LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI, IDENTIFIKASI, DAN PERHITUNGAN MIKROORGANISME

LOKAL DARI BAHAN DASAR WORTEL

Semester Ganjil 2021

Disusun Sebagai Tugas Mata Kuliah Praktikum Bioproses

Disusun Oleh :

RAFIF SAKHI INDRATMA

2141420006
1B D4 TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

PROGRAM STUDI D-IV TEKNOLOGI KIMIA INDUSTRI

JURUSAN TEKNIK KIMIA
POLITEKNIK NEGERI MALANG
 KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas segala limpahan rahmat, serta
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan Laporan Praktikum Isolasi dan
Identifikasi Mikroba Pada MOL Limbah Wortel ini ditujukan untuk memenuhi
salah satu tugas mata kuliah Praktikum Bioproses.
Penulis mengucapkan terimakasih kepada semua pihak yang terlibat dalam
penyusunan laporan pratikum ini: Ibu Dr. Yanty Maryanty, S.T, M.T selaku Dosen
pengampu mata kuliah Praktikum Bioproses yang telah membimbing dari awal
hingga selesainya laporan praktikum ini. Tidak lupa, terimakasih juga kepada pihak
lain yang terlibat pula dalam proses penyusunan laporan ini dengan memberi
bantuan dan arahan kepada penulis sehingga laporan dapat terselesaikan dengan
baik.
Penulis menyadari bahwa masih terdapat kekurangan pada penyusunan
laporan ini baik materi maupun cara penulisannya. Oleh karena itu, penulis
mengharapkan kritik dan saran membangun di kemudian hari dari berbagai pihak
agar laporan praktikum ini lebih baik dan bermanfaat.
Akhir kata, semoga laporan ini dapat bermanfaat bagi kita semua dan bagi
pihak yang membutuhkan.
Malang, Desember 2021

Penulis
 DAFTAR ISI

KATA PENGANTAR ........................................................................................... ii

DAFTAR ISI ......................................................................................................... iii
BAB I PENDAHULUAN ..................................................................................... 5
1.1 Latar Belakang .............................................................................................. 5
1.2 Rumusan Masalah ......................................................................................... 6
1.3 Tujuan ............................................................................................................ 6
1.4 Manfaat .......................................................................................................... 7
BAB II LANDASAN TEORI ............................................................................... 8
2.1 Wortel ............................................................................................................ 8
2.2 Mol (mikroorganisme lokal) ......................................................................... 8
2.3 Isolasi Mikroorganisme ................................................................................. 9
BAB III METODE PERCOBAAN .................................................................... 12
3.1 Waktu Percobaan ......................................................................................... 12
3.2 Alat dan Bahan ............................................................................................ 12
3.2.1 Pembuatan Mol ..................................................................................... 12
3.2.2 Sterilisasi............................................................................................... 12
3.2.3 Isolasi Metode Cawan Tuang ............................................................... 13
3.2.4 Isolasi Metode Cawan Gores ................................................................ 13
3.2.5 Penyimpanan Kultur Murni di Agar Miring ......................................... 14
3.2.6 Pengamatan Mikroskop ........................................................................ 14
3.2.7 Perhitungan Mikroorganisme ............................................................... 15
3.3 Prosedur Kerja ............................................................................................. 15
3.3.1 Pembuatan MOL ................................................................................... 15
3.3.2 Sterilisasi............................................................................................... 16
3.3.3 Isolasi Metode Cawan Tuang ............................................................... 16
3.3.4 Isolasi Metode Cawan Gores ................................................................ 17
3.3.5 Penyimpanan Kultur Murni di Agar Miring ......................................... 19
3.3.6 Pengamatan Mikroskop ........................................................................ 20
3.3.7 Perhitungan Mikroorganisme ............................................................... 20
BAB IV HASIL DAN PEMBAHASAN ........................................................... 22
4.1 Hasil Pengamatan ........................................................................................ 22
 4.1.1 Pembuatan Mol ..................................................................................... 22
4.1.2 Isolasi Metode Cawan Tuang ............................................................... 22
4.1.3 Isolasi Metode Cawan Gores ................................................................ 22
4.1.4 Isolasi Metode Agar Miring .................................................................. 23
4.1.5 Pengamatan dengan Mikroskop ............................................................ 23
4.1.6 Perhitungan Mikroba ............................................................................ 23
4.2 Pembahasan ................................................................................................. 24
4.2.1 Pembuatan Mol ..................................................................................... 24
4.2.2 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Tuang .................................... 24
4.2.3 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Gores .................................... 25
4.2.4 Isolasi Metode Agar Miring .................................................................. 25
4.2.5 Pengamatan dengan Mikroskop ............................................................ 26
4.2.6 Perhitungan Mikroorganisme ............................................................... 26
BAB V KESIMPULAN DAN SARAN ............................................................. 28
5.1 Kesimpulan .................................................................................................. 28
5.2 Saran ............................................................................................................ 28
Daftar Pustaka ..................................................................................................... 29
LAMPIRAN ......................................................................................................... 30
 BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Wortel merupakan salah satu jenis sayuran yang mudah ditemukan serta
banyak dikonsumsi oleh masyarakat Indonesia. Wortel kaya akan karotenoid,
flavonoid, poliasetilen, vitamin, dan mineral. Karotenoid dan antosianin
merupakan pigmen antioksidan utama dari wortel. Dengan beragamnya kandungan
di dalam wortel yang sangat bermanfaat bagi kesehatan tubuh, masyarakat
Indonesia umumnya mengolah wortel sebagai bahan utama atau pendamping
dalam berbagai macam olahan masakan. Ramainya peminat wortel menyebabkan
tingkat kebutuhan sayur ini meningkat dan tidak lupa jumlah limbah yang
dihasilkan pun juga ikut meningkat. Selain itu limbah sayuran juga dapat
menimbulkan polusi udara yang disebabkan karena bau busuk yang ditimbulkan
dari limbah tersebut. Maka perlu dilakukan tindakan untuk menekan jumlah limbah
wortel yang dihasilkan. Salah satu tindakan yang dapat dilakukan untuk menekan
sekaligus mengatasi peningkatan jumlah limbah wortel yaitu mengolahnya
menjadi nutrisi yang baik untuk pertumbuhan tanaman berupa pupuk atau limbah
sayur ini juga dapat diolah menjadi “MOL” (mikroorganisme lokal).
MOL adalah mikroorganisme yang dapat dihasilkan limbah sayuran, buah-
buahan, nasi sisa, bonggol pisang dan rebung. Dibidang pertanian MOL digunakan
untuk mempercepat penghancuran bahan organik. MOL mengandung berbagai
macam jenis mikroorganisme yang dapat menguraikan selulosa dan dapat
berpotensi sebagai fungisida hayati, selain itu larutan MOL dapat digunakan
sebagai dekomposer penghasil kompos, pupuk cair untuk meningkatkan kesuburan
tanah dan sumber unsur hara bagi pertumbuhan tanaman (Sutari, 2010). Melalui
pembuatan mol dengan memanfaatkan limbah wortel yang ada seperti kulit wortel
maupun wortel yang sudah membusuk, sehingga jumlah limbah sayuran serta
polusi udara yang dihasilkan dapat berkurang.
Mikoorganisme yang terkandung di dalam mol dapat dikembangbiakkan
kembali untuk pemanfaatan lebih lanjut melalui metode isolasi mikoorganisme.
Isolasi merupakan proses mengambil mikroba dari medium atau lingkungan
asalnya dan menumbuhkannya di medium buatan sehingga diperoleh biakan
murni. Ada beberapa contoh metode isolasi mikroba yaitu:
1. Spread plate (metode sebar)
Merupakan teknik isolasi mikroba dengan cara menginokulasi kultur
mikroba secara sebaran di permukaan media agar yang telah memadat
menggunakan batang L.
2. Streak plate (metode gores)
Dilakukan dengan cara sampel diencerkan kemudian digoreskan berulang
hingga di dapat satu kultur murni. Cara penggoresan dapat secara
langsung, goresan kuadran, dan radian.
3. Pour plate (metode tuang)
Metode ini dilakukan dengan mencampur suspensi bakteri pada medium
agar pada suhu 50°C kemudian dituangkan pada petridish steril. Setelah
agar mengeras diharapkan bakteri mengelompok sehingga terbentuk koloni
tunggal.
1.2 Rumusan Masalah
Berdasarkan latar belakang yang telah diuraikan diatas maka didapatkan
rumusan yang akan dibahas adalah :
1) Apa saja jenis mikoorganisme yang terdapat di dalam mol yang telah
dibuat?
2) Bagaimana cara melakukan isolasi mikroorganisme?
3) Bagaimana pertumbuhan dari mikroorganisme di dalam mol setelah
diisolasi?
4) Bagaimana cara melakukan sterilisasi dengan benar?
5) Berapa jumlah mikroorganisme yang tumbuh dengan menggunakan colony
counter dan haemocytometer?

1.3 Tujuan
Berdasarkan rumusan masalah yang telah diuraikan di atas maka dapat
ditentukan tujuan dari praktikum sebagai berikut :
1) Mengidentifikasi jenis mikroorganisme yang ada di dalam mol limbah
wortel,
 2) Mengetahui bagaimana cara melakukan isolasi mikroorganisme yang
benar,
3) Mengetahui pertumbuhan dari mikoorganisme di dalam mol dengan
metode isolasi,
4) Mengetahui berapa jumlah mikroorganisme yang tumbuh dengan
menggunakan colony counter dan haemocytometer

1.4 Manfaat
Manfaat dari praktikum ini adalah menambah pengetahuan tentang bagaimana
cara melakukan isolasi mikoba serta mengidentifikasi jenis mikroba yang terdapat
di dalam mikroorganisme lokal yang telah dibuat.
 BAB II
LANDASAN TEORI
2.1 Wortel
Wortel (Daucus carota L.) merupakan tanaman yang sangat bermanfaat karena
banyak mengandung betakaroten. Semakin orange warnanya, maka semakin tinggi
pula kandungan betakarotennya. Pemanenan wortel harus dilakukan secara hati-hati
agar tidak terjadi luka pada umbinya. Luka akan menyebabkan masuknya bakteri,
antara lain bakteri kelompok Leuconostoc yang cepat sekali tumbuh dan
menguraikan gula yang ada dalam wortel yang akan diubah menjadi dextran yaitu
senyawa berbentuk lendir sehingga wortel tidak layak untuk dikonsumsi
(Kumalaningsih, 2006).

2.2 Mol (mikroorganisme lokal)

Mikroorganisme lokal (MOL) adalah mikroorganisme yang dimanfaatkan
sebagai starter dalam pembuatan pupuk organik padat maupun pupuk cair. Bahan
utama MOL terdiri dari beberapa komponen yaitu karbohidrat, glukosa, dan sumber
mikroorganisme. Bahan dasar untuk fermentasi larutan MOL dapat berasal dari
hasil pertanian, perkebunan, maupun limbah organik rumah tangga. Karbohidrat
sebagai sumber nutrisi untuk mikroorganisme dapat diperoleh dari limbah organik
seperti air cucian beras, singkong, gandum, rumput gajah, dan daun gamal. Sumber
glukosa berasal dari cairan gula merah, gula pasir, sebagai sumber energi, air kelapa
dan urin sapi sebagai sumber mikroorganisme.
Larutan MOL yang telah mengalami proses fermentasi dapat digunakan sebagai
dekomposer dan pupuk cair untuk meningkatkan kesuburan tanah dan sumber
unsur hara bagi pertumbuhan tanaman. Waktu fermentasi MOL berbeda-beda
antara satu jenis bahan MOL dengan yang lainnya. Waktu fermentasi ini
berhubungan dengan ketersediaan makanan yang digunakan sebagai sumber energi
dan metabolisme dari mikroorganisme. Mikroorganisme pada MOL cenderung
menurun setelah hari ke-14. Hal ini berhubungan dengan ketersediaan makanan
dalam MOL. Proses fermentasi yang lama menyebabkan cadangan makanan akan
berkurang karena dimanfaatkan oleh mikroba di dalamnya (Suhastyo, 2011).
Mikrooganisme yang dapat tumbuh pada wortel sehingga dapat menyebabkan
kerusakan pada wortel yaitu, Botrytis cineria, Sclerotinia spesies, Sclerotium
rolfsii, Rhizopus stolonifera, Mycocentrospora acariena, Clostridium perfringens,
Pseudomonas sp., dan sebagainya.
2.3 Isolasi Mikroorganisme
Isolasi adalah mengambil mikoorganisme yang terdapat di alam dan
menumbuhkannya dalam suatu medium buatan. Prinsip dari isolasi mikroba adalah
memisahkan satu jenis mikroba dengan mikroba lainnya yang berasal dari
campuran bermacam-macam mikroba. Hal ini dapat dilakukan dengan
menumbuhkannya dalam media padat, sehingga sel-sel mikroba akan membentuk
suatu koloni sel yang tetap pada tempatnya. Ada beberapa cara isolasi untuk
mendapatkan biakkan murni, yaitu cara penuangan, cara penggoresan, dan cara
penyebaran.
a. Cara penuangan Isolasi bakteri dengan cara penuangan bertujuan untuk
menentukan perkiraan jumlah bakteri hidup dalam suatu cairan. Hasil
perhitungan jumlah bakteri pada cara penuangan dinyatakan dalam koloni
(Irianto, 2006).
b. Cara penggoresan Isolasi bakteri dengan cara penggoresan bertujuan
membuat garis sebanyak mungkin pada permukaan medium pembiakkan,
dengan jarum ose yang terlepas pada garis-garis tersebut semakin lama
semakin sedikit, sehingga pada garis terakhir koloni yang terbentuk akan
terpisah agak jauh (Irianto, 2006). Cara penggoresan dilakukan dengan
menuangkan terlebih dahulu medium agar pada cawan petri steril. Jarum ose
yang digunakan dipanaskan dahulu hingga memijar, setelah itu disentuhkan
pada koloni bakteri yang akan diisolasi, kemudian digoreskan pada medium
yang tersedia. Menginkubasi selama 2x24 jam pada suhu ruang, lalu
melakukan pengamatan.
c. Cara penyebaran Tujuan dari isolasi bakteri dengan penyebaran serupa
dengan isolasi bakteri cara penuangan. Hal yang membedakan kedua teknik
tersebut adalah teknik penuangan suspensi sampel dan medium.Isolasi
dengan cara penyebaran diawali dengan pengenceran sampel. Pengenceran
sampel dilakukan sama seperti pada cara penuangan. Medium yang telah
dipersiapkan dituangkan ke dalam cawan petri steril tunggu hingga
memadat, setelah itu suspensi sampel dituangkan di atas permukaan agar.
 Penyebaran suspensi sampel dilakukan dengan menyebarkan suspensi
dengan batang L yang telah dipanaskan terlebih dahulu (Waluyo, 2007).
Dari ketiga teknik isolasi di atas terdapat dua diantaranya yang paling sering dan
paling banyak digunakan adalah Teknik cawan tuang dan cawan gores. Kedua
metode ini didasarakan pada prinsip yang sama yaitu mengencerkan organisme
sedemikian rupa sehingga individu species dapat dipisahkan (Plezar, 2006).

2.4 Sterilisasi
Sterilisasi adalah proses atau kegiatan menghancurkan atau memusnahkan
semua mikroorganisme termasuk spora, dari sebuah benda atau lingkungan. Hal ini
biasanya dilakukan dengan pemanasan atau penyaringan tetapi bahan kimia atau
radiasi juga dapat digunakan. Prinsip dasar sterilisasi yaitu memperpanjang umur
simpan bahan pangan dengan cara membunuh mikroorganisme yang ada di
dalamnya. Mikroorganisme yang tumbuh pada produk pangan biasanya dapat
mencemari produk pangan dan membuat makanan lebih cepat basi.
Mikroorganisme pembusuk tersebut bisa berupa bakteri, kapang (jamur) dan
khamir (yeast) (Hiasinta, 2001).
2.4.1 Autoklaf
Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat dan bahan yang
digunakan dalam mikrobiologi menggunakan uap air panas bertekanan. Autoklaf
juga disebut dengan sterilisasi basah. Peralatan yang digunakan perlu disterilisasi
agar pada saat kontak dengan produk, tidak menyebabkan kontaminasi. Sebelum
digunakan autoklaf terlebih dahulu divalidasi untuk membuktikan bahwa autoklaf
berfungsi dengan baik dan mampu menghasilkan material yang steril. Tekanan
yang digunakan adalah 1,5 kg/cm2 atau sekitar 1 atm dengan suhu 121 °C dalam
waktu 15 menit. Autoklaf mempunyai cara kerja yang hampir sama dengan alat
masak pressure cooker, sebab alat ini merupakan sebuah bejana yang dapat diisi air
dan ditutup rapat-rapat. Autoklaf ada yang model listrik tetapi ada pula yang harus
diletakkan diatas kompor gas. Jika alat ini dipanaskan, maka akan terjadi uap air
yang tidak dapat keluar karena bejana tertutup rapat, sehingga tekanan didalam
autoklaf naik sampai melebihi tekanan normal. Kenaikan tekanan uap ini akan
menyebabkan air mendidih diatas 1000C. Apabila tekanan uap tidak diatur, maka
akan semakin bertambah tinggi .Oleh karena itu, tekanan perlu diatur sampai
mencapai 1,5 kg/cm2 (Daisy, 2012).
2.5 Perhitungan Mikroorganisme
Berdasarkan beberapa metode kuantifikasi sel yang telah diketahui hingga saat
ini, perhitungan manual dengan haemocytometer masih umum digunakan karena
biaya yang dibutuhkan relatif rendah serta kemampuannya dalam menghitung
beberapa jenis sel.
2.5.1 Colony Counter
Colony counter digunakan untuk mempermudah perhitungan koloni yan g
tumbuh setelah diinkubasi di dalam cawan karena adanya kaca pembesar. Selain itu
alat tersebut dilengkapi dengan skala/ kuadran yang sangat berguna untuk
pengamatan pertumbuhan koloni sangat banyak. Jumlah koloni pada cawan petri
dapat ditandai dan dihitung otomatis yang dapat di-reset (Fardiaz, 1992).
2.5.2 Haemocytometer
Haemocytometer merupakan metode perhitungan mikroskopis secara langsung.
Pada metode ini sampel ditaruh di ruang hitung dan jumlah sel ditentukan secara
langsung dengan bantuan mikroskop. Keuntungan metode ini adalah
pelaksanaannya relatif sederhana dan tidak memerlukan banyak peralatan. Namun
kelemahan dari metode ini tidak bisa membedakan sel-sel yang hidup dan sel-sel
yang mati. Dengan kata lain hasil yang diperoleh dari metode ini adalah jumlah
total sel yang ada didalam populasi. Kelemahan lain dari metode ini adalah sulitnya
menghitung sel yang berukuran sangat kecil seperti bakteri karena ketebalan
haemocytometer tidak memungkinkan digunakannya lensa objektif celup minyak.
Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga lebih mudah dilihat.
Kelemahan lainnya, kadang-kadang sel cenderung bergerombol sehingga sukar
membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah memisahkan gerombolan
sel dengan menambahkan bahan anti gumpal seperti dinatriumetilenadiamina-
tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1% (Hadioetomo, 1990)
 BAB III
METODE PERCOBAAN
3.1 Waktu Percobaan
Pembuatan mikoorganisme lokal yang berbahan dasar limbah wortel mulai
dibuat pada tanggal 7 November 2021. Praktikum isolasi, identifikasi, dan
perhitungan mikroorganisme dilakukan pada tanggal 1 dan 8 Desember 2021.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Pembuatan Mol
No. Nama Alat dan Bahan
1. Limbah wortel (wortel busuk) ± 100 gr
2. Air kelapa ± 500 mL
3. Kunyit ± 10 gr
4. Lengkuas ± 10 gr
5. Gula merah ± 10 gr (sudah dilarutkan dengan air kelapa)
6. Terasi ±10 gr
7. Pisau
8. Sendok
9. Wadah (botol)
10. Cobek dan ulekan
11. Blender
12. Kain saring

3.2.2 Sterilisasi
No. Nama Alat dan Bahan
1. Cawan petri
2. Tabung reaksi beserta rak
3. Pipet ukur 10 mL
4. Labu takar 100 mL
5. Batang pengaduk
6. Kaca arloji
7. Kertas pembungkus
8. Kain kassa
 9. Kapas berlemak
10. Tali Kasur
11. Autoclave Hirayama
12. Gunting
13. Hot plate
14. Neraca analitik
15. Spatula
16. Beaker glass
17. Potato Dextrose Agar bubuk (PDA)
18. Aquades

3.2.3 Isolasi Metode Cawan Tuang

No. Nama Alat dan Bahan
1. Cawan petri steril
2. Tabung reaksi steril
3. Pembakar spiritus
4. Korek api
5. Pipet mikro 100-1000 µL
6. Tip pipet mikro steril
7. Pipet ukur steril 10 mL
8. Ball pipet
9. Vortex mixer
10. Incubator
11. Air steril
12. Ethanol 70%
13. Media PDA
14. Suspensi mikroorganisme (MOL)

3.2.4 Isolasi Metode Cawan Gores

No. Nama Alat dan Bahan
1. Cawan petri steril
2. Lup inokulasi
 3. Pembakar spiritus
4. Incubator
5. Media agar PDA steril
6. Cawan petri hasil isolasi dengan metode cawan tuang

3.2.5 Penyimpanan Kultur Murni di Agar Miring

No. Nama Alat dan Bahan
1. Tabung reaksi steril
2. Rak tabung reaksi
3. Batang penyangga
4. Pembakar spiritus
5. Kawat ose
6. Media agar PDA cair steril
7. Biakan hasil isolasi cawan tuang
8. Ethanol 70%
9. Incubator

3.2.6 Pengamatan Mikroskop

No. Nama Alat dan Bahan
1. Mikroskop binokuler
2. Kaca preparat
3. Kaca penutup (cover glass)
4. Pembakar spiritus
5. Korek api
6. Lup inokulasi (kawat ose)
7. Pipet tetes
8. Aquades steril
9. Biakan hasil isolasi cawan tuang
10. Ethanol 70%
 3.2.7 Perhitungan Mikroorganisme
No. Nama Alat dan Bahan
1. Mikroskop binokuler
2. Mikropipet
3. Tip mikro pipet steril
4. Pembakar spiritus
5. Korek api
6. Colony counter
7. Haemacytometer
8. Ethanol 70%
9. Biakan hasil isolasi metode cawan tuang

3.3 Prosedur Kerja

3.3.1 Pembuatan MOL

Persiapan Bahan
- 100 gr limbah wortel dihaluskan dengan cobek dan
ulekan
- 10 gr kunyit dan 10 gr lengkuas dipotong menjadi
kecil dan dihaluskan dengan blender
- 10 gr gula merah dilarutkan dengan air kelapa
Pengolahan
- Limbah wortel dimasukkan ke dalam wadah
- Ditambahkan 500 mL air kelapa
- Ditambahkan 10 gr kunyit dan 10 gr lengkuas
- Ditambahkan 10 gr larutan gula merah dan 10 gr
potongan terasi

Pengadukan
- Diaduk hingga seluruh campuran tercampur rata
- Ditutup wadah dengan menyisihkan sedikit
rongga pada tutup wadah

Fermentasi
 - Disimpan di tempat yang minim cahaya
- Dibuka tutup wadah selang waktu 24 jam untuk
membuang gas
- Disaring antara endapan dengan cairannya
menggunakan kain saring dan dimasukkan ke
dalam botol
MOL

3.3.2 Sterilisasi

Dicuci alat yang akan digunakan kemudian ditiriskan hingga kering

Ditutup dengan sumbat untuk tabung reaksi dan peralatan berleher.

(sumbat terbuat dari kapas berbungkus kain kassa)

Dibungkus semua peralatan dengan kertas bungkus kecuali erlenmeyer

Ditimbang Potato Dextrose Agar bubuk sebanyak 3,9 gr, dan dilarutkan
dengan aquades di dalam beaker glass sampai 100 mL

Dipanaskan hingga larut sempurna dan diaduk sesekali agar tidak

mengendap. Setelah itu dimasukkan ke dalam Erlenmeyer dan ditutup
dengan sumbat

Dimasukkan ke dalam keranjang, peralatan dan media yang sudah

terbungkus. Kemudian disterilisasi di dalam autoklaf pada suhu 121 °C
selama 30 menit (pastikan air sudah mencapai tanda batas)

Setelah sterilisasi selesai autoklaf dimatikan, kemudian dimasukkan alat

dan media ke dalam oven untuk dikeringkan.

3.3.3 Isolasi Metode Cawan Tuang

Diambil 6 tabung reaksi berisi air steril masing-masing 9 mL, diletakkan

di rak tabung reaksi dan diberi nomor
 Diambil 1 mL campuran biakan secara aseptik dengan mikro pipet,
dipindahkan ke tabung reaksi 1, dikocok

Diambil 1 mL dari tabung reaksi 1 campuran biakan secara aseptik dan

dipindahkan ke tabung reaksi 2, dikocok. Dilakukan hal yang sama pada
kelima tabung reaksi

Dipindahkan 1 mL campuran dari masing-masing tabung secara aseptik

ke 5 petridish steril (diberi nomor dan keterangan pengenceran sesuai
asal biakan tabung)

Ditambahkan agar cair bersuhu ± 40°C secukupnya ke dalam petridish

secara aseptik

Diputar cawan petri dengan posisi di meja kerja searah jarum jam
sebanyak 5 kali, kemudian berlawanan arah jarum jam 5 kali, diputar
membentuk angka delapan sebanyak 5 kali. Kemudian dibiarkan beku

Dibungkus dengan kertas pembungkus dan diinkubasi selama 2x24 jam

dalam incubator oben dalam keadaan terbali (tutup cawan di bawah)
pada suhu yang sesuai

Diamati diameter (mm), warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk,

konsistensi serta bau

3.3.4 Isolasi Metode Cawan Gores

Disiapkan cawan petri kering dan steril. Kemudian dipanaskan bibir

cawan beberapa kali di api pembakar spiritus

Diletakkan di meja dan dibuka tutup cawan petri tidak terlalu lebar,
cukup untuk menuangkan media agar cair bersuhu ± 60°C ke dalamnya
 Diisikan ±1/3 bagian dari kedalaman cawan petri, kemudian dibiarkan
tutup cawan terbuka sedikit untuk mendinginkan media agar dan uap
panas tidak mengembun di tutup cawan

Setelah beku, cawan dibalik dan dibuat sketsa area penggoresan dengan
spidol

Diletakkan cawan petri di atas meja dengan posisi tutup terletak disisi
atas

Dipindahkan secara aseptik dengan lup inokulasi sebanyak satu lup

penuh biakan mikroba pada sektor 0 dan digoreskan membentuk pola
zig-zag (goresan dilakukan tanpa tekanan tapi mantap)

Dipijarkan kembali lup dan dibiarkan dingin, kemudian digoreskan lup

ke sektor 0 satu sampai tiga kali dan dilanjut dengan goresan ke arah
tepi luar sektor 1. Dilanjutkan dengan goresan zigzag pada sektor 1 dan
tidak tumpang tindih.

Diputar cawan petri sehingga sektor 1 berada di sisi kiri, kemudian

diulangi 1 langkah diatas untuk mengencerkan biakan dari sektor 1 ke
sektor 2

Diputar cawan petri sehingga sektor 2 berada di sisi kiri, kemudian

diulangi langkah diatas untuk mengencerkan biakan dari sektor 2 ke
sektor 3 (lup selalu dipijarkan setiap kali berpindah sektor)

Dipanaskan sekali lagi bibir cawan petri dengan pembakar spiritus

kemudian dibungkus rapi

Diinkubasikan cawan petri terbalik dalam incubator oven pada suhu yang
disesuaikan selama 2x24 jam

Diamati diameter (mm), warna, ketinggian koloni, tepian, bentuk

3.3.5 Penyimpanan Kultur Murni di Agar Miring
3.3.5.1 Pembuatan Agar Miring

Disiapkan tabung reaksi kering dengan sumbat kapasnya

Dituangkan media PDA cair hingga ±1/3 tinggi tabung reaksi (secara
aseptis), kemudian ditutup dengan sumbat kapas

Disimpan dalam posisi miring setelah proses sterilisasi selesai, diatur

hingga media agar di dasar tabung tidak terlalu tebal dan ujung agar
miring cukup jauh (± 8 cm) dari mulut tabung

3.3.5.2 Inokulasi

Dituliskan tanggal pada permukaan luar tabung agar miring, kemudian

diletakkan pembakar spiritus ± 30 cm, serta dibersihkan meja kerja dan
tangan dengan etanol 70%

Dipegang cawan petri berisi isolat di tangan kiri dan lup inokulasi di
tangan kanan. Kemudian dipijarkan lup inokulasi hingga memerah dan
dipanaskan bibir cawan petri dalam beberapa putaran

Dibuka tutup cawan petri dengan gerakkan ibu jari tangan kiri ketas dan
ditahan dengan telunjuk serta jari tengah kanan kiri

Diambil satu lup biakan isolate yang sudah dipilih dan ditutup cawan
petri dengan cepat, kemudian dipanaskan kembali bibir cawan petri

Dipegang tabung reaksi dengan tangan kiri dan lup inokulasi di tangan
kanan kemudian dibuka tutup kapasnya dengan kelingking tangan kanan
dan dijepitkan ke telapak tangan kanan

Dipanaskan bibir tabung reaksi dalam beberapa putaran, lalu dimasukkan

lup inokulasi dan digoreskan ke agar miring dalam tabung reaksi dengan
pola zig zag
 Dipanaskan bibir tabung sebelum kapasnya ditutupkan kembali, lalu
diinkubasi dalam incubator oven selama 2x24 jam pada suhu yang sesuai

Dipijarkan kembali lup inokulasi sebelum disimpan

3.3.6 Pengamatan Mikroskop

Dicuci kaca preparat dan kaca penutup kemudian disterilkan dengan

alkohol dan dilewatkan di api

Diletakkan sejumlah air steril di permukaan kaca preparat dengan

menggunakan kawat ose secara aseptik

Dipanaskan kembali kawat ose hingga berpijar, kemudian dipanaskan

bibir cawan petri hasil isolasi cawan tuang

Dibuka cawan petri tidak terlalu lebar, kemudian diambil

mikroorganisme pada koloni menggunakan kawat ose

Diletakkan koloni mikroorganisme di kawat ose pada kaca preparat yang

sudah ada air steril, kemudian ditutup dengan kaca penutup

Diamati di mikroskop

3.3.7 Perhitungan Mikroorganisme

3.3.7.1 Colony counter
Disiapkan cawan petri hasil isolasi cawan tuang, kemudian dinyalakan
colony counter dan diletakkan cawan petri di wadah colony counter

Ditunjuk tiap titik koloni dengan spidol hingga tercatat angka yang
menunjukkan jumlah koloni yang ada dalam cawan petri tersebut

Angka yang diperoleh dikalikan dengan faktor pengencerannya. Jumlah

koloni adalah perkalian dari hasil perhitungan dengan angka
pengencerannya
3.3.7.2 Haemocytometer

Dibersihkan permukaan hitung haemocytometer dengan tisu dan etanol

70% (jangan menggosok terlalu kuat karena kacanya mudah tergores)

Dikocok suspensi biakan mikroba (pengenceran 10-2 ) dengan vortex

mixer, kemudian diambil sebanyak 10µL menggunakan pipet mikro

Diletakkan pada ruang hitung haemocytometer, kemudian ditutup dengan

kaca penutup

Diletakkan haemocytometer pada meja preparate mikroskop dan diamati

dengan perbesaran (40x)

Dihitung jumlah sel yang terdapat pada 80 buah kotak kecil yang terletak
di dalam kotak bagian tengah

Dihitung sesuai ketentuan cara perhitungan haemocytometer

 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil Pengamatan

4.1.1 Pembuatan Mol
Indikator Pengamatan Keterangan
Warna Jingga keruh kecoklatan
Bau Setelah melalui proses fermentasi
selama 7 hari, mol yang dihasilkan
mengeluarkan baru hasil fermentasi
seperti tape.
Wujud Campuran terpisah menjadi 2 wujud/
bagian, pada bagian bawah berwujud
padat dan pada bagian atas berwujud
cair

4.1.2 Isolasi Metode Cawan Tuang

Pengenceran Keterangan
Blanko tidak terdapat kontaminan dari mikroorganisme pada cawan petri
berisi media PDA
10-2 Mikroba yang tumbuh memiliki bentuk koloni bundar berwarna
putih dengan tepian berombak dan elevasi timbul.
10-3 Mikroba yang tumbuh memiliki bentuk koloni bundar berwarna
putih dengan tepian berombak dan elevasi timbul. Selain itu
terdapat juga koloni mikroba yang berbentuk konsentris
berwarna putih dengan tepian licin dan elevasi datar.
10-4 Mikroba yang tumbuh memiliki bentuk koloni bundar berwarna
putih dengan tepian berombak dan elevasi timbul.

4.1.3 Isolasi Metode Cawan Gores

Sektor Keterangan
0 Terdapat koloni mikroba yang tumbuh dengan bentuk bulat dan
berkumpul
1 Pada sektor 1 terdapat sedikit koloni mikroba yang tumbuh dan
pola goresan tidak terlihat jelas
2 Pada sektor 2 tidak terdapat mikroba yang tumbuh dan pola
goresan tidak terlihat jelas
3 Pada sektor 3 terdapat sedikit koloni mikroba yang tumbuh dan
pola goresan tidak terlihat jelas
 4.1.4 Isolasi Metode Agar Miring
Biakan Keterangan
Koloni dari Bentuk dari goresan tidak teratur sehingga terlihat menumpuk
pengenceran di awal penggoresan
10-3

4.1.5 Pengamatan dengan Mikroskop

Biakan Keterangan
Koloni dari Mikroba memiliki bentuk batang dan berkelompok
pengenceran
10-3

4.1.6 Perhitungan Mikroba

4.1.6.1 Metode Colony Counter
Tingkat Hasil Keterangan SPC
pengenceran perhitungan
10-2 245 dari ketiga data (66.000+24.500)/2
10-3 66 tersebut yang = 45.250
10-4 24 dipakai adalah = 4,525 x 104 CFU/mL
data pengenceran
10-2 dan 10-3

4.1.6.2 Metode haemocytometer

Ruang Jumlah hitungan Hasil perhitungan
hitung per-ruang hitung
1 0 Pada 80 kotak kecil dengan luas 0,2mm2 .
2 3 jadi dalam setiap mm2 terdapat 18 x 5 atau
3 12 90 sel. Kedalaman cairan hemasitometer
4 2 adalah 0,1 mm. maka volume yang
5 1 tercakup adalah 0,1 mm3 , artinya terdapat
90/0,1 mm3 atau 900 sel/mm3. 1 mL=1 cm3
atau 1000 mm3, maka jumlah sel dalam
suspensi asal adalah 9 x 105 sel/ml
4.2 Pembahasan
4.2.1 Pembuatan Mol
Pada proses pembuatan mol berbahan dasar wortel diperlukan waktu fermentasi
selama ± 14 hari. Pembuatan mol dilakukan dengan memanfaatkan limbah wortel
yang sudah busuk sebanyak 100 gr kemudian dihaluskan yang kemudian dilarutkan
dengan 500 mL air kelapa. Lalu ditambahkan dengan 10 gr kunyit dan 10 gr
lengkuas yang telah dihaluskan, serta 10 gr larutan gula merah dan 10 gr potongan
terasi. Setelah itu semua bahan diaduk hingga tercampur rata, kemudian di simpan
di tempat tertutup dan dibuka tutup nya setiap 24 jam sekali. Dilakukan buka tutup
wadah secara rutin ini bertujuan untuk membuang gas hasil proses fermentasi, agar
MOL yang dibuat tidak meledak. Selama 14 hari pengamatan terdapat perubahan
yang terjadi. Perubahan tersebut berupa perubahan bau dan warna. MOL yang
awalnya berwarna jingga, setelah melalui proses fermentasi mengalami perubahan
warna menjadi jingga kecoklatan. Sementara perubahan bau yang terjadi, yaitu bau
yang awalnya busuk berubah menjadi sedikit asam atau bau seperti tape yang
merupakan hasil dari proses fermentasi oleh mikroorganisme.
Pada MOL sayuran umumnya mengandung mikroorganisme berupa Eschericia
coli, Bacillus sp., Pseudomonas sp., Citrobacter sp.,Citrobacter sp., Streptococcus
sp., dan Enterobacter sp.

4.2.2 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Tuang

Isolasi mikroorganisme ini dilakukan dengan tujuan untuk mendapatkan
mikroorganisme dalam bentuk koloni tunggal. Isolasi metode cawan tuang
dilakukan dengan melakukan pengenceran suspensi/biakan bakteri (MOL)
sebanyak 6 kali dengan pengambilan volume setiap pengenceran sebanyak 1 mL
menggunakan mikropipet. Setelah itu dipilih variasi pengenceran untuk dituangkan
ke dalam cawan petri dan dicampurkan dengan media PDA. Kemudian diinkubasi
di dalam incubator oven selama 2x24 jam dan diamati perubahannya. Pada isolasi
mikroorganisme dengan metode cawan tuang ini dilakukan dengan menggunakan
pengenceran 10-2, 10-3, dan 10-4 Berdasarkan tabel pengamatan dari praktikum yang
telah dilakukan, didapatkan hasil bahwa pada pengenceran 10-2, terdapat banyak
mikroorganisme yang tumbuh pada cawan petri dengan koloni yang berwarna putih
dengan bentuk bundar, tepian berombak, dan elevasi timbul. Sedangkan pada
cawan petri dengan pengenceran 10-3 terdapat mikroorganisme yang tumbuh lebih
sedikit dibandingkan dengan pengenceran sebelumya. Pada pengenceran 10-3
koloni yang tumbuh memiliki bentuk bulat dengan tepian berombak dan elevasi
timbul. Selain itu terdapat juga koloni lain yang memiliki bentuk konsentris
berwarna putih dengan tepian licin dan elevasi datar. Sedangkan pada pengenceran
10-4 hanya terdapat sedikit koloni mikroorganisme yang terbentuk pada cawan petri
dengan bentuk bundar berwarna putih dengan tepian berombak dan elevasi timbul.

4.2.3 Isolasi Mikroorganisme Metode Cawan Gores

Isolasi metode cawan gores ini dilakukan dengan menggunakan biakan hasil dari
isolasi metode cawan tuang dengan tingkat pengenceran tertentu. Untuk praktikum
ini digunakan biakan hasil isolasi dari pengenceran 10-3. Inokulasi mikroorganisme
dilakukan dengan bantuan kawat ose yang telah dipijarkan, kemudian diambil dari
koloni yang memiliki bentuk paling besar dan di goreskan pada cawan berisi media
PDA yang telah dibuat. Penggoresan dilakukan mengikuti sektor atau bagian yang
telah digambarkan pada permukaan luar cawan petri dengan goresan zig zag
dimulai dari sektor 0 hingga ke sektor 3. Setelah itu diinkubasikan dalam incubator
oven selama 2x24 jam. Berdasarkan data pengamatan didapatkan hasil bahwa pada
sektor 0 terdapat koloni mikroorganisme yang tumbuh dengan bentuk bundar
berwarna putih. Sedangkan pada sektor 1,2, dan 3 tidak terlihat pola goresan yang
jelas dikarenakan cara penggoresan yang terlalu menekan, sehingga media dapat
tergores dan inokulasi mikroorganisme menjadi tidak merata dan tidak teratur.

4.2.4 Isolasi Metode Agar Miring

Pada isolasi dengan metode agar miring, dilakukan pembuatan media PDA
terlebih dahulu dengan menuangkan media PDA cair ke dalam tabung reaksi yang
kemudian di letakkan miring. Lalu setelah dingin dan memadat, koloni pada biakan
dari isolasi metode cawan tuang pengenceran 10-3 diinokulasikan pada media agar
miring dengan penggoresan secara zigzag. Kawat ose dipijarkan terlebih dahulu,
kemudian setelah dingin, diambil koloni pada biakan cawan tuang pengenceran 10-
3
lalu di goreskan pada media agar miring. Lalu diinkubasikan dalam incubator oven
selama 2x24 jam. Berdasarkan data pengamatan didapatkan hasil bahwa,
mikroorganisme tumbuh pada media agar miring dengan pola zigzag yang terlihat
jelas. Akan tetapi koloni terlihat menumpuk pada bagian awal penggoresan.
 4.2.5 Pengamatan dengan Mikroskop
Identifikasi mikroorganisme yang terdapat di dalam MOL dilakukan dengan
menggunakan mikroskop yang diawali dengan pembuatan preparat terlebih dahulu.
Preparat dibuat dengan menginokulasikan mikroorganisme pada koloni hasil
biakan cawan tuang pengenceran 10-3 menggunakan kawat ose yang telah
disterilkan, kemudian diletakkan pada kaca preparate yang telah ditetesi akuades
steril. Lalu ditutup dengan menggunakan deckglass dan diletakkan pada meja
preparat di mikroskop. Berdasarkan data pengamatan didapatkan hasil bahwa pada
perbesaran 400x terlihat bentuk dari sel mikroorganisme yang diamati yaitu,
berbentuk batang dengan berkelompok. Berdasarkan jurnal dan teori, ciri-ciri
mikroorganisme tersebut teridentifikasi sebagai bakteri Erwinia carotovora yang
merupakan bakteri perusak sayuran sehingga menyebabkan busuk lunak pada
tanaman umbi-umbian seperti wortel. Bakteri tersebut memiliki bentuk koloni
bundar berwarna putih mengkilat dengan elevasi timbul. Pada media PDA yang
merupakan media khusus untuk pertumbuhan jamur atau kapang, akan tetapi pada
praktikum ini tidak tumbuh jamur atau kapang. Hal tersebut dapat diakibatkan oleh
beberapa faktor yaitu banyaknya bakteri yang tumbuh pada saat pembuatan
mikroorganisme lokal, selain itu pada bahan dasar yang dipakai juga merupakan
bahan busuk sehingga bakteri yang terdapat di dalamnya cukup banyak. Kemudian
untuk menumbuhkan kapang/jamur pada media PDA membutuhkan waktu
inkubasi yang cukup lama dibandingkan dengan media NA untuk bakteri.

4.2.6 Perhitungan Mikroorganisme

Koloni bakteri merupakan sebuah kumpulan dari bakteri yang sejenis menjadi
satu dan membentuk koloni-koloni. Untuk mengetahui berapa jumlah koloni
mikroorganisme yang tumbuh pada media dapat menggunakan alat bantu untuk
menghitung jumlah koloni, yaitu colony counter. Cara menggunakan alat ini yaitu
dengan meletakkan cawan petri berisi media yang telah ditumbuhi bakteri pada
colony counter yang sudah menyala dengan memastikan sudah terhubung ke listrik
dan tombol on sudah ditekan, serta tampilan angka pada display telah direset hingga
menunjukkan angka 0. Kemudian koloni pada cawan petri ditandai menggunakan
spidol dengan bantuan kaca lup/ kaca pembesar agar lebih jelas. Berdasarkan data
pengamatan dari praktikum yang telah dilakukan, didapatkan hasil bahwa pada
pengenceran 10-2 terdapat koloni sebanyak 245, pada pengenceran 10-3 terdapat 66
koloni, dan pada pengenceran 10-4 terdapat 24 koloni. Setelah dilakukan
perhitungan jumlah koloni, maka didapatkan hasil jumlah koloni dengan
menggunakan colony counter yaitu sebanyak 4,525 x 104 CFU/mL.

Selain itu perhitungan mikroorganisme juga dapat dilakukan dengan

menggunakan haemocytometer. Perhitungan dengan alat ini diawali dengan
mengambil biakan pada metode cawan tuang pengenceran 10-2 menggunakan
mikropipet dan diletakkan pada ruang hitung haemocytometer yang sudah
disterilkan menggunakan alcohol. Kemudian ditutup menggunakan deckglass
steril, lalu diletakkan di meja preparate pada mikroskop. Setelah itu dilakukan
pengamatan pada ruang hitung sesuai dengan ketentuan yaitu, ruang 1, 2, 3, 4, dan
5. Berdasarkan data pengamatan didapatkan hasil bahwa pada ruang 1 tidak
terdapat sel dari bakteri, pada ruang 2 terdapat 3 sel bakteri, pada ruang 3 terhitung
12 sel bakteri, sedangkan pada ruang 4 dan ruang 5 terlihat hanya terdapat 2 dan 1
sel bakteri. Pada pengamatan menggunakan haemocytometer didapatkan hasil yang
kurang teliti dikarenakan gambar yang kurang jelas serta tidak didapatkan titik yang
fokus sehingga dapat menyebabkan kesulitan saat menghitung sel bakteri. Setelah
melalui proses perhitungan didapatkan jumlah sel bakteri dalam suspensi awal
sebanyak 9 x 105 sel/ml.
 BAB V
KESIMPULAN DAN SARAN

5.1 Kesimpulan
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan dapat disimpulkan bahwa :

1. Pada mikroorganisme lokal yang telah dibuat dengan bahan dasar wortel,
terdapat mikroorganisme yang tumbuh di dalamnya yaitu, bakteri Erwinia
carotovora yang merupakan bakteri penyebab busuk lunak pada sayur
umbi-umbian seperti wortel.
2. Isolasi mikroorganisme dapat dilakukan dengan melakukan beberapa
metode seperti cawan tuang, cawan gores, dan agar miring dimana setiap
metode memiliki cara isolasi masing-masing.
3. Pertumbuhan mikroorganisme dari metode isolasi yang telah dilakukan
dapat diketahui dengan adanya koloni yang terbentuk pada media PDA
metode cawan tuang dimana terdapat koloni dengan bentuk bundar
berwarna putih dengan tepian berombak dan elevasi timbul. Sedangkan
pada cawan gores dan agar miring pertumbuhan mikroorganisme dapat
diketahui dengan adanya koloni yang berbentuk goresan zigzag pada media.
4. Jumlah mikroorganisme yang tumbuh dan dihitung menggunakan colony
counter yaitu sebanyak 4,525 x 104 CFU/mL. Sedangkan saat menggunakan
haemocytometer jumlah sel yang diketahui sebanyak 9x105 sel/mL.

5.2 Saran
Pada saat melakukan praktikum perlu diperhatikan dan diingat kembali pentingnya
bekerja dengan steril. Untuk menghindari adanya kontaminan dari bakteri maupun
jamur, maka perlu dilakukan sterilisasi dengan benar. Oleh sebab itu, bekerja
dengan aseptik juga dapat meminimalisir adanya kontaminan yang dapat
mengurangi kegagalan dari hasil praktikum. Sehingga dengan kita bekerja dengan
steril dan aseptik, maka hasil yang didapatkan dapat maksimal.
 Daftar Pustaka

Daisy. 2012. Autoklaf. Bandung : Penerbit Kanisius

Fardiaz, S. 1992. Mikrobiologi Pangan I. Jakarta: Gramedia Pustaka Utama

Hadioetomo, R. S. 1990. Mikrobiologi Dasar dalam Praktek. Jakarta: PT Gramedia

Irianto, K. 2006. Mikrobiologi: Menguak Dunia Mikroorganisme Jilid 2. Bandung:

CV. Yrama Widya

Kumalaningsih, S. 2006. Antioksidan alami penangkal radikal bebas, sumber

manfaat, cara penyediaan dan pengolahan. Surabaya : Trubus. Agrisaran

Plezar. 2006. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: UI Press

Purnawijayanti, Hiasinta A. 2001. Sanitasi, Higiene dan Keselamatan Kerja dalam

Pengelolaan Makanan. Yogyakarta: Kanisius

Suhastyo, A. A. 2011. Studi Mikrobiologi dan Sifat Kimia Mikroorganisme Lokal

(MOL) yang Digunakan pada Budidaya Padi Metode SRI (System of Rice
Intensification). Tesis. Intitut Pertanian Bogor

Sutari, N. W. S. 2010. Uji Berbagai Jenis Pupuk Cair Biourine terhadap

Pertumbuhan Dan Hasil Tanaman Sawi Hijau (Brassica juncea L.).
Agritrop : Jurnal Ilmu-Ilmu Pertanian (Journal On Agricultural Sciences)
edisi desember 2010. Vol.29.

Waluyo. L. 2007. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press

 LAMPIRAN

1. Isolasi mikroorganisme metode cawan tuang

Pengenceran 10-2 Pengenceran 10-3 Pengenceran 10-4

2. Isolasi mikroorganisme metode cawan gores dan agar miring

3. Pengamatan pada mikroskop

4. Perhitungan mikroorganisme dengan haemocytometer

Ruang 1 Ruang 2

Ruang 3 Ruang 4

Ruang 5