Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas

1
Maret

PETUNJUK PRAKTIKUM
FITOKIMIA

Disusun Oleh :
Dr. Apt. Dinar Sari C. Wahyuni, M.Si.
Dr. Apt. Nestri Handayani, M.Si.

PROGRAM STUDI S1 FARMASI

FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS SEBELAS MARET
SURAKARTA
2022

1
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
2
Maret

HAL HAL YANG HARUS DIPATUHI

OLEH PESERTA PRAKTIKUM FITOKIMIA

1. Peserta praktikum dianjurkan untuk mempersiapkan segala sesuatu untuk

keperluan praktikum.
2. Peminjaman dan pemasangan alat praktikum dilakukan setelah menjalani
pretes pada dosen/asisten yang ada
3. Setelah selesai praktikum,semua peralatan praktikum harus dikembalikan
dalamkeadaan bersih dan kering kepada petugas laboratorium
4. Praktikan dianggap gugur seluruh praktikum yang ada, jika tidak mengikuti
2 mata acara praktikum (< 75%), tanpa alasan yang syah.
5. Alat praktikum yang rusak/hilang/pecah selama masih dalam pinjaman
wajib diusahakan gantinya sesuai dengan spesifikasinya alat tersebut
secepat mungkin. Semua peralatan yang tidak dipinjam pergolongan
praktikum dan disediakan laboratorium untuk pemakaian bersama menjadi
tanggung jawab seluruh anggota golongan yang praktikum pada hari yang
bersangkutan
6. Praktikan harus membawa : kertas label, kain lap dan tissue.
7. Setelah selesai praktikum, praktikan membuat laporan sementara yang
diparaf oleh pengampu untuk dilampirkan pada laporan resmi.
8. Laporan praktikum resmi dibuat perorangan dengan format tulis tangan dan
dikumpulkan pada saat praktikum selanjutnya.
9. Hal-hal yang belum tercantum dalam ketentuan ini akan diatur lebih lanjut
oleh Kepala Laboratorium
Pengampu praktikum,

Dr. Apt., Dinar Sari C. Wahyuni, M.Si.

2
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
3
Maret

DAFTAR ISI
Percobaan I. Isolasi Piperin Dari Fructus Piperis Nigri Atau Piperis Albi Dengan
Metode Sokletasi
Percobaan II. Isolasi Minyak Atsiri Dari Cengkeh Dengan Metode Destilasi
Percobaan III. Isolasi Alkaloid Total Dengan Metode Ekstraksi Asam Basa
Percobaan IV. Isolasi senyawa aktif menggunakan metode perkolasi
Percobaan V. Kuantifikasi curcuminoid menggunakan metode KLT-densitometri
Percobaan VI. Fraksinasi senyawa Filantin Dari Phyllanti Herba Dengan
Kromatografi Kolom

3
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
4
Maret

PERCOBAAN I
ISOLASI PIPERIN DARI FRUCTUS PIPERIS NIGRI ATAU
PIPERIS ALBI
A. Pendahuluan
Piperin merupakan senyawa amida basa lemah yang dapat membentuk
garam dengan asam mineral kuat. Piperin bila dihidrolisis dengan KOH-
etanolik akan menghasilkan kaliumpiperinat dan piperin. Oleh sebab itu,pada
proses isolasi pemberian KOH-etanolik tidak boleh berlebihan dan hrus dalam
keadaan tidak panas. Tumbuhan yang termasuk jenis piper selain mengandung
5-9% piperin juga mengandung : minyak atsiri berwarna kuning, berbau
aromatis senyawa berasa pedas (kavisin) amilum resin protein. Senyawa amida
piperin berupa kristal berbentuk jarum berwarna kuning, tak berbau, tak berasa
lama-kelamaan pedas, larut dalam etanol, asam cuka, benzen dan kloroform.
Pada akhir praktikum diharapkan mahasiswa dapat memahami prinsip
dan melakukan isolasi piperin dari fructus Piperis nigri atau Piperis albi beserta
analisis kualitatif hasilisolasi dengan metode KLT.
B. Prinsip Kerja
Piperin disari dari buah piper dengan etanol 96%, dipisahkan dari senyawa
resin dengan penambahan KOH-etanol 10% b/v. Kristalisasi dilakukan
dengan etanol.
C. Alat dan Bahan
Bahan
1. Serbuk buah Piper nigrum atau album
2. Etanol 95 %
3. KOH-etanolik 10 %
4. Silika Gel GF 254
5. Diklormetan
6. Etil asetat
7. Anisaldehid-asam sulfat (pereaksi semprot)
8. Piperin pembanding
Alat

4
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
5
Maret

1. Perangkat penyari Soxhlet (volume 100 ml)

2. Kompor dengan penangas air atau heating mantle
3. Batang pengaduk
4. Cawan porselin
5. Corong
6. Perangkat KLT

D. Cara Kerja
1. Timbang 30,0 g serbuk merica, masukkan ke dalam alat penyari Soxhlet
yang telah dipsang kertas saring, kemudian tambahkan etanol 96%
paling sedikit sebanyak dua kali sirkulasi. Jangan lupa menambahkan
batu didih.
2. Penyarian dilakukan selama 2 jam dengan kecepatan 6-8 sirkulasi per
jam
3. Setelah dingin, dipisahkan sari dari bagian yang tidak terlarut dengan
penyaringan melalui kertas saring
4. Sisihkan sari jernih yang didapat sebanyak 3 ml dalam flakon dan tutup
5. Sisanya diuapkan di atas penangas air konsistensi kental
6. Setelah dingin, tambahkan 10 ml KOH etanolik 10% sambil diaduk-
aduk sehingga timbul endapan
7. Setelah mengendap, pisahkan sari dari bagian yang tak larut melalui
kapas/kertas saring
8. Sari jernih yang didapat didiamkan dalam lemari es sampai hari
praktikum yang akan datang atausampai pembentukan kristal optimal
9. Kristal yang timbul dipisahkan, dicui dengan etanol 96% (dingin) dan
dikeringkan dalam almari pengering pada suhu 40ᵒC selama 30-45 menit
kemudian disimpan dalam eksikator.
E. TUGAS
1. Hitung rendemen hasil percobaan
2. Lakukan percobaan KLT terhadap larutan kristal dalam etanol dan sari
hasil penyarian dengan soxhlet , dengan kondisi :

5
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
6
Maret

a. Fase gerak : Diklormetan : Etil asetat (75 : 25 v/v)

b. Fase diam : Silika Gel GF254
c. Pembanding : Piperin standar
3. Amati warna bercak yang timbul pada kromatogram
a. Sinar tampak
b. Sinar UV 254 dan 366 nm
c. Setelah disemprot dengan pereaksi Dragendrorf
4. Hitung harga Rf bercak
5. Lakukan pengamatan organoleptik terhadap kristal yang didapat (bau,
warna, rasa)
6. Serahkan kristal yang diperoleh kepada petugas laboratorium
F. Soal (Tuliskan jawabannya dalam laporan)
1. Sebutkan kandungan golongan senyawa yang pada umumnya terdapat
dalam tumbuhan yang termasuk satu jenis dengan Piper nigrum!

6
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
7
Maret

PERCOBAAN II
ISOLASI MINYAK ATSIRI DARI CENGKEH

destilasi, destilasi pakenya air, klo etanol

A. Tujuan Percobaan nguap, yg di penangans pake minyak
Mahasiswa mampu membuat minyak atsiri dengan cara penyulingan dan
ekstraksi dari cengkeh.
B. Dasar Teori
Minyak atsiri yang didominasi oleh senyawa monoterpara dan fenol
sederhana lainnya dapat memberikan hasil yang memuaskan jika suhu kolom
diprogram mulai dari 40/50 C (Agusta, 2000). Distilasi cengkeh bukan suatu
masalah yang mudah. Hasil maupun sifat sifat fisika kimia cengkeh sebelum
dilakukan destilasi (utuh maupun ditumbuk), juga tipe alat/cara distilasi
distilasi stahl (distilasi air, distilasi air dan uap, maupun distilasi uap langsung). Bila
cengkeh didistilasi utuh, maka gaya hidrofusi memegang peranan penting,
dan fraksi pertama yang didistilasi khususnya eugenol (Guenther, 1990). Ada
tiga cara umum untuk mengambil komponen atsiri dari tumbuhan: distilasi,
ekstraksi memakai pelarut, dan pengaliran udara atau aerasi.
Minyak mudah menguap (atsiri) yang berasal dari bunga cengkeh
dengan destilasi mengandung, sebagai konstituen utamanya adalah eugenol
bebas (70-90 Persen), eugenol asetat, dan kariofillen. Meskipun bahan-bahan
tersebut
berjumlah sampai 99 persen dari seluruh minyak, ia bukan merupakan
bahan yang dapat memberi ciri berbau buah seperti terdapat pada minyak
cengkeh murni menurut penunjukkan Smith. Bukti sifat tersebut adalah
membandingkan suatu campuran antara minyak cengkeh murni, eugenol pakenya
kemaren
asetat dan kariofillen dalam proporsi yang tepat dengan minyak cengkeh asam galat
alami. Sebagai penampilan khusus perlu dinyatakan disini bahwa minyak
cengkeh mengandung cukup banyak eugenol asetat sedangkan minyak
gagang dan minyak daun cengkeh terdapat dalam jumlah yang sangat sedikit.
(Guenther, 1990).

7
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
8
Maret

Konstituen minyak daun cengkeh dapat dibagi menjadi dua kelompok.

Kelompok pertama merupakan senyawa fendat dan eugenol yang merupakan
komponen paling besar. Senyawa ini mudah diisolasi dengan NaOH dan
kemudian dinetralkan dengan asam mineral. Kelompok kedua mengandung
senyawa-senyawa non fenolat yaitu ß-karoifelin, a-kubeben, a-kopaen,
hulumen, - kadien, dan kadina 1,3,5-trien. Semua senyawa terebut telah dapat
diidentifikasi (Hardjono, 2004).
C. Bahan dan alat
Alat yang digunakan :·
Seperangkat alat distilasi stahl Labu didih
Gelas kimia Termometer
Gelas ukur Spatula
Pipet ukur Neraca analitik
Bola karet Kertas timbang
Bak penampung es
Bahan yang digunakan :
Cengkeh kering
Etanol 96 %
Batu es

D. Cara Kerja
1. Menimbang cengkeh sebanyak 50 gram dam memasukkanya kedalam labu alas bulat
sifon lalu menyumbatnya dengan menggunakan kapas yang telah di
padatkan.
2. Memipet larutan etanol 96 % sebnyak 150 mL ke dalam labu bundar atau
labu didih.
3. Memasang rangkaian alat ekstraksi sedemikian rupa dan memasang
kondensernya. Memasukkan siffon yang berisi cengkeh kedalam
apparatus destilasi.
4. Melakukan ekstraksi sampai 2 jam sehingga memperoleh 10 siklus.
5. Menjaga suhu ekstraksi yaitu pada 78◦C – 80◦C.

8
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
9
Maret

6. Mengamati dan mencatat saat tetesan kondensat pertama menetes.

7. Menimbang atsiri yang diperoleh.

E. Analisis Kualitatif
Deteksi keberadaan senyawa eugenol dalam residu fenolik dengan
KLT. Dengan menggunakan fase diam silika gel GF 254 dan fase gerak
berupa n-heksana – kloroform (3:2) deteksi sinar UV 254 dan UV 366 dengan
pereaksi semprot anisaldehid asam-sulfat.

9
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
10
Maret

PERCOBAAN III
ISOLASI ALKALOID TOTAL DENGAN METODE EKSTRAKSI ASAM
BASA
A. Pendahuluan
Alkaloid merupakan salah satu golongan metabolit sekunder yang substansinya
relative memiliki sifat toksis. Contoh beberapa efek farmakologis alkaloid yaitu
analgetik dan narkotik (morfin dan kodein), stimulansia sentral (kofein), anti asma
(efedrin), relaksan otot halus (atropine dan papaverine) dll. Kegunaan adanya
alkaloid antara lain sebagai racun untuk melindungi tanaman dari serangga dan
binatang, sebagai bahan penetral racun untuk diri sendiri, sebagai pengatur tumbuh
dan sebagai faktor pertumbuhan tanaman dan cadangan makanan.
Alkaloid berasal dari kata “Alkali-like” yang bersifat basa karena mengandung
nitrogen heterosiklis. Sifat fisika dari alkaloid secara umum yaitu (1) berbentuk
kristal/padatan, kadan berbentuk amorf atau cairan kental (nikotin dan coniine), (2)
umumnya tidak berwarna kecuali berberine (poliaromatik), (3) alkaloid basa larut
dalam pelarut organik (4) alkaloid garam larut dalam air. Disamping itu, sifat kimia
alkaloid yaitu basa dimana sifat kebasaan alkaloid tergantung pada substitusi pada
atom Nitrogen. Subtituen yang merupakan kelompok electron donating group
(pendonor atau pemberi elektron) akan meningkatkan kebasaan. Contoh gugus
pemberi electron adalah gugus alkil dimana urutan kebasaannya yaitu trietilamine
> dietilamine > etilamine (Gambar 1) dimana ketersediaan electron pada nitrogen
naik sehingga senyawa lebih bersifat basa. Sedangkan subtituen yang berasal dari
electron withdrawing group (penarik elektron) akan menghilangkan sifat basa
sehingga bisa menjadi netral bahkan sedikit asam. Contoh gugus penarik electron
adalah gugus karbonil yang menyebabkan ketersediaan pasangan electron pada
nitrogen berkurang sehingga sifat kebasaan berkurang.

10
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
11
Maret

Gambar 1. Struktur kimia berurutan dari kiri ke kanan yaitu trietilamina, dietilamina
dan etilamina dimana semakin ke kanan semakin kecil sifat kebasaannya

Gambar 2. Struktur berurutan dari kiri ke kanan yaitu caffein, atropine dan
berberine. Caffein merupakan basa lemah, atropine merupakan basa kuat
dan berberine merupakan basa kuartener yang larut dalam air.

B. Alat dan Bahan

Alat yang digunakan:
1. Corong pisah 500 mL
2. Statif dan klem
3. Penangas air
4. Gelas ikur 50 mL
5. Pipet tetes
Bahan yang digunakan:
1. Serbuk daun papaya
2. Pelarut petroleum eter
3. Etanol 95%
4. Etil asetat
5. Asam tartrat 2%
6. Amoniak
C. Prosedur Kerja
Isolasi senyawa alkaloid
1. Simplisia daun papaya yang telah diperkecil ukuran partikelnya di
maserasi dengan pelarut petroleum eter (PE) selama 24 jam.

11
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
12
Maret

2. Pelarut PE disaring dan dipisahkan

3. Simplisia diangin-anginkan sampai pelarut PE menguap
4. Simplisia dimaserasi menggunakan etanol 95% selama 24 jam kemudian
maserat diuapkan sampai diperoleh ekstrak kental.
5. Proses maserasi ulang dengan etanol 95% dilakukan sekali lagi.
6. Ekstrak kental yang diperoleh dari 2 kali maserasi digabungkan.
7. Ekstrak kental etanol ditambahkan 50 mL asam tartrat 2% dan dipartisi
menggunakan 50 mL etil asetat pada corong pisah.
8. Corong pisah digojok secara kuat selam 3 menit dan didiamkan sampai
terbentuk 2 lapisan terpisah
9. Kedua lapisan yaitu etil asetat (lapisan atas) dan air asam (lapisan bawah)
dipisahkan
10. Lapisan air asam ditambahkan ammonia sampai pH 8-10 dan dipartisi
lagi menggunakan etil asetat pada corong pisah
11. Corong pisah digojok secara kuat selam 3 menit dan didiamkan sampai
terbentuk 2 lapisan terpisah
12. Kedua lapisan yaitu etil asetat (lapisan atas) dan air asam (lapisan bawah)
dipisahkan
Identifikasi senyawa alkaloid
1. Ekstrak kental dilarutkan dengan etanol 95%
2. Siapkan bejana KLT dengan fase gerak heksana: etil asetat (8:2 v/v) dan
jenuhkan
3. Totolkan larutan sampel dengan mikropiper pada plat KLT ukuran 2 x 10
cm
4. Masukkan plat KLT pada bejana yang telah dijenuhkan
5. Eluasi hingga batas atas plat KLT
6. Semprot plat KLT dengan penampak bercak Dragendorff
7. Noda berwarna jingga menunjukkan sampel positif mengandung senyawa
alkaloid.

12
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
13
Maret

PERCOBAAN IV
PERKOLASI DAUN SIRIH HIJAU (Piper betle L.)
A. Dasar Teori
Istilah perkolasi berasal dari bahasa latin per yang artinya melalui dan colare
yang artinya merembes. Jadi, perkolasi adalah penyarian dengan mengalirkan
cairan penyari melalui serbuk simplisia yang telah dibasahi. Alat yang digunakan
untuk mengekstraksi disebut perkolator, dengan ekstrak yang telah dikumpulkan
disebut perkolat (Ansel, 1989)
Penyarian dapat dilakukan dengan metode perkolasi yaitu cara penyarian
yang dilakukan dengan mengalirkan cairan penyari melalui serbuk simplisia yang
telah dibasahi. Metode perkolasi memberikan beberapa keuntungan dibandingkan
metode maserasi, antara lain adanya aliran cairan penyari menyebabkan adanya
pergantian larutan dan ruang di antara butir-butir serbuk simplisia membentuk
saluran kapiler tempat mengalir cairan penyari. Kedua hal ini meningkatkan derajat
perbedaan konsentrasi yang memungkinkan proses penyarian lebih sempurna.
Serbuk simplisia yang akan diperkolasi tidak langsung dimasukkan ke dalam bejana
perkolator, tetapi dibasahi dan dimaserasi terlebih dahulu dengan cairan penyari.
Hal ini dimaksudkan untuk memberikan kesempatan sebesar-besarnya kepada
cairan penyari memasuki seluruh pori-pori dalam simplisia sehingga
mempermudah penyarian selanjutnya. Untuk menentukan akhir perkolasi, dapat
dilakukan pemeriksaan zat aktif secara kualitatif pada perkolat terakhir. Untuk obat
yang belum diketahui zat aktifnya, dapat dilakukan penentuan dengan cara
organoleptis seperti rasa, bau, warna dan bentuknya (Depkes RI, 2008).
Daun sirih hjau (Piper betle L.) secara tradisional dimanfaatkan sebagai obat
untuk mengatasi sariawan, sakit tenggorokan, obat batuk, obat cuci mata, obat
keputihan, menghentikan pendarahan pada hidung (mimisan), mempercepat
penyembuhan luka, dan menghilangkan bau mulut. Berdasarkan khasiatnya,
industri obat herbal maupun kosmetik berlomba -lomba menghasilkan produk dari
ekstrak daun sirih hijau, baik sebagai zat aktif maupun zat penunjang (Depkes RI,
1995)
B. Tujuan : Melakukan ekstraksi daun Sirih dengan metode perkolasi.

13
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
14
Maret

C. Alat yang digunakan:

1. Perkolator
2. rotary evaporator
3. spektrofotometer UV –Vis
4. cuvet
5. neraca analitik
6. alat –alat gelas lainnya
D. Bahan yang digunakan
1. Serbuk simplisia daun sirih hijau (Piper betle L.)
2. Aquadest
3. etanol 70%
4. kuersetin
5. etanol p.a
6. serbuk Mg
7. AlCl310%
8. HCl pekat.
E. Cara Kerja
Perkolasi bahan uji
1. Simplisia diserbuk menggunakan blender.
2. Menimbang serbuk sesuai kebutuhan.
3. Memasukkan bahan ke dalam wadah kemudian dibasahi dengan cairan
penyari diaduk sampai rata, ditutup dan didiamkan di tempat yang
terlindung cahaya.
4. Menyiapkan 1 set alat perkolasi.
5. Memasukkan bahan yang telah dibasahi ke dalam bejana perkolasi sedikit
demi sedikit sambil sesekali di tekan
6. kemudian memasukkan kertas saring di atas permukaan serbuk.
7. Meneteskan cairan penyari dari corong pisah ke dalam serbuk dengan
kecepatan 1 ml / menit sampai didapat penyari setinggi 1 cm diatas
permukaan serbuk, lalu didiamkan beberapa jam.

14
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
15
Maret

8. Meneteskan penyari dan filtrat dengan kecepatan yang sama (1 ml per

menit) sampai filtrat berwarna jernih.
9. Menampung ekstrak cair dalam wadah yang sesuai/erlenmeyer dan
memberi label.
10. Menguapkan ekstrak hingga menjadi ekstrak kental
11. Dilakukan skrining fitokimia metode tabung dan uji KLT dan uji kadar total
flavonoid terhadap ekstrak.
Uji Penetapan Kadar Flavonoid Total
a. Pembuatan Larutan Pereaksi
1. Pembuatan larutan heksametilentetramin (HMT) 0,5% b/v
Larutan HMT 0,5% b/v dibuat dengan menimbang 0,5 g HMT dilarutkan dalam
100 mL aquadest lalu dihomogenkan.
2. Pembuatan larutan asam asetat glasial (CH3COOH) 5% v/v
Larutan CH3COOH 5% v/v dibuat dengan memasukkan 5 mL CH3COOH ke
dalam labu ukur 100 mL lalu ditambahkan metanol P hingga tanda.
3. Pembuatan larutan alumunium klorida (AlCl3) 2%
Larutan AlCl3 2% dibuat dengan menimbang 2 g AlCl3 lalu dilarutkan dalam
100 mL CH3COOH 5% v/v.
b. Pembuatan Larutan Blanko
Diambil 10 mL etil asetat dimasukkan dalam labu ukur 25 mL. Lalu ditambahkan
1 mL AlCl3 2% dan diencerkan dengan CH3COOH 5% hingga tanda
c. Pembuatan Larutan Standar
Ditimbang 2 mg kuersetin dan dilarutkan dalam 2 mL etil asetat P sehingga
dihasilkan larutan kuersetin 1000 ppm, selanjutnya dilakukan pengenceran larutan
standar dengan konsentrasi 2, 4, 6, 8 dan 10 ppm. Pembuatan larutan baku berfungsi
untuk membuat kurva baku kuersetin. Kadar kuersetin merupakan variabel bebas
dan nilai absorbansi merupakan variabel terikat. Larutan standar konsentrasi 2, 4,
6, 8 dan 10 ppm dimasukkan dalam labu ukur 25 mL, ditambahkan 1 mL larutan
AlCl3 2% dan larutan CH3COOH 5% hingga tanda, selanjutnya didiamkan selama
30 menit pada wadah gelap diukur panjang gelombang maksimum 437 nm dengan
larutan blanko.

15
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
16
Maret

d. Pembuatan Larutan Uji

Ekstrak ditimbang sebanyak 200 mg kemudian dimasukkan 1 mL larutan
HMT, 20 mL aseton P, dan 2 mL HCl P. Lalu direfluks selama 30 menit, disaring
menggunakan kertas saring kemudian filtrat dimasukkan kedalam labu ukur 100
mL. Residu dimasukkan kembali kedalam labu ukur dan ditambahkan 20 mL aseton
P selama 30 menit. Hasil refluks disaring menggunakan kertas saring dan campur
filtrat ke labu ukur 100 mL, serta ditambahkan aseton P sampai tanda. Diambil 20
mL larutan dimasukkan ke corong pisah lalu ditambahkan 20 mL air dan diekstraksi
3 kali. Digunakan 15 mL etil asetat P tiap sekali ekstraksi. Fase etil asetat yang
terbentuk dimasukkan kedalam labu ukur 50 mL serta ditambahkan etil asetat P
sampai tanda.
Larutan uji diambil 10 mL dan dimasukkan dalam labu ukur 25 mL,
ditambahkan 1 mL larutan AlCl3 2% dan larutan CH3COOH 5% hingga tanda.
Selanjutnya didiamkan selama 30 menit pada wadah gelap. Konsentrasi diukur
absorbansinya menggunakan panjang gelombang maksimum 437 nm dengan
larutan blanko sehingga didapatkan absorbansi.

16
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
17
Maret

PERCOBAAN V
Kuantifikasi curcuminoid menggunakan metode KLT-densitometri
A. Pendahuluan
Kromatografi Lapis Tipis. Metode KLT secara teratur dapat digunakan untuk
identifikasi, pemisahan, kuantifikasi atau semikuantitatif dari pigmen alam
termasuk kurkuminoid. KLTdensitometri termasuk metode yang cepat dan
sederhana yang telah dikembangkan untuk analisis kuantitatif simultan kurkumin,
demetoksikurkumin dan bisdemetoksikurkumin dalam serbuk curcuma. Akurasi
dan presisinya dapat diterima (Pothitirat dan Gritsanapan, 2005) serta preparasi
sampelnya yang sederhana (Liang et al., 2004).
Silika gel merupakan fase diam yang sering digunakan untuk KLT. Zat ini
digunakan sebagai adsorben universal untuk kromatografi senyawa netral, asam,
dan basa. Selain fase diam terdapat fase gerak yang merupakan salah satu bagian
penting dalam analisis pemisahan senyawa menggunakan KLT karena polaritas dari
fase gerak dapat menentukan pemisahan.
Densitometri. Teknik kuantitasi dapat didasarkan atas pengukuran intensitas
sinar yang diserap (absorbs), intensitas sinar yang dipantulkan (reflektansi), atau
intensitas sinar yang difluoresensikan (fluoresensi). Disini biasanya dipilih sinar
pada Panjang gelombang yang diserap atau dipantulkan paling banyak oleh noda
yang diteliti. Banyaknya sinar yang direfleksikan akan ditangkap paling banyak
oleh suatu alat yang disebut reflection photomultiplier yang aka diteruskan ke
pencatat atau rekorder untuk diubah menjadi suatu puncak atau kromatogram.
(Mintarsih, 1990). Monkromator digunakan untuk memilih Panjang gelombang
yang cocok, system untuk memfokuskan sinar pada lempeng, pengganda foton, dan
rekorder. Densitometer dapat bekerja secara serapan atau fluoresensi, dalam system
serapan terdapat dua model yaitu pantulan dan transmisi. Cara pantulan dapat
digunakan untuk sinar tampak maupun ultraviolet sedangkan transmisi hanya dapat
digunakan untuk sinar tampak (Gandjar dan Rohman, 2007).
B. Tujuan: Metode KLT-Densitometri untuk penetapan kadar kurkumin pada
produk obat herbal yang mengandung ekstrak kunyit (D1) dan temulawak (D2)
(Hanwar dkk, 2018).

17
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
18
Maret

C. Alat yang digunakan

• Seperangkat alat KLT-Densitometri (CS 9301 PC dual wavelight flying
spot scanning densitometer)
• neraca analitik
• seperangkat alat gelas
• sonifikator
• mikropipet 0,5-10μL
• mikroppet 100-1000μL.
D. Bahan yang digunakan
• Produk berbasis kurkumin yaitu sampel D1 (120 mg ekstrak Curcuma
domestica)
• sampel D2 (75 mg ekstrak Curcumae Rhizoma)
• Kurkuminoid (purity 80%) Sigma Aldrich
• plat KLT silika GF254
• Metanol teknis (Brataco)
• Metanol
• Chloroform
• Benzen
• kertas saring
• alumunium foil
E. Cara kerja
• Keseragaman Bobot. Ditimbang masing-masing sampel 20 kapsul produk obat
herbal berbasis kurkumin merek D1 dan D2, dicatat dan dievaluasi hasil
keseragaman bobotnya menggunakan uji statistik dengan syarat RSD < 5% dan
syarat keseragaman bobot pada FI IV.
• Optimasi Fase Gerak KLT: Optimasi fase gerak dilakukan dengan menotolkan
sampel (produk) dan standar kurkuminoid pada plat KLT sebanyak 2 μL, kemudian
dielusi dengan fase gerak A (kloroform: benzen: metanol 80:15:5) diperoleh Rf
kurkumin 0,6 (Pothitirat dan Gritsanapan, 2005) dan fase gerak B adalah modifikasi
dari fase gerak A yaitu (kloroform: benzene: metanol 75:15:10).

18
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
19
Maret

• Pembuatan Larutan Stok Kurkumin 0,5% dan 5%: Ditimbang dengan seksama
kurang lebih 50 mg dan 500 mg standar kurkuminoid, kemudian dilarutkan dengan
metanol hingga volume tepat 10 mL dan disonikasi dalam ultrasonic bath selama
±10 menit.
• Pembuatan Kurva Baku: Kurva baku kurkumin dibuat dengan kadar 0,020%;
0,040%; 0,060%; 0,08%; 0,10%; 0,12%; dan 0,140% dari larutan stok kurkumin
0,5%. Masing-masing ditotolkan 2 μL. Luas area yang diperoleh dicatat. Dan
dihitung regresi liniernya untuk memperoleh kurva baku, luas area sebagai sumbu Y
dan konsentrasi sebagai sumbu X.
• Preparasi Sampel: Ditimbang dengan seksama masing-masing produk D1 dan D2,
dimasukkan ke dalam labu takar 5 mL. Ditambahkan metanol p.a hingga volume
tepat 5 mL dan disonikasi pada ultrasonik bath selama ±10 menit kemudian disaring.
• Perhitungan Kadar: Luas area yang diperoleh dimasukkan pada kurva baku sebagai
nilai Y. Nilai X dikalikan faktor pengenceran (fp) bila ada, dan diperoleh kadar
kurkumin dalam % bobot per volume. Nilai tersebut dikonversikan menjadi kadar
kurkumin dengan membagi bobot penimbangan awal dan dikalikan bobot rata-rata
dari keseragaman bobot yang diperoleh sebelumnya.

19
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
20
Maret

PERCOBAAN VI
Isolasi senyawa Filantin Dari Phyllanti Herba Dengan Kromatografi Kolom
A. Dasar Teori
Kromatografi adalah cara pemisahan campuran yang didasarkan atas
perbedaan distribusi dari komponen campuran tersebut diantara dua fase, yaitu fase
diam (stationary) dan fasa bergerak (mobile). Dimana dalam kromatografi fasa
diam dapat berupa zat padat atau zat cair, sedangkan fasa bergerak dapat berupa zat
cair atau gas.
Kromatografi kolom merupakan metode kromatografi klasik yang masih
banyak digunakan. Kromatografi kolom digunakan untuk memisahkan senyawa-
senyawa dalam jumlah yang banyak berdasarkan adsorpsi dan partisi.
Pemilihan teknik kromatografi sebagian besar bergantung pada sifat
kelarutan senyawa yang akan dipisahkan. Kromatografi digunakan sebagai untuk
memisahkan substansi campuran menjadi komponen-komponennya. Molekul yang
terlarut dalam fase gerak akan melewati fase diam. Molekul yang memiliki ikatan
yang kuat dengan fase diam akan cenderung bergerak lebih lambat dibanding
molekul yang berikatan lemah. Dengan ini, berbagai macam tipe molekul dapat
dipisahkan berdasarkan pergerakan fg pada kolom. Setelah komponen terelusi dari
kolom, komponen tersebut dapat dianalisis dengan menggunakan KLT.
Sistem pelarut pada krom kolom bisa dilakukan dengan cara mengubah
kepolaran dari eluen yang digunakan secara bertahap. Eluen tersebut merupakan
campuran dua jenis pelarut dengan kepolaran berbeda. Dengan mengubah
perbandingan campurannya kita dapat menggeser tingkat kepolaran dari eluen ini.
Bisa juga dengan sistem isokratik dimana pelarut yang digunakan tetap sama.
Filantin merupakan komponen utama Phylanthus niruri Linn yang memiliki
aktivitas melindungi hati dari zat toksik (antihepatotoksik) baik berupa parasit,
virus maupun bakteri.

20
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
21
Maret

Senyawa filantin ini merupakan senyawa gol lignan yang merupakan

senyawa marker pada Phyllanti Herba.
B. Prinsip Kerja
Prinsip kerja dari kromatografi kolom jenis ini adalah komponen kimia yang
terdapat pada ekstrak akan terdistribusi kedalam fase diam atau fase gerak dengan
sesuai dengan sifatnya.
C. Alat dan Bahan
Bahan yang digunakan:
1. Ekstrak/fraksi meniran
2. Kloroform
3. Metanol
4. Silika gel G60
5. Glaswool
6. Sand
Alat yang digunakan
1. Kolom Kaca
2. Corong pisah
3. Vial
4. Statif
5. Klem
D. Cara Kerja
1. Penyiapan fase diam dengan metode basah, yaitu dibuat bubur silika,
kemudian tuang dan biarkan mengendap, keluarkan pelarut pelan pelan
dengan membuka kran bawah.

21
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
22
Maret

2. Ekstrak yang telah dicampur sengan sedikit fase diam diletakkan di atas fase
diam, kemudian tuangkan fase gerak secara perlahan.
3. Metode yang digunakan adalah metode isokratik, yaitu dengan fase gerak
tetap. Fase gerak yang digunakan kloroform-metanol (9:1) v/v.
4. Eluen dialirkan untuk pemisahan komponen dengan kecepatan alir sekitar
100 tetesan per menitnya. Aliran eluen diatur agar tidak terlalu cepat agar
komponen dapat terpisah dengan. Alirannya pun diusahakan tidak terlalu
lambat agar proses tidak terlalu lama.
5. Eluen mengalir mengelusi sampel menyusuri fase diam di sepanjang kolom
dengan memanfaatkan gaya gravitasi, tampung dalam vial @ 3 ml.
6. Vial – vial dilakukan uji KLT dengan fase gerak yang sama dengan fase
gerak kolom, dengan pembanding filantin sebagai senyawa marker.
Penampak bercak : UV 254 dan 366 nm, Cerium sulfat
7. Fraksi-fraksi profil KLT nya hampir sama dan yang terdapat spot yang
nilai Rf dan warna sama dengan filantin standar bisa dijadikan satu. Untuk
proses isolasi selanjutnya dapat diteruskan dengan teknik KLTP maupun
dilakukan kromatografi kolom lagi hingga diperoleh senyawa filantin
tunggal.

22
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
23
Maret

Contoh Format Laporan sementara

(ditulis dengan tulisan tangan pada kertas kuarto/ A4, dilampirkan pada Laporan
resmi praktikum)

LAPORAN SEMENTARA
PRAKTIKUM FITOKIMIA
Nama :
NIM :
Hari/Tanggal Praktikum :
Kelompok :
Nama Asisten :

A. Tujuan
B. Alat dan Bahan
C. Cara Kerja
D. Data/ Hasil

Surakarta,................................

Mengetahui,
Pengampu, Praktikan,

(.....................) (........................................)

23
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
24
Maret

Format Laporan Resmi

(ditulis dengan tulisan tangan pada kertas kuarto/ A4)
A. Tujuan
(sebutkan tujuan praktikum yang saudara lakukan)
B. Dasar Teori
(Jelaskan teori yang melandasi percobaan dengan menyebutkan sumber
pustakanya)
C. Alat dan Bahan
a. Alat yang digunakan
b. Bahan yang digunakan
D. Cara Kerja
(tulis cara kerja yang anda lakukan secara sistematis).
E. Hasil dan Pembahasan
(buatlah pembahasan terkait praktikum yang saudara lakukan dengan
mengacu pada teori yang telah tertulis dalam dasar teori, penjelasan
tentang jalannya praktikum dan fungsi penambahan zat dalam formulasi
sediaan steril).
F. Kesimpulan
(Sebutkan beberapa hal yang dapat disimpulkan dari praktikum yang
saudara lakukan yang disesuaikan dengan tujuan praktikum).
G. Daftar Pustaka
(Sebutkan buku acuan yang digunakan untuk membuat laporan. Contoh
penulisan daftar pustaka sbb :
Anonim, 1995, Farmakope Indonesia, Edisi IV, 1009, 1016, Departemen
Kesehatan RI, Jakarta.)

Surakarta,................................

Mengetahui,
Pengampu, Praktikan,

(.................................) (........................................)

24
 Petunjuk Praktikum Fitokimia Program Studi S1 Farmasi Universitas Sebelas
25
Maret

DAFTAR PUSTAKA

1. Mabry A.J., Markham K.R., Thomas, M.B., 1970, The Systematic

Identification of Flavonoids, Spinger, Verlag, Berlin.
2. Perry, L.M., 1970, Medicinaf Plants of East and Southeast Asia, Yhe MIT
Press, Cambridge, Massochusetts and London.
3. Depkes RI,1977, Materia Medika Indonesia, Jilid II Jakarta, hal 82-84
4. Ikan, R., 1969, Natural Product, Academic Press, London and new York, hal
185-187
5. Stahl, E., 1973, Drug Analysis by Chromatography and Microscopy. Ann
Arbor Science Publisher Inc., hal 184.
6. Hanwar, D., Aisyah, S. and Suhendi, A. (2018) ‘Validasi Metode KLT-
Densitometri untuk Penetapan Kadar Kurkumin pada Produk Obat Herbal
Berbasis Curcuma sp.’, Proceeding of The URECOL, pp. 379–385.

25