(Cumplimiento de la Ley de Lambert-Beer y anlisis de mezclas) ______________________________________________________________________________________ ____

Prctica de espectrofotometra UV-Visible

FUNDAMENTO DE LA TCNICA
Como es sabido, las tcnicas espectroscpicas se basan en la interaccin de la radiacin electromagntica con la materia. A travs de esta interaccin las molculas pueden pasar de un estado energtico, m, a otro estado energtico distinto, l, absorbiendo una cantidad de energa radiante igual a la diferencia energtica existente entre los dos niveles: que:

E l Em . Para conseguir esto, las molculas absorben un fotn de una radiacin tal E = h =

hc

El Em

h = Constante de Planck= 6.63.10-34 J.s

= Frecuencia de la radiacin=

c = velocidad de la luz=3.1010 cm.s -1 = longitud de onda Estos trnsitos energticos son los que dan origen a los espectros que, en definitiva, no son mas que el registro de las distintas (o ) a las que se producen estos trnsitos energticos. Debido a la existencia de diferentes tipos de energa: de los electrones en si, de los movimientos vibracionales de las molculas, de la rotacin de las mismas...etc, las molculas pueden interaccionar con radiaciones electromagnticas de un rango muy amplio de longitudes de onda, dando lugar a distintos tipos de espectroscopas segn las diferentes regiones. Un esquema podra ser el siguiente:

/ nm

10 10 10 10 10 10 10 Rayos Rayos x UV VIS INFRARROJO MICROONDAS ONDAS RADIO

Transitos electrones internos nucleares
400

electrones externos
500 600

Vibraciones
700

Rotaciones

RMN

violeta ail azul verde amarillo naranja rojo

La espectroscopa UV-Visible (espectros electrnicos), se debe a la transicin de los electrones mas externos de los tomos de las molculas, desde niveles fundamentales a niveles mas altos de energa.

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LEY DE LAMBERT-BEER
Si se hace incidir radiacin monocromtica sobre una muestra con una concentracin C de una sustancia que absorbe a esa longitud de onda , la intensidad

de la radiacin que la atraviesa, I, est relacionada con la intensidad incidente I 0 y con el espesor de la muestra,l , por la expresin :

I = I 0 10 l c
aplicando logaritmos: reordenando trminos:

logI = log I 0 l c logI 0 log I = l c I log I0 = l c

pudindose escribir :

I I0 se denomina transmitancia de la muestra y se suele Habitualmente, el cociente I expresar como porcentaje de luz transmitida: I0 100 . Por otra parte, se define la absorbancia de la muestra como: A = log(1/T). Tanto la absorbancia como la transmitancia son magnitudes que se obtienen directamente en el espectrofotmetro. Segun estas definiciones, queda finalmente la siguiente expresin que se conoce con el nombre de la ley de Lambert-Beer:

A=lc
donde es la absortividad molar (una medida de la radiacin absorbida), que es un valor constante para cada sustancia a cada longitud de onda y en unas condiciones experimentales determinadas; tambin se denomina coeficiente de extincin molar si, como es frecuente, la concentracin se expresa en moles por litro. Si se opera, por tanto, a una longitud de onda dada y con una cubeta de un determinado espesor, l , la absorbancia A, medible directamente, es proporcional a la concentracin molar de la muestra, c, lo que constituye el fundamento del anlisis espectrofotomtrico cuantitativo. Existen, sin embargo, distintos factores que afectan al cumplimiento de la ley de Lambert-Beer, especialmente a concentraciones elevadas. Por ello antes de proceder al anlisis de una muestra es preciso comprobar experimentalmente el rango de concentraciones en que dicha ley se cumple, obteniendo la curva de calibrado que relaciona las absorbancias con las concentraciones.

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La ley de Lambert-Beer puede tambin aplicarse al anlisis cuantitativo de mezclas de dos o ms sustancias, siempre que sus respectivos espectros de absorcin sean lo suficientemente distintos. El procedimiento se basa en que la absorbancia es una propiedad aditiva, de tal forma que la absorbancia total de una mezcla es la suma de cada uno de los componentes. As, para una mezcla de dos componentes, 1 y 2, que absorben radiacin de una misma longitud de onda, se cumplir que:

A = A 1 + A 2 = 1 l c1 + 2 l c2
Supongamos, entonces, que nuestro problema es el anlisis de una mezcla de dos sustancias. En primer lugar se habr de registrar el espectro de absorcin de cada una de ellas por separado, con lo que nos podremos encontrarnos en una de las dos situaciones siguientes: a) Ambos espectros no presentan solapamiento en el margen de longitudes de onda de trabajo. El problema se reduce, entonces, a sendos anlisis por separado, cada uno en la zona del espectro en donde cada componente de la mezcla se presenta como nico absorbente. b) Ambos espectros presentan solapamiento en una zona determinada de longitudes de onda. En este caso se han de seleccionar dos longitudes de onda diferentes, 1 y 2, y obtener, con disoluciones de las sustancias puras, las respectivas 1 2 1 2 absortividades molares a cada longitud de onda: 1 , 1 , 2 , 2 . Con estos datos se pueden determinar las concentraciones de los dos componentes de la mezcla a partir de las medidas de la absorbancia de la misma a las longitudes de onda de trabajo seleccionadas, A y A . El clculo se realiza resolviendo el siguiente sistema de 2 ecuaciones con 2 incgnitas:
1 2

A A

1 2

= =

1
2

l c l c

1 1

+ +

2 2

l c l c

2 2

CARACTERSTICAS DE UN ESPECTROFOTMETRO UV-VISIBLE

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Lmpara

Lente Rendija de entrada Fototubo

Rendija de salida

Objetivo
(m

ul

ti )

(mono

Prisma

Filtro Cubeta

La medida de la absorbancia se lleva a cabo con la ayuda de un espectrofotmetro, que en esencia consta de un monocromador (prisma o red de difraccin) que controla la longitud de onda de la radiacin que se hace incidir sobre la muestra. La radiacin no absorbida se detecta y mide convenientemente. La absorbancia de la muestra se compara con la de una referencia que consta estrictamente de disolvente. Las instrucciones generales de manejo de un espectrofotmetro seran: 1.- Encendido de lmparas : 1.1. Lmpara de tungsteno (zona del Visible, 900 a 340 nm), encendido instantneo. 1.2. Lmpara de Deuterio (zona del UV, 340 a 200 nm aprox.), necesita un calentamiento previo. 2.- Adaptacin del espejo a la lmpara adecuada, atendiendo al rango de longitud de onda de trabajo (slo en los espectrofotmetros no automticos). 3.- Seleccionar el valor de longitud de onda con el mando correspondiente. 4.- Ajuste del cero de transmitancias (tapa levantada) con ayuda del mando Ajuste del cero, hasta que aparezca CERO en la pantalla. 5.- Ajuste del 100% de transmitancia (0 de absorbancia) con la referencia, que normalmente es el disolvente de la muestra, utilizando para ello el mando A-T. 6.- Leer el valor de Absorbancia/Transmitancia de la muestra. Las cubetas empleadas en el espectrofotmetro (1.00 cm de espesor) deben estar escrupulosamente limpias y deben cogerse siempre por sus caras esmeriladas u opacas. No es conveniente secarlas o limpiarlas con papel ordinario por el carcter abrasivo de ste sino con un papel suave.

APLICACIONES DE LA TCNICA
Una de las aplicaciones prcticas de mayor inters de la espectrofotometra de absorcin UV-Visible es la del anlisis cuantitativo, basada en la aplicacin de la ecuacin de Lambert-Beer

OBJETIVO DE LA PRCTICA

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Se trata de analizar la composicin de una disolucin que contiene una mezcla del indicador Azul de Bromotimol en su forma molecular HA (cida) y disociada A (bsica), las cuales presentan absorcin en la regin VISIBLE del espectro. Las propiedades espectrofotomtricas del Azul de Bromotimol en ambas formas son diferentes, lo que permite su cuantificacin en disoluciones en las que aparecen mezcladas. Para ello habr que registrar los espectros de absorcin de las dos formas (cida y bsica) y obtener las correspondientes rectas de calibrado a dos longitudes de onda seleccionadas.

MATERIALES Y REACTIVOS

Espectrofotmetro UV-Visible y 6 cubetas de plstico. Matraces aforados de 10 mL Vasos de precipitados de 100 mL Pipetas graduadas de 10 mL y de 5 mL. 4 Frascos de almacenamiento. Disolucin de Azul de Bromotimol en medio cido (HA) de concentracin 5.10-5 M Disolucin de Azul de Bromotimol en medio bsico (A-) de concentracin 5.10-5 M Disolucin diluyente cida: HCl 10-2M. Disolucin diluyente bsica: NaOH 10-2 M.

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
a) Preparacin de disoluciones de la forma cida del Azul de Bromotimol:
Tomando como base una disolucin de partida, facilitada por el profesor, de Azul de Bromotimol 5.00.10-5 M en medio cido (HCl), preprense por dilucin las siguientes disoluciones: Disolucin A: En un matraz de 10 mL pipetear 8 mL de disolucin de partida enrasar con diluyente cido (HCl). { Disolucin B: En un matraz de 10 mL pipetear 6 mL de disolucin de partida enrasar con diluyente cido. { Disolucin C: En un matraz de 10 mL pipetear 4 mL de disolucin de partida enrasar con diluyente cido. { Disolucin D: En un matraz de 10 mL pipetear 2 mL de disolucin de partida enrasar con diluyente cido.
{

y y y y

Nota: El pKa del azul de bromotimol es 7.30, al encontrarse en medio cido no hay duda de que el indicador se encuentra totalmente bajo su forma cida:

HA A + H +

(pKa=7.30)

b) Preparacin de disoluciones de la forma bsica del Azul de Bromotimol:

Tomando ahora como base una disolucin de partida, facilitada por el profesor, de Azul de Bromotimol 5.00.10-5 M en medio bsico (NaOH 10-2M), preprense por dilucin las mismas disoluciones que en el apartado anterior pero ahora enrasando con diluyente bsico (NaOH).

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Nota: Como el pKa del indicador es 7.30 no hay duda de que ste se encuentra totalmente bajo su forma bsica en NaOH 10-2 M .

c) Obtencin de los espectros de la forma cida y bsica del indicador:

Para ello vamos a utilizar las disoluciones A respectivas preparadas anteriormente. En cada caso, llenaremos una cubeta con la referencia adecuada y otra con la muestra a medir. A continuacin, iremos midiendo el valor de la absorbancia de la muestra a distintas longitudes de onda entre 400 y 680 nm, haciendo las medidas a intervalos de 10 nm. Es importante tener en cuenta que, cada vez que se modifique el valor de la longitud de onda, hay que ajustar de nuevo el cero de absorbancia con la referencia. Finalmente, se representan los datos en papel milimetrado, de manera que figure la absorbancia A en ordenadas frente a longitud de onda en abcisas:

A
1.000

Forma bsica

Forma cida

0.000 400 500 600 700

Longitud de onda / nm d) Obtencin de las rectas de calibrado para las formas cida y bsica del Azul de Bromotimol:
A la vista de los espectros de absorcin de la forma cida y bsica del indicador, se apreciar un mximo para la forma bsica en torno a 620 nm y un mximo para la forma cida alrededor de 440 nm. Elegidos estos valores de longitud de onda como los mas idneos, se mide la absorbancia de cada una de las disoluciones preparadas en el apartado a) (disoluciones de la A a la D), ajustando previamente el cero de absorbancia a cada longitud de onda con la referencia adecuada. Con los datos de Absorbancia se elaboran las dos tablas correspondientes, una para la forma cida y otra para la forma bsica, que sern del tipo:

Disolucin C / mol L-1 Absorbancia a 440 Absorbancia a 620

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A continuacin se representan en papel milimetrado los datos de las dos tablas anteriores (absorbancia frente a concentracin) y se obtienen las 4 rectas de calibrado que confirman el cumplimiento de la ley de Lambert-Beer:
0.8

A
0.6 0.4

0.2 0.0

c /10 M
Las rectas que se obtienen son del tipo y = ax, de forma que al compararlas con la ley de Lambert-Beer se deduce que:

-5

pendiente =

y x

y2 y 1 x2 x 1

= l

de donde:

pendiente l

Como la longitud de la cubeta es de 1.00 cm se obtiene el valor de en M-1cm -1. Por tanto habremos determinado las cuatro absortividades molares que estabamos buscando:

440 HA

, 620 , 440 , 620 HA A A

e) Anlisis de una muestra desconocida de azul de bromotimol

A partir de una muestra facilitada por el profesor se trata de determinar las concentraciones de HA y A- que hay en la muestra. Para ello se medir la absorbancia de la muestra a 440 y 620 nm y a partir de las ecuaciones correspondientes se obtendrn las concentraciones de HA y A- .

f) Comprobacin del pKa del azul de bromotimol

Con los datos obtenidos en el apartado anterior y recordando la ecuacin de Henderson-Hasselbalch se puede calcular el valor del pKa del indicador:

pH = pKa + log [HA] pKa = pH log [HA]

por tanto sabiendo las concentraciones de HA y A- y midiendo el pH de la muestra se puede calcular el pKa.

[A ]

[A ]

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Si la suposicin de que la absorbancia era aditiva es correcta, el pKa as obtenido ha de cerrar con el pKa determinado potenciomtricamente para este indicador. Sabiendo que el valor tabulado es de 7.30, podra discutir la validez de nuestras suposiciones y calcular los errores relativos cometidos por el experimentador.

Bibliografa
CONNOR, K.A., "Curso de anlisis farmacutico", Ed. Revert. 1980. MIONES, J., "Manual de tcnicas instrumentales", Crculo editor Universo. 1978.