Jurnal 1 Gaster
Jurnal 1 Gaster
Abstract
This study aimed to determine the potential of vacuum desiccator as an anaerobic incubator.
Desiccator vacuum is being pumped so that the atmosphere inside is empty. Tested Isolate used are
Pseudomonas aeruginosa as aerobic bacteria, Escherichia coli as facultative anaerobic bacteria and
Desulvofibrio as obligate anaerobic bacteria. Tested isolates were incubated in a vacuum desiccator.
As a comparison is Hungate technique that is replacing the oxygen gas inside the tube head space
with nitrogen gas and positive control. Positive control is a culture grown in test tubes containing
thioglikolat media without gas replacement (replacing gas) and incubated with putting it on the
laboratory bench. The results showed that all isolates tested could grow in a vacuum desiccator,
Hungate technique and control. It is anticipated by the factors used thioglikolat media has influence
on the degradation conditions of aerobic - anaerobic. Also because of time pumping gas out of the
desiccator is not maximized so that there is still oxygen in the head space test tube.
METODOLOGI
Waktu dan Tempat Penelitian
Penelitian dilakukan pada bulan Mei
sampai Oktober 2010 di Laboratorium
Mikrobiologi dan Bioteknologi Biologi ITS.
Pewarnaan Gram
Cara kerja pewarnaan Gram
P. aeruginosa sama pada pewarnaan Gram
Desulfovibrio dan E. coli. Hasil positif bakteri (a) (b)
P. aeruginosa berwarna merah muda
(merupakan gram negatif) dan berbentuk Gambar 4.1 (a) Inkubasi di desikator vakum
batang. Hal ini dikarenakan lapisan dan (b) Inkubasi di suhu ruang pada teknik
peptidoglikan yang lebih tipis pada bakteri Hungate
tersebut dan tidak dapat mengikat pewarna
pertama dan hanya dapat mempertahankan Pada penelitian ini digunakan kontrol
pewarna kedua, berupa safranin yang berwarna positif untuk mengetahui pertumbuhan isolat
merah (Lay, 1994). uji tanpa adanya perlakuan inkubasi di
desikator vakum dan teknik Hungate. Kultur
Uji Triple Sugar Iron Agar (TSIA) pada kontrol positif ditanam di tabung reaksi
Cara kerja uji TSIA pada P. aeruginosa yang berisi media thioglikolat tanpa pergantian
sama pada uji TSIA E. coli. Hasil positif gas (replacing gas) dan diinkubasi dengan
P. aeruginosa merupakan bakteri yang hanya meletakannya di meja laboratorium.
memfermentasi glukosa ditandai dengan Berdasarkan Gambar 4.2 dan Lampiran 2
adanya perubahan warna menjadi kuning pada diketahui bahwa pada kontrol positif ini semua
bagian bawah agar (Harley and Prescott, isolat uji P. aeruginosa (bakteri aerob obligat),
2002). E. coli (bakteri anaerob fakultatif) dan
Desulvofibrio (bakteri anaerob obligat) dapat
Rancangan Penelitian tumbuh.
Penelitian dilakukan dengan sembilan
kali pengulangan. Data penelitian dianalisa
dengan menggunakan metode deskriptif.
Deskripsi keberhasilan teknik vakum dan
telah habis digunakan untuk respirasi E. coli.
Zona Warna merah muda pada kultur P. aeruginosa
aerob terlihat samar karena tertutup oleh biomasa sel
yang tumbuh pada permukaan media (Gambar
4.2).
Demikian pula dengan teknik Hungate,
isolat uji P. aeruginosa (bakteri aerob obligat),
E. coli (bakteri anaerob fakultatif) dan
Desulvofibrio (bakteri anaerob obligat) juga
(a) (b) (c) dapat tumbuh seperti terlihat pada Gambar 4.3
dan Lampiran 2. Harapan awalnya adalah
Gambar 4.2 Isolat uji yang tumbuh pada dengan aplikasi teknik Hungate maka yang
kontrol positif setelah inkubasi selama 72 jam. dapat tumbuh hanyalah isolat Desulfovbrio
(a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan saja sebagai indikator ketidakberadaan oksigen
(c) Desulvofibrio. di head space tabung reaksi. Tetapi hasil
penelitian ini menunjukkan hal yang
Adanya pertumbuhan isolat uji pada sebaliknya, semua isolat uji dapat tumbuh.
kontrol positif ini mungkin disebabkan oleh Dugaan penyebab tumbuhnya isolat uji pada
faktor pendukung berupa media thioglikolat. teknik Hungate adalah sama dengan kontrol
Media thioglikolat adalah media yang positif, yaitu diduga karena kandungan media
mengandung sodium thioglikolat, 0,075% thioglikolat. Namun antara kontrol positif dan
agar, resazurin dan nutrisi lainnya (Lampiran teknik Hungate terdapat perbedaan
1). Sodium thioglikolat berfungsi sebagai penampakan warna merah muda pada
donor elektron yang akan mereduksi oksigen permukaan media thioglikolat. Pada teknik
di dalam media. Hungate tidak ada warna merah muda yang
Kandungan agar 0,075% pada media menandakan oksigen telah habis tergantikan
thiogliolat menghambat difusi oksigen dari oleh nitrogen.
permukaan media ke dasar media, sehingga
ada stratifikasi konsentrasi oksigen dalam
media. Konsentrasi oksigen pada permukaan
media relatif lebih tinggi dari pada bagian
tengah dan bawah, sehingga bagian permukaan
media relatif bersifat aerob dan bagian dasar
media bersifat anaerob (Marschall et al; 1992).
Adanya stratifikasi konsentrasi oksigen pada
media mengakibatkan perbedaan lokasi
pertumbuhan isolat uji (Gambar 4. 2). P.
aeruginosa yang bersifat aerob obligat tumbuh
(a) (b) (c)
hanya di permukaan media, E. coli yang
bersifat anaerob fakultatif tumbuh pada Gambar 4.3 Isolat uji yang tumbuh pada
seluruh bagian media dan Desulfovibrio yang teknik Hungate setelah inkubasi selama 72
bersifat anaerob obligat tumbuh di bagian jam. (a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan
bawah media. (c) Desulvofibrio.
Pada permukaan media kontrol positif
terlihat perubahan warna resazurin menjadi Meskipun isolat P. aeruginosa masih
merah muda. Resazurin pada media dapat tumbuh setelah aplikasi teknik Hungate,
thioglikolat merupakan indikator redoks yang tetapi biomassa selnya lebih sedikit jika
akan berubah warna menjadi merah muda jika dibandingkan dengan kontrol positif.
terdapat oksigen (Turoski, 2001). Warna P. aeruginosa adalah bakteri obligat aerob
merah muda setinggi ± 1cm terlihat jelas pada yang mutlak membutuhkan gas oksigen untuk
permukaan media dari isolat uji Desulfovibrio respirasinya. Walaupun tidak dilakukan
yang menunjukkan adanya oksigen pada perhitungan gas oksigen di headspace tabung
permukaan tersebut (Gambar 4.2). Sedangkan reaksi, namun diduga penukaran gas oksigen
pada kultur E. coli tidak nampak adanya dengan gas nitrogen belum dapat
warna merah muda, karena oksigen diduga menghilangkan semua gas oksigen dalam
headspace tabung reaksi setelah aplikasi
teknik Hungate. Menurut Ortega (2007)
dengan konsentrasi 0,4% saja P. aeruginosa
masih bisa tumbuh dengan waktu pembelahan
biner sel (doubling time) 138 ± 20 menit.
Lamanya waktu paruh ini bisa dilihat dari
tipisnya biomassa sel pada teknik Hungate jika
dibandingkan dengan kontrol positif (Gambar
4.2). Selain itu ternyata menurut Ramsdell
(1935), kadar oksigen kurang dari 0,3 ml (a) (b) (c)
dalam media tidak mengakibatkan perubahan
warna pada resazurin. Rendahnya kadar Gambar 4.4 Isolat uji yang tumbuh pada
oksigen dalam teknik Hungate ini mungkin desikator vakum setelah inkubasi selama 72
sebagai penyebab tidak terdeteksinya jam. (a) P. aeruginosa, (b) E. coli dan (c)
keberadaan oksigen oleh resazurin. Desulvofibrio
Proses vakum yang dilakukan pada
desikator diharapkan dapat mengeluarkan Melihat indikasi ini, mungkin potensi
semua gas yang berada di dalam head space desikator vakum sebagai inkubator kultur
desikator dan head space tabung reaksi. Gas bakteri anaerob dapat dikaji ulang dengan
yang ada di head space tabung reaksi meningkatkan waktu vakum sampai dengan
diasumsikan dapat ikut tertarik keluar ketika batas maksimalnya. Batas waktu maksimal
proses vakum dilakukan, karena tabung reaksi tersebut dapat dilihat berdasarkan volume
hanya ditutup dengan kapas dan kasa. desikator dan kecepatan proses vakum pompa
Sehingga, berdasarkan parameter keberadaaan (air displacement) seperti persamaan (1)
oksigen (Tabel 3.1) bakteri fakultatif anaerob berikut.
dan obligat aerob diharapkan akan mati.
Namun hasil yang diperoleh adalah isolat uji Volume desikator (1)
P. aeruginosa (bakteri aerob obligat), E. coli Air Displacement
(bakteri anaerob fakultatif) dan Desulvofibrio
(bakteri anaerob obligat) dapat tumbuh seperti
yang ditunjukkan oleh Gambar 4.4 dan Bila kecepatan pompa vakum (Haiou®, Cina)
Lampiran 2. Hal ini diduga selain karena adalah 0,9 m2/h atau 0,25 L/dt dan volume
faktor media thioglikolat, juga karena faktor desikator adalah 18,5 L, maka waktu maksimal
oksigen yang masih ada di head space tabung proses vakum adalah 74 detik seperti
reaksi. Terlihat dari Gambar 4.4 ada warna perhitungan (2) dibawah ini
merah muda pada permukaan media yang 18,5 L
diinokulasi dengan Desulfovibrio sebagai Volume desikator (2)
= 0,25 L/dt
indikasi keberadaan oksigen.
Air Displacement
Berdasarkan hasil tersebut dapat
disimpulkan bahwa pemompaan gas keluar Secara kualitatif, biomassa isolat uji
dari desikator yang dilakukan selama 1 menit yang tumbuh dari dua metode anaerob tersebut
(60 detik) belum dapat mengeluarkan gas yang (desikator vakum dan teknik Hungate) tidak
berada di head space tabung reaksi. Adanya berbeda nyata, tetapi secara kuantitatif diduga
oksigen di head space tabung reaksi dapat memiliki perbedaan biomassa sel. Sebagai
mendukung pertmbuhan bakteri P. aeruginosa contoh pada isolat uji Desulfovibrio.
(bakteri aerob obligat) dan E. coli (bakteri Pertumbuhan isolat uji pada kontrol positif
anaerob fakultatif) walaupun inkubasi (Gambar 4.2), teknik Hungate (Gambar 4.3)
dilakukan di dalam desikator yang divakum. dan desikator vakum (Gambar 4.4)
menunjukan kesamaan ketinggian biomassa
sel bila dilihat dari dasar media. Tetapi apabila
diuji secara kuantitatif, mungkin jumlahnya
tidak sama. Uji kuantitatif yang bisa dilakukan
adalah secara turbidimetrik yaitu perhitungan
massa sel berdasarkan kekeruhan (Waluyo,
2008).
Untuk konfirmasi bahwa isolat yang
tumbuh bukan kontaminan, maka dilakukan uji
konfirmasi dengan pengamatan mikroskopik
dan uji fermentasi dengan media Triple Sugar
Iron Agar (TSIA). Uji TSIA dilakukan karena
dapat membedakan fermentasi dari E. coli dan
P. aeruginosa serta dapat membuktikan
adanya gas H2S pada bakteri yang mereduksi
sulfur. Menurut Holt et al., (1994) E. coli
(a) (b) (c)
bersifat anaerob fakultatif dan dapat
menfermentasi laktosa dan glukosa, sedangkan Gambar 4.6 Uji TSIA pada P. aeruginosa. (a)
P. aeruginosa bersifat obligat aerob dan hanya teknik desikator, (b) teknik Hungate dan (c)
dapat menfermentasi glukosa saja. kontol positif.
Hasil uji TSIA menunjukan karakter
isolat uji E. coli seperti yang diharapkan, yaitu Sedangkan uji TSIA Desulfovibrio tidak
melakukan fermentasi laktosa dan glukosa menghasilkan karakter yang diharapkan, yaitu
sehingga terjadi penurunan pH menjadi asam terbentuk endapan hitam (FeS) yang
dan menghasilkan gas. Indikasi penurunan pH merupakan reaksi dari H2S dengan ferous
ditunjukkan dengan perubahan warna merah sulfat pada media TSIA, meskipun media telah
menjadi kuning pada seluruh bagian media dan ditambahkan MgSO4. 7H2O sebagai elektron
indikasi ada gas ditunjukkan oleh terangkatnya akseptor dan sodium laktat sebagai elektron
bagian bawah media biakan (Gambar 4.5). donor. Desulfovibrio adalah bakteri pereduksi
sulfat yang menggunakan SO4 sebagai elektron
akseptor sehingga terbentuk H2S (Madigan et
al, 1997; Matias et al, 2005). Widdle and Bak
(1991) menyatakan bahwa substrat yang toksik
bagi Desulfovibrio adalah yang mengandung
indol atau phenol yang dapat menghambat
pertumbuhan Desulfovibrio dan
mengakibatkan tidak terbentuknya H2S pada
media. Sedangkan media TSIA mengandung
phenol red sebanyak 0,024 gr per liter (Harley
and Prescott, 2002). Selain itu Desulfovibrio
(a) (b) (c) adalah bakteri yang bersifat obligat anaerob;
Gambar 4.5 Uji TSIA pada E. coli pada (a) media TSIA yang digunakan walaupun telah
kontol positif, (b) teknik Hungate dan (c) ditambahkan MgSO4. 7H2O sebagai elektron
teknik desikator. akseptor dan sodium laktat sebagai elektron
donor tetapi tidak dikondisikan secara anaerob.
Uji TSIA juga menunjukkan bahwa
isolat uji P. aeruginosa adalah isolat yang KESIMPULAN
diharapkan. Media TSIA mengandung 1% Dari hasil penelitian diketahui bahwa
laktosa, 1% sukrosa dan 0.1% glukosa. P. desikator berpotensi sebagai inkubator kultur
aeruginosa hanya mampu memfermentasikan anaerob ditandai dengan tumbuhnya isolat
sebagian saja dari gula tersebut yaitu glukosa. Desulfovibrio (anaerob obligat). Namun
Fermentasi parsial yang dilakukan P. terdapat kelemahan dalam pemanfaatan
aeruginosa dapat dilihat dari perubahan warna desikator vakum ditandai dengan hidupnya
media TSIA yang juga parsial, ada bagian isolat P. aeruginosa (aerob obligat) dan E. coli
yang berubah warna menjadi kuning dan ada (fakultatif anaerob) yang diduga masih
yang masih berwarna merah. Warna merah terdapat oksigen di head space tabung reaksi.
menunjukkan bahwa gula tidak
difermentasikan dan tidak terjadi perubahan SARAN
pH (tetap basa) (Gambar 4.6) (Harley and Untuk mengetahui potensi desikator
Prescott, 2002). vakum sebagai alternatir anaerob jar perlu
diperhatikan kemungkinan kebaradaan oksigen Lay, W.B. (1994). Analisis Mikroba di
dalam head space tabung reaksi. Laboratorium. PT Raja Grafindo.
Madigan, M.T dan J.M. Martinko. 1997.
DAFTAR PUSTAKA Brock; Biology of Microorganisms.
Chung, King-Thom dan M. P. Bryant. 1997. 8th edition. Pearson Prentice Hall,
Robert E. Hungate: Pioneer of USA.
Anaerobic Microbial Ecology. Mans, J. 2006. Vacuum Physics and
Department of Microbiology and Technology. 6th edition. Spring. E-
Molecular Cell Sciences, The book.
University of Memphis, Memphis, TN Marschall, Christoph., P. Frenzel., dan H.
38152 Department of Animal Science, Cypionka. Influence of oxygen on
University of Illinois, Urbana, IL sulfate reduction and growth of
61801, U.S.A. Anaerobe (3): 213– sulfate-reducing bacteria. 1992. Arch
217. Microbiol Vol: 159:168-173.
Dwidjoseputro. D. 1978. Dasar-dasar Margaret. 2009. Artikel: The Recognition of
Mikrobiologi. Penerbit Djambatan: Anaerobic Growth and the
Surabaya. Development of the Anaerobic Jar.
Fitriana, M. 2009. Skripsi: Formulasi dan Uji www.cmpt.ca/pdf_archived.../anaerob
Aktivitas Antijamur Secara In Vitro es_jar_mswift_03_7_4.pdf.
Salep Minyak Atsiri Rimpang Temu Didownload pada 29 November 2009
Giring (Curcuma heyneana val.) pukul 08.00 WIB.
dengan Basis Vaselin. Fakultas Nelson, D. L. dan Michael M. C. 2004.
Farmasi Universitas Muhammadiyah: Lehninger: Principles Of
Surakarta. Biochemistry. 4th edition. Worth
Gilespie, S. H. 1994. Medical Microbiology Publishers. Inc, New York.
Ilustrated. Butterwort Heinemann: Ortega. C. A dan C. S. Harwood. 2007.
London. Responses of Pseudomonas
Hansen, S. P. 1999. High Vacuum with aeruginosa to low oxygen indicate that
Mechanical Pumps. Bell Jar. Vol. 8, growth in the cystic fibrosis lung is by
No. 2. aerobic respiration. Molecular
Harley and Prescott. 2002. Laboratory Microbiology Vol 65(1): 153–165.
Exercise In Microbiology. 5th Oxtoby, D.W. 2002. Prinsip- Prinsip Kimia
Edition. Mc Graw Hill. Modern. Edisi keempat. Erlangga:
Holt, J.G. (1994). Bergey’s Manual of Jakarta.
Determinative Bacteriology . Ninth Pak, K Ran, H Lee, H lee1, Y kim,Y oh, and S
Edition. Williams and Wilkins: USA. Choi. 2003. Involvement of Organic
Horn, K. V., Katherine. W., dan E. J. Acid During Corrosion of Iron
Baccaglini. 1997. Evaluation of the Coupon by Desulfovibrio
AnaeroPack System for Growth of desulfuricans. Journal Microbiol.
Anaerobic Bacteria. Department of Biotechnol. Vol 13(6): 937–941
Clinical Pathology, Westchester Ramsdell.G. A., W. M. T Johnson., JR., and f.
County Medical Center,1 and R. Evans. 1935. Investigation of
Department of Pathology, New York Resazurin as an Indicator of The
Medical College,2 Valhalla, New Sanitary Condition of Milk. Journal
York 10595. Journal Of Clinical Dairy Science. Vol 18: 705-717.
Microbiology. Vol. 35, No. 8: 2170– Reed G. B. dan J. H. ORR. 1945. Cultivation
2173, of Anaerobes and Oxidation-
Imhof, A. dan I. Heinzer. 1996. Continuous Reduction Potentials. Queen
Monitoring of Oxygen Concentrations University, Kington, Kanada. J. Bact:
in Several Systems for Cultivation of 309-320.
Anaerobic Bacteria. Institute of Shahin, May., W. Jamal, T. Verghese, dan
Microbiology, Kantonsspital, CH- V.O. Rotimi. 2002. Comparative
5001 Aarau, Switzerland. Journal of Evaluation of Anoxomat and
clinical microbiology. Vol. 34, No. 7: Conventional Anaerobic GasPak Jar
1646–1648. Systems for the Isolation of Anaerobic
Bacteria. Departments of Place, Edinburgh. J. clin. Path. Vol
Microbiology, Faculty of Medicine, 29: 534-536.
Kuwait University and Mubarak Al- Widdle and Bak edited by Burt, R. dan K. D.
Kabeer Teaching Hospital, Kuwait. Phillips. 1991. Gram Negative
Med Princ Pract. Vol 12: 81–86. Mesophilic Sulfat Reducing Bacteria
Smith. 1952. Desiccator Data. Noyes in Technical methods: A new
Chemical Laboratories. University of anaerobic jar. Public Health
Illinois. Analytica Chimica Acta. Vol Laboratory, Luton and Dunstabk
6. Hospital, Lewsey Road, Luton LU4
Turoski V., S. D. Richardson., J. Plude. 2001. ODZ, UK. J. Clin. Pathol. Vol
Paper: A New Method For Monitoring 30:1082-1084.
Toxicity Using Stock Culture Or www.textbookofbacteriology.net/themicrobial
Indigenouss Biomss. Division of world/Structure.html. Diakses pada
Enviromental Chemistry. American tanggal 7 April 2010 pada Pukul 21.58
Chemistry Society. Vol 41 No 1. WIB.
Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode Dasar www.eid.ac.cn/MirrorResources/7279/ecoli.ht
dalam Mikrobiologi. UMM press: m.1.1.html. Diakses pada tanggal 7
Malang. April 2010 pada Pukul 21.30 WIB.
Watt, B, j. G. Collee. dan R. Brown. 1976. http://www.jlindquist.net/generalmicro/dfnewt
Tests of Performance of Anaerobic hiopage.html. Diakses pada tanggal 23
Jars. Microbiological Laboratories, januari 2011 pada Pukul 18.00 WIB.
Western General Hospital, Crewe http://en.academic.ru/dic.nsf/enwiki/76356.
Road, Edinburgh EH4 2XU and Diakses pada tanggal 7 April 2010
Department of Bacteriology, pada Pukul 22.00 WIB.
University Medical School, Teviot