,
Munk MH, Kaup FJ. 2015. Outbreak
of tuberculosis in a colony of rhesus
monkeys (Macaca mulatta) after possible
indirect contact with a human TB patient.
J Comp Path. 153: 81-91.
Pai, M, Denkinger CM, Kik SV, Rangaka
MX, Zerling A, Oxlade O, Metcalfe
JZ, Cattamanchi A, Dowdy DW,
Dheha K, Banael N. 2014. Gamma
interferon release assays for detection of
Mycobacterium tuberculosis infection.
Clin Microbiol Rev 27 (1).
Pang C, Shen Y, Tian Y, Zhu J, Feng M,
Wan C, Wen F. 2015. Accuracy of the
interferon gamma release assay for the
diagnosis of tuberculous pleurisy: an
updated meta-analysis. PerrJ 3:e951; DOI
10.7717/peerj.951.
25
Payne KS, Novak JJ, Jongsakul K, Imerbsin
R, Apisitsaowapa Y, Pavlin JA, Hinds
SB. 2011. Mycobacterium tuberculosis
infection in a closed colony of rhesus
macaques (Macaca mulatta). J Am Assoc
Lab Anim Sci 50(1): 105-108.
Pourahmad J, Salimi A. 2015. Isolated
human peripheral blood mononuclear
cell (PBMC), a cost effective tool for
predicting immunosuppressive effects
of drugs and xenobiotics. Iranian J
Pharmaceut Res 14(4):679-980.
Pratomo IP, Setyanto DB. 2013. Penggunaan
kompleks antigen ESAT-6 dan CFP-10
untuk diagnosis tuberkulosis. J Respir
Indo 33 (1).
Rai RC, Dwivedi VP, Chatterjee S, Prasad
DVR, Das G. 2012. Early secretory
antigenic target-6 of Mycobacterium
tuberculosis: enigmatic factor in patogen-
host interactions. Microbes and Infection
14: 1220-1226.
Scanga AC, Flynn JL. 2017. Modeling
tuberculosis in nonhuman primates.
Cold Spring Harb Perspect Med
2014;4:a018564.
Shin N, Kwon S, Han D, Bai G, Yoon J, Cheon
D, Son S, Ahn K, Chae C, Lee Y. 1995.
Mycobacterium tuberculosis infection in
an orangutan (Pongo pygmaeus). J Vet
Med Sci 57(5):951-953.
Thoen CO, Steele JH, Gilsdorf MJ. 2006.
Mycobacterium bovis Infection in Animals
and Humans. New York (US): Blackwell
Publishing.
Tjahajati I, Asmara W, Soebono H. 2007.
Pengembangan diagnosis tuberkulosis
pada hewan kesayangan menggunakan
antigen spesifik Mycobacterium
tuberculosis ESAT-6 dan CFP-10. J
Kedokteran Brawijaya 23(2).
Wu X, Ma Y, Wang L, Li D, Yang Y, Hu
M, Liang Y, Xue H, Zhang J. 2014.
Diagnostic value of ELISPOT technique
for osteoarticular tuberculosis. Clin Lab
60:1865-1870.