RESUME BAB 20

REPLIKASI DNA, PERBAIKAN, DAN REKOMBINASI DNA

Struktur DNA yang diusulkan oleh Watson da Crick pada tahun 1953 segera
menyarankan metode replikasi. Urutan nukleotida dari satu untai secara otomatis
menentukan urutan yang lain karena dua untai DNA heliks ganda saling melengkapi.
Watson dan Crick mengusulkan bahwa dua untai heliks terlepas selama replikasi
DNA dan bahwa setiap untai DNA bertindak sebagai cetakan untuk sintesis untai
komplementer. Dengan cara ini, replikasi DNA menghasilkan dua molekul anak untai
ganda, masing-masing mengandung satu untai induk dan satu untai yang baru
disintesis. Cara replikasi ini disebut semikonservatif karena satu untai DNA induk
disimpan dalam setiap molekul anak.

Dalam serangkaian eksperimen elegan, Matthew Meselson dan Franklin W.

Stahl menunjukkan pada tahun 1958 bahwa DNA memang direplikasi secara
semikonservatif seperti yang diprediksi oleh Watson dan Crick . Sekitar waktu yang
sama, laporan tentang pemurnian dan sifat beberapa enzim yang terlibat dalam
replikasi mulai muncul. DNA polymerase pertama dimurnikan pada tahun 1958 oleh
Arthur Kornbeg, yang dianugerahi Hadiah Nobel untuk pencapaian ini. Baru-baru ini
ahli, biokimia telah mengisolasi dan mengkarakterisasi enzim yang mengkatalisis
semua langkah dalam replikasi DNA dan telah mengidentifikasi gen yang mengkode
protein ini.

Ada tiga tahap yang berbeda dalam replikasi DNA :

1. Inisialisasi dimulai dengan perakitan protein replikasi yang benar

ditempat dimana replikasi DNA akan dimulai.
2. Selama tahap pemanjangan, DNA direplikasi secara semikonservatif
karena kompleks mengkatalisis penggabungan nukleotida kedalam
untai DNA yang sedang tumbuh.
3. Akhirnya, ketika replikasi berakhir, mesin protein dibongkar dan
molekul anak terpisah sehingga mereka dapat memisahkan kedalam
sel baru mereka.

Pemeliharaan informasi genetik dari generasi ke generasi mengharuskan

replikasi DNA berlangsung cepat ( karena seluruh komplemen DNA harus direplikasi
sebelum setiap pembelahan sel ) dan akurat. Semua sel memiliki enzim yang
memperbaiki kesalahan replikasi dan memperbaiki DNA yang rusak. Selanjutnya,
semua sel dapat mengacak potongan DNA dalam proses yang dikenal sebagai
rekombinasi genetik. Baik perbaikan maupun rekombinasi menggunakan banyak
enzim dan protein yang sama yang diperlukan untuk replikasi DNA.

20.1 Replikasi DNA Bersifat Dua Arah

Kromosom E. coli adalah molekul DNA untai ganda yang besar, melingkar,
dengan 4,6 × 103 pasangan kilobasa (kb). Replikasi kromosom ini dimulai di situs
unik yang disebut asal replikasi dan berlangsung dua arah sampai dua kompleks
replikasi bertemu di situs terminasi, dimana replikasi berhenti. Mesin protein yang
melakukan reaksi polimerasi disebut replisome, ini mengandung sejumlah protein
berbeda yang diperlukan untuk replikasi DNA yang cepat dan akurat. Satu replisome
terletak di masing-masing dari dua garpu replikasi, titik dimana DNA induk
dilepaskan.

Karena DNA induk dilepaskan pada garpu replikasi, setiap untai digunakan
sebagai cetakan untuk sintesis untai baru. Laju pergerakan garpu replikasi pada E.
coli adalah sekitar 1000 pasangan basa (bp) per detik. Dengan kata lain, masing-
masing dari dua untai baru diperpanjang dengan kecepatan 1000 nukleotida per detik.
Karena ada dua garpu replikasi yang bergerak dengan kecepatan ini, seluruh
kromosom E. coli dapat diduplikasi dalam waktu sekitar 38 menit.

20.2 DNA Polimerase

Sintesis untai baru DNA dicapai dengan penambahan nukleotida berturut-

turut ke ujung rantai yang sedang tumbuh. Polimerasi ini dikatalisis oleh enzimyang
dikenal sebagai DNA-directed DNA polymerase, atau hanya DNA polymerase. Sel
E. coli mengandungtiga DNA polymerase yang berbeda, setiap protein diidentifikasi
dengan angka romawi sesuai dengan urutan penemuannya. DNA polymerase I
memperbaiki DNA dan berpartisipasi dalam sintesis salah satu untai DNA selama
replikasi. DNA polimerasi II berperan dalam perbaikan DNA. DNA polymerase III
adalah enzim replikasi DNA utama yang bertanggung jawab untuk pemanjangan
rantai selama replikasi DNA dan merupakan bagian penting dari replisome.

a) Pemanjangan rantai adalah reaksi transfer gugus nukleotidil

b) DNA polymerase III tetap terikat pada garpu replikasi
c) Mengoreksi kesalahan polimerasi yang eror.

20.3 DNA polimerase mensintesis dua untai secara bersamaan

DNA polimerase mengkatalisis pemanjangan rantai secara eksklusif dalam

arah 5ˈ→ 3ˈ. Karena kedua untai DNA adalah antiparalel, sintesis 5ˈ→ 3ˈ
menggunakan untai template terjadi dalam arah yang sama dengan gerakan garpu
tetapi sintesis 5ˈ→ 3ˈmenggunakan untai template lain terjadi dalam arah yang
berlawanan dengan gerakan garpu. Untai baru yang dibentuk oleh polimerasi dalam
arah yang sama dengan gerakan garpu disebut untai utama.

a) Sintesis Untai Lagging Terputs-terputus

Untai utama disintesis sebagai satu satu polinukleotida kontinu
yang dimulai di titik asal dan berakhir ditempat terminasi .
Sebaliknya , untai yang tertinggal disintesis secara terputus-putus
dalam potongan-potongan pendek dengan arah gerakan garpu yang
berlawanan. Potongan-potongan untai tertinggal kemudian bergabung
dengan reaksi terpisah.
Molekul DNA yang baru dibuat kemudian diisolasi,
didenaturasi, dan dan dipisahkan berdasarkan ukuran. Eksperimen
mendeteksi dua jenis molekul DNA berlabel : molekul DNA yang
sangat besar yang secara kolektif mengandung sekitar setengah
radioaktifitas dari DNA yang direplikasi sebagian dan fragmen DNA
yang lebih pendek dari sekitar 1000 residu yang secara kolektif
mengandung setengah lainnya dari radioaktifitas. Molekul DNA besar
muncul dari sintesis kontinu untai utama sedangkan fragmen yang
lebih pendek muncul dari sintesis terputus untai tertinggal. Potongan
DNA untai tertinggal diberi nama fragmen Okazaki untuk
menghormati penemunya, Reiji Okazaki. Mekanisme keseluruhan
repikasi DNA disebut semidiscontinuous untuk menekankan
mekanisme yang berbeda untuk mereplikasi setiap untai.
b) Setiap fragmen okazaki dimulai dengan RNA Primer
Jelas bahwa sintesis untai tertinggal terputus-putus tetapi tidak
jelas bagaimana sintesis setiap fragmen Okazaki dimulai.
Masalahnya adalah tidak ada DNA polimerase yang dapat memulai
polimerasi de novo; mereka hanya dapat menambahkan nukleotida ke
polimer yang ada. Keterbatasan ini menghadirkan sedikit kesulitan
untuk memimpin sintesis untai karena begitu sintesis DNA
berlangsung, nukleotida terus ditambahkan ke rantai yang sedang
tumbuh. Namun, pada untai tertinggal , sintesis setiap fragmen
Okazaki membutuhkan peristiwa inisiasi baru. Hal ini dicapai dengan
membuat potongan pendek RNA di garpu replikasi. Primer RNA ini
melengkapi template untai yang tertinggal. Setiap primer
diperpanjang dari ujung 3ˈ oleh DNA polimerase untuk membentuk
fragmen Okazaki.
 c) Fragmen Okazaki digabungkan oleh aksi DNA polimerase I dan DNA
ligase
Fragmen Okazaki akhirnya bergabung untuk menghasilkan
untaian DNA yang berkesinambungan. Reaksi berlangsung dalam tiga
langkah : penghapusan primer RNA, sintesis DNA pengganti, dan
penyegelan fragmen DNA yang berdekatan.

20.4 Model Replisom

Replisom mengandung primosom, holoenzim DNA polimerase III dan

menambahkan protein yang diperlukan untuk replikasi DNA. Perakitan banyak
protein menjadi satu mesin memungkinkan sintesis terkoordinasi dari untaian
terdepan dan tertinggal di garpu replikasi.

1. Penggabungan fragmen Okazaki dengan aksi gabungan DNA

polimerase I dan DNA ligase :
a) Penyelesaian sintesis fragmen Okazaki meninggalkan celah
antara fragmen Okazaki dan RNA primer sebelumnya pada
untai tertinggal
b) DNA polimerase I memperluas fragmen Okazaki sementara
aktivitas eksonukease 5-3ˈnya menghilangkan RNA primer.
Proses ini, yang disebut translasi Nick, menghasilkan
pegerakan nick disepanjang untai yang tertinggal.
c) DNA polimerase I terdisosiasi setelah memperpanjang
fragmen okazaki 10-12 nukleotida. DNA ligase mengikat Nick.
d) DNA ligase mengkatalisis pembentukan hubungan
fosfodiester, yang menyegel Nick, menciptakan untai
tertinggal terus menerus. Enzim kemudian berdisosiasi dari
DNA.
2. Sintesis simultan dari untaian terdepan dan tertinggal di garpu
replikasi. Replisom mengandung DNA polimerase III holoenzim
( hanya kompleks inti yang ditampilkan); primosom yang
mengandung primase, sebuah helikase, dan subunit lainnya; dan
komponen tambahan termasuk single-strand binding protein (SSB ).
Satu kompleks inti holoenzim mensintesis untai utama sedangkan
kompleks inti lainnya mensintesis untai tertinggal. Template untai
tertinggal dilingkarkan kembali melalui replisome sehingga untai
tedepan dan penandaan dapat disintesis dalam arah yang sama dengan
gerakan . (c) dan (d) lanjuta kehalaman berikutnya.
 a) Template untai tertinggal berputar kembali melalui replisom
sehingga untai terdepan dan tertinggal disintesis dalam arah
yang sama. SSB mengikat DNA untai tunggal.
b) Saat helikase membuka cetakan DNA, primase mensintesis
RNA primer. Polimerase untai tertinggal melengkapi fragmen
Okazaki.
c) Ketika polimerase untai tertinggal bertemu dengan fragmen
Okazaki sebelumnya, ia melepaskan untai tertinggal.
d) Polimerase untai tertinggal mengikat primer yang baru saja
disintesis dan mulai mensintesis fragmen Okazaki lainnya.

20.5 Inisiasi dan Pengakhiran Replikasi DNA

Seperti disebutkan sebelumnya, replikasi DNA dimulai pada urutan DNA

spesifik yang disebut asal. Pada E. Coli, situs ini disebut oriC, dan terletak sekitar
pukul 10 pada peta genetik kromosom. Perakitan awal replisom di oriC bergantung
pada protein yang berikatan dengan situs ini yang menyebabkan pelepasan lokal
DNA. Salah satu protei ini, DnaA, dikodekan oleh gen DnaA dengan mengontrol
frekuensi inisiasi. RNA primer awal yang diperlukan untuk sintesis untai utama
mungkin dibuat oleh primosom di titik asal.

Penghentian replikasi pada E. Coli terjadi ditempat terminasi (ter), suatu

daerah yang berlawanan dengan titik asal pada kromosom sirkular. Wilayah ini
mengandung sekuen DNA yang merupakan tempat pengikatan protein yang dikenal
sabagai zat pemanfaatan terminator (Tus). Daerah untai terletak pada alur utama
DNA dimana rantai samping asam amino melakukan kontak dengan pasangan basa
dan mengenali urutan ter. Tus mencegah garpu replikasi melewati wilayah dengan
menghambat aktivitas helikase dan replisom. Situs terminasi juga mengandung
sekuens DNA yang berperan dalam pemisahan kromosom anak ketika replikasi DNA
selesai.

20.6 Teknologi Replikasi DNA

Pemahaman kami tentang prinsip-prinsip dasar replikasai DNA telah

mengarah pada pengembangan beberapa teknologi menakjubkan yang tidak pernah
diantisipasi Watson dan Crick pada tahun 1953. Kami telah menemukan matagenesis
yang diarahkan ke lokasi. Pada bagian ini kami mengeksplorasi teknologi amplifikasi
dan sekuensing yang telah mengubah biokimia dan tentu saja, semua biologi.
Teknologi ini telah menghasilkan urutan genom spesies yang punah ( misalnya,
Homo neanderthalensis ) dan penemuan dasar genetik dari banyak sifat dan penyakit
manusia.

a) Reaksi rantai polimerase ( PCR ) menggunakan DNA polimerase

untuk memperkuat urutan DNA terpilih.
b) Sekuensing DNA menggunakan dideoksiukleotida.
c) Pengurutan DNA paralel secara masif dengan sintesis.

20.7 Replikasi DNA pada eukariota

Mekanisme replikasi DNA pada prokariota dan eukariota pada dasarnya

serupa. Pada eukariota seperti pada E. Coli, sintesis untai utama terus menerus dan
sintesis untai tertinggal terputus-putus. Labih lanjut, pada prokariota dan eukariota,
sintesis untai tertinggal adalah proses bertahap yang melibatkan : sintesis primer,,
sintesis fragmen Okazaki, hidrolisis primer, dan pengisian celah oleh polimerase.
Primase eukariotik, seperti primase prokariotik, mensintesis primer pendek sekali
setiap detik pada template untai tertinggal. Namun, karena garpu replikasi bergerak
lebih lambat pada eukariota, setiap fragmen okazaki hanya sekitar 100 hingga 200
nukleotida residu panjang, jauh lebih pendek daripada prokariota. Menariknya,
primase DNA eukariotik tidak memiliki kesamaan urutan yang signifikan dengan
enzim E. Coli dan primase eukariotik juga tidak mengandung beberapa penanda
struktural klasik DNA polimerase seperti domain “ jari” atau “ibu jari”. Kurangnya
homologi menunjukkan bahwa kapasitas untuk mensintesis RNA primer untuk
inisiasi DNA mungkin telah berevolusi secara independen setidaknya dua kali.

20.8 Perbaikan DNA yang Rusak

Ada beberapa jenis kerusakan DNA seperti modifikasi basa, penghapusan

atau penyisipan nukleotida, ikatan silang untai DNA, dan kerusakan tulang punggung
fosfodiester. Sementara beberapa kerusakan DNA adalah hasil dari agen lingkungan
(misalnya, bahan kimia atau radiasi), sebagian besar krusakan DNA adalah hasil dari
kesalahan yang dibuat selama replikasi DNA. Kerusakan parah mungkin mematikan
tetapi sebagian besar kerusakan terjadi in vivo diperbaiki. Banyak nukleotida yang
dimodifikasi , serta basa yang tidak cocok yang lolos dari mekanisme proofreading
DNA polimerase, dikenali oleh enzim perbaikan spesifik yang terus memindai DNA
untuk mendeteksi perubahan . Beberapa lesi diperbaiki dengan perbaikan langsung,
suatu proses yang tidak memerlukan pemecahan tulang belakang fosfodiester DNA.
Perbaikan lainnya membutuhkan pekerjaan yang lebih ekstensif.

a) Perbaikan setelah fotodimerisasi: contoh perbaikan langsung

 DNA heliks ganda rentan terhadap kerusakan sinar ultraviolet
(UV). Kerusakan akibat sinar UV yang paling umum terbentuk di
antara timin yang berdekatan. Replikasi DNA tidak dapat terjadi
dengan adanya dimer pirimidin karena mereka mendistorsi untai
cetakan. Oleh karena itu, penghilangan dimer pirimidin sangat penting
untuk kelangsungan hidup.
b) Perbaikan eksisi
Bentuk lain dari radiasi pengion dan bahan kimia dapat merusak DNA.
Beberapa senyawa, termasuk asam dan zat pengoksidasi, dapat memodifikasi
DNA dengan alkilasi, metilasi atau deaminasi. DNA juga rentan terhadap
hilangnya basa heterosiklik secara spontan, suatu proses yang dikenal sebagai
depurinisasi dan depirimidisasi. Banyak dari cacat ini dapat diperbaiki dengan
jalur perbaikan eksisi umum yang fitur keseluruhannya serupa disemua
organisme. Jalur dimulai ketika endonuklease mengenali DNA yang
terdistorsi dan rusak dan membelah di kedua sisi lesi melepaskan
oligonukleotida yang mengandung 12 hingga 13 residu. Pembelahan ini
dikatalisis oleh enzim UvrABC pada E. Coli. Penghapusan oligonukleotida
DNA mungkin memerlukan aktivitas helikase yang sering menjadi komponen
kompleks enzim perbaikan eksisi. Hasilnya adalah celah beruntai tunggal.
Celah tersebut kemudian diisi oleh aksi DNA polimerase I pada prokariota
atau perbaikan DNA polimerase pada eukariota. Torehan tersebut disegel oleh
DNA ligase.

20.9 Rekombinasi Homolog

Rekombinasi adalah setiap peristiwa yang menghasilkan pertukaran atau

transfer potongan DNA dari satu kromosom ke kromosom lain atau di dalam
kromosom. Sebagian besar rekombinasi adalah contoh rekombinasi homolog karena
terjadi di antara potongan-potongan DNA yang memiliki urutan yang terkait erat.
Pertukaran antara kromosom berpasangan selama meiosis adalah contoh rekombinasi
homolog. Rekombinasi antara barisan yang tidak berhubungan disebut rekombinasi
nonhomolog. Rekombinasi antara molekul DNA juga terjadi ketika bakteriofag
berintegrasi ke dalam kromosom inang. Ketika rekombinasi terjadi di lokasi tertentu
itu disebut rekombinasi khusus situs.

 Model Holiday dari rekombinasi umum

Rekombinasi homolog dimulai dengan pengenalan pemecahan untai
tunggal atau untai ganda ke dalam molekul DNA. Rekombinasi melibatkan
pemutusan untai tunggal sering disebut rekombinasi umum.
 Rekombinasi dalam E. Coli
 Rekombinasi bisa menjadi bentuk perbaikan