AGAR MAC CONCKEY

Este medio se utiliza para el aislamiento de bacilos Gram negativos de fcil desarrollo, aerobios y anaerobios facultativos. Permite diferenciar bacterias que utilizan o no, lactosa en muestras clnicas, de agua y alimentos. Todas las especies de la familia Enterobacteriaceae desarrollan en el mismo. Fundamento: En el medio de cultivo, las peptonas, aportan los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y la mezcla de sales biliares y el cristal violeta son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de gran parte de la flora Gram positiva. Por fermentacin de la lactosa, disminuye el pH alrededor de la colonia. Esto produce un viraje del color del indicador de pH (rojo neutro), la absorcin en las colonias, y la precipitacin de las sales biliares. Los microorganismos no fermentadores de lactosa producen colonias incoloras. Frmula (en gramos por litro) Peptona 17.0 Pluripeptona 3.0 Lactosa 10.0 Mezcla de sales biliares 1.5 Cloruro de sodio 5.0 Agar 13.5 Rojo neutro 0.03 Cristal violeta 0.001 pH final: 7.1 0.2 Instrucciones

Suspender 50 g del polvo por litro de agua destilada. Reposar 5 minutos y mezclar hasta uniformar. Calentar suavemente y hervir 1 a 2 minutos hasta disolver. Esterilizar en autoclave a 121C durante 15 minutos.

Siembra: - Sembrar en superficie. - Utilizando la tcnica de Pour Plate: sembrar 1 ml de muestra y agregar aproximadamente 15 ml de medio de cultivo fundido y enfriado a 45-50 C. Incubacin Durante 18-48 horas, a 35-37 C, en atmsfera aerbica

Resultados:

Microorganismos Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri ATCC 12022 Proteus mirabilis ATCC 43071 Enterococcus faecalis ATCC 29212

Colonias Rojas con halo turbio Rosadas mucosas Incoloras, transparentes Incoloras, transparentes Incoloras, transparentes Diminutas, incoloras, opacas

Caractersticas del medio Medio preparado: rojo prpura Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

AGAR EMB

Este medio es utilizado para el aislamiento selectivo de bacilos Gram negativos de rpido desarrollo y escasas exigencias nutricionales. Permite el desarrollo de todas las especies de la familia Enterobacteriaceae. Fundamento Este medio combina las frmulas de Holt-Harris y Teague con la de Levine, para obtener un mejor rendimiento en el aislamiento selectivo de enterobacterias y otras especies de bacilos Gram negativos. La diferenciacin entre organismos capaces de utilizar la lactosa o sacarosa, y aquellos que son incapaces de hacerlo, est dada por los indicadores eosina y azul de metileno; stos ejercen un efecto inhibitorio sobre muchas bacterias Gram positivas. Muchas cepas de Escherichia coli y Citrobacter spp presentan un caracterstico brillo metlico. Las cepas que utilizan la lactosa poseen centro oscuro con periferia azulada o rosada, mientras que las que no lo hacen son incoloras. Este medio permite el crecimiento de Candida spp como colonias rosadas y puntiformes; la siembra en profundidad permite el desarrollo de clamidosporas en C. albicans. Enterococcus spp crece en este medio como colonias puntiformes y transparentes, mientras que Acinetobacter spp y otras bacterias oxidativas pueden dar colonias de color azul lavanda; esto puede ocurrir aunque las cepas no sean capaces de acidificar a partir de lactosa al 0.5% y ello se debe a la incorporacin de azul de metileno a sus membranas. En este medio se obtiene adems, un buen desarrollo de especies de Salmonella y Shigella.

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Peptona 10.0 Suspender 36 g del polvo en un litro de agua Lactosa 5.0 destilada. Reposar 5 minutos; mezclar, Sacarosa 5.0 calentando a ebullicin durante 1 o 2 Fosfato dipotsico 2.0 minutos hasta su disolucin. Esterilizar en Agar 13.5 autoclave a no ms de 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45C y distribuir Eosina 0.4 agitando suavemente. Azul de metileno 0.065 pH final: 7.2 0.2

Siembra En superficie, por estriado a partir de un inculo poco denso, para obtener colonias aisladas. En profundidad, para favorecer el desarrollo de clamidosporas. Incubacin De 24 a 48 horas a 35-37C en aerobiosis. Resultados Microorganismos Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Proteus mirabilis ATCC 43071 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Shigella flexneri ATCC 12022 Salmonella typhimurium ATCC 14028 Tipo de Colonia Verdosas con brillo metlico y centro negro azulado Mucosas, rosa prpura, confluentes Incoloras Incoloras, pequeas, puntiformes Incoloras Incoloras

Caractersticas del medio: Placas preparadas: color prpura. La esterilizacin del medio de cultivo reduce el azul de metileno al color naranja. El color prpura se restaura por agitacin. La presencia de un precipitado en el medio esterilizado es normal y no debe ser removido, ya que es parte esencial del mismo. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

AGAR MUELLER HINTON

Este medio de cultivo ha sido recomendado universalmente para la prueba de sensibilidad a los antimicrobianos. Adems es til con el agregado de sangre para el cultivo y aislamiento de microorganismos nutricionalmente exigentes. Fundamento El Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI), ex National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS), recomend su uso en forma rutinaria para la realizacin del antibiograma en medio slido, debido a una serie de factores que se detallan a continuacin: presenta buena reproductibilidad lote a lote en las pruebas de sensibilidad, su contenido en inhibidores de sulfonamidas, trimetoprim y tetraciclina es bajo, la mayora de los patgenos crece satisfactoriamente y una gran cantidad de datos han sido evaluados usando este medio de cultivo. Cuando se suplementa con sangre de carnero al 5%, es til para realizar las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos en especies de estreptococos.

Frmula (en gramos por litro) Infusin de carne 300.0 Peptona cida de casena 17.5 Almidn 1.5

Agar

Instrucciones Suspender 37 g del medio deshidratado en un litro de agua destilada. Dejar embeber de 10 a 15 minutos. Calentar con agitacin frecuente y hervir durante 1 minuto. Esterilizar a 121C durante 15 minutos. Enfriar a 45-50C y distribuir a cajas de Petri (o agregar los 15.0 suplementos que se desee) hasta un nivel de 4 mm sobre una superficie horizontal (25-30 ml en placas de 9 cm de dimetro). pH final: 7.3 0.1

Siembra Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la metodologa apropiada. Incubacin Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la metodologa apropiada. Resultados Consultar en la seccin prueba de sensibilidad a los antimicrobianos, la metodologa apropiada.

Notas: 1- Los lotes de agar Mueller Hinton Britania cumplen con las normas descriptas en el documento M6 - P del NCCLS: Evaluating production lots of dehydrated Mueller Hinton agar. Esto es muy importante pues algunos lotes pueden variar significativamente y si las bacterias no crecen adecuadamente, las zonas de inhibicin en las pruebas de difusin son generalmente ms grandes, quedan fuera de los lmites de control de calidad y pueden dar resultados errneos. 2- Los medios que contienen cantidades excesivas de timidina o timina pueden revertir el efecto inhibitorio de las sulfonamidas y trimetoprima, produciendo as zonas de inhibicin ms pequeas y por lo tanto informes de falsa resistencia. Para evaluar el contenido de timidina del lote de agar Mueller Hinton, se prueba la cepa de control de calidad: Enterococcus faecalis ATCC 29212 frente a discos de TMS. En un medio satisfactorio, se produce una zona clara de inhibicin de 20 mm o ms. 3- Otro aspecto de cuidado en el control de calidad en el agar Mueller Hinton es que las variaciones en cationes divalentes principalmente calcio y magnesio pueden afectar los resultados con tetraciclina, polimixina y aminoglucsidos cuando se ensayan cepas de Pseudomonas spp. Por tal motivo, se deben cumplir los lmites de control de calidad publicados por el NCCLS. 4- Los resultados deben ser cuidadosamente observados con todos los organismos de control para evitar datos aberrantes debido al medio de cultivo. Para aquellas cepas que fallan de crecer satisfactoriamente sobre Agar Mueller Hinton no suplementado, se agrega sangre desfibrinada de carnero al agar fundido y enfriado, a una concentracin final al 5% (v/v).

Para el control de precisin y exactitud del agar de Mueller Hinton se usan las siguientes cepas control: S. aureus E. coli P. aeruginosa E. faecalis ATCC 25923 ATCC 25922 ATCC 27853 ATCC 29212

Para evaluar el desempeo de inhibidores de beta lactamasa, se utiliza la cepa control: E. coli ATCC 35218

Caractersticas del medio Medio preparado: mbar. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.

AGAR SALMONELLA SHIGUELLA

Medio de cultivo utilizado para el aislamiento de Salmonella spp y de algunas especies de Shigella spp a partir de heces, alimentos y otros materiales en los cuales se sospeche su presencia. Fundamento Es un medio de cultivo selectivo y diferencial. La selectividad, est dada por la sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayora de los coliformes y el desarrollo invasor del Proteus spp. Es diferencial debido a la fermentacin de la lactosa, y a la formacin de cido sulfhdrico a partir del tiosulfato de sodio. Los pocos microorganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar, acidifican el medio haciendo virar al rojo el indicador de pH, obtenindose colonias rosadas o rojas sobre un fondo rojizo. Salmonella, Shigella y otros microorganismos no fermentadores de lactosa, crecen bien en el medio de cultivo, y producen colonias transparentes. La produccin de cido sulfhdrico se evidencia como colonias con centro negro debido a la formacin de sulfuro de hierro. Para aumentar la selectividad, se recomienda incubar previamente la muestra en Selenito caldo (B02-120-05).

Frmula (en gramos por litro) Instrucciones Pluripeptona 5.0 Extracto de carne 5.0 Suspender 60 g del polvo por litro de Lactosa 10.0 agua destilada. Reposar 5 minutos y Mezcla de sales biliares 8.5 mezclar hasta homogeneizar. Calentar Citrato de sodio 8.5 a ebullicin durante 2 o 3 minutos. NO Tiosulfato de sodio 8.5 ESTERILIZAR EN AUTOCLAVE. Citrato frrico 1.0 Enfriar a 45-50C y distribuir unos 20 Agar 13.5 ml por placa. Secar la superficie del Verde brillante 0.00033 medio unos minutos en la estufa. Rojo neutro 0.025 pH final: 7.0 0.2

Siembra Sembrar por estriado la superficie del medio de cultivo. Recomendaciones, se aconseja sembrar en forma conjunta una placa de agar E.M.B. (B02-101-05) o de agar Mac Conkey (B02-114-05). Incubacin Durante24-48 horas a 35-37 C, en aerobiosis. Resultados Microorganismos Salmonella typhimurium ATCC 14028 Shigella flexneri Shigella sonnei Proteus mirabilis ATCC 43071 Escherichia coli ATCC 25922 Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 Enterococcus faecalis ATCC 29212 Caractersticas del medio Medio preparado: rojo naranja. Almacenamiento: Medio deshidratado: a 10-35 C. Colonias Transparentes, centro negro Incoloras Incoloras Transparentes, centro negro Rosadas a rojas Rosadas cremosas y mucosas Incoloras, de muy escaso crecimiento

AGAR SANGRE

Medio para propsitos generales, para el aislamiento y cultivo de numerosos microorganismos. Con la adicin de sangre, el medio es til tanto para el aislamiento y cultivo de microorganismos aerobios y anaerobios nutricionalmente exigentes a partir de una gran variedad de muestras, como para la observacin de reacciones de hemlisis. Tambin, este medio de cultivo, puede utilizarse como medio base para preparar el medio agar chocolate. Fundamento La infusin de msculo de corazn y la peptona, otorgan al medio un alto valor nutritivo, que permite el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, an de aquellos nutricionalmente exigentes. El cloruro de sodio mantiene el balance osmtico. El agregado de sangre al medio de cultivo, en concentracin final de 5-10 %, aporta nutrientes para el crecimiento bacteriano, y permite detectar hemlisis.

Frmula (en gramos por litro) Infusin de msculo de corazn Peptona Cloruro de sodio Agar pH final: 7.3 0.2 Instrucciones

375.0 10.0 5.0 15.0

Suspender 40 g del polvo en un litro de agua destilada. Dejar reposar 5 minutos y mezclar perfectamente hasta obtener una suspensin homognea. Calentar con agitacin frecuente y hervir 1 minuto. Esterilizar 20 minutos a 121C. Enfriar a 45-50C agregar sangre desfibrinada al 5%. Homogeneizar y distribuir en placas.

Preparacin de la placa de Agar Sangre: Aadir en forma asptica un 5% de sangre estril desfribinada a temperatura ambiente, el agar debe estar a 45C Preparacin de Agar Chocolate: Despus de aadir la sangre y agitando frecuentemente se mantiene el medio de cultivo a 80C por 10 minutos hasta que adquiera un color pardo chocolatado. Siembra Por inoculacin directa del material en estudio, sobre la superficie del medio de cultivo. Incubacin El tiempo, temperatura y atmsfera de incubacin, dependern del microorganismo que se quiera aislar.

Resultados Microorganismos E. coli ATCC 25922 S. aureus ATCC 25923 S. pyogenes ATCC 19615 S. pneumoniae ATCC 6305 S. pneumoniae ATCC 49619 Crecimiento Abundante Abundante Abundante Abundante Abundante Hemlisis -Beta Beta Alfa Alfa

Limitaciones Las reacciones hemolticas de muchos microorganismos son diferentes al usar sangre de caballo respecto a la sangre de carnero, tal es el caso de algunas cepas de estreptococos grupo D, queproducen beta hemlisis en el agar suplementado con sangre de caballo pero no en agar suplementado con sangre de carnero, y son mal clasificados como Estreptococos Grupo A al usar sangre de caballo.

Caractersticas del medio Medio preparado: mbar. Medio preparado con 5% de sangre de carnero: rojo cereza. Almacenamiento Medio deshidratado: a 10-35 C. Medio preparado: a 2-8 C.