Virologia Licenciaturas em Biologia 2006-2007

AULAS PRTICAS VIROLOGIA

Parte I - Tcnicas de cultura de clulas animais 1 Observao, manuseamento e obteno de sub-culturas de clulas animais. 2 Determinao da concentrao e da taxa de inviabilidade de uma suspenso celular. 3 Obteno de sub-culturas de clulas VERO. Parte II - Tcnicas de Virologia 1 Produo de vrus (EMCV, FV3 e outros iridovrus) em clulas Vero 2 Titulao dos vrus produzidos Parte III - Tcnicas de Virologia molecular 1 Extraco e caracterizao dos genomas virais 1.1 - Extraco dos genomas dos vrus produzidos 1.2 - Caracterizao dos genomas virais 1.2.1 - Anlise electrofortica 1.2.2 - Traduo in vitro (apenas para o genoma do EMCV) 2 Extraco e caracterizao de protenas de clulas infectadas 2.1 - Marcao radioactiva e extraco de protenas 2.2 - Caracterizao dos polipptidos celulares e virais 3 Extraco e caracterizao de RNAs de clulas infectadas 3.1- Extraco de RNAs 3.2- Caracterizao do RNA celular e viral 3.2.1- Anlise electrofortica do RNA 3.2.2 - Traduo do RNA in vitro

Parte I

TCNICAS DE CULTURA DE CLULAS ANIMAIS

1 OBSERVAO, MANUSEAMENTO E SUB-CULTURA DE CLULAS ANIMAIS Objectivos 1 - Observao de culturas de clulas VERO e de outras linhas celulares. 2 - Identificao de culturas confluentes. 3 - Obteno de suspenses celulares. 4 - Determinao da concentrao e da taxa de inviabilidade de uma suspenso celular. 5 - Obteno de sub-culturas (passagem de clulas). Introduo Vo ser utilizadas diversas linhas celulares, que so cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) suplementado com soro fetal de bovino (foetal calf serum) a 10% (DME-FCS10). O pH do meio mantido numa atmosfera com CO2 a 5% (obtida ou por gazeamento ou por colocao em estufa de CO2 com atmosfera hmida). As clulas crescem em monocamada, aderentes superfcie do frasco/placa de cultura. A sub-cultura das clulas faz-se habitualmente a partir de culturas confluentes, enquanto que a infeco efectuada preferencialmente com culturas subconfluentes. As clulas so subcultivadas, a partir de suspenses celulares obtidas por tripsinizao das clulas da monocamada. Todas as operaes envolvidas no manuseamento das clulas e respectivos meios so efectuadas em condies de assepsia, com material estril, e em cmara de fluxo laminar.

Procedimento 1 - Observar os frascos e placas com culturas celulares. 2 - Subcultivar as clulas de um frasco T25 (com 25cm2 de rea) para: 2 placas P35 (com 35mm de dimetro - 9,6cm2 de rea) de forma a que possam ser infectadas da a dois dias; 1 T25 que esteja ptimo (confluente) para ser subcultivado da a 2 dias.

2.1 - Lavar a monocamada celular por duas vezes com 2ml de PBS-A. 2.2 - Adicionar 1ml de tripsina e rejeitar o excesso aps passagem por toda a monocamada. 2.3 - Incubar a 37 C at que as clulas se destaquem do frasco (2 a 3 minutos). 2.4 - Adicionar 2ml de meio e ressuspender bem as clulas, por pipetagem. 2.5 - Contar o nmero de clulas presentes na suspenso celular (ver protocolo Determinao da concentrao e da taxa de inviabilidade de uma suspenso celular). 2.6 - Calcular os inculos a distribuir pelas placas e frasco de cultura pretendidos (ver protocolo Obteno de sub-culturas de clulas VERO) 2.7 - Aps distribuio dos inculos, adicionar meio de cultura s P35 e ao T25 de forma a ficarem respectivamente com 2ml e 6ml de meio. Colocar a incubar na estufa de CO2 (deixando o frasco mal rolhado).

2 DETERMINAO DA CONCENTRAO E DA TAXA DE INVIABILIDADE DE UMA SUSPENSO CELULAR Objectivos 1 - Determinao da concentrao de uma suspenso celular. 2 - Determinao da taxa de inviabilidade de uma suspenso celular. Introduo O nmero de clulas de uma cultura pode ser contado. necessrio obter primeiro uma suspenso celular devidamente homogeneizada, da qual se retira uma alquota para aplicar numa cmara de contagem. Quando tambm se pretende conhecer a taxa de inviabilidade dessa cultura, utiliza-se para a contagem uma alquota da suspenso celular diluda numa soluo de azul de tripano em PBS-A. O azul de tripano um corante de excluso que apenas entra em clulas permeabilizadas (inviveis). Aps a entrada na clula atravessa o invlucro nuclear e acaba por se localizar nos ncleos, que ficam corados de azul.

Procedimento 1 - Retirar 0,1ml da suspenso celular para um microtubo 2 - Adicionar 0,2ml de azul de tripano em PBS-A e misturar bem. (Nesta alquota a suspenso celular fica diluda 1:3) 3 - Pipetar uma amostra para uma cmara de contagem (hemacitmetro), aps montar devidamente a lamela. 4 - Contar os nmeros de clulas viveis e inviveis presentes nos dois campos da cmara de contagem. (distinguem-se as clulas inviveis por apresentarem os ncleos corados de azul). Calcular as mdias dos dois valores obtidos: nv e ni, respectivamente. 5 Clculos: 5 -1 - Calcular a concentrao de clulas viveis (Cv) presentes na suspenso celular Cv = nv X 104 X 3 5 -2- Calcular a concentrao de clulas inviveis (Ci) presentes na suspenso celular Ci = ni X 104 X 3 5 -3 - Calcular o nmero de clulas viveis (Nv) presentes na suspenso celular Nv = C X V 5 - 4 Calcular a taxa de inviabilidade (Ti) da suspenso celular Ti = (ni / nv) X 100 % - C (concentrao) o nmero de clulas existentes em 1 mililitro de suspenso celular - nv a mdia do nmero de clulas viveis observado por campo da cmara de contagem (10-4 cm3) - Nv o nmero de clulas viveis presentes na suspenso celular - V o volume da suspenso celular

3 OBTENO DE SUB-CULTURAS DE CLULAS VERO Objectivos: Tendo em considerao o tipo de frasco/placa a utilizar e o tempo de cultura pretendido, determinar os inculos adequados para preparao de sub-culturas destinadas a: i) passagem de clulas / manuteno da linha celular ii) inoculao com um vrus, tendo em vista a sua produo Introduo As clulas VERO so uma linha contnua com origem em clulas de rim de macaco verde africano. So clulas fibroblsticas, que crescem em monocamada, a 37C, em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DME) suplementado com soro fetal de bovino (foetal calf serum) a 10% (DME-FCS10). O pH do meio mantido numa atmosfera com CO2 a 5% (obtida ou por gazeamento ou por colocao em estufa de CO2 com atmosfera hmida). Uma cultura confluente tem cerca de 2,5 X 105 clulas por cm2. O ciclo de replicao celular de cerca de 24 horas, aps uma taxa de crescimento de apenas 1,25X no primeiro dia de cultura. A subcultura das clulas faz-se habitualmente a partir de culturas confluentes, enquanto que a infeco efectuada preferencialmente em culturas subconfluentes. As clulas so subcultivadas a partir de suspenses celulares obtidas por tripsinizao das clulas da monocamada (ver protocolo Observao, manuseamento e subcultura de clulas animais) .

Procedimento Utilizar a seguinte tabela para calcular os inculos adequados obteno das sub-culturas pretendidas

SUB-CULTURA DE CLULAS VERO Frasco/Placa a preparar T25 = T24 T75 = T83 T180 = T175 placa de 24 poos P35 = P40 P60 = P58 P100 = P92 P150 = P144 Utilizao pretendida ao 3 dia: PIPassagem - 5x104 clulas/cm2 Infeco - 2,5x104 clulas/cm2 rea (cm2) 24 83 175 45 8,8 20,8 56,7 145 N de clulas na confluncia 6x106 2x107 4,5x10 107 2,2x106 5,2x106 1,4x10
7 7

Inculo para utilizar ao 3 dia 1,2x106 P 4x106 P 9x10 P, 4,5x106 I

6

106 I 2,2x105 I 5,2x105 I 1,4x106 I 3,6x106 I

3,6x107