Pyrogen

Pendahuluan Pada awal abad ke 20 demam sering terjadi (suatu komplikasi) yang sering terjadi saat pemberian iv temperatur tubuh sering naik. Pyrogenik. Pyro = keadaan yang berhubungan dengan panas. Gen = Membentuk (menghasilkan). Pada tahun 1923 Seibert membuktikan bahwa pyrogen adalah substansi yang: Tidak tersaring Thermostabil Non Volatile.

Pada tahun 1937 Co Tui membuktikan bahwa kontaminasi pyrogen ini juga terjadi pada alat-alat seperti wadah-wadah untuk melarutkan obat suntik, juga pada zat kimia yang digunakan sebagai zat berkhasiat. Pirogen adalah suatu produk mikroorganisme, terutama dari bakteri gram negatif dan dapat berupa endotoksin dari bakteri ini. Endotoksin ini terdiri dari suatu senyawa komplek yaitu terdiri dari suatu lipopolysaccharida yang pyrogenic, suatu protein dan suatu lipid yang innert. Sumber pyrogen ini bermacam-macam seperti : dari pelarut dari obat itu sendiri peralatan karena metoda penyimpanan.

Pyrogen berbahaya bila : a. Injeksi volume besar akan mengandung pyrogen yang besar pula. b. Injeksi Volume besar (infus). Biasanya diberikan Intra vena efek cepat. c. Infus untuk pasien gawat, bila terjadi penaikan suhu badan bisa berakibat fatal.

Sifat-sifat pyrogen : a. Thermostabil proses sterilisasi > 2000 C. b. Larut dalam air. Tidak bisa memakai penyaring bakteri. c. Tidak dipengaruhi oleh bakterisida yang biasa. d. Tidak menguap, destilasi biasa ada yang ikut bersama percikan air e. Berat molekul (BM) antara 15.000 4.000.000 f. Ukuran umumnya 1 50 m, yang dapat ditentukan secara dialisa).

Penentuan pyrogen Pyrogen atau pyrogenitas a. Penentuan pyrogen secara fisiko kimia. (kuantitatif pyrogen) 1. Dengan fotokolorimetri, reagen Tetrabrom phenolphtalein. (TBP). Dengan penambahan asam acetat 0,2 N, sehingga timbul warna. 2. Polarografi. Pyrogen mepunyai panjang gelombang maksimum oksigen pada polarografi. 3. Elektroforesis. 4. Spektrofotmetri. Pyrogen mempunyai absorbsi spktrum ultraviolet pada E maksimum 265 m. b. Penentuan pyrogen secara biologis (kwalitatif dari pirogenitas). Tahap : i. Pengujian pengukuran temperatur badan hewan percobaan.

Persiapan : Hewan percobaan : Efek pyrogen tidak hanya ditentukan oleh pyrogen itu, tetapi juga oleh spesies penerima injeksi. Hewan percobaan : Kelinci himalaya putih (sensitifitas tinggi terhadap pyrogen) Tempat penyuntikan I.V. pada telinga kelinci Syarat (Ph. Ind. III): Kelinci yang digunakan, haruslah selama seminggu sebelum pengujian tidak menunjukkan penurunan berat badan . Kelinci yang tidak dapat digunakan adalah : a. Tiga hari sebelumnya telah digunakan untuk uji pyrogenitas dan hasil negatif. b. Tiga minggu sebelumnya telah digunakan untuk uji pyrogenitas, tidak memenuhi syarat. c. Telah digunakan kapan saja untuk uji pyrogenitas dan respon rata-rata kelompok kelinci melebihi 1,20. Alat : Termometer yang dipakai ketelitian 0,1 cm. Jarum terbuat dari kaca atau bahan lain yang cocok, tahan pemanasan 2500. Sediaan Uji : zat uji diencerkan dengan larutan NaCl P steril bebas pyrogen.
0

dan dapat memasuki dubur kelinci 5

Prosedur Kerja

1. kelinci dimasukkan ke kotak dengan penahan leher yang cukup longgar, badan bebas, kelinci dapat duduk dengan bebas. 2. Uji pendahuluan : Satu sampai tiga hari sebelum pengujian, suntik kelinci masing-masing dengan 10 ml/kgBB dengan larutan NaCl P steril bebas pyrogen. Ruang harus tenang, di ruang dengan perbedaan terhadap

temperatur pemeliharaan tidak boleh lebih dari 3 0C. 1 malam hingga pengujian selesai kelinci tidak diberi makan dan selama waktu pengujian tidak diberi minum. Catat temperatur badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimulai 90 menit sebelum penyuntikan hingga tiga jam sesudah penyuntikan dengan larutan NaCl P steril bebas pyrogen. Kelinci yang menunjukkan beda temperatur lebih besar dari 0,6 0C tidak dapat digunakan untuk pengujian utama. 3. Pengujian utama. 1 kelompok hewan percoban terdiri dari 3 ekor kelinci. Hangatkan sediaan uji hingga temperatur 38,5 0C. Suntikan perlahan-lahan ke dalam vena auricularis tiap kelinci. Lama penyuntikan tidak lebih dari 4 menit dan volume sediaan uji tidak kurang dari 0,5 ml dan tidak lebih dari 10 ml per kg bobot badan. Jika gagal, ulangi pengujian hingga 4 kali, tiap kelompok uji terdiri dari 3 ekor kelinci. 4. Penafsiran hasil.

 Temperatur

awal

adalah

temperatur

rata-rata

pembacaan

temperatur dengan interval 30 menit dan dilakukan 40 menit sebelum penyuntikan sediaan uji. Temperatur maksimum adalah temperatur tertinggi yang dicatat selama 3 jam setelah penyuntikan sediaan uji. Catat suhu badan kelinci dengan interval tidak lebih dari 30 menit dimula 90 menit sebelum penyuntikan hingga 3 jam setelah penyuntikani. Selisih temperatur awal dengan temperatur maksimum tiap kelinci dinyatakan sebagai temperatur respon. Jika temperatur respon negatif, dianggap nol. Kelinci memenuhi syarat. Bila antar kelinci perbedaan suhu awal tidak lebih dari 10 C.

Kelinci tidak memenuhi syarat: Perbedaan temperatur awal lebih besar dari 0,2 0C. Temperatur awal lebih kecil dari 38,0 0C dan tidak lebih besar dari 39,8
0

C.

Sediaan uji dinyatakan memenuhi syarat : Jika jumlah respon tidak melebihi kolom 2 dan dinyatakan tidak memenuhi syarat jika jumlah respon melebihi kolom 3 untuk tiap kelompok. Jika jumlah respon terletak antara kolom 2 dan kolom 3, pengujian diulangi. Jika pengujian keempat jumlah respon melebihi 6,60 C sediaan uji dinyatakan tidak memenuhi syarat. Tabel 2. Persyaratan hewan untuk uji pyrogenitas

Sediaan uji memenuhi Jumlah syarat bila respon tidak kelinci 3 6 9 12 melebihi 1,20 2,80 4,50 6,60 jika jumlah respon melebihi 2,7 4,30 6,00 6,60 Sediaan uji tidak memenuhi syarat

ii. Perhitungan sel darah putih. Injeksi obat suntik yang mengandung pyrogen pada pembuluh balik darah kelinci akan menyebabkan terjadinya perobahan sel-sel darah putih. Mis ; penurunan lympocyte dan menaikan neutrophyls. ini menjadi terhadap adanya aktivitas pyrogen. iii. Test limulus. Prinsip : pengumpalan ekstrak cair sel darah kepiting ladam kuda (limulus polyphemus) dengan adanya pyrogen. Limulus poliphemus, Cairan limpha atau darahya mengandung 1 jenis sel-sel yang beredar dan disebut Amoebocyten. Amoebocyten mudah hancur dan mengandung protein yang dapat menggumpal (Procoagulantin). Tahun 1885, Howelel menemukan sifat-sifat koagulasi dari limulus lysate ini diteruskan oleh Loeb. Beberapa tahun berikutnya, Bang, dkk, memperlihatkan bahwa indikator

bakteri gram negatif bereaksi dengan darah intravascular kepiting

tersebut dan ekstrak sel darah dari kepiting sangat sensitif terhadap endotoksin bakteri gram negatif. Levin Bang dan Reinhold Fine adalah yang pertama kali menulis metoda in vitro untuk penentuan endotoksin berdasarkan kerja Bang. Metoda LAL Test LAL test merupakan metoda yang sensitif untuk penentuan endotoksin bakteri gram negatif atau lipopolisakharida (pirogen), dimana lipid A dari molekul endotoksin dapat memberikan reaksi menjadi gel dari limulus lysate. Ada kecocokan atau persamaan hasil antara LAL dengan test kelinci.

n
LIPID A CORE O-SPECIFIC ANTIGENIC CHAIN LIPOPOLYSACCHARIDE

Keterangan: = asam lemak = glukosa = fosfat = senyawa yang mengandung fosfor

 Gambar 25. Struktur dari pirogen

Penghilangan Pyrogen Beberapa metoda : 1. Cara destilasi 2. Cara pemanasan 3. Cara penyerapan 4. Cara depyrogenasi 5. Dengan penukar ion 6. Dengan gamma radiasi 7. Getaran ultrasonik. 1. Cara penyulingan. Untuk membebaskan air dari pyrogen. a. Destilasi biasa destilasi bertingkat (penyulingan dikerjakan beberapa kali) dengan alat destilasi tertutup. Dapat ditambah 0,5% KmnO4, pemutih). Alat-alat destilasi dibuat dari kaca netral atau wadah logam yang cocok, yang dilengkapi dengan labu percik. Dengan alat dipasang sedemikian rupa guna mencegah terbawanya titik-titik air pada waktu penampungan destilat. Cara : Labu diisi 2/3 kali Volume labu suling. 100 ml hasil suling dibuang, hasil selanjutnya ditampung. Menurut Stich, uap panas selama 10 15 menit dibiarkan melalui alat pendingin tanpa didinginkan untuk mensterilkan alat. Saat 1/10 dari volume awal penyulingan dihentikan karena kandungan kotoran yang tinggi. semakin baik kualitas air yang disuling,semakin baik hasilnya. Beberapa farmakope mensyaratkan menggunakan air minum untuk bahan baku. Sesudah 0,5% NaCLO (Bubuk

penyulingan selesai, bila tidak segera dipakai disterilkan dengan cara sterilisasi A atau C. Kekurangan : Mahal, karena hasil yang diperoleh sedikit, dengan energi yang terpakai besar. 2. Cara pemanasan a. Untuk Larutan (Pyrogen thermostabil ) 6 8 jam pada suhu 1200 ( Autoclave) 30 menit 1 Jam 1400 (Autoclave ).

b. Dalam keadaan kering. Untuk alat-alat dan bahan yang tahan pemanasan : Dipanasi selama 30 menit 2500 C. Atau dipanasi 2 jam 2000 C.

3. Cara penyerapan Penghilangan pyrogen dengan cara adsorpsi menggunakan filter asbes aktif, atau carbon aktif. Pelaksanaannya dapat dibagi : a. Berbentuk saringan. menggunakan penyaring yang terbuat asbes aktif, norit aktif dsb. b. Menambahkan bubuk. Larutan yang mengandung pyrogen ditambah dengan bahan-bahan adsorben dalam bentuk bubuk,kocok beberapa waktu,saring, Dapat dipakai penyaring bakteri, dan kertas saring rangkap, atau keduanya untuk menghindari kebocoran carbo adsorben. Adsorbensia yang biasa digunakan adalah : Carbo adsorben . ditambahkan 0,1 0,3 % Norit aktif, panaskan pada suhu 60 700C. kocok 5 sampai 10 menit. Saring dengan kertas saring rangkap dua. Filtrat

pertama dibuang, selanjutnya ditampung bisa juga memakai penyaring bakteri. Asbes aktif . tambahkan 1% asbes aktif, kocok 20 menit, kemudian disaring. Bahan adsorbensia lain Kieselguhr Silika Kaolin dan lain sebagainyaAdsorben yang bersifat ionik seperti ; Ca3(PO4)2 dan CaSiO4. 4. Cara depyrogenasi . Memakai oksidator dan golongan asam / basa kuat . a. Golongan oksidator . KMn04. Untuk alat-alat gelas. Cara : Alat gelas dimasak dalam larutan KmnO4 0,1N, dalam suasana asam/basa, bilas dengan steril bebas pyrogen. Keringkan,panaskan pada suhu 2500C, selama 1 jam. b. Larutan bikhromat . Larutan Natrium/Kalium bikhromat dalam H2SO4 pekat, Untuk sterilisasi alat-alat. Cara : Alat-alat direndam selama satu hari dalam larutan bikhromat,bilas dengan air steril bebas pyrogen, panaskan 1 jam 160 1800C. Atau rendam dalam larutan bikhromat 1 jam pada suhu 700C. c. H2O2 untuk larutan yang tidak terurai oleh H2O2.

Cara: Larutan dididihkan selama 1 jam 15 menit, tambahkan H2O2 0,1% Larutan mengandung 0,03 0,003% H2O2, dinginkan sampai suhu 900C. Kemudian ditambahkan karbodsorben atau MnO2 untuk menghilangkan kelebihan H2O2. d. Golongan Asam/basa kuat . NaOH atau Na3PO4, untuk alat-alat gelas. Cara: Alat direndam dalam larutan asam/basa kuat selama1 hari atau dipanaskan pada suhu 700C selama 1 jam bilas dengan aquadest steril bebas pyrogen, keringkan. e. Dengan penukar ion Biasanya digunakan penukar ion dari jenis anion. Misalnya campuran dari berjenis-jenis amberlite. f. Gamma radiasi . Pyrogen dinonaktifkan oleh ionic radiasi. misalnya untuk Plasma. g. Getaran Ultrasonik. dapat menonaktifkan pyrogen. Substan dan preparat yang harus bebas pyrogen . a. Air untuk injeksi . b. Larutan infus . c. Antibiotika d. Garam asam organik (Calcium glukonas) e. Produk-produk hewani Chorionic Gonadotropin

f.

Gelatin (sebagai pengganti plasma). Heparin .

Obat tetes dan substansi lain, yang diberikan IV untuk maksud diagnostic. Inulin - Indigocarmin - Conggored , dsb.

g. Produk-produk darah . Human albumin .