04

Oxidacin Microbiolgica de Alcoholes por
Nocardiacorallina
8.276
n . ..
QUE PARA
OBTENER EL GRADO
DE:
DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS
HERMINIA INES PEREZ MENDEZ
MEXICO. O. F.
NOVIEMBRE D E 1998
EL DOCTORADO EN CJENCIAS BIOLGJCAS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA

METROPOLITANA EST INCLUIDO EN EL PADRN DE EXCELENCIADELCONACyT
POSGRADOS DE
Y ADEMSCUENTA
CON APOYODEL
MISMO
CONSEJO, CON EL CONVENIO NMERO PFP-200-93.
El jurado designado por las Divisiones de Ciencias Biolgicas y de la Salud de las Unidades lztapalapa y Xochimilco aprob la tesis que present:
Q.1. HERMlNlA INS PREZ MNDEZ.

"I
' x
:
'.)
El da 10 de Noviembre del ao de 1998
V '
Comit Tutorial:
" 1
Tutor: DR. HECTOR MANUEL LUNA CONTLA.
Asesor: DR. ANGEL HORACIO SANDOVAL Y TRUJILLO
Asesor: DR. LUIS ANGEL MALDONADO GRANIEL
Dedicatoria: A mi madre: Elisa Mndez Vda. de Prez
A la memoria de mi padre: Dionisio Prez Capdevila

A mi esposo Norbert0 que tuvo un sueo y lo pude hacer realidad, gracias a su apoyo, paciencia y conocimientos para alcanzar esta meta. A mi suegra: Carmen Alvarez Vda. de Manjarrez A la memoria de mis abuelos: Eleuterio Prez Vega y Herminia Capdevila de Prez
A mis hermanos: Eleuterio, Betty y Alejandro

Amis sobrinos: Dionisio, Ivan, Carlos, Celeste, Ariadna, Anah, Kathia, Alejandra, Adhara, Alfredo, Ernesto, Angel, Luis Angel, Eduardo, Toms, Mara del Carmen y Mara Dolores. A mis cuadas: Josefa, Rosa, Carmen, Dolores, Rosario y Silvia. A mis cuados: Angel, Toms, Luis Angel y Miguel A mis tios, tias y primos A mi comit Tutorial: Dr. Hctor Luna, Dr. Maldonado A mis sinodales: Dra. Ahide Lpez y Dr. Hctor Jaime Salgado Horacio Sandoval y Dr. Luis Angel
Pginas
RESUMEN ABSTRACT 1
3
5 OBJETIVOS: GENERAL Y ESPECFICOS ANTECEDENTES -Biotransformaciones -Oxidaciones microbiolgicas -Oxidaciones qumicas -Descripcin morfolgica de Actinomicetos Nocardia -Inmovilizacin de Clulas 8 15 19 23 28 31
PARTE EXPERIMENTAL
41 68 99 102 104 105 113 118
RESULTADOS Y DISCUSI~N
CONCLUSIONES PERSPECTIVAS RECONOCIMIENTOS BIBLIOGRAFA ARTCULOS PUBLICADOS RECONOCIMIENTOS Y PREMIO
RESUMEN
La oxidacin en el campodelaqumicaorgnicaindustrialconstituyeunadelas principales herramientas la en sntesis compuestos de orgnicos uno y de mtodos con mayor potencial de contaminacin, por los
lo anterior eventuales
desarrollos de metodologas alternas como las oxidaciones microbiolgicas siempre sern bienvenidas.
El objetivo principal del presentetrabajoesestudiar
el espectroyalcancedela
oxidacin microbiolgica de alcoholes porNocardia corallina B-276.
Se sometieron a la biooxidacin 43 substratos con Nocardia corallina B-276, a una escala de 1mmol;deloscuales, producto dichas debiotransformaciones 21 fueron dealcoholesbenclicosprimarios. fueron El
los
cidos carboxlicos
correspondientes, y una cetona con rendimientos del 5 al 77 %. Por otro lado, de los
5 alcoholes allicos solamente dos produjeron los cidos,

57 %; los tresrestantes fueron heterocclicos,de
en rendimientos del 25 al
no fueron biotransformados.Dentro de lossubstratos 4

los cuales solo
el alcoholfurfurlicoseoxido
al cido
furoco en un rendimiento del 51 O , y los otros tres no fueron biotransformados. h Tambin se incluyeron 4 aldehdos, en estos casos todos cidos carboxlicos en rendimientos del 33 al 71 %. ellos produjeron los
Entrelos
alcoholes norelacionadosestructuralmente,
el 2-naftilcarbinol y el cis19 y 71 % de rendimiento,
verbenol produjeron los productos esperados en respectivamente.
De los
7 dioles que
se probaron, soiamente de uno
ellos produjo lactona la
esperada en 42 YOde rendimiento.
Todos
los
productos fueron
purificados (cristalizacin o
cromatografa)
caracterizados por: pf, espectroscopia de IR, RMN-H (comparndolos con muestras estndar).
Estetrabajomuestrala
versatilidad y limitaciones de laoxidacindealcoholes viabilidad de sta
benclicos y allicos con la Nocardia coralina B-276 as como la metodologa,ya que se puede partirindistintamentedel
alcohol o del aldehdo,
conduciendo a resultados reproducibles.
Adems se describen estudios iniciales de la inmovilizacin de

corallina B-276 en alginato de bario
clulas de Nocardia
y su utilizacin en la oxidacin microbiolgica
descrita anteriormente, substrato.
para estos estudios
se uso al alcohol furfurlico como
ABSTRACT.
Oxidation is one of the main tools
in the synthesis of organic compounds and it is potential forenvironmental pollution, for that
also one of the methods withmore
reason new methodologies, as microbial oxidation, are always welcome.
The main objective of this work is the determination of the
scope and limitations of
the microbial oxidation of alcohols by Nocardia coralha B-276; in order to do these 43 substrates were selected: 21 primary benzylic alcohols,
5 allylic alcohols, 4
heterocyclic alcohols, 4 aldehydes,2-naftol,cis-verbenol scale. For the primary benzylic alcohols, the products the corresponding carboxylic acids, the with exception corresponding ketone, with yield ranging from 5 to 77 O . h
and 7 diols, in a lmmol
of the biotransformation were one that produced the
For the
allylic alcohols tested, only two
of them gave the carboxylic acid in yields
around 25-57 %; the other three were biotransformed. not heterocyclic compounds, only
In the case
of the furoic
furfurilic alcohol was successfully oxidized to
acid in 51 % yield; the other three were not biotransformed. The aldehydes produced carboxylic acid in yield from 33 to 71 %.
2-naftol and cis-verbenol, non-structurally related to benzyl alcohol, were oxidized to the expected products in 19 and 71 % yield, respectively.
For the diols only one produced the expected lactone in 42 % yield.
All products were purified (by crystallization or chromatography) and characterized
by: mp, IR and 'H-NMR spectroscopy (by cornparation with authentic samples).
This work shows the versatility and limitations of the microbial oxidation of benzylic and allylic alcoholswithNocardia
corallina B-276,aswellasthe
viability ofthis used asstarting
methodology, because eitherthealcoholorthealdehydecanbe materials, obtaining reproducible results.
It also describes the initial work in the study of immobilization of the cells of Nocardia
corallina B-276 withbariumalginateandits
application to the microbial oxidation
described above. In these studies thefurfurilic alcohol was used as substrate.
La creciente preocupacin la por proteccin
del ambiente, ha impulsado a la si no esque,no,
investigacin hacia la generacin de procesosqumicosmenos, contaminantes. Como un ejemplo problemtica de esta
estn los procesos
oxidativos, los cuales generan grandes cantidades de residuos difciles de manejar o eliminar; muchos agentes oxidantes estn basados en iones metlicos txicos como el cromo. Reacciones laterales no deseadas este en tipo comunesdebido oxgeno molecular, a supobreespecificidad. de conversiones son e inocuo oxidante, el
El ms barato
no puede ser usado eficientemente, por
lo cual se hace
necesario el uso de catalizadores metlicos,los cuales son generalmente costososy contaminantes. Es altamente significativo el hecho de que existenpocos ejemplos de oxidaciones regio- ylo estereoselectivas.
creado la Por lo anterior se ha
inquietud de generar procesos oxidacin de
biocatalticos, por las ventajas que estos ofrecen. Entrelos mtodos biocatalticos, el uso microorganismos posiblemente de es procesos oxidativos, debidosistema al poseen. el ms adecuado para utilizarse en natural de reciclaje de cofactores que
Una aplicacin interesantede la metodologaantesmencionada bacteria Nocardia corallina, reportada Luna por et al,"*
es el uso de la
para la oxidacin de
alcoholes allicos. Lo anteriornosindujoaestudiar
el efecto de la estructurade
alcoholes allicos y benclicos sobre el proceso de oxidacincon Nocardia corallina. Conbase en lo anterior fue pertinenteampliartambin el estudioadioles no
simtricos y depreferenciadenaturalezaqumicadistintacomosera,alcoholes primarios y secundarios. Recientemente Morimoto3 estudi la formacin de lactonas a partir de dioles no simtricos con NaBrO2-almina en fase heterognea y encontr la oxidacin preferencial del alcohol primario sobre el secundario, para el caso de
1,6-dioles. Lo anterior nos motivo a considerar este tipo de substratos, para estudiar el alcance y limitaciones las de condiciones de
corallina.
la biooxidacin con
Nocardia
Con la finalidad de facilitar el manejo de este tipo de biotransformaciones se aplicadoprocedimientosdeinmovilizacin de lasclulas
han
m i ~ r o b i a n a s ,esta va ~'~ la reutilizacindelas la
permite una mejormanipulacindelabiomasa,ademsde clulasinvolucradas en el procesooxidativo.
Lo anteriornosllevoaestudiar
inmovilizacin de Nocardia corallina y los parmetros necesarios para reproducir la bioconversin en estas nuevas condiciones, y posiblemente sentar las bases para un eventual desarrollo biotecnolgico de aplicacin a escala industrial.
OBJETIVO GENERAL
Estudiar el espectroyalcancedelaoxidacinmicrobiolgica
Nocardia corallina -276. B
de alcoholespor
OBJETIVOS ESPECFICOS
a) Estudiar el efecto de la estructura de diferentes substratos en la oxidacin de alcoholes allicos y benclicos con Nocardia coralha.
b) Estudiar la regioqumica y estereoqumica en la oxidacin de dioles para producir las lactonas correspondientes.
c) Analizar los resultados alcanzados y estructurar una propuesta de metodologa, incluyendo los alcances y limitaciones del proceso.
ANTECEDENTES
Para el desarrollo de este proyecto dentro de las Ciencias Biolgicas,se requiere de la convergencia de varias disciplinas como son: la qumica orgnica, la microbiologa
y la qumica analtica. Por lo que se estimo de suma relevancia el tener una base de
conocimientosgeneralessobreestostemasquenos
permitieran desarrollarlas
mejores estrategias para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo.
BIOTRANSFORMACIONES
,-,
7
f .
f ' :, < /
1
r- :.
3
:: : ,. . Y
'
%
L
Biotransformacin, bioconversin, conversin microbiolgica microbiolgica esconversin una la de substancia qumica (substrato) substancia(producto)por
o transformacin T,'_
'
a otra el
in
I *
L
L.
un microorganismo.8 En estasreaccionesenzimticas
I-. t
1
substrato puede ser metabolizado,peroenalgunoscasoslaconversin lugarsingananciadeenerga(comensalismo).Unproceso
puede tener
, ' .. -
industrial puede ser
llevado a cabo por mtodos qumicos tradicionales o por bioconversin, sta ltima opcin presenta las siguientes
ventaja^:^"^
- Especificidad
desubstrato:unaenzimainteractua
o acepta un limitadonmero
de substratos, generalmente relacionados estructuralmente.
Especificidad de sitio (regioespecificidad): Si existen en la molcula varios
grupos funcionales de un tipodeterminado,lasenzimassolamenteafectanuna posicin especfica.
Estereoespecificidad: Si se utiliza una mezcla racmica material como de un enantimeroconvertido. es

A tener un centro quiral, I
partida, solamente
como resultado de reaccin la enzimtica, pticamenteactivo.
e l
producto normalmente
es
- Condiciones
la destruccin de conversin.
de reaccin suaves: reacciones Las enzimticas de los substratos sensibles, debido
no causan
a las suaves condiciones causan menos
Los medios usados en este tipo de reacciones
dao al ambiente, ya que el disolvente es generalmente agua.
Procesos Industriales de Biotransformacin Microbiana
En una conversin microbiana de compuestos orgnicospueden ser utilizados como biocatalizadores: sistemas de esporas; cultivos de clulas en crecimiento; clulas en reposo; y clulas inmovilizadas. En los procesos con cultivos en crecimiento, la cepa utilizada se cultiva en un medio adecuado y despus del crecimiento del cultivo se aade una solucin concentrada substrato. variante de Una del procedimiento
anterior es utilizar un inoculo muy grande y aAadir el substrato inmediatamente, sin permitir un perodo de crecimiento.
Para la biotransformacin de materiales hidrofbicos es posible emplear un sistema polifsico. A la fase acuosa, que contiene el material celular o la enzima, se superpone una fase inmiscible en la que seha disuelto el substrato. El substrato pasar lentamente a la fase acuosa y a medida que contina la biotransformacin se producir lentamente el producto y este regresar al disolvente. En algunos casos la biotransformacin se produce en la interfase.
El tiempo de la bioconversin est generalmente relacionado al tipo de reaccibn, la concentracin del substrato y el microorganismo utilizado. Las reacciones de oxidacin que utilizan bacterias frecuentemente son concluidas en horas; las conversiones con levaduras varios das. unas pocas
y especialmente con hongos pueden llevar
Las reacciones de biotransformacin en equipo de gran escala condiciones estriles en fermentadores agitados conversin monitoreado por cromatografa
se llevan a cabo en
y aireados, siendo el proceso de
o espectrofotomtricamente. El proceso
termina cuando se alcanza un ttulo mximo del producto esperado. La esterilidad
10
del sistema necesaria es porquecontaminacin la
puede suprimir reaccin la
deseada, inducir la formacin de falsos productos de biotransformacin o producir la degradacin total del substrato o producto.
Los productos finales dereacciones las
de transformacin microbiana son
normalmente extracelulares y pueden encontrarse disueltos o en suspensin en el medio de la reaccin. Para el procesamiento adicional generalmente no se separan las bacterias ni las levaduras, mientras que el micelio de los hongos generalmente es eliminado por filtracin. En todos los casos el material celular separado debe ser lavado repetidamente agua con
o con disolventes orgnicos, ya

pueden
que parte
significativa de los productos la dereaccin celulas.
estar adsorbidos las en
Una transformacin microbiolgica es diferente a una fermentacin y un resumen de

las diferencias se muestra en la tabla 1.
11
Tabla 1: Diferencias entre Siotransformaciones y Fermentaciones Botransformaciones Fermentaciones Microorganismo Reaccin reaccin Materias primas Cultivos en crecimiento, clulas en reposo, o clulas inmovilizadas Reaccin cataltica sencilla (uno o varios pasos) Corto Tiempo de Substratos caros Cultivos en crecimiento
Producto Naturales o no naturales Fcil Aislamiento del producto Cantidad de enzimas activas Pocas Pocos Subproductos Alto Concentracin del producto
Proceso vida de (secuencia de reacciones multipasos) Largo y carbn Fuentes de nitrgeno baratos Solamente naturales Tedioso Muchas Muchos Bajo
Labiocatlisisaplicadaa
la sintesisorgnicaes
un readeinvestigacin
bien
definida la cual esta teniendo gran un auge; diferentes libros126
y revisiones
b i b l i o g r f i ~ a s ~se ~ ocupado de esta temtica. La biocatlisis se efecta con ~ han clulas completas de animales,20-22 plantas23-26 o microorganismos.27-30a,31 Tambin se han purificado, a diferentes niveles, algunas de las enzimas presentes materialesparausarsedirectamente en estos
en transformacionesqumicas. En ocasiones
estas enzimas se han utilizado en medios de reaccin y con objetivos alejados a su capacidad de transformacin biolgica natural. Como es de esperarse, al purificar
las enzimas el costo aumenta pero ello conlleva a otros beneficios, actualmente se dispone de una amplia variedad de stas macromolculas de manera
12
Las enzimas se agrupan de acuerdo
al tipo especfico de
reaccin que ellas son
33 capaces de catalizar y tradicionalmente se dividen en seis clases:
Oxidoreductasas: a) catalizan reacciones oxido-reduccin, de involucrando oxigenacin, o remocin o adicin de tomos hidrgeno de a hidrocarbonado. b) Transferasas: transferencia de grupos acilos, como glucosilo, fosfatos y equivalentes de aldehdos y cetonas de una molcula a otra. c)Hidrolasas: el rangodegruposhidrolizadosporestasenzimasesmuyamplio, incluyendo anhdridos,amidas, y glucsidos, steres,pptidos otras funcionalidades que contienen el enlace C-N. d) Liasas: estas enzimas catalizan adiciones usualmente de tambin catalizan el proceso inverso. e) Isomerasas: pueden efectuarse estas con enzimas isomerizaciones varias incluyendo migraciones ligaduras, dobles de isomerizaciones racemizaciones. un esqueleto
H-X a dobles enlaces y
cis-frans
Ligasas:estasenzimastambinllamadassintetasas,medianlaformacinde
enlaces C-O, C-S, C-N, C-C y enlaces de steres de fosfatos.
Las enzimas de las clases a,b,c,y d son las ms usadas en sntesis. Las reacciones de oxidacin son particularmente tiles en la industria.
Por otro lado las tcnicas de biologa molecular estn abriendo nuevos horizontes, por ejemplo el desarrollo enzimas de artificiales nuevas con caractersticas,
0
simplemente el rediseo de enzimas por la tcnica de mutagenesis directa permite la alteracin de la estructura de la enzima original;
los mtodos modernos
de
secuenciasdeprotenasycristalografaderayos determinacinla de estructura tridimensionalla de enzima clonacin del gen responsable de sntesis la de
Ochrobacfrurn anthropi en Escherichiacoli
X soncapacesdeapoyarla m ~ d i f i c a d a . ~La ~ la D-aminopeptidasa de es un ejemplo de comolaactividad
enzimticapresenteen
un microorganismopuedeserincrementadapormuchos
ordenes de magnitud y la concentracin del producto requerido es mayor.35 Se sabe quealgunas de estasclasesdeenzimasrequierencofactores
o coenzimas, los
el
cualessoncostosos,difcilesdeconseguir,conservar,yquehacenpreferible emplear la clula completaI2tales el casodelasoxidoreductasas.Centraremos
estadiscusinalrededordeestetipodeenzimas(oxidoreductasas)
ya quees el
objetivo de esta tesis. En estos casos las clulas mas comnmente utilizadas son las de los microorganismos, los cuales utilizan sucomplejamaquinariadeenzimasy coenzimasdurantesuciclometabliconormalytransforman al substratoen el
marcodesumetabolismosecundario.Sehaninformadoejemplosdeaplicacin industrial haciendo uso de esta idea para lograr interesantes biotransformacione~,~~ siendo en el campo de productos qumicos finos (farmoqumicos e intermedios) la
13
hidroxilacin de progesterona a 1la-hidroxiprogesterona por Rhizopus arrhzus y R.
ngricans reportado por Peterson y Murray un excelente e j e ~ p l o , ~ ,yaqueste ~~

paso sinttico simplific e hizo realidad la preparacin, a muy costo, bajo de
hormonas corticosteroides y varios de sus derivados, llevando el precio de cortisona de US$200 a US$6 por gramo y a la fecha solamente US$ 1 por gramo.34b
OXIDACIONES MICROBIOL~GICAS
Dentro del amplio campo de la biotecnologa, enzimas, ocupa una parte importante
el uso de los microorganismos o sus un rea que se est
y es a la fecha
desarrollando rpidamente. La oxidacin con microorganismos tan viejacomo la humanidad,siendo
es una metodologa
la produccin de vinagre el ejemplo ms
antiguo y ms conocido (hay datos de su uso y obtencin desde 2000 aos A.C. por los b a b i l o n i ~ s ) . ~ ~ ~ un Este campo investigacin ltimamente ha es de que se revitalizado, debido al incremento en el control de la contaminacin ambiental y a la posibilidad de realizar sntesis asimtrica con biotransformaciones. el empleo tipo de de este
Lasaplicacionesdelasbiotransformaciones los substratos polifuncionales. pueden
en rea muy esta son variadas
ir desde hidrocarburos molculas hasta complejas
15
En todos estos casos la funcionalizacin (oxidacin) y la estereoqumica generada son factores estudio de inseparables regio
y lo estereoespecificidad
busca sesiempre
la
mayor
posible; manera a de ejemplo se puede la cual el la uso
mencionar el caso de de
la
epoxidacin de alquenos en
c o d i s ~ l v e n t e s ~ ~ modificar pueden substancialmente
estereoqumica
Nocardia
producida. Pseudomonas oleovorans, Methylococcus sp.

coralhna 8-276 y Brevibacterium sp.
CRL MI, se cuentan
CRL 61,
entre los
microorganismos ms
utilizados
para
este al
tipo biotransformacin, de epoxidar: 1-deceno, el de uso la un oxidacin
que, lograr ademsestereoespecificidad de tetradeceno algunas qumica

un
1-
propileno
respectivamente, evita se
y
sales inorgnicas tradicional,
perxidos usados en
los cuales constituir pueden

personal involucrado.
riesgo ambiental y
peligro para la seguridad del
oxidaciones Ejemplos de microbiolgicas son:
la
oxidacin de
o
cadenas laterales alifticas con formacin de aldehdos, cetonas carboxilo; la conversin den-dodecilbenceno
funciones
al cido fenilactico por Nocardia
sp.
con un 80
O h
conversin; de degradacin las la oxidativa de ejemplo por la conversin del I-fenildodecano al
cadenas laterales,
cido 2-hidroxifenilactico por Nocardia opaca Stamm TI6 o al cidofenilactico por Nocardia opaca P2 con un 67-85
O h
deconversin;
la ruptura oxidativade
16
10s anillos aromticos por conversin ejemplo la

saliclico por
del sp.
naftaleno con
al
cid0 de
Corynebacterium
(ATCC 15570)
un 70 ?41
conversin; oxidativa ruptura la de substituyentes (desaminacin oxidativa, desmetilacin grupos: de

O-CH3 o N-CH3), un ejemplo la es transformacin de
1O, 11-dimetoxiamorfina
(ATCC 9245) con
isocapocodena por
Cunninghamella blakesleana
un 100 %
conversin; grupos de oxidacin la de a grupos formacin nitro; de N-xidos el 2-amino-4-alquilimidazol deshidrogenacin la de glaucina con un 60 % de conversin; al y 2-nitro-4a la
heterofuncionales (grupos amino sulfxidos), ejemplo por alquilimidazol por dihidroglaucina por hidroxilacin de triptofano
Streptomyces sp; Fusarium
solani
la
al 5-hidroxitriptofano por
B. subtilis.28 Entre
los
microorganismos que se han utilizado en este campo estn entre otros gneros las,
Pseudomonas,
Nocardia,
Rhodococus,
Acinetobacter,
Xanthobacter,
El Cunninghamella, Chaetomi~m.~' gnero Nocardia hasidoutilizadoampliamente

para la epoxidacin microbiolgica de alquenos, siendo Nocardia corallina la que ha proporcionado los mejoresresultados. 4-7, 41-53 Luna y COI,' informaron el potencial
USO
de los dos primeros microorganismos para transformar alcoholes
alilicos a [os
correspondientesaldehdos/cidos o cetonas,siendo los resultadoscon Nocardia
COra//ina los de mayor inters. El proceso se lleva a cabo en un medio de reaccin

difsico, encontrndose al microorganismo mayormente en la interfase. Este
microorganismo, lo reportado tambin Lunapromovii, por et la oxidacin de
17
dioles a lactonasquirales;logrndoseprepararmaterialesdealtapurezaptica, con la oxidacin preferencial del grupo pro-S. En todos los ejemplos estudiados se utilizaron dioles primarios; es relevante el hecho que, cuando se efectu la oxidacin de un diol protegido, como el monometil ter, la reaccin no condujo a productos de oxidacin,
lo que sugiri la que oxigenasa en
N. corallina no oxida alcoholes
saturados primarios y se presume la necesidad de la presencia de ambos grupos hidroxlicos, en su forma libre, para la mencionada biotransformacin.
Un beneficio de laoxidacinmicrobiolgica
es que facilita la eliminacin y10 el
tratamiento del agua residual de la reaccin, lo cual al final del proceso presenta un menor impacto en el ambiente, sin disminuir la eficiencia qumica de la
biotransformacin.
Aunque por su volumen muchos procesos petroqumicos son an irremplazables, el avance enel uso de microorganismos o enzimasdecualquierprocedencia, en
procesos de bajo volumen de produccin, se hace cadavez estima que en un futuro cercanocon incrementar la escala de produccin.
ms evidente y se
se podr
nuevos desarrollostecnolgicos
La posibilidad deinducirasimetra
en el readesntesisqumicaessinlugar
dudas un reto a la creatividad del qumico y el poder usar los procesos biolgicos de
1s
distintos orgenes o enzimas aisladas, abre una amplia gama de posibilidades cuya exploracin est en franco crecimiento, se estima que tan solo en el campo de las biotransformaciones, aplicadas a los farmoquimicos se estn utilizando ms de
200054enzimas para el desarrollo de procesosconducentes a lapreparacinde
molculas q u i r a l e ~ . ~ ~ nosindica Esto biotransformaciones
el enormeimpacto que tiene el readelas
y se considera muchos que farmoqumicos quirales que
estarn en el mercado para el ao 2000 se obtendrn a travs de sta metodologa.
OXIDACIONES QUMICAS
Es innegable que este tipo de reaccin, es una de las ms empleadas en la qumica

orgnica. Pero a su vez una de las mas complejas; tanto por el nmero de reactivos que se puedan utilizar, comopor la granvariedaddemecanismosdereaccin ya han sido industrial la
involucrados. Algunas de las limitaciones este para proceso mencionadas, sin embargo en el campo la dequmica orgnica oxidacin constituye una de las
principales herramientas en la sntesis de potencial de contaminacin,por lo
compuestos y uno de los mtodosconmayor anterior se estima
que desarrollo de nuevas metodologas alternas siempre sern degruposfuncionalessusceptiblesdeser se revisarn a continuacin el proceso oxidativo;
5637
bienvenidas. Dada lagrandiversidad
oxidados y a los objetivos planteados para sta tesis,
reacciones de oxidacin por tipo de enlace involucrado en
19
manerademarcoconceptualparavisualizarunaeventualcomparacincanlas biotransformaciones estudiadas.
A. Reacciones de eliminacin de Hidrgeno. A.l La aromatizacin alquilciclohexanos, de ciclohexenos
o ciclohexadienos a
derivados del benceno es el ejemplo mas representativo, estareaccin es catalizada por platino, nquel o paladio. A.2 Reacciones de ciclodeshidrogenacin. La formacin de naftaleno a partir butilbenceno sobre catalizadores de almina crmica a proceso.
A.3 La deshidrogenacin alcoholes de a aldehdos
de n-
500 OC: ilustra este tiDo de
y cetonas. Este
tipo de
transformacin se puede llevar a cabo con una gran variedad de agentes oxidantes, tales como:
88 oo
CI
"to4,
Br2, Mn02, el complejo de CrOs-piridina, o el empleo de CuCrOs,
m Z Q rn 2 7 3? ;
plata o cobre
previenen la oxidacin alcoholes de primarios hasta
los cidos
nivel industrialpara
?S 3: j
' IL!
carboxlicoscorrespondientes,
y sonampliamenteutilizadosa
p Fc
"
1;7
0:
laproduccin de aldehdos;algunascetonassepreparan
por esteprocedimientoa el mtodo general
F;5
" i
I:!?
partir de alcoholes secundarios; aunque a escala de laboratorio
ms empleado es el del reactivo de Jones.58 En el caso de alcoholes benclicos se han utilizado compuestos de Ce(lv) para obtener aldehdos. agentes Otros
empleados son la N-bromosuccinimida o la N-clorosuccinimida.
20
La variedad de posibilidades y condiciones de reaccin son muy amplias para este tipo de transformacin qumica.
B. Reacciones que involucran reemplazo de hidrgeno por oxgeno.

B.1 Oxidacin de arilmetanos a aldehdos. Esta transformacin se lleva a cabo por lo general con cloruro de cromilo (CrO2CI2)o conunamezcladeCrOs actico en rendimientos moderados. y anhdrido
8.2 Oxidacin de alcoholes primarios a cidos carboxlicos. La reaccin se puede

realizar con varios agentes oxidantes fuertes, como KMn04 en medio: cido o bsico; en medio cido es preferible el uso de dicromato de sodio o potasio, dado los riesgos inherentes al cido permangnico. En estas condiciones se obtienen cantidades considerables del ster, posiblemente por la oxidacin del hemiacetal formado por la reaccin del aldehdo intermedio con el alcohol de partida. Este procedimiento permite tambin preparar lactonas, por oxidacin de dioles que posean al menos, un alcohol primario; si bien existen otros mtodos para preparar estos steres cclicos.3,56,57
C. Reacciones de adicin de oxgeno a enlaces insaturados.

C.1 Formacin de epxidos a partir de alquenos. Esta reaccin se lleva a cabo con
peroxicidos; con oxgeno y catalizadores organometlicos de titanio59-62 O manganeso.63,64 Es importante mencionarque la reaccin de Sharpless muestrauna
21
alta
induccin asimtrica ciertos con substratos
y que por ello es gran de

a
importancia en qumica sinttica. En carbonilos, cetonas por ejemplo a,P-insaturadas,
el caso dobles de enlaces conjugados se forma el
epxido
correspondiente por la reaccin con H202en medio bsico.
D. Reacciones en las cuales un par electrnico no compartido se enlaza oxgeno. a Si bien existen reacciones de oxidacin sobre tomos de: azufre, nitrgeno, selenio, boro,etc., se seleccion al azufrecomoejemplodeeste dada la importanciade los sulfxidosquirales,debido tipo de transformacin, a suamplia aplicacin en
sntesis asimtrica como intermediarios tiles y en nuestro futuro inters en ampliar nuestro estudio de oxidacin de sulfuros proquirales con Nocardia corallina.
D.l Oxidacin de sulfuros a sulfxidos o sulfonas. Esta reaccin se lleva a cabo con
cantidades controladas de H202 al 30 % con el objetivo de dirigir la reaccin hacia el grupo funcional deseado. sulfona La se oxidantes fuertes como KMn04, o puede obtener directamente cido hipocloroso. Siendo utilizando
de inters la
transformacin estereoselectiva del sulfur0 a sulfxido con agentes oxidantes ms suaves y especficos.
22
DESCRIPCI~N MORFOL~GICA ACTINOMICETOS DE
Los actinomicetos, conforman un grupo amplio y diversos de bacterias, son bacilos
grampositivos con una tendencia caracterstica a formar cadenas o filamentos. Los actinomicetos incluyen cierto nmero de taxones superiores varan que en
morfologa, requerimientos de oxgeno, composicin de la pared celular y capacidad de formar esporas.
El trminoactinomiceto no tiene valideztaxonmicayaqueestosorganismosse

clasifican como bacterias en un sentido estricto y son miembros del orden
Actinomycetales, pero no todos los gneros de los Actinomycetales se consideran como actinomicetos en el lenguaje comn. Los actinomicetos son microorganismos que producen filamentos delgados y ramificados que se desarrollan en un micelio en todos los gneros, excepto el gnero Actinomyces. El filamento del actinomiceto puede ser bastante largo -aunque en algunos grupos es corto- puede fragmentarse y en muchas unidades ms pequeas. Las hifas o filamentos individuales se asemejan morfolgicamente a los filamentos fngicos son pero mucho delgados, ms generalmente de 0.5 a 1.0 pm dedimetro;sinembargo, en algunos gneros las
hifas pueden tener ms de 2 pm de dimetro. Muchos de los actinomicetos del suelo producen sobre sus hifas esporas asexuales, conocidas como conidias, aisladas en
23
paredes o formando cadenas, mientras unos que cuantos habitantes
del suelo
producen sus esporas en una estructura especializada conocida como esporangio.
A pesar de estarcolocadosjunto
con lasbacterias,la
relacin aparentede
los
actinomicetos con los hongos se manifiesta en tres propiedades: a) el micelio de los actinomicetossuperiorestienelasextensasramificacionescaractersticasde los
hongos; b) muchos actinomicetos forman un micelio areo, y c) el crecimiento de los actinomicetos en cultivolquidoraramenteproducelaturbidezasociadaconlas bacterias unicelulares que sino produce formacin filamentos, la de grumos esferas.Porotrapartelamorfologay el tamaodelashifas,lasconidiasy
o
los
fragmentos individuales las de especies micelio segmentacin cuyo sufre son

65 semejantes a las estructuras que se observan entre las bacterias.
Distribucin y Abundancia de los Actinomicetos en la Naturaleza.
Los actinomicetos son numerosos y estn ampliamente distribuidos, no
slo en el
suelo sino en una variedad de hbitats diferentes, incluyendo estircol; fango de los ros y el fondo de los lagos. Se encuentranen la superficie del suelo as como en los horizontes inferiores, aprofundidadesconsiderables. bacterias y a veces En abundancia,siguenalas
el nmero viable de ambos es casi igual. Particularmente, en
ambientes de pH elevado, los actinomicetos constituyen una gran proporcin de la
24
comunidad.Como regla generalsonsaprfitos,aunquealgunasespeciespueden provocar enfermedades a las plantas, animales domsticos e incluso hombre. al
En hbitats sus normales,
los actinomicetos pueden presentarse
en forma de
conidias o de hifas vegetativas y ambas formas pueden originar colonias en medios de agar. Tanto terreno en virgen como terreno en cultivado, actinomicetos los constituyen del 10 al 50 % de la comunidad en alcalinas, total; reas y especialmente cuando hay sequedad, la abundancia alta. relativa es espectacularmente
Se pueden hacer algunas generalizaciones respecto
al papel de las caractersticas
ambientales especficas en la determinacin de la abundancia de los actinomicetos. En comparacin con las bacterias verdaderas, actinomicetos menos los son comunes en reas hmedas que en reas secas. Adems la poblacin es mayor en pastizalesy en suelosdepastoreoqueensueloscultivadosylaabundanciaen campos de cultivo con frecuencia sobrepasa la de los sitios vrgenes adyacentes. Sin embargo desfavorables las son en turberas, las en reas inundadas
y los
ambientes cuyo pH es menor de 5.0; los suelos en regiones climticas clidas son ms favorables para una extensa flora de actinomicetos que los de reas ms fras; el tamao la de comunidad actinomicetos latitudes de en templadas tiende a aumentar conforme se acerca a los trpicos.
25
Taxonoma de los Actinomicetos.
Actualmente se sabe que
los suelos contienen gran cantidad de actinomicetos de
gneros caractersticamente diferentes y estos se pueden dividir en las siguientes familias: I. STREPTOMYCETACEAE. Hifas generalmente no fragmentadas. Extenso micelio areo y cadenas de esporascon
5 a 50 o msconidiasporcadena.Gneros:
Streptomyces, Microeiiobosporia, Sporichthya.

H.
NOCARDIACEAE. caractersticamente Hifas fragmentadas que producen

o
pequeas redondeadas estructuras
elongadas. Gneros:
Nocardia,
Pseudonocardia.
111. MICROMONOSPORACEAE. Hifas no fragmentadas. Conidias aisladas, en pares
o en cadenas cortas. Gneros:
Micromonospora, Microbispora, Micropolyspora,
Thermomonospora, Thermoactinomices, Actinobifida.

IV. ACTINOPLANACEAE.Esporasformadasenesporangios.
El dimetro las de
hifas puede ser de 0.2 a ms de 2.0 blm. Gneros: Streptosporangium, Actinoplanes,
Planobispora, Dactyiosporangium. V. DERMATOPHILACEAE. Los fragmentos hifales se

dividen para formar gran
nmero de estructuras redondas, mviles. Gnero: Geodermatophjim.
26
VI. FRANKIACEAE. Habita lo en ndulos las de races algunas de plantas no leguminosas. No crecen fuera de la planta hospedera. Gnero: Frankia. Vil. ACTINOMYCETACEAE. No producen micelios verdaderos. Por desde anaerobios estrictos a facultativos. Gnero: Actinomyces. lo general son
Aunque en el suelo se desarrollan un nmero razonable de gneros,
tan slo las
especies de algunos gneros predominan sobre las colonias de actinomicetos que aparecensobremediosdeagarinoculadosconsuspensionesdiluidasdesuelo. Casi invariablemente,
Streptomyces predomina numricamente,
con frecuencia
constituye ms del 70 al 90 % de las colonias en la mayora de los medios de agar; raramente es baja su frecuencia relativa, pero a veces
las especies de ste gnero
representan slo el 5 % de los actinomicetos en algunos suelos. Nocardia es, por lo general, el segundo abundante, ms del 10 al 30 % decolonias las de
actinomicetos son nocardias. Las especies de
Mcromonospora son las terceras en

que crecensobre
frecuencia y presentndosedel 1 al 15 O delosactinomicetos h medios slidos miembros este son de grupo morfolgicamente distintivo. Las
especies de Actinomyces se consideran poco comunes y los otros gneros tambin existen en nmero escaso.65
27
Gnero: Nocardia; Morfologa y Coloracin.
Las especies de Nocardia son bacilos grampositivos aerobios parcialmente acidorresistentes.Dentro del gnero la formacindefilamentosylaramificacin
estn muy desarrolladas. Las especies de Nocardia producen filamentos profundos yareos(tambindenominadoshifas
o micelios) de alrededor de
1pm de ancho.
los
Las clulas de los filamentosprofundosseseparan
en formasderosarioy
filamentosareosexperimentanfragmentacinparaproducirclulassimilaresa esporas unicelulares que se dispersan y forman aerosoles con facilidad. AI igual que los Mycobacterium, Rhodococcus, y Corynebacterium, las paredes de las Nocardia poseen cidos miclicos, denominados cidos nocrdicos. Los cidosmiclicossoncidosgrasoslargosp-hidroxiladosya-ramificados,por
lo
comn saturados o monoinsaturados. Los cidos nocrdicos tienen alrededor de 50 carbonos de largo, en tanto que los cidos corinomiclicos tienen 32 a 36 carbonos. Las especies de Corynebacterium no son acidorresistentes y las Nocardia presentan una acidorresistencia dbil o parcial cuando se las tie con carbolfucsina de acuerdo con el mtodo de Kinyoun. Si se las decolora con cido sulfrico lugar del decolorante fuerte, ms la mayor de parte presentarn acidorresistencia. del 1 ai 4 % en
la cepas de
Nocardia
28
Fisiologa deNocardia
Caractersticas de
su cultivo. Nocardia proliferan con facilidad y rapidez en
diversos medios de cultivo. En los que contienen agar las colonias aparecen dentro de los tres siguientes das a la inoculacin. Despus siete de a diez se das
presentan colonias apiladas, irregulares, cerosas, brillantes y de varios milmetros dedimetro. A medida que seformanlosfilamentosareoslasuperficiedela
colonia se torna opaca y vellosa.
Propiedades metablicas diferenciales. Nocardia puede diferenciarse de gneros similares por su capacidad para descomponer y utilizar la parafina como una fuente de carbono y energa. Esta propiedad permite el aislamiento selectivo de Nocardia de cultivos mixtos.
Un mtodo para atrapar Nocardia implica el uso de varillas de vidrio recubiertas con parafina que se preparan al sumergir una varilla de vidrio en parafina fundida. Las varillas pueden colocarse en suelos o agua del medio ambiente y las especies de Nocardia, si estnpresentes, se desarrollarnalrededordela varilla de vidrio
recubierta con parafina. Usando esta tcnica se han aislado especies patgenas y saprfitas de Nocardia de una amplia variedad de suelos, agua dulce y agua de mar en todo el mundo. Los estudios ecolgicos tienden a correlacionar la prevalencia de
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una cepa particular de N. asteroides en el ambiente con su incidencia de infecciones como: 1) nocardiosis localizada o sistmica; 2) infecciones cutneas; 3) infecciones linfocutneas (esporotricoides); 4) micetomas en lapoblacin nativa. Adems de la digestin de la parafina, las especies deNocardia producen catalasa y ureasa.
Infeccin Clnica por Nocardia
Epidemiologa. Ms de la mitad de los pacientes que desarrollan nocardiosis tienen algn tipo de deficiencia. El 30 % de los pacientes refieren el antecedente de haber recibido esteroides y/o tratamiento inmunodepresor, pulmonares crnicas y el cncer, con pero las infecciones
o sin ellos,
sus respectivos tratamientos
tambin proporcionan una base para la nocardiosis oportunista. Alrededor
del 6 %
de los pacientes presenta una tuberculosis previao concurrente. Otras categoras de alto riesgo incluyen a los receptores transplantes de y a los pacientes de
alcoholismo crnico. En los pacientes en quienes prevalece afeccin no una subyacente el pronstico esconsiderablementemejor.En frecuencia de la nocardiosis fue estimada en
los EstadosUnidosla
1976 como de 500 a 1000 casos por
ao. Desde entonces esta enfermedad ha sido reconocida con frecuencia como una infeccin oportunista. Del
0.5 al 2 % de los pacientes con
el sndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA)contraennocardiosis,cadaao
se producen
30
varioscientosdecasosnuevos.
La nocardiosisno se transmiteentrepersonas
animales,aunque se han notificadovariosbrotesentrepacientesconsusistema inmunolgico deprimido.=
INMOVILIZACIN DE CLULAS.
222485
Uno de los principales problemas se que presentan fermentaciones en cuyos productossonligeramentedifundidos al medioes la formacinde
los llamados
Pellets los cuales se definen como un aglomeradodeclulasque
al tomar esta
formacin afectan la difusin de los substratos al interior de la clula, as como la secrecin de productos al exterior. El problemaanteriorpuedesersolucionado incrementar la velocidad del propulsor en el tanque de fermentacin, esto crea gran dispersin de las esporas o clulas evitndose la formacin de pellets. al una
En aos recientes, los procesos de inmovilizacin de clulas completas han atrado grandemente la atencin por el descubrimiento del enorme potencial que ofrecen los microorganismos en la industria qumica. La tcnica de inmovilizacin ha sido
definida como el procedimientoen el cual se confina una enzimacatalticamente activa o una clula dentro de un sistema, permitiendo el libre paso del substrato y del producto a travs de l.67 Tampion y Tampion la han definido como una clula o
31
una porcin de ella que, por medios naturales o artificiales es impedida de moverse independientemente de susvecinas en todaslaspartes de una fase lquida del
sistema bajo estudio.68 Las enzimas o clulas se emplean en la industria de forma inmovilizada cuando se desea el reciclado de procesos biocatalticos continuos.
los biocatalizadores, o bien en
Otro aspecto de la durabilidad de los biocatalizadores inmovilizados es la resistencia a la degradacin microbiana, su operacin es deseable en condiciones donde los contaminantes microbianos no pudieran desarrollarse fcilmente.
Esta metodologa tambin mejora
el rendimiento de los productos, esto puede ser la actividad biocataltica,
atribuido a muchos factores talescomolaextensinde
cambios metablicos ventajosos o la canalizacin del flujo del material dentro de la clula a travs de una va particular. Adems se mejora la estabilidad del producto, debido al corto tiempo de residencia de productos inestables o la disminucin de la degradacin microbiana del
Desde que se empezaron a estudiar los sistemasde purificadas, sehadescubiertoqueestnlimitados involucran cofactores, adems
inmovilizacin de enzimas que no
a reaccionessimples
que presentan algunas
dificultades en su
reutilizacin. Consecuentemente, se ha incrementado el inters de emplear sistemas
32
de inmovilizacin de clulas completas, que
pueden catalizar reacciones de varios
pasos, involucrando una serie completa de diferentes enzima~.~'
Las comparaciones econmicas entre los procesos que involucran enzimas y clulas inmovilizadas otras con alternativas posibles resultan sumamente complejas. costo depende mucho del sistema adoptado controlables. embargo, Sin es y de fuerzas de mercado El no
posible hacer ciertas generalizaciones
de cada
proceso con sus ventajas dificultades. y
Entrelasventajasqueofrecen
los sistemasdeinmovilizacin
de biocatalizadores reutilizables y la
estn, el que proporcionan una larga estabilidad, usualmente son
recuperacin del producto es fcil. Aunque la inmovilizacin celular sido ha desarrollada despus dela econmicos inmediatos, inmovilizacin deenzimas,sta ha tenidobeneficios
de separacin al evitarse los costos til en
y purificacin
procesos
enzimtica, adems inmovilizacin es dela que celular
multienzimticos y es posible reutilizar lasclulas.Frecuentemente,lasenzimas presentes en clulas inmovilizadas exhiben mayor enzimas inmovilizadas en estado puro. estabilidad que las mismas
Como una de las dificultades quetienen los sistemas de inmovilizacin podemos mencionar principalmente labaja difusin de substratos a travs de la matriz
y a
33
travs las de
clulas en el caso enzimas de intracelulares, desventaja se que
presenta en sistemas de soporte en geles.
La tecnologa
de la fermentacin sumergida tiene
la ventaja de que es bien disponible. Pero los ciclos y
fcilmente entendida y el equipo utilizado es
desperdiciados de esterilizacin del medio,inoculacin,crecimientodeclulas
limpieza del equipo de fermentacin son algunas de sus desventajas; los cuales se reducen en los sistemas de inmovilizacin. Como se not previamente, una de las
principales ventajas de la inmovilizacin es extender la vida metablica de clulas en un estado estacionario, adems la recuperacin del producto es ms fcil y el
.!
tamao del recipiente puede ser reducido en un procesocon clulas inmovilizadas, con el consecuente ahorro de operacin.
'
. .
. ,
los componentes del medio de cultivo y en la
'
6 -
-i '
'
Las tcnicas
de inmovilizacin se clasifican en cuatro procedimientos bsicos de
...
acuerdo a lo propuesto por RadovichI7' siendo: inmovilizacin sin acarreador, que consiste en la formacin agregados de celulares por floculacin natural o por superficial delas
floculacin inducida utilizando agentes que modificanlacarga clulasejemplo, (por
polielectrolitos aninicos o catinicos); acoplamiento
covalente, empleando un tratamiento con agentes entrecruzadores comoel bromuro de ciangeno; adsorcin a travs de enlaces inicos, hidrofbicos o de hidrgeno
34
sobre un acarreador inerte; y atrapamiento en un material inerte semipermeable tal comogeles, alginatos, fibras o membranas.Esteltimoes utilizado. el procedimiento ms
Las caractersticas deseables que debe tener un acarreador en el atrapamiento son las siguientes: En la inmovilizacin: 1) controlar en lo posible el tamao y porosidad del medio de atrapamiento, especialmente para reactores a escala industrial, 2) que los agentes
atrapantes formen una matriz estable en el medio acuoso a temperaturas y valores de pH compatibles con la accin enzimtica deseada y del microorganismo, 3) todos
los acarreadores deben ser baratos y fcilmente disponibles, para tener el costo del
proceso de inmovilizacin ms bajo posible.
En la produccin: 1) el acarreador debe poseer estabilidad mecnica para resistir largos periodos de reaccin y estabilidad qumica en presencia de otros los componentes del sistema, 2) el acarreador debe ser inerte para el microorganismo,
3) el medio de atrapamiento debe permitir la libre difusin del substrato, producto y
otros metabolitos, especialmente los dos ltimos, porque pueden inhibir la reaccin,
4) el acarreador debe tener capacidad para soportar una alta densidad de
clula^.^'
de
Una ventaja
sustancial de un sistemadeinmovilizacines
la altadensidad
clulas y velocidad de flujo, que permiten incrementar la productividad y la facilidad
35
de purificar el producto. Trabajar con velocidades de
dilucin ms grandes que la a
velocidad crecimiento microorganismos de de contaminantes tambin ayuda resolver problemas de contaminacin.
Por otra parte,
los sistemas de inmovilizacin presentan
problemas como: posibles
alteraciones metablicas que dependen de las caractersticas de las clulas que se empleen, ya sea, clulas vivas en activa reproduccin, clulas que son viables pero no reproducibles o clulas muertas; la necesidad de asegurar una eficiente difusin de substrato y productos a travs de la matriz; y los costos de inmovili~acin.~~ La transferencia de masa de la interfase incluye todos los pasos de la transferencia de masa de los substratos y nutrientes hacia dentro de la matriz y la de productos a la superficie externa de la matriz de la clula inmovilizada.
Una de las formas para alcanzar una efectiva inmovilizacin es
el atrapamiento de
un agente biolgico dentro de una matriz de gel. El sistema usualmente tiene tres fases: la fase biocataltica, el flujo de alimentacin/producto y la fase gaseosa del substrato introducido y del producto generado. La completa descripcin del sistema requiere el conocimiento de todas las fases. entrelas fases y su relacin conla El transporte del substrato y producto
productividad especfica del biocatalizador
inmovilizado.
36
Varios factores afectan la productividad especifica del biocatalizador inmovilizado cuando se comparan conmicroorganismosindividuales en unasuspensinlibre. de las esferas
Algunos de estos factores son condiciones las fisicoqumicas comparadas con la masa lquida y la resistencia en
el transporte de masa de
los
substratos necesarios y los productos resultantes dentrode la matriz.72
Las limitaciones significativas de
difusin son comunes
de en los sistemas
atrapamiento en geles y pueden causarque inhibicin porproductodentro
el substrato se agote o que exista clulas sonmuysensibles a su
de lamatriz.Las
microambiente, una concentracin adecuada de substrato y productos dentro de las esferas juegan un importante papel en la productividad y crecimiento. Las condiciones del proceso de operacin tales como velocidad de flujo y concentracin de nutrientes en la fase lquida son ptimamente determinados sonsuperadas. Las condicionesptimasclaramente si las limitaciones
se basan en un anlisis de
difusin y reaccin en la matriz celular.73
La actividad de las enzimas inmovilizadas son usualmente expresadas en trminos del nmero de gramos de producto inmovilizada usada por hora, formado por de gramo enzimalclula
o como gramo producto de
formado por litro de combinados de los factores,
volumen de reactor por unidad de tiempo. Los efectos
los cuales afectan las propiedades intrnsecas de la enzima son expresadas como
37
factores de efectividad, junto con las prdidas de actividad que tengan lugar durante tambin la inmovilizacin a los que se denomina eficiencia de acoplamiento,
porcentaje de retencin y recuperacin de a~tividad.~
Por lo tanto, las propiedades del transporte de masa dentro conocido para predecirla
de la matriz debe ser
efectividad del biocatalizadorincorporado.
El alginato
permite la rpida difusin del soluto de bajo
peso molecular, aunque hay algunas
evidencias que a altas concentraciones de alginato afectan la velocidad de difusin de los solutos.
Johansen y Flink consideran que las propiedades del alginato pueden influir en las caractersticas de las clulas levadura de inmovilizadas (especialmente transporte de masa ), las propiedades en el
que primeramente influyen son el peso
molecular del alginato (caracterizado por su viscosidad), la proporcin entre el cido gulurnico y cido manurnico (proporcin G/M) y la concentracin del alginato en el inmovilizado. Pueden tambin influir otras propiedades como la resistencia del gel, la retencin y el nmero final de clulas inmo~ilizadas.~~
Unode
los soportesms
utilizados paralainmovilizacin el alginatodecalcio,
de enzimas,clulas en bloquesde
organelossubcelulareses
el cualconsiste
copolimeros compuestos de p-D-manuronato y a-R-guluronato. Ocurriendo la
38
gelacinen
presencia de ionescalcio.
Se tratadeun
gel que esunapelcula
tridimensional; es bioqumicamente inerte y las clulas pueden ser atrapadas en los espacios interticiales del gel. La resistencia de dicho soporte esta en funcin de sus componentes, de su concentraciny de la dispersin de poros dentro de la muestra.
El alginato est presente en todaslasalgasmarinascafs,principalmenteen

sargazogigante
el
(Macrocystis pyrifera), queeslaespecie
ms importanteparala
produccin de alginatos. En Mxico se ha venido cosechando desde 1958, con una produccin promedio de 28,300 toneladasporao.
El proceso de produccin se
basa en una serie de reacciones de intercambio inico que permite extraer del alga el alginato de sodio, dicho tratamiento se inicia con el secado de las algas, adiciona un cido diluido. Para extraer los alginatos se alcalina de carbonato de sodio, masapor se les
les somete a una solucin
el alginato que queda en la solucin separando la

es tratada
centrifugacin o filtracin. Lasolucindecolorcafclaro
nuevamente con cido o sales calcio, de obtenindose
los alginatos forma en
gelatinosa (si se us cido) o como fibras (si se emple sales de calcio). Finalmente para obtener el alginato de sodio se le agrega sales de sodio y por ltimo las fibras se secan y muelen, el producto final es un alginato en polvo de color amarillo claro,
El alginato tiene mltiplesaplicacionesenlaindustriafarmacutica,hulera,textil, papelera, de alimentos y cervecera. Se utilizan para espesar, dar consistencia de
39
gel,dar
estabilidad y suavizarproductos.Cuando
se usa producir para
un gel
estable, el alginato usualmente semezclaconunasalde usado bsicamente para formar perlas de alginato que
calcio, estemtodo es contengan clulas vivas o
muertas. Debido a que los gelesdealginatosontrmicamenteirreversibles,las perlas de alginato pueden usarse a temperaturas
elevada^.'^
Encuanto a laspropiedadesfsicas
y qumicas del alginato que se utiliza en la
inmovilizacin de clulas, el alginato forma esferas con muchos cationes divalentes y trivalentes, son trmicamente resistentes, pero se destruyen o se hinchan por un
exceso de cationes tales como el Na', NH4', Mg2', K' o por agentes quelantes como que la el EDTA, citratos, fosfatos y polifosfatos, provocan Se mejora la resistencia mecnica de las perlas de alginato prdida de Ca2+.77 usando bario en lugar
de calcio como agente gelificante. La afinidad de los iones de bario hacia el alginato esmuchomsalta que los iones calcio, las perlas de alginato de bario sonmuy
estables en soluciones cidas o neutras en contraste a las de alginato de calcio. Las perlas son ms estables a los efectos qumicos (amortiguador de fosfato) y mecnico (s~nicacin).'~Las esferasdealginato clulas y tejidos en vivo.79 de bario se han usado comomatrizpara
40
PARTE EXPERIMENTAL
Los espectros de infrarrojo (FTIR) se determinaron en un espectrofotmetro Perkin de Elmer modelo Paragon 1000; los espectros Resonancia Magntica Nuclear
Protnica (RMN-H) en un espectrmetro Bruker modelo DMX500, los espectros de Masas en un espectrmetro Jeol modelo Gcmate, las lecturas de UV se
determinaron en un espectrofotmetro Beckman modelo 35. Los puntos de fusin se determinaron en un aparatoOsymaynoestncorregidos.Lasincubacionesse llevarona cabo en un agitador orbital contemperatura controlada Revcomodelo 051473A. Para cromatografa en capa fina (ccf), se utiliz silicagel GFZs4, (Merck). Los reactivos utilizados fueron adquiridosde:Aldrich,Sigma, Merck yBioxon.La
bacteria Nocardia corallina 5-276 (ATCC 31338),fue adquirida del American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA).
222485
41
Preparacin alcoholes de benclicos substituidos benzoic0 Reaccin de Cannizzaro
y derivados cido de
Alcohol 4-clorobenclico y cido 4-clorobenzoico8o

CHO
I
COOH
Cl
CI
En un matraz de tres bocas de 250 ml, se
pes 2 g
(1.4 X IOq2 mol) de
4-
clorobenzaldehdo, se adiciona poco a poco 11.15 ml (7.1 X I O mol) de KOH al 50

%, la mezcla se agita en un bao mara
para mantener la temperatura de 50-60
OC,
hasta que desaparezca el olor al aldehdo, aproximadamente 3 h. Posteriormente se le agrega 55 mldeagua,precipitando el alcohol 4-clorobenclico pf 68-69
C. La
fase acuosa se extrae con ter (2 X 20 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, y se evapora a presin reducida; para obtener 0.366 g del alcohol 4-clorobenclico, pf 68-70
O C
(informado, 70-72 oC)32arendimiento 36.1 %. La fase acuosa se acidifica

% (pH=2), se forma precipitado, un se
con HCI al 15
recristaliza de etanol
obtenindose 0.347 g del cido 4-clorobenzoico, pf 237-240 O (informado, 239-241 C

0C)32b rendimiento 31.2 %. Los productos se identificaron por ccf e I.R.
42
Alcohol 2-nitrobenclico y cido 2-nitrobenzoico
N02
En un matraz de 3 bocas de 250 ml se coloca 2 g (1.3 X 1O-* mol) de 2nitrobenzaldehdo, se adicionapoco a poco 11.35 (9.9 ml
mol) NaOH de
al
35 %, se calienta ligeramente en un bao mara, no dejando subir la temperatura a

ms de 45OC, durante 50 min. Se agrega 100 ml de aguay se extrae con ter (2X 25 ml), formndose un slido, el cual se recristaliza de etanol para obtener 0.396 g del alcohol 2-nitrobenclico, pf68-70
OC, (informado,70-72 0C)32c rendimiento 39.1 %.
La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter, (2X 25 ml), se seca sulfato sodio sobre de anhidro,
y se evapora a presin reducida,

OC,(informado,
obtenindose 0.607 g del cido 2-nitrobenzoico, pf 143-145
146-148
oC)32d rendimiento 54.9 %. Los productos se identificaron por ccf e I.R.
Alcohol 4-nitrobenclico y cido 4-nitrobenzoico
43
En un matraz de 3 bocas de
250
ml, se colocan2g
(1.3 X I O mol) 4de
nitrobenzaldehdo, se adiciona poco a poco 11.35 ml (9.9 X IO-* mol) de NaOH al 35 %, se mantiene a una temperatura de 45 agua,seextraeconter
O C
durante 30 min. Se agrega 85 ml de de sodio anhidro, se
(2 X 25 ml), sesecasobresulfato
evapora a presin reducida, para obtener 0.419 g del alcohol 4-nitrobenclico, pf 8891 OC,(informado, 92-94 0C)32c rendimiento 41.4 %. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter anhidro, se evapora a (2 X 25 mi), se seca sobre sulfato de sodio
presin reducida, obtenindose 0.467
g del cido 4-
nitrobenzoico, pf 234-238 OC, (informado,239-241 0C)32e rendimiento42.2 O . Los h productos se identificaron por ccf e I.R.
Alcohol 3-nitrobenclico y cido 3-nitrobenzoico 8o
En un matraz de
3 bocas de ml, colocan 25 se
0.2 g (1.3 X
mol) de
3-
nitr~benzaldehdo,~~adicionapocoapoco1.06ml(9.9 se 35 %, se mantiene a una temperatura de 45 agua,seextraeconter

O C
mol) de NaOH al
durante 30 min. Se agrega 5 ml de sulfato de sodio anhidro, se
(2 X 15m!),sesecasobre
44
evapora a presin reducida, para obtener 0.039 g del alcohol 3-nitrobenclico, pf 3031 O , (informado, 30-32 0C)32e C rendimiento 38.4 %. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter (2
X I 5 ml), se seca sobre sulfato de sodio

g del cido 3-
anhidro, se evapora a presin reducida, obtenindose 0.047
nitrobenzoico, pf 138-140 O C , (informado,140-142 0C)32e rendimiento42.2 productos se identificaron por ccf e I.R.
YO.Los
Alcohol 2-bromobenclico y cido 2-bromobenzoico8o
En un matraz de
3 bocas de 250 ml, equipado con
agitacin y bao mara;se le
agrega 6.35 ml (5.7 X 1O-2 mol) de KOH al 50 %, se adiciona 1.5 g (8.1 X IOe3 mol) de 2-bromobenzaldehdo;mezcla la se calienta ligeramente para mantener la
temperatura a 6OoC, se continua la agitacin por 2 h. Se agrega agua, se extrae con ter (2 X 15ml), se secasobresulfatodesodioanhidro,seevapora
a presin
reducida, para obtener 0.230 g del alcohol 2-bromobenclico, se recristaliza de agua

%. pf 77-81 O C (informado, 79-82 0C)32f rendimiento 30.3 La fase acuosa se acidifica
con HCI al 15 % (pH=2), obtenindose 0.233 g del cido 2-bromobenzoico pf 145-
45
148 O (informado, 145-150 0C)32f rendimiento 28.6 Los productos se identificaron C %. por ccf eI.R.
Alcohol 3-bromobenclico y cido3-bromobenzoico 8o
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, equipado con agitacin y bao mara; se agrega 4.24 ml (3.8X I O mol) de KOH al 50 %, se adiciona 1.O g (5.4 X Omol) de 3I bromobenzaldehdo; se calienta ligeramente para mantener la temperatura a 60 O , C se continua la agitacin por 2 h. Se agrega 20 ml de agua, se extrae con ter (2X 15 ml),sesecasobresulfatodesodioanhidro,seevaporaa presin reducida] para
obtener 0.246 g de un lquido, siendo el alcohol 3-bromobenclico, rendimiento 48.7

%
. La fase acuosa se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), obtenindose 0.260 g del
cido 3-bromobenzoico, pf 153-156 O (informado, 155-158 0C)3a C rendimiento 47.9

%. Los productos se identificaron por ccf e I.R.
46
Alcohol 4-bromobenclico y cido 4-bromobenzoico
En un matraz de 3 bocas de
250 ml, equipado con agitacin mecnica se adiciona
h 12.7 ml (1.1 X 10 mol)de KOH al 50 O , seagrega3g
(8.1 X I O 9 mol) de 4-
bromobenzaldehdo; se calienta ligeramente para mantener la temperatura a O y 60 C se continua la agitacin durante 90 min se agrega 50 ml de agua, se extrae con ter
(2 X 15ml), se evaporaa presin reducida para obtener 0.444 g del alcohol 4bromobenclico, pf 73-75 OC, (informado, 75-77 0C)32f rendimiento 29.3 %. La fase acuosaseacidificacon
HCI al 15 % (pH=2),obtenindose0.761g
del cido4-
bromobenzoico, pf 249-252 OC, (informado, 252-254 productos se identificaron por ccf eI.R.
0C)32f rendimiento 46.7 %. Los
47
Alcohol 4-metilbenclico 81
CHO
C H Y
CH3
En unmatraz de 3 bocas de 250 ml,secolocan1.82 de KOH, se adiciona 2.68 ml MeOH,mezcla de la se
g (1.6 X
mol)de hojuelas
agita hasta completa
disolucin, se adiciona poco a poco una mezcla de 1.25 ml de solucin de CH20 al

36 % (1.5 X IO4 mol) y 1.47 ml (1.25 X IO-* mol) de 4-metilbenzaldehdo , se deja a
reflujo durante6:40
h; se destila el MeOH, se agrega 20 ml deagua
se enfria,
formndose un slido de pf 48-50 OC, la fase acuosa se extrae con tolueno (2 X 20 ml), posteriormente se destila el tolueno, dando un slido de pf 43-46
O , C
con un
rendimiento de 83.1 %. Se recristalizan de hexano, para obtener 0.936 g del alcohol 4-metilbenclico, pf 57-59 O C , (informado, 59-61 0C)32grendimiento de 50.6 O . Se y h identifica por ccf e I.R.
48
Preparacin de derivados de cidos carboxlicos aromticos Reacciones de Oxidacin con KMn04, HNOS
cido 2-naftoico 82
En un matraz de
3 bocas de 250 ml, se coloca0.5
g (3.2 X I O " mol) 2de
naftaldehdo, se adiciona 125 ml de agua, se deja en vigorosa agitacin hasta formar una emulsin; se calienta ligeramente en un bao mara a una temperatura de 708OoC, se adiciona una solucin de KMn04 [ 0.70839 (4.5 X I O " mol) en 14.16 ml de agua 1, se mantiene la temperatura durante una hora.Se agrega 9 ml de NaOH al 30 %, se filtra y se lava con agua caliente, el filtrado se enfra hasta que precipite la materiaprima sin reaccionar, (62 mg). El filtrado se acidifica con HCI al 15 %
(pH=2), los cristales amarillos se filtran, obtenindose 0.141 g del cido 2-naftoico, pf 183-1 86 O C , (informado, 185-1 87 0C)32h rendimiento 25.6 ste se identifica por %, ccf e I.R.
49
cido 6-bromoveratrIi~o~~
se En un matraz de 3 bocas de 250 ml,
coloca 0.5 g (2.5 X
mol) de 6-
bromoveratraldehdo, se adiciona 125 mi de agua, se deja en agitacin hasta formar una emulsin, se calienta ligeramente en un bao de agua para alcanzar una
temperatura de 70-80 O . Se adiciona una solucin de C mol) en 9 m de agua], se en 1 deja
KMn04 [0.45 g (1.8 X I O "
agitacin por una hora manteniendo la
h temperatura. Se agrega 8 ml de NaOH al 30 O , se filtra en caliente sobre Celita, el
filtrado se enfra hasta que precipite la materia prima sin reaccionar,
el filtrado se
acidifica con HCI al 15% (pH=2), se filtra y se seca para obtener 0.362 g del cido 6bromoveratrlico, pf 181-184
OC,
(informado,185-1870C).32iRendimiento
67.9 %,
ste se identifica por ccf e I.R.
50
cido 4-hidroxibenzoico8*
OH
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca 0.462 g (3.8 X I O " mol) de 4-hidroxibenzaldehdo, se adiciona 125 ml de agua, deja se agitando hasta formar una emulsin. se calienta ligeramente en un bao de agua para mantener la temperatura de 70-80 O C . Se adiciona una solucin de KMn04 [0.837g (5.3 X IOm3mol) en 14 ml de agua], s e deja agitando por 2 h, manteniendo la temperatura. Se agrega 10 ml de KOH al 10 % y se filtra en caliente, las sales se lavan con agua caliente, el filtrado se acidifica con 15 ml de HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo (3 X 20 ml),sesecasobresulfatodesodioanhidro,seevaporaa presin reducida. Se
recristaliza de agua obtenindose 0.069 g del cido 4-hidroxibenzoico, pf 212-215
OC, (informado, 215-217 0C).32irendimiento 13.1 %, ste se identifica por ccf e I.R.
51
cido 2-metoxibenzoico8*
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca metoxibenclico, se adiciona 250 m de 1 agua, temperatura de 70-80C. Posteriormente
1 g (7.2 X I O " mol) de alcohol 2-
se calienta ligeramente a una
se adiciona una solucin de KMn04
[0.8120g (5.1 X I O " mol) en 16.4 ml de agua], manteniendo la temperatura por 40 min. Se adiciona 10 ml de NaOH al 30 %, se filtra y se lavan las sales con agua caliente, se enfra para que precipite la materia prima sin reaccionar. Se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo (3 X 20 ml), se evapora a 0.334 g del cido 2-
presin reducida, obtenindosedespusdelavarconter metoxibenzoico, pf
96-99 OC, (informado,98-100
oC).32k rendimiento 30.2 %. El
producto se identifica por ccf e I.R.
52
cido 4-metilbenzoic0~~
En un
matraz de 3 bocas de
250 mi, se pesa 1 g (8.3 X
mol) de 4-
.- I:
_I
i
metilbenzaldehdo, se adiciona 200 m de 1 agua, calienta se ligeramente para mantener la temperatura de 70-80C. Se adiciona una solucin de (1.1 X mol) en
3.4 m de se 1 agua], continua la
{#o-,
3..
KMn04 [1.77g
( . , c .
:.: ,- c.
r
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agitacin por hora, una
5 ; 5.
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: .
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ct
r8-k
manteniendo la temperatura. Se agrega 15 m de KOH al 10 % (pH=12), se filtra en 1 caliente, se lavan las sales con agua caliente, el filtrado se acidifica con HCI al 30 % (pH=2), se filtra y se seca. Se recristaliza de ter para obtener
2;;; :G :3
clr
I -
,C(,
r i m
f ;
1.I3 g del cido 4-
o
A-
k.
t:!
metilbenzoico, pf 179-181 O , (informado,180-1 82 0C).32'rendimiento 52.1 %. Se C identifica por ccf eI.R.
I:
cido 2-clorobenzoico 83
53
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, se coloca 0.5 g (3.5 X I O " mol) de alcohol 2clorobenclico se adiciona 4.34 ml (9.7 X I O " mol) de HN03al 65 %, manteniendo la temperatura de 70-80 O C por una hora. Se enfra, se le adiciona 15 ml de agua fra y se filtra, para obtener 0.383 g del cido 2-clorobenzoico, pf 136-139 OC,(informado, rendimiento 69.7 %. El cido se identifica por ccf e I.R. 138-140 0C).32b
Preparacin de alcoholes benclicos substituidos

LiAIHd Reacciones de Reduccin con
Alcohol 4-hidroxibenclic0~~
CHQ
I
OH
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto detrampa
de cloruro decalcio, mol) de 4-
refrigerante de aire, y agitacin; se coloca 1 g (8.2 X IO-'
hidroxibenzaldehdo y 8.97 ml de THF; se adiciona poco a poco 0.36 g (9.6 XIO" mol) de tiAIH4 manteniendo la temperatura a 30 OC,se adiciona 30 ml ms de THF,
se deja en agitacin durante 22:30 h. Se agrega 3 ml de agua y se adiciona 10 ml

de NaOH al 30
OO /.
La fase acuosa se acidifica con HCI al 15% (pH=2) , se extrae
con acetato de etilo (2 X 25 mi), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora
54
a presin reducida, rendimientocrudode97.6
%, los cristales se lavanconter,
obtenindose 0.229 g del alcohol 4-hidroxibenclico, pf 110-1 12 OC, (informado, 118122 0C).32m rendimiento 22.5 YO. identifica por ccf e I.R. Se
Alcohol 6-bromoveratrIi~o~~
CH20H
t
LiAIH4 I THF>
Er@
OCH3
OCH3
OCHR
OCHR
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto detrampade
cloruro decalcio,
refrigerante y agitacin; se coloca 1.5 g (6.1 X 10" mol) de 6-bromoveratraldehdo, y 36.3 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.23 g (6.7 X I O 3 mol) LiAIH4 de
manteniendo la temperatura a 30 OC, la mezcla se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 3
ml de agua y 10 ml de NaOH al 10 %, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica

con HCI al 15 % (pH=2); se extrae con acetato de etilo (2 X 25 ml), se seca sobre
sulfato de sodio anhidro, se evapora a presin reducida, dando un slido de pf 64-70

. O C con rendimiento de96.4
%, se recristaliza deter,obtenindose1.12g
del
alcohol 6-bromoveratrlico, pf 88-90

I.R.
O rendimiento 70.1 C
%. Se identifica por ccf e
55
Alcohol 3-metoxibencilic0~~
En un matraz de 3 bocas de 25 ml, provisto de trampa de cloruro de calcio, refrigerante y agitacin; se coloca 0.55 g (3.6 X IO
mol) del cido 3-
metoxibenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.29 g (7.5 X O I mol) de LiAIH4manteniendo la temperatura a 30 OC, se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 1 mi de agua y 0.3 ml de NaOH al 15%, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con HCI al 15 % (pH=2),se extrae con ter (2 X 15 ml), se seca sobre sulfato de un liquido,
sodio anhidro, se evapora a presin reducida, obtenindose 0.396 g de
siendo el alcohol 3-metoxibenclico con rendimiento de 79.3 %. Se identifica por ccf
e I.R.
Alcohol 3-metilbenclic0~~
56
En un matraz de 3 bocas de 25 ml, provisto de trampa
de cloruro decalcio,
refrigerante y agitacin; se coloca 1.O g (7.4 X I O mol) de cido 3-metilbenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.59 g (15.5 X mol) de LiAIH4 1 ml de
manteniendo la temperatura a 30 O C , sedeja a reflujo 2:10 h. Se agrega
agua y 0.3 ml de NaOH al 15 O h , para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con
HCI al 15 % (pH=2), se extrae con ter (2 x 15 ml), se seca sobre sulfato de sodio
anhidro, se evapora a presin reducida, para obtener 0.717 g de un lquido, siendo el alcohol 3-metilbenclico, con rendimiento de79.9 %. Se identifica por ccf e I.R.
Alcohol 3-clorobencilic0~~
En un matraz de 3 bocas de 25 mi, provisto de trampa de
cloruro decalcio,
refrigerante y agitacin; se coloca 1.1 g (6.4 X 1O mol) de cido 3-clorobenzoico, y 6 ml de THF, se adiciona poco a poco 0.38 g (9.6 X I O mol) de LiAIH4 manteniendo la temperatura a 30 O , se deja a reflujo 2:lO h. Se agrega 1 ml de agua y 0.3 ml de C NaQH al 15 %, para eliminar el excesodeLiAIH4.Se acidifica conHCI al 15 % de sodio anhidro, se
(pH=2), se extrae con ter (2 X 15 ml), se seca sobre sulfato
57
evapora a presin reducida, para obtener 0.978 g de un lquido, siendo el alcohol 3clorobenclico con rendimiento de 97.6%. Se identifica por ccf e I.R.
Alcohol 2-naftil~arbinol~~
En un matrazde 3 bocas de 250 ml, provisto detrampade
cloruro de calcio; se
coloca 0.5 g (3.2 X IO" mol) de 2-naftaldehdo, se adiciona 4 m de THF, se agrega 1 poco a poco 0.0649 (8.0 X IO4 mol)deLiAIH4
, sedeja
en vigorosa agitacin
durante 1:40 h a temperatura ambiente y una hora a 30 O C . Se adiciona 3 ml de agua

y 10 ml de NaOH al 30 % para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con HCI al
15 % (pH=2), se extrae con ter (2 X 25 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro
y se evapora a presin reducida,para obtener 0.464 g del alcohol 2-naftilcarbinol, pf
75-78*C, (informado, 79-81 0C).32n rendimiento 91.7

ccf e I.R.
%. El alcohol se identifica por
Alcohol 3-nitrobencli~o~~
58
En un matraz de 3 bocas de cloruro de calcio
250 ml, provisto de refrigerante de aire, trampa

0.44 g (2.91 X I O "
de
y agitacin, se coloca
mol) de 3-
nitrobenzaldehdo, se adiciona 16 ml de THF, se calienta ligeramente para mantener la temperatura de 3O-4O0C, durante 40 min,seagrega,pocoapoco, LiAIH4 (3.4 X
0.13 g de
mol).Seadiciona 3 ml deaguay 10 ml de NaOH paraeliminar el al 15 O (pH=2),seextraeconacetatode h

y se evapora a
excesode LiAlH ; seacidificaconHCI
etilo (2 X 25 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro
presin
reducida, para obtener un lquido aceitoso con rendimiento de
75.4 O . Se purifica h
por cromatografa en columna, se eluy con una mezcla de acetato de eti1o:hexano (2:1), obtenindose 0.139 g del alcohol 3-nitrobenclico, pf 30-31 O , (informado, 30C 32 0C)32e rendimiento 31.2 %. Se identifica por ccf e I.R.
Alcohol 2-hidroxibencilic0~~
En un matrazde
3 bocasde
250 ml,provistodetrampa
de clorurodecalcio,
refrigerante y agitacin;secoloca 3 g (2.5 X

15 ml de THF. Seadicionapocoapoco0.47
mol)de2-hidroxibenzaldehdo, con
g (1.3 X IOb2 mol)de
LiAIH4, se
mantiene a reflujo durante 10 min y 20 min en agitacin a temperatura ambiente. Se
59
adiciona 3 ml de agua y 10 ml de NaOH al 30
OY
para eliminar el exceso de LiAIH4;
se acidifica con HCI al 15 % (pH=2), se extrae con acetato de etilo seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora a 1.247 g
(2 x 25 ml), se
presin reducida, para obtener
del alcohol 2-hidroxibenclico recristalizado acetato etilo-hexano de de

OC,
(1:0.5), 80-83 pf
(informado,83-85
O)" C"
rendimiento40.9 %. El producto se
identifica por ccf e I.R.
Preparacin de 3-nitrobenzaldehid0~~
CHO
CHO
En un matraz de 3 bocas de 250 ml, provisto de un embudo de adicin; se adiciona

h 61.7 ml (1. I 6 mol) de HzS04al 98% y 8.9 ml (2.0 X I O " mol) de HNOS al 65 O , se
enfrasobre
un bao de hielo paramantenerunatemperaturade
5-10 OC. Se
adiciona,gotaagota,
9.5 m (9.9 X IO-' mol) de benzaldehdoaproximadamente 1
durante una hora, manteniendo la temperatura, al trmino de la adicin se retira el bao de hielo y se deja en agitacin durante
25 min. a temperatura ambiente. Se
agrega 150 g de hielo, se forma un slido ste se filtra y se lava en varias ocasiones
con agua fra, se lleva a (pH=12) con NaOH al 12 %, se filtra, el slido se recristaliza
60
de etanol, para obtener 8.977 g del 3-nitrobenzaldehdo, pf 55-57

59 0C)32 rendimiento del 60.0 %, este se identifica por ccf e I.R.
OC,
(informado, 57-
Mtodo general de preparacin de dioles LiAIH4& correspondientes por reduccin con
partir
de las lactonas
222485
Se prepararon los siguientes dioles: 1,4-pentanodiol; 1,4-octanodiol; 13y-
siguientes lactonas: undecanodiol; 1-fenil-I ,4-butanodiol a partir de las valerolactona, y-octanolactona, 6-undecanolactona y y-fenily-butirolactona.
En un matraz de 3 bocas de ml, 25
provisto de trampa de cloruro de calcio,
refrigerante y agitacin; se coloca 1 mol de la lactona, con 7 ml de THF, se adiciona poco a poco 1.2moldeLiAIH4 manteniendo la temperatura a 30
O , sedeja C
en
agitacin a temperaturaambientesiguiendo
el curso de la reaccin porccf.Se
agrega suficiente agua y 5 ml de NaOH al 30 %, para eliminar el exceso de LiAIH4. Se acidifica con 15 ml de HCI al 18 % (pH=2); se extrae con ter (2 X 20 ml), se seca sobre sulfato de sodio anhidro, se evapora a presin reducida, dando un lquido con rendimiento de 47-79 %. Se identifica por ccf e I.R.
61
Tabla 2. Obtencin de Dioles Lactona y-valerolactona y-octanolactona 6-undecanolactona y-fenily-butirolactona Tiempo Diol 1,4-pentanodiol 1,4-octanodiol 1,5-undecanodiol 1-fen-I ,4-butanodiol
% Rendimiento
(h) 2:O
22:o O: 17 3:O
79.1 47.3 79.3 70.0
Activacin de Nocardia corallina 8-276
La activacin de la bacteria se efectu a travs de la inoculacin de una placa de agar con una suspensin de la cepa comercial fue incubada a 30 O por tres das. y C La composicin del agar es: Extracto de carne, 3.0 g/; peptona, 5.0 g/l; agar, 15 g/l; a un pH = 6.8.
Una muestra de la cepa almacenndose a -2OOC.
se preserv en glicerol acuoso
al 80 % (v/v),
62
El medio de cultivo lquido usado en las biotransformaciones se prepar de la

siguiente manera:
Solucin A: FeS04 7. H20,0.05 gll; K2HP04,1.74 gll; (NH4)2SO, , 2.0 gll; extracto de levadura, 1.O g/l. Solucin B: MgS04 , 1.5 g/. Solucin C:glucosa, 2.0 g/l. Cada solucin fue esterilizada por separado y aspticas ajustando el pH final, a 8.0 (fl.5). se mezclaron condiciones bajo
Procedimiento general para efectuar las biotransformaciones
Precultivo I: Un matrazErlenmeyer
de 125ml,conteniendo
50 mldemediode
cultivo estril, fue inoculado con el contenido de una placa de agar (con crecimiento
o desarrollo de ms de 72 h), posteriormente se incub a 28-30
O C
con agitacin
rotatoria (200 rpm) por 24-30 h. Precultivo II: El contenido del matraz de la etapa del Precultivo I fue aspticamente trasvasado a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, el cual contena 100 ml del mismo
O C
medio de cultivo estril; el matraz fue incubado a 28-30 (200 rpm) por 24-30 h.
con agitacin rotatoria
63
Biotransformacin: Los substratos se adicionaron, bajo
condiciones aspticas, al
cultivo anterior (Precultivo II) en cantidades de 100-150 mg, utilizando 1.O mi de N,Ndimetilformamidacomocodisolvente,seguidode la adicin de 10 ml den-octano
como segunda fase. La mezcla se agit a 28-30 O C y el progreso de la reaccin se sigui por ccf.
El aislamiento del producto se realiz llevando la mezcla de reaccin a un pH cido con la adicin de 0.5 ml de HCI al 20 % , saturando con cloruro de sodio y filtrando sobre Celita, el filtrado se extrae con acetato de etilo
(4 X 25 ml), se seca sobre
sulfato de sodio anhidro, y se evapora el disolvente a presin reducida. El residuo se disuelve en ter etlico y se adiciona una solucin saturada de bicarbonato de sodio
o de hidrxido de sodio 1N, (2 X 10 ml), separndose las fases. La fase orgnica se
seca sobre sulfato de sodio anhidro, se
filtra y se evapora el disolvente a presin
reducida obtenindose, entre los neutros, el alcohol recuperado. La fase acuosa se ajusta a pH=l con sol. de HCI al 18 % y se extrae con ter etlico (4 X 20 ml), se secasobresulfatodesodioanhidro,se reducida obtenindose el cido deseado. filtra y evapora el disolvente a presin
64
Procedimiento general para la biotransformacn de dioles
La biotransformacin se llevo acabo por el procedimiento anteriormente descrito y el aislamiento del producto por sus caractersticas se efectu de la siguiente manera:
la mezcla de reaccin se lleva a un pH=5 con 0.5 m de HCI al 10 %, saturando con 1

cloruro de sodio y filtrando sobre Celita, el lquido se extrae con cloruro de metileno
(3 X 25 ml), sesecasobresulfatodesodioanhidro,se
filtra y se evapora el
disolvente a presin reducida. A veces se requiere de extraccin continua (12 h) con cloruro de metileno o cloroformo (200 ml).
Cuantificacin de clulas Este mtodo se basa en laslecturasde
las densidadespticas (D.0) de varias
I I diluciones (1:O, 1:I 00, I :000, etc) para la cuantificacin de clulas en mg/ml por
medio de un espectrofotmetro.
A los medios de cultivos lquidos de clulas preparados como
se mencion
anteriormente (por duplicado) despus de 72 h, se centrifugan a 9000 rpm/20 min a

4 O C , se desecha el sobrenadante y el precipitado es resuspendido en 20 m de agua 1
destilada, de esta mezcla se toma 1 ml y se agregan 9 ml de agua destilada y se lee en el espectrofotmetro a 660 nm, de esta dilucin se toma 1 ml ms 9 ml de agua
65
destilada y se lee en el espectrofotmetro y as sucesivamente se hacen varias diluciones. Este mtodo seha desarrollado con la estndar y poder extrapolar los resultados. finalidad de obtener una curva
Se pesaron 10 filtros milipore, 47 mm de dimetro, se ponen a peso constante a 60

O C
durante 22 h, posteriormente se pesa cada uno deellos.
En los filtros milipore pesados anteriormente se filtran las diluciones hechas, se ponen a peso constante a 60
O C
durante 22 h. Por diferencia se obtiene
el peso
seco, el cual junto con la D.O. se graficaobtenindoseas
la pendiente (m) y el
intercepto (b) para poder extrapolar los resultados obtenidos en la grficay aplicar la siguiente ecuacin:
X= (y-b/m) (dilucin)
Donde:
X= mg/ml de clulas (peso seco) m= pendiente
Y= densidad ptica b=intercepto
Procedimiento para la inmovilizacin de clulas
Produccin de biornasa. En un matraz Erlenmeyer de 500 ml conteniendo 200 ml del medio de cultivo estril (etapa para la produccin de biomasa) fue inoculado con las clulas contenidas en la placa deagar y se incubo a 28-30 OC, con agitacin rotatoria (200 rpm) por 96 h. Las mezcla se centrifug a 4
O C
(9000 rpm) por 20 min.
66
Procedimiento inmovilizacin. de
AI paquete celular
(suspensin de clulas
centrifugadas para tener una concentracin aproximada de 100 mg de peso seco de clulas por ml de solucin de alginato) se le adicion la solucin del cido alginic0 al 15 % (p/v) y esta suspensin se gote a velocidad constante (bomba peristltica) sobre una solucin de cloruro de bario 0.125 M, dejndose en agitacin por 24 h. Guardndose en la misma solucin a 4 OC,hasta su uso.
Procedimiento parala biotransformacin con clulas inmovilizadas
La biotransformacin se llev a cabo en matraces Erlenmeyer de 125 ml utilizando de 10 a 40 esferas de Nocardia inmovilizada, se le adiciona de 50 a 150 mg de alcohol furfurlico en 50 mi del medio de cultivo lquido antes descrito, 0.8 agitacin rotatoria (140 rpm) a 28-30
m de DMF l
y 10 ml de n-octano. La mezcla heterognea se agita por periodos de 24 a 72 h con
"C.
67
RESULTADOS Y DISCUSJN
Se estudiaron en primera instancia, las condiciones adecuadas para
el crecimiento
de Nocardia corallina, con agitacin reciprocante, para ello se cuantific el peso del microorganismo desarrollado en relacin a la temperatura de incubacin (intervalo
de 2 O a 32O C) y al pH del medio de cultivo (intervalo de 6.97 a 8.6) encontrndose 6 que el intervalo de pH ms adecuado para producir 7.6-8.0 y la temperatura de incubacin de 28-30 OC. un ptimo crecimiento fue de
Durante el estudio anterior se enfrentaron serios problemas,
ya que Nocardia
corallina presentaba diferentes formas de desarrollo, lo mas frecuente fue encontrar

una aglutinacin de clulas,conduciendo a biotransformaciones no reproducibles. Ademsenla fase dePrecultivo I I lasclulasmostraron una coloracin amarilla,
fuera de lo normal. Por estudios microscpicos (frotis en fresco) se observ que el material biolgico no estaba contaminado conservndose la identidad de la bacteria, pero se aprecia algo de lisis celular.
El problema de la aglutinacin se atribuy al tipo de agitacin que se estaba biomasa utilizando, ya que al cambiar a agitacin rotatoria la produccin de
68
(Precultivo II), nos llevo al desarrollo de clulas en suspensin con opalescencia de color salmn, lo cual condujo a biotransformaciones exitosas y reproducibles.
El objetivo de esta tesis era el estudiodelaoxidacin

primarios, por ello el substrato inicial, ademsdeser
de alcoholes benclicos la referencia lgica, fue el
alcohol benclico. De los experimentos realizados con el alcohol benclico (35-50 mg, con tiempos de 4-22 h de biotransformacin), no se obtuvo el cido benzoico esperado y si una mezcla compleja de por lo menos dos productos mayoritarios, no observndose el aldehdo correspondiente.
Con el objetivo de racionalizar estosresultados, se llev a cabo un experimento utilizando al cido benzoico como substrato, las bajo mismas condiciones de biotransformacin; sin embargobajoestascondiciones biotransform, recuperndose la materia prima sin cambio. el microorganismo no lo
Ello hace evidente que
el cido benzoico no es un intermediario en la ruta para obtener alguno de los dos compuestos no identificados antesmencionados, otras rutas benzoico. metablicas estn involucradas, previas y nos indica que posiblemente a la produccin del cido
A pesar de los resultados desalentadores se procedi a probar la biotransformacin
con otros alcoholes benclicos substituidos en
el anillo aromtico. Para esta
69
discusin los resultados se presentarn agrupados por patrn de substitucin,
seguido por los substratos no relacionados estructuralmente.
En la Tabla 3 semuestran los resultadosobtenidos con los alcoholesbenclicos
Tabla 3. Biotransformacin de alcoholes benclicosorto-~ubstituidos~~
CHzOH
I
COOH
I
% Rendimiento
Tiempo Reaccin de (h )
27
110
26
(mol/mol)
1: R= OH
3: R= NO:!
2: R= OH
4: R= NO2
6: R= C I
74
5: R= C I 7: R= NH2
1 9
8 : R= NH2
-b
5
12
26
9:R= OCH3
11: R= Br
10: R= OCHJ
12: R= Br
27
30
a: 25 YOde materia prima recuperada b: mezcla compleja
70
Los grupos substituyentes se seleccionaron con el fin de investigar, s los efectos

electrnicos de estos podran influencia tener Desafortunadamente los resultados no en el procesooxidacin. de
mostraron una relacin clara entre
los
efectos electrnicos y el rendimiento de los productos de oxidacin. Para el caso de los gruposactivadores(hidroxilo,amino,metoxilo), el orfo-hidroxiderivado
(1)
produjo el rendimiento ms alto, por el contrario el o-metoxi derivado (2), mostr una caida sustancial del rendimiento (solo 5%). Lo anterior nos llevo a especular sobre la necesidad de la presencia del grupo oxidrilo libre a cierta distancia del grupo ltimo viene a reforzar la
reactivo, en este caso el oxidrilo benclico primario. Esto
hiptesis, presentada por Luna et al2, de que un grupo oxidrilo libre a cierta distancia es imprescindible para llevarse a cabo la oxidacin de Il4-dioles (ambos primarios) para producir lactonas quirales con la Nocardia coralha.
Otra posible explicacin para el bajo rendimiento en la
produccin del cido
(u),
del
podra ser un potencial impedimento estrico, efecto ampliamente conocido en casos similares. Aunque para el caso de voluminoso tomo bromo de
los derivadoshalogenados,lainfluencia
(12 O de h rendimiento)
no produjo una caida tan
dramtica en relacin al substituyente cloro (19 O h rendimiento).
71
El caso del amino derivado (I), parece involucrar factores adicionales a los efectos
electrnicos del substituyente; se observ la desaparicin de la materia prima, pero en lugar del esperado cido antranlico
(S) se obtuvo una mezcla compleja de (S), condujo a la recuperacin de la

a pesar del largo no
productos.Por el contrario el nitro derivado
materia prima en un 25 % (despus de recristalizar deagua),
perodo de reaccin; el anlisis cromatogrfico durante biotransformacin la
mostr la aparicin de ningn producto adicional y la baja recuperacin de la materia prima se debi a la recristalizacin de la compleja fase neutra extrada.
Es de mencionarse que esta metodologa constituye unanueva opcin para preparar

el conocido intermedio farmoqumico denominado c. saliclico (2).
72
Tabla 4. Biotransformacin de alcoholes benclicos a r a - s u b s t i t ~ i d o s ~ ~ p
R
% Rendimiento
Tiempo de Reaccin
(mollmol)
13: R= OC:H3
(h)
6
14: R= OC;Hz 16 : R= C I 18: R= NO2

20: R=OH
32
15: R= CI 17: R= NO2

19: R= OH
50
50
a
24 24
24
27
21:
R= CH3
22: R= CH3
47 11
23: R= Br
24:R= Br
34
a: mezcla compleja
Los rendimiento producidos por los derivados para-substituidos (Tabla 4) fueron

superiores a los obtenidos con
los ismeros orto, a excepcin del derivado
hidroxilado (19) el cual produjo una mezcla compleja, dela cual no se logr aislar un compuesto mayoritario. Es interesanteobservarque
e derivadometoxilado l
(m,
un
con el grupo en una posicin mas alejada del sitio de la reaccin,produjo
73
rendimientomayor al del ismeroen orto, enmenortiempo
222485
de bioconversin, en
experimentos a tiempos mayores (30 h) se observa un decremento en el rendimiento (25 %). Los alcoholes halogenados, bromo (23) y cloro
(u) presentan resultados
contrastantes en ste caso, si los efectos estricos de los tomos en la serie orto fuera el predominante, los resultados seran los esperados (11 % y 50 % respectivamente); ya que los efectos electrnicos muy son similares. Esta
explicacin, sin embargo no es consistente con el caso del derivado metoxilado
(u)
o el nitro derivado
(u), esbiotransformado que
al cido
(S) un 50 % de en
resultado
rendimiento en 24 h, lo que ademsest
en franca oposicin conel
observado con su ismero orto, el cual no reacciona a pesar de 110 h. Para el metil derivado
(a) observa un 47 % de rendimiento. se
Los resultados obtenidos con los
derivados cloro y nitro, son iguales (50 % de rendimiento); ya que ambos grupos son desactivadores del anillo aromtico pero con efectos resonantes contrarios, se
l podra especular un efecto electrnico en el proceso de oxidacin. Sin embargo e

metil derivado presenta un rendimiento muy similar, siendo este grupo dbil del anillo aromtico, si bien por efectos de hiperconjugacin; lleva a proponer que posiblemente oxidacin la no se un activador
lo anterior nos
vea afectada
significativamente por los efectos electrnicos en el anillo por los substituyentes.
74
Tabla 5. Biotransformacin de alcoholes benclicos meta-substituidosa7
aR
?"*-OH
25:R= NO;! 27:R= OCH3
29:R= C I 31:R= Br
COOH
Nocardiacorallina
% Rendimiento Reaccin Tiempo de
(mol/mol)
26: R= NO2 64
(h)
123 25
28:R= OCH3
77
46
30:R= C I 32:R= Br
52 72
33:R= CH3
34:R= CH3
25 25 25
Para los ismeros en mefa se observa en la Tabla 5 rendimientos ms homogneos y por lo general mayores. Esto se puede racionalizar en que existe un leve efecto electrnico, ya que por la substitucin en meta esteefectoseaprecia
menos. El
nitro derivado (25) presenta los tiempos de bioconversin mas grandes y un 64 % de -rendimiento. Resalta el comportamiento del metoxilo (27) el cual presenta el rendimiento ms alto de todos los substituyentes estudiados, un 77 %. En esta serie no se pudo contar con el
meta hidroxi derivado. Los derivados halogenados cloro

y 52 %
(29) y bromo ( 3 1 ) dan rendimientos medianos muy similares, 46

75
respectivamente. El grupo activador metilo ( 3 3 ) favorece la oxidacin y se obtiene un
72 % del cido 34 siendo entonces, observable en

positivo para la biotransformacin con y metilo).
la serie meta, un ligero efecto
la presencia de grupos activadores (metoxilo
Tabla 6 Comparaci6n de los rendimientos de la oxidacin

(orto,meta, para) de alcoholes benclicos monosubstituidos.
de los ismeros
Substituyente Tiempo (h)
O!
Tiempo (h)
y ,
Tiempo (h)
25% de materia prima recuperada;
mezcla compleja; n.d. no determinado.
En la Tabla 6 se resumen los resultados alcanzados en las tres series isomricas de

alcoholes benclicos, en general podemos concluir existe que
un ligero efecto
electrnico del substituyente que influye la oxidacin con msevidenteenlaserie
Nocardia corallina, siendo
meta, el resultado taninteresanteenlaoxidacin
del
76
alcohol orfo hidroxibenclico seatribuyea
un posible puente de hidrgeno entre
ambos grupos hidroxlos, favoreciendo la accin de la enzima para llevar a cabo la bioconversin. Esta posibilidad no es posible al tener el grupo metoxilo en el alcohol
35
2-naftilcarbinol
Para analizar el efecto del tamao del anillo aromtico se someti al alcohol naftilcarbinol
(S),biotransformacin a la
por 24 h, obtenindose 18.75 % de
rendimiento del cido 2-naftilcarboxlico identificndose por IR, y comparacin en c d y pf con unamuestra autntica.
Con la finalidad de reforzar el entendimiento de
las tendencias en reactividad
observada con los derivados monosubstituidos, especialmente en lo relacionado a la posicin de substitucin, se efectuaron experimentos trisubstituidos. Cabe notar que con derivados di- y
el criterio utilizado en la seleccin de estos
tuvo substratos fue su disponibilidad y que no se en
mente algn patrn de
77
substitucin en particular por ello la discusin de los resultados obtenidos se llevara a cabo individualmente.
CH20H
YOOH
36
37
cido 5-bromo-2-hidroxibenzoico
Alcohol 5-bromo-2-hidroxibenclico
E alcohol 5-bromo-2-hidroxibenclico(S), despub de 144 h de biotransformacin y

purificacin por extraccin decido/neutro,produjo cido un 22 % de rendimiento del de neutros siendo
5-bromo-2-hidroxibenzoico (37)
62.3 mg
mayoritariamente, por ccf e I , el alcohol de partida con impurezas. R
Sorpresivamente este rendimiento del 22 % no fue el esperado, ya que el alcohol orto-hidroxibenclico ('I) fue el derivado orto monosubstituido que produjo el
rendimiento ms alto y adems el alcohol mefa-bromobencilico rendimiento del 50 Oh, lo cual podrasuponerse
(u) tuvo
3 6 ,
un
el
que para el compuesto
rendimiento de la oxidacin microbiolgica fuera similar o cercano, al obtenido por
los compuestos monosubstituidos ( y 1
El bajorendimiento podra atribuirse a
78
restricciones estricas en el sitio de reaccin de la(s) enzima(s) involucradas en el proceso.
COOH
38
39
cido veratrlico
Alcohol veratrlico
El alcohol veratrilico ( 3 8 ) despus de 6 h de biotransformacin y separacin por

extraccin de cidoheutro, condujo a un 28 % de rendimiento del cido veratrlico
(39) y21.8
mg de neutrossiendoeste,
una mezclamayoritariade
alcohol
38
impurezasdetectadasporccfe
IR. Suponiendo que al aumentar el tiempode
biotransformacin la cantidad de cido aumentara, se llevo a cabo un experimento con 100 mg de 38 con un tiempo de reaccin de 24 h, produciendo tan solo un 13.3
% de producto, recuperndose
6.3 mg de neutros.Este
resultado no refleja lo
esperado ya que el alcohol monosubstituido con metoxilo en meta (27) nos di un 77

% de rendimiento y el ismero en para
(u) 32 %. Podemos entonces suponer un
que el substituyente en la posicin 4 puede regir la viabilidad del proceso oxidativo.
79
Con el objeto de ampliar la informacinsobre el sitio de la oxidacin, se decidi explorar la biotransformacin del grupo aldehido, ya que si bien no ha sido aislado por nosotros en nuestras condiciones, es lgico suponer que puede formar parte de
la ruta de oxidacin de la Nocardia corallina, pero sto era necesario demostrarlo. El

aldehdo veratrilico, se someti a biotransformacin por 9 h, obtenindose 39 % del cido veratrlico ( 3 9 ) , recuperando 41.3 mg de neutros cuya composicin mayoritaria era el aldehdo veratrlico. Este resultado nos indica que s es consistente el obtener
un mejor rendimiento al cambiar el substrato de alcohol al aldehdo, ya que el tomo

de carbono involucrado en la oxidacin cambia de nmerode oxidacin (-2 a O) y se acerca ms al embargo esta del cido carboxlico
+2 de ruta la
esperada de oxidacin. Sin
modificacin no contrarresta el fuerte efecto que disminuye la

Nocardia y solo se observa
capacidad oxidativa la de
un ligero incremento
comparndolo con el 28 % obtenido a partir del alcohol veratrilico (M), lo que resalta el efecto estructural del substituyente en para como responsable de estos resultados.
Dada la conocida capacidad
de oxidacin de aldehidos aromticos por
el aire se el
decidi estudiar el efecto del mediodecultivo,sin
el microorganismo,sobre
aldehdo veratrlico (experimento blanco). Se someti a las condiciones usuales por 51 h y luego de la separacin se recuper un 86 % del aldehdo. Con este resultado
so
se ratifica la capacidad la de
Nocardia para oxidar aldehdos aromticos
y
el
concluimos que el ambiente y el medio no participan significativamente en proceso oxidativo.
Nocardia corallina
bCH3
40
bCH3
41
Alcohol 6-bromoveratrlico cido
6-bromoveratrlico
En vista de los resultados y observaciones derivadas de la oxidacin del alcohol 3
8 ,
nos parecio interesante probar la biotransformacin con el alcohol 6-bromoveratrlico
(40); despus de 33 h se recuper solo materia prima (53
%). Lo anterior vino a
ratificar dos teoras que han surgido durante el desarrollo de ste trabajo, una que el efecto estrico en la posicin orto al sitio de reaccin es muy significativo y, segundo que la presencia de grupos metoxilo en el anillo aromtico conducen al consumo del substrato por una va no determinada, adems de que no se logro observar ni aislar productos de dicha ruta alternativa.
81
Dentro de los alcoholes benclicosmascomplejos cromanol (42), y el 4-flavanol
se prob laoxidacin
del 4-
(a), estructura cuya
bicclica podraaportardatos
acerca de los requerimientos estructurales de este proceso oxidativo.
42 4-cromanol
Con el 4-cromano1, despus de 30 h de biotransformacin,seobtuvoun balance. de masa de una mezcla de alcohol
94 %
y cetona, debido a estos resultados se
decidi aumentar el tiempo biotransformacin de dando despus de 100 h de biotransformacin, produjo
el siguiente resultado;
31.5 % balance demasadeuna
mezcla del alcohol original y la cetona. Lo cual nos esta indicando que en el proceso de oxidacin con la Nocardia coralhna, probablementetanto cetona se estn degradando. el alcohol como la
43 4-flavanol
82
El 4-flavanol
(a), despusde
observndose
144 h de biotransformacibn se recuper 39.3 %
balance demasadeunamezclacompleja, partida; no para stos
siendo minoritariamente el alcohol de ejemplos, viable el proceso de
biotransformacin con este microorganismo.
Dos ejemplos de alcoholes bencilicos heterocclicos fueron probados.
iOTZ Nocardia corallina
44
45
alcohol furfurlico Z= -CH20H

furfural Z= -CHO
cido furoico
El alcohol furfurlico (44), por ser ste el primer alcohol heterocclico que se
experimentaba, se decidi efectuar el estudio completo haciendo las
biotransformaciones con el alcohol (44, Z=-CH20H), el aldehido (44, Z=-CHO), y el cido furoico
(e), de adems una
reaccin blanco (aldehdo ms medio de

y despus de 25 h de
(45).
reaccin), obtenindose lo siguiente: Con el alcohol biotransformacin se obtuvo un 51.3 % del cido furoico
A partir del aldehdo y
8 5 0 h de biotransformacin, se obtuvo 71.4 % de rendimiento, del cido furoico
(S), recuperndose 35.9 mg de material neutro, siendo esta una mezcla minoritaria
83
del aldehdo. Para el icido
45 y despus de 25 h de biotransformacin, se recupera
h el 76 O del cido, con esto consideramos que el substrato, cido furoico, es estable
en el medio de reaccin y al microorganismo. La reaccin blanco, consistiendo de aldehdo y medio de reaccin, por 51 :20 h, se observa la recuperacin de solamente el 36.2 % de la materia prima.88 Laidentificacin del cido furoico (45) se efectu por ccf y pf comparando con una muestra autntica,
y por medio de los espectros de
RMN-H,* Masas, fueron idnticos a los publicados. Por

podemos afirmar, en primera instancia, la que
lo anterior
Nocardia s acepta estructuras
anlogas a los alcoholes benclicos; la biotransformacin
del aldehdo al cido nos
permite inferir tambin que el proceso oxidacin la de conespecie
Nocardia
involucra primero al aldehdo y despus se lleva a cabo la oxidacin hacia el cido correspondiente. Es evidente que el mejor rendimiento para preparar el c. furoico es a partir del aldehdo. Con esteresultado susceptibles oxidacin la de por se observaque
los aldehdosson
Nocardia coralha 6-276 y es ste, el primer
reporte de la biotransformacin de este grupo funcional.
De todos es conocido la catlisis que aporta
facilidad de oxidacin del anillo furnico por el aire y la en las condiciones de la materiaprima. el caso del blanco solo
la luz a este proceso, embargo sin
estudiadas en estetrabajo se favoreceunaoxidacinlimpia Esta sensibilidad a la que se alude, se hizo manifiesta en
(aldehdomasmedio),dado
el bajoporcentaje del aldehdorecuperado,tan
84
36.2 O , sin que se observe la formacin del c. furoico. Adems no se observa el h

proceso reversible de la reduccin del producto obtenido ni la destruccin del anillo heterociclico con la
Nocardia corallina,
como con ocurrido ha otros
microorganismos.88
46
Alcohol nicotnico
El otro substrato heterociclico seleccionado fue el alcohol nicotnico

a 5 h debiotransformacin,
(a), someti se
deseado
observndose a desaparicin de lamateriaprima,
dando un producto el cual se aisl a un pH de 4.85 (debido a que d i & oel
forma un zwiterion), despus de 24 h de extraccin continua de CHCl3 , el producto aislado no correspondi al cido nicotnico. Con el objetivo obtener de mayor
cantidad del posible producto se repiti la biotransformacin, triplicando la escala, sin embargo el compuesto logro no aislarse suficiente con pureza su para identificacin. Con el objetivo de comprobar si el producto deseado, cido nicotinico, se biotransformaba en el medio se decidihacer
un experimentocon
el cido
nicotnico, e cual despus de 25 h de biotransformacin; produjo un producto que l por IR no corresponda al cidodepartida.Deestamanera
85
seobservaque
el
material deseado es metabolizado biotransformacin.
a otro substrato
en las condiciones de
En la bsqueda de establecer los lmites y alcances de esta oxidacin de alcoholes

con N. corallina se probaron otros substratos con caractersticas electrnicas
similares a los anteriores, a continuacin se discutirn los resultados obtenidos en la biotransformacin de diversos alcoholes alilcos.
Nocanlia corallina)
34h/57.2%
47 alcohol cinmico
48 cido cinmico
El alcohol cinmico
(a), se seleccion como
un caso especial de alcohol benclico se someta a competencia la
con conjugacin extendida, en este compuesto
conocida capacidad epoxidante de la Nocardia corallina con la posibilidad estudiada por nosotros de oxidacin de un alcohol vecino a una doble ligadura, encontramos que en los experimentos efectuados no se observ en ningn caso la epoxidacin .deldoble enlace. Sinembargo, despus de 34 h de biotransformacin el alcohol cinmico nos di 57.2 % de rendimiento del cido cinmico (48) y 1.6 % material neutro, el cual fue identificado como el alcohol de partida.
86
Con la finalidad decorroborar el camino que siguelaoxidacinconla (primero biotransformacin aaldehdo
Nocardia
y posteriormente al cido) s se parte del
aldehdo cinmico el tiempo de biotransformacin debera ser menor la cantidad de y cido generado mayor, por lo anterior se decidi experimentar la biotransformacin del aldehdo cinmico; en estas condiciones, despus de 850 h, se obtuvo 23.4 mg
(20.87 %) del cido cinmico, se recupera 37.4 % del aldehdo. situacin que no se
correlaciona con los experimentos efectuados con el alcohol y el aldehdo furfurlico, donde la obtencin del c. furoico es favorecida a partir del aldehdo, esto puede ser racionalizado desde distintos puntos de vista que pasan por estructuras las intrnsecas de cada substrato y la labilidad inherente que favorece una descomposicin, etc..
Con el objetivo de ver el efecto del medio se prepar un experimento con aldehdo mas medio de cultivo por 51 hrecuperndose transformacin.Estos el 85 % de la materiaprima sin
resultados nos indican quelaoxidacin
del aldehdo s se
lleva a cabo por el microorganismo y el experimento con el blanco nos seala que el medio no induce una oxidacin qumica en las condicionesde biotransformacin.
87
(OH
N o c a r d i a corallina
YOoH
30h125%
49 alcohol perilllico
50 cido perilllico
Otro alcohol allico probado fue el alcohol perilllico (S),cual despus de 30 h de el biotransformacin, produjo
25 %, del cido perilllico (50). Se estudi la
biotransformacin del aldehdo perilllico y una reaccin blanco (aldehido y medio de cultivo), obtenindose lo siguiente: A partir del aldehdo y despus de 8 5 0 h de biotransformacin, se obtuvo 64.4 % de rendimiento del cido. La reaccin blanco despus de 51:20 h, se recuper el 94.5 % del aldehdo original. Cabe mencionar que en los experimentos efectuados no se observ en ningn caso, epoxidacin del aclarar que doble enlace terminal. Es necesario en nuestro ejemplo, la doble el grupo
ligadura que consideramos susceptible de epoxidacin en esta
isopropilideno; el metilo sobre ese doble enlace o ms an el ciclohexenilo mismo, pueden generar el suficiente impedimento estrico para que no ocurra la esperada epoxidacin. En la literatura se encontr que la epoxidacin de dobles enlaces de 2metilalquenos se lleva a cabo estereoespecificamente con produciendo un 76-90
O / O
Nocardia ~orallina,~
deexcesoenantiomrico
del enantimero R, lo que
contrasta con lo encontrado por nosotros.
FH3
51 cis-verbenol
52 cis-verbenona
Nos pareci interesante someter al proceso de oxidacin al (+)-cis-verbenol
(m,el
cual posee un alcohol allico secundario y una molculaconmayorcomplejidad estructural; despus de 28 h de biotransformacin se obtuvo la cis-verbenona (52) en un 71.3 % de rendimiento. Estees el primercasodeoxidacinde allico secundario quiral que se reporta con este microorganismo.
un alcohol
53 2-propen-I -01
Nos pareci interesante la reactividad que presentan los alcoholes allicos y esto
nos indujo a probar las oxidaciones microbiolgicas del 2-propen-1-01
m), cual el
despus de 26 h de biotransformacin y 25 h de extraccin continua con CHC13,nos da la mezcla del cido acrilico y e alcohol l
m),el cual
se identific por ccf e IR;
siendo e mayor problema la extraccin del producto y materia prima del medio de l
89
biotransformacin, hacindolo imprctico y difcil de cuantificar como producto aislado. A lo anterior se debe sumar la inestabilidad inherente al producto mismo el cual se polimeriza fcilmente, dificultando an ms su aislamiento. Por ste ejemplo, slo se puede afirmarmanera de
lo que para
cualitativa que ocurre una
biotransformacin.
HCEC-CH~-OH
54
Alcohol proparglico
Debido a qlue el triple enlace es muy cercano
en S#ucomportamiento a un doble
enlace, decidimos estudiar la biotransformacin de los alcoholes proparglicos, con

Nocardia corallina, si bien se considerqueporanaloga
con el substrato
53
se
podran presentar problemasen orgnicos deseados,
el procesode
recuperacin de los compuestos
del medio lquido de la biotransformacin. la Dada
disponibilidad del alcohol 54 se procedi al estudio correspondiente. A 150 mg del miembro mas sencillo o simple de esta familia, el alcohol proparglico (S), despus de 26 h de biotransformacin y 24 h de extraccin continua de CHC13 nos di ms de un gramo de neutros, lo anterior ilustra lo complejo que se vuelve el proceso de extraccin ya que se aisla materia orgnica del medio de cultivo y de la Nocardia. A diferencia del caso anterior y a pesar de seis experimentos no se puede afirmar que Ocurra la formacin del cido correspondiente. Se explor el efecto del medio y se
90
decidi realizar dos blancos, uno con el alcohol proparglico y otrocon el cido proparglico. Con el primercaso,luegode28
h dereaccin,
de los 150 mgde
partida se logr aislar 18.3 mg de un lquido caf despus de extraccin continua de CHC13 por 23 h, en el IR no se observa la seal caracterstica de la triple ligadura por lo anterior se concluye que el medio juega un papel participativo que conduce a otros productos no caracterizados e imposibilita por esta accin, el poder realizar la biotransformacin en los casos que se emple el microorganismo. Es de mencionarse que con el segundo blanco, el cido propargilico, despus de 28 h se obtuvo lo siguiente:De 150 mgserecuper36.2mg del mismo; lo anteriornos
ilustra que el medio sorprendentemente no lo descompone, a pesar uno que esperara una mayor labilidad por ser un sistema ms reactivo. Por lo anterior estos resultados nos llevan a la necesidad, para ste substrato, de seleccionarlo para otro tipo de condiciones de biotransformacin; las clulas inmovilizadas pueden ser una va en un medio lquido diferente al aqu utilizado. El producto ms importante aislado de estabiotransformacinpresenta un peso molecularde 254.9921 por
espectroscopia de Masas y se observa por RMN-H 4 grupos de seales en 3.37 un singulete (rea 3.37) en 4.4238 singulete (rea 2,18)y seales complejas en la zona de hidrgenos aromticos de 7.8165-8.0542 (rea 3.1 y 1 .O0 respectivamente); por
I C=O en1738 R
estructura.
cm ; con informacin esta
no hemos asignado todava una
91
OH H3C-CH-CECH
55 3-butin-2-01 Porotro lado el 3-butin-2-01
(S),34 con
h debiotransformacin,
se observ la
desaparicin de la materia prima,
y la aparicin de una mezcla de productos
(aproximadamente 22% de balance de masa) el cual por IR se observa la presencia del grupo carbonilo en 1686.7 cm" y la desaparicin de la triple ligadura y por RMN1
H se indica la ausencia del hidrgeno del alquino y no se observa el metilo en 2.4 el producto deseado 3-butin-2-ma. al producto
ppm que sonlassealescaractersticaspara Con este resultado se decidi someter
al medio de biotransformacin
esperado y ver cual era el efecto de la Nocardia sobre el mismo, despus de 34 h de biotransformacin y extraccin continua de CHCl3 se obtuvo un crudo inestable (aproximadamente 25% balance de masa) el cual por IR presenta setales similares a los observadas anteriormente.
Por el momento no sehadeterminadolaestructura reacciones, ste pero resultado inesperado sumado
de los productos de ambas al obtenido con el alcohol
proparglico nos induce a reafirmar la necesidad de abrir, en un futuro, una nueva lnea de investigacin relacionada a la biotransfosmacin de alquinos con Nocardia
92
corallina, y se deber de
seleccionar substratos de peso molecular ms alto para
obviar las dificultades encontradas en el proceso de aislamiento.
Otro objetivo del presente trabajo era profundizar el estudio iniciado por Luna et al2, de la oxidacin de dioles para producir lactonas, por ello fueron seleccionados los siguientes dioles simtricos y no simtricos para someterlos a biotransformacin:
HO
H o T H
Y
57
OH
OH
56
1,4-pentanodiol
58
1,5-hexanodiol
1,4-octanodiol
HO
7
Ph
OH
OH
59
1-fen-I .4-butanodiol
60
1,5-undecanodiol
HO - H O
61
HO
/"=>
62
OH
cis-2-buteno-I ,4-diol
93
2-butino-I ,4-diol
Se obtuvieron los siguientes resultados:
El 1,4-pentanodiol ( 5 6 ) , despus de 27 h de biotransformacin y extraccin continua

con CHCI3(12h), se obtuvieron 30 mg que por IR, RMN-'H, no corresponden a la yvalerolactona deseada, observndose que es materia prima con otros compuestos.
'."
El 1,4-octanodiol (57),despus de 30 h de biotransformacin y extraccin continua
con CHCI3 (12h), se obtuvieron 14 mg que por IR, RMN-'H, no corresponden a la yoctanolactona deseada, compleja. observndose que es materia en mezcla primauna
El 1,5-hexanodiol (58),despus de 27 h de biotransformacin y extraccincontinua

de CHCI3 (12 h), se obtuvieron 69 mg que por IR, RMN-'H, no corresponden a la 6hexanolactona,reproducindose
los resultadosanteriores
-.
;-:
I
t
5 f.
L':
de no formacin de la
lactona, recuperacin conmucha dificultad de partede la materiaprima y por el volumen de disolvente empleadoextraccin de otroscompuestos del medio o de residuos de la Nocardia.
El I-fenil-I ,4-butanodiol
(S), despus de
26 h de biotransformacin y extraccin
continua con CHCl3 (12 h), se obtuvieron 32 mg de crudo que por IR, RMN-'H, no
94
corresponden a la y-fenily-butirolactona deseada, observndose un resultado similar a los anteriores.
El 1,5-undecanodiol
(m),
despus de 26 h de biotransformacin
y extraccin
no
continua con CHCI3 h),obtuvieron (12se corresponden a la 8-undecanolactona deseada.
1 mg que por RMN-H, 6 IR,
El cis-2-buteno-l,4-diol
(a), despusde
29 h de biotransformacin y extraccin
continua con CHC13 (12 h), permiti aislar un 42 % de la 2-(SH)furanona, la cual fue identificada por cd, IR, RMN-H y espectroscopiadeMasas.Estesubstrato aislado por Luna et al2con fue
un rendimiento del 50 %, por lo anteriorpodemos
concluir que nuestras condiciones de biotransformacin estn estandarizadas y los resultados son reproducibles, por lo que el problema es debido al tipo estructural de
los dioles seleccionados.
El 2-butino-l,4-diol (62), depus 26.4de de h biotransformacin

continuaconCHCI3 (12 h), se produjo 56 O (balancedemasa) h
y extraccin
de una mezcla
compleja. Aunque no se esperaba obtenerlactona, la
debido a la restriccin
estructural para la ciclizacin, fue interesante constatar la reactividad inesperada de
los alquinos observada con los alcoholes proparglicos.
95
Con estos
resultados se puede inferir
que dioles con
alifticos lineales,
con
posibilidad de giro libre, no hay formacin de las lactonas esperadas, al menos en las condiciones estudiadas; solo el caso del cis-Z-buteno-l,4-diol noscondujo al
producto esperado. Estos hechos sumados a los logrados por Luna, orientan a que adems de requerir estar libres los dos hidroxilos se requiere una relativa rigidez en la molcula que mantengan cercanos ambos grupos oxidrilos, para que proceda la biotransformacin.
Dentro de los objetivos de sta tesis se planteaba el estudio, en su etapa inicial, de la posibilidad de inmovilizar las clulas de N. corallina y su posterior evaluacin en relacin a su capacidad oxidativa. Se seleccion al alcohol furfurilico como substrato que de referencia por los excelentes resultados que ste produjo, adems de ste es el primer reporte de preparacin biocatalizada del cido furoico.88
En primera instancia se empezaron haciendo pruebas con siete fases lquidas, para ver la resistencia de esferas las (sin Nocardia corallina), tanto mecnica como
qumica. Se probaron con 20 esferas en cada experimento, se realizo la medicin de las esferas con un Vernier:
1) Medio de cultivo, DMF y n-octano, dimetro de las esferas entre 2.0-2.2 mrn
2) DMF, dimetro de las esferas entre 2.2-2.3 mm
96
3) n-octano, dimetro de las esferas entre 2.3-2.5 mm
4) hexano, dimetro de las esferas entre 2.7-2.8 mm

5) n-octano y medio de cultivo, dimetro de las esferas entre 2.7-2.8 mm
6) DMF y medio de cultivo, dimetro de las esferas entre 2.7-2.8 mm
7) Medio de cultivo, dimetro de las esferas entre 2.8-2.9 mm.
Se agitaron a 28-30
O C
y a 200 rpm con diferentes tiempos 22 h, 48 h, y 88 h. A las
22 h se observ lo siguiente para cada caso:

1) Se pusieron opacas sin cambio significativo en su dimetro
2) Su dimetro aumento de 2.2-2.3 mm a 2.7-2.8 mm
3) Su dimetro disminuyo de 2.3-2.5 a 1.8-2.0 mm y se endurecieron

4) La finalidad de utilizar hexano por n-octano fue por el costo de ste ltimo, pero
este se empez a evaporar en nuestras condiciones, adems de que las esferas se hicieron ms chicas, dimetro de 2.7-2.8 mm a 2.13 mm
5) Se pusieron opacas, su dimetro aumento de2.7-2.8 mm a 4.03 mm

6) No se aprecia cambio significativo
7) Se pusieron opacas, su dimetro aumento de 2.8-2.9 mma 4.51-4.78 mm.
A las 48 h y 88 h de agitacin en estas condiciones de evaluacin, algunas esferas

se empezaron a romper y se incrementaron las caractersticas anteriormente
97
descritas; cuando la esfera se agrandaba stasedeformaba adquieren una apariencia de disco irregular, similar a lentejas.
y algunas de ellas
Con base en este estudio preliminar, se decidi hacer las biotransformaciones en la fase lquida denominada I), medio cultivo, con de velocidad de agitacin menor ( 140-160 rpm).
DMF y n-octano, pero
con
La biotransformacin del alcohol furfurlico al c. furoico nos dio los siguientes resultados: Se obtuvo el cido furoico con rendimientos del 22 al 37 %, por periodos de 24 a 72
h de bioconversin. Se encontr que las clulas inmovilizadas pueden reutilizarse

hasta tres veces, manteniendo su eficiencia y conservando su actividad hasta por siete meses despus de inmovilizadas. resultados Estos requerirn optimizarse, sin embargo se demuestra es que son preliminares y posible conservar la
actividad enzimtica de la Nocardia corallina6-276por tiempos mayores y se facilita el trabajo de extraccin, por la sensible disminucin de la biomasa y los crudos se
obtienen ms limpios; con respecto at medio no requiere de esterilizacin.
98
CONCLUSIONES
1. Se estudio el efecto dela estructuraen el procesode oxidacin con Nocardia
corallina de alcoholes benclicos; con la informacin obtenida se observa
un ligero
efecto que tienen ciertos substituyentes tanto en la posicin relativa que guardan con respecto el grupo a oxidar, como por la naturaleza de sus propiedades, aunque no se logr encontrar una relaci6n lineal entre los efectos electrnicos de substituyentes y los rendimientos de la reaccin.
los
2. Se demostr que la oxidacin de alcoholes bencilicos puede ser extrapolada a

sus contrapartes heterociclicas (alcohol furfurlico) y la posibilidad de utilizar otro tipo de hidrocarburos aromticos como el naftaleno.
3. Se observ que el aldehdo correspondiente, aunque no se logra aislar,

ser intermediario durante el proceso de oxidacin.
puede
4. La oxidacin de dioles en estascondiciones,presentacomo
gran limitacin la
.necesidad de una estructura rgida en el diol inicial para permitir la oxidacin. Lo anterior es un hallazgo que restringe de manera notable el espectro de posibilidades para preparar sintnes con control de la estereoqumica en las lactonas resultantes.
99
5. Con base en los resultados obtenidos la tcnica de inmovilizacindesarrollada
s afecta la eficiencia de la oxidacin microbiolgica
de Nocardia corallina
observada a nivel matraz; aunque por el momento no se pueden sacar conclusiones determinantes,antes de efectuarestudiosmasprofundos al respecto.Aunque se
observan ventajas para el manejode la oxidacin con la inmovilizacin, se deber continuarbuscandootrossistemas

corallina.
para fijarlasclulascompletasde
Nocardia
6. Dado el tiempo de vida activa de las clulas inmovilizadas, se puede concluir que
el procedimiento adecuado optimizable es pero y puede industrial de esta metodologa de oxidacin.
hacer viable el uso
7. Se puede ya, estructurar algunas propuestas
acerca del alcance y limitaciones
de esta biotransformacin que nos permita considerarla como un mtodo general de oxidacin, las cuales son:
Que los gruposmetoxilos(activadoresfuertes),puedentener
un efectoen
el
microorganismo que dificulta su bistransformacin, (esto dado los resultados con los alcoholes p-,o-metoxibenclicos, veratrlico y 6-bromoveratrlico).
1O0
- Que la posicin meta independientemente del substituyente tendran rendimientos

ms altos, debido a un ligero efecto electrnico.
- Que la metodologa con Nocardia corallina puede extrapolarse a otros compuestos

heterocclicos relacionados,
- Que con derivados de alcoholes allicos en estas condiciones, la Nocardia corallina

prefiere oxidar al tomo de carbono del alcohol o del aldehdo m& que inducir la adicin deoxgeno a doblesligadurasparadar el epxidocorrespondiente,por
ejemplo en los casos de los alcoholes y aldehdos perilllico, cinmico.
101
PERSPECTIVAS
Con los resultados alcanzados y la experiencia adquirida en esta tesis, visualizaralgunasaccionesporcontinuarconla
se pueden
investigacin enstarea,as futuro cercano. Considero
como otros tpicos que podran desarrollarse un en relevante desglosar algunas ideas en este sentido:
1. Se debe continuar el estudio de la oxidacin de alcoholes bencilicos secundarios, con el objetivo de evaluarla Nocardia enantioselectividad del proceso de oxidacincon allicos racmicos la acabo su resolucin,
corallina. As como en evaluar alcoholes
biotransformacin para encontrar las condiciones para llevar con base en elresultado observado con el cis-verbenol.
2.
Es conveniente continuarcon el estudiode la inmovilizacin de la Nocardia
corallina incluy6ndose la evaluacin de diferentes tipos de material de soporte.
3. Siguiendo la mismalnea de investigacin,seleccionaralgunossubstratosde
esta tesis y efectuar biotransformaciones con otros microorganismos, especialmente actinomicetos.
102
4. Hacer una bsqueda de posibles compuestos de inters comercial, en donde se

pueda aplicar esta metodologa con Nocardia corallina,para eventuales desarrollos tecnolgicos, sta idea estara muyrelacionada con la perspectiva 2.
5. En la lnea de extender las
bondades de e s t i metodologa, por correlacin con
los reactivos qumicos tradicionales, los cuales llevan a cabo la oxidacin de

alcoholes benclicos y transformacindedioles a lactonas, se podria explorarla
aplicacin de sta metodologa microbiolgica para la preparacin desulfxidos quirales por oxidacin con Nocardia corallina de sulfuros proquirales, ste puede ser un tema de inters; dada la amplia gama de aplicaciones de estos substratos en puede ofrecer un mtodo
sntesis. supuesto obtencin las Por la de sulfonas alternativo de sntesis.
6. Profundizar en el estudio la de oxidacin de
dioles a lactonas quirales,
especialmente incrementando la rigidez de la molcula en los substratos.
Con estos ejemplos de perspectivas para ampliar esta temtica, se puede observar la riqueza de posibilidades que puede ofrecer el campo emergentelas de biotransformaciones.
103
RECONOCIMIENTOS
AI Consejo Nacional de Ciencia
y Tecnologa por
el apoyo brindado la para
realizacin de este proyecto doctoral por medio del Programa de Apoyo a Proyectos de Investigacin (0491P-B9506) y el Programa Fomento de al
Posgrado(PFP/200/93).
A la Divisin de Ciencias Biolgicas y de la Salud
de la Unidad Xochimilco por el
apoyo brindado para la realizacin de la parte experimental de sta tesis. Se agradece al M.en C. Atilano Gutirrez Carrillo por la realizacin de los espectros de RMN-'H en esta Universidad.
104
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112
ARTCULOS PUBLICADOS
Oxidation of substituted benzyl alcohols to carboxylic acids ,by Nocardia corallina 9-276
Herminia 1. Prez*, Hctor Luna, Luis A. Maldonados, Hotacio Sandoval, Norbert0 Manjarrez, Aida Solis and Remedios Snchez.
Universidad Autnoma Metropolitana, Unidad Xochimilco. Departamento Sistemas Biol6gicos; A. P. 23/181; Mxico, D.F, MEXICO. 'Instituto de Qumica, Universidad Nacional Autnoma de Mxico, Ciudad Universitaria, Mbxico, D.F., MEXICO. Whole cells of Nocardia corallina 8-276, oxidized 21 substituted benzyl alcohols, at 1 mM scale, to carboxylic acids a 28-30 "C. giving yields of products from 5 to 77% t
Introduction
Oxidation of alcohols to either aldehydes or carboxylic acids is a process generally performed at laboratory scale with the Jones reagent (Lindberg, 1984)but in industry it is usually carried our with O?in presence of organometallic catalysts (Sharpleu. 1985; G o , 1990; Lee et aI., 1991). Biocatalytic methods are emerging as viable alternatives to traditional organic chemistry methodsand tohelp overcome adverse environmental impacts.
Among the more used microorganisms inthis field arc: Pseudomonas. Nocardia. Rh&ns, An'ttetobacttn; Xanthhactcq CunningbameIIa an Chuetmium ( Holland, 1992). Thus, it is well documented the ability of Nocardha rwulliwa to oxidize alkenes to optically active 1,2-cpoxyalkanes (Takahashi and Furuhashi, 1990;Furuhashi, 1989).
General procedurefor biotransformation PreCulture I

A 125 m1 Erlenmeyer flask containing 50 m1 of sterile culture medium was inoculated from an agar plate ( t h e days old) and incubated at 28-30 "C on an orbital shaker (200rpm) for 20-24 h.
Preculture II The content of Preculcure I flask was aseptically poured into a 250 m1 Erlenmeyer flask conraining 100 m1 of fresh sterile culture medium. fiuk The was incubated at 283 "Con an orbital shaker (200 rpm) b r 24 h. 0
''
.
'
"
c.
c .
I
Biotransformation
Under aseptic conditions the substrate (1 mmol) was added to the Bask containing Prcculture I1 using 1 m1 of N,NDimethylformamide, followed by the addition of n-octane (15 ml). The mixture (166m1 final volume) was incubated at 28-30 O on an orbital shaker (200 rprn). The bioC transformation was monitored by TLC, andstopped (sec Figure 1, 2, and 3 for reaction time of each substrate) by acidifing to pH 1 with 0.05 M HCI, then saturated with NaCl and filtered through Celite; the carboxylic acids were extracted with ethyl acetate or dichloromethane (4 X 25 ml). The acids were purified by recrystallization.
:;r.
% ;
u,
Luna et al., 1993 reported the application of Pscvdomonas ofewwans and Nwardirr roraffina to the biotransformation of allylic alcohols to the corresponding aldehydes or carboxylic aclds, these results were interesting as it was the fist report of these two microorganisms oxidizing alcohols. Due to our interest in microbial oxidations, we describe here a study of the microbial oxidation of x v e d substituted benzyl alcohols to carboxylic acids.
Materials and methods

Ncxaria rmrrllina 0-276ATCC 31338 was grown at 28-30 O on agar plates (Luna et aI., 1994).Incubation of liquid C cultures was done in an orbital shaker. All substrates were prepared by conventional methods mentioned in theliterature or purchased from Aldrich, Sigma or Janssen. All carboxylic acids were identified by infrared spectra, as liquid films or KBr discs, and by TLC on Silica gel 60 GF214, compararive analysis with authentic samples. for
8 1998 Chapman & Hall
Results and discussion

Benzyl alcohol, gave acomplexmixture of products as shown by TLC analysis, wherc benzoic acid, the expected product, was never found. The possible reason for the unexpected result was thatthis substrate may be taken throughthe metabolic cycles of the bacterta and transformed to different products. We also subjected benzoic acid to the same reaction conditions, resulting in the recovering of the unchanged acid; showing in this manner
Biotabnology Lat ; . Vol 20 . No I . tu
I
1998
77
"-
H.!. Perez
et
al
that the expected oxidarlon product was nor further metabolized.
To discuss the subsequent results we grouppedthesubstrates by substitution patterns. In the ortho series the hydroxyl substituted benzyl alcohol 1 gave the best results of all with a 74% yreld (see Figure 1). We explain this fact under the hypothesis of the closeness of the o-hydroxyl group to the reaction sire; this idea is supported by the observation in previous work (luna et uf., 1994) where 1,4-diols are transformed by N. rwaflino to the corresponding lactones, when rhe two hydroxyl groups are close enough to interact; when such interaction is prevented, the oxidation did not take place. The halides gave the acids in low yields (6 19% and 12, 12%), and the methoxyl derivarive 9 gave only 5% yield. The nitro compound 3 failed to give oxidationproducts with the recovering of starring material. The mho-ammo compound 7 gave a complex mixture of products, from which a main product could not be isolated.
In the paru series (see Figure 2), this methodology failed for the hydroxyl-substituted compound 19, reinforcing our early suggestion, but the other derivatives, pru-chloro 15, pura-nitro 17, para-merhyl 21, were biotransforrned in moderate yields (50%,50% and 4795, respectively). In the mta series (see Figure
Figure 1 Biotransfomation of ortho-substitutedbenzyl afcohols
5 % and 32% yield obtained for the mho and para cases respectively, strengthening our previous statement.
Table 1 shows asummary of results obtainedwith five different substituents attached to the rhrce isomeric positions; with exception o f the mta-chloro compound 29, the other four cases showed for the mta series the best yields in chis study.
In general we c a n conclude that a slightly electronic effect is influencing the oxidation process with Nocaraiu rwa&w in terms of isolated yields. We can also explain these results, considering a steric effect in the ortho series, with exception of the hydroxyl group; but as we mention before, we attributed this fenomena to the facr that in 1, there is
3), rhe ma-nitro compound 25, produced the acid 26 in 64% yield. Comparing chis last result with the mho-isomer 3 (where no bioconversion took place) and the pura-isomer 17, with a 50% yield; make us to think in the possibility of some electronic effect being involved during this biotransformation. The mtumcthoxy compound 27 gave 77% yield, contrasting with a
P .
% Yield * Reaction Time (molhol) (h)
13: R= OCH3 15: R= C1 17: R= NO2
14: R= OCH3 16: R= c1
19: R= OH
2 3 : R= Br
18:R=N02 20: R= OH
22:R= 24: R= Br reactions &tions
32 6 5 0 2 4 50 24
X*
21:R= CH3
4 7 11
24 27
34
* I m M substrate used in each case ** Complex mixtun.

Figure 2
w e n not optimised.
Biotransformation of para-substitutedbenzyl alcohols
Oxratton of strbstjruted benzyl afrohoh roTrboxylir arrdr by Nocardia corallina B-276
Table I Comparison of isomeric (ortho,neta, para) mono-sustitutedbenzylalcohols.

ortho
Substituent Rxn OMe
meta yield (%)

1 5 Rxn time ( ) h
Pam
Yield (%)
time ( ) h
Rxn time (n) 24 6 24 34 27
Yield (%)
NO,
110
CI Br Me
27 26 30 n.d.
19
12
n.d.
123 25 25 25 25
64 77 46
50
32
50
11
52
72
47
1: 25 % startlng matenai recovered n.d.: not deterrnlned
similar h), to the yield produced with the pmeroxybenzylic alcohol 13. The inclusion of an extra bromine atom to the last compound, in position-6, 37, did not lead to the expected 6-bromoveratrylic acid, possibly due to the increase in the sterlc hindrance at ortho position. The 5-bromo-2-hydroxybenzyl alcohol 39, showed a very similar behaviour, producing only 22% yield ( h e r 144 h) of the corresponding acid, in contrast with 7496 produced for 1. In conclusion, we consider this merhodology of general application for the oxidation of benzyl alcohols tothe corresponding carboxylic acids with substituents rhe in meza and para positions.
Rgum 3 Biotransformation of meta-substitutedbenzyl alcohols
Acknowledgements
Wethankthe financial support of Consejo Nacional de Ciencia y Tecnologia, MEXICO, Grant Num. 400200-
m'rc
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Lett.
325055.
hydrogen bonding between both hydroxyl groups, favoring the action of the enzyme to carry out the bioconversion. This possibility is forbidden for the mechoxyl group. We extended our study, exploring the oxidation of more substitured benzyl alcohols. Ventrylic alcohol 35 (see Figure 4), a trisubstituted compound. produced the corresponding acid, veratrylic acid. in 28% yield (after only 6
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Received: 6 October 1997 Revisions requested: 17 October/6 November 1997 Revisions received: 3 November/28 November 1997 Accepted: 1 December 1997
Blotahnology
Lmws
. Vol 20 . No
1998
79
. . ...
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.
.
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I
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~
PREPARACIN DE CIDO FUROICO POR OXIDACI~N MICROBIOL~GICA

FUROIC PREPARATION BY MICROBIAL OXIDATION ACID
Hctor Luna, Norbert0 Manjarrez A, Herminia 1 Perez M Aida Sols O. y Remedios Snchez D. . . . , Metropolitana-Xochimilco. DepartamentoSistemas Biolgicos, Universidad Autnoma
. .. . . .* .. . .-.. , . "." ._;_ ....._...;. , .." ,

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~
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INTRODUCCI~N n nuestra lnea de investigacin sobre biotransformacionesse est trabajando enel desarrollo de mtodos biocatalticos de oxidacin de alcoholes ); tipo benclicos (1 una variante de este de compuestos son los derivados heterocclicos, delos cuales el alcohol furfurlico es un ejemplo. S decidi e experimentar con este alcohol debido a Nuestro reporte es el primen, de esre tipo de que algunos reportesindican que la biorranhmaci6n de un compuesto Neurospora (2) efecta esta hetwociclicop r Nocardia corallina. o biotransformacin a travs de un rnecanismo complejo de xido.reduccin en el cual intervienen los tres estadios de oxidacin de este compuesto(alcoholmuchas veces generan residuos dificiles de aldehdo-cido carboxlico); consecuentetratar. v Dor lo tanto son inaceotables bajo mente, es imposible SU aplicaci6n prepara- las nuevas regulaciones ambientales. . tiva. Otros microorganismos llevan cabo a L~~ mtodos biocatalticos permiten la la destrucci6n completadel anillo (3-5). eliminacin eltratamiento del agua y(o) Dentro de laqumica orgnica indusresidual de la reaccin,10 que al final del trial, la oxidacin constituye una de las et proceso presenta un menor impacto en principales herramientas en la sntesis de ambiente, sin mermar la eficiencia qumica 0 compuestos orgnicosy por 1 tanto es uno de la transformacin. de los mtodos con mayorpotencial de dao ecolgico;p o r ello, son siempre bienvenidos los desarrollos de metodolbgas alternas. La oxidacin de alcoholes a aldehdos o en su caso a los cidos carboxlicos correspondientes es un proceso que, por lo general, se efecta en presencia de oxgeno y cataliradores organometAlicos de titanio (6-9) o manganeso (1 0,111. Estos mtodos
~ ~~
heteiiiz;
Nocardiac o r a i l i m ~
El cido furoico (ver Fig. y otros 1) anlogos se utilizan para conservar alimentos debido a su efecto baaeriosttico y fungicida (121, Pero SU importancia radica en formar parte de intermediarios en la sntesis de compuestoscon antimicrobiana (13-21). Seha informado de la preparacin, con mtodos qumicos, del cido furoico a
COOH
cido furoico
alcohol furfurlico Z= -CHzOH
Correspondencia: Hktor luna Calzada del Hueso 1100, Col. Vtlla Quietud C.P. 04960MCico,D.F.
17
pamr del turiural por reaccin con KMnO, (22)o con K2Cr,07 (23); una reaccin va de Canniuaro con NaOH (24,251;por oxidacin catalitica con sales de Ni2+, Co en NaOCl (26);por oxidacin con aire y Pd/carbn animal en solucin acuosa alcalina (27);por reaccin con aire sobre Ag,O en medio alcalino (28)o con CuOAg,O-C en un medio alcalino (29);por oxidacin con Ag (30),o aire sobre CuOAg20(31 ); con perxidode hidrgeno en medio alcalino (32);y con disolventes orgnicos como piridina (33).Tambin se ha empleado NaOCl (34,352para esta transformacin.
Procedimiento general para eiectuar las

biotransformaciones
nasas, heron identlcos a los publicados
37-39).
RESULTADOS Y DlSCUSlN
MATERIALES Y MhODOS Los espectros de infrarrojo con transformada de Fourier(FTIR) se determinaron en un espectrofot6metro Perkin Elmer modelo Paragon 1000; los espectros de resonancia magnQica nuclear (RMN-Vi), un en espectrmetro Bruker modelo DMXSOO; y los espectros de masas, enun espectrmetm leo1 modelo GCmate.Los puntos de fusibn no estn corregidos. Las identificaciones por cromatografia en capa fina (ccf) se efectuaron utilizando silicagel ,C F , Merck. Los reactivos empleados fueron de a marcas: Aldrich, Sigma, ls Merck y Bioxon. La bacteria Nocardiacoralha 6-276 (ATCC 31338) se adquiri en la American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). La activacin de la bacteria se efectu a 30C en placas de agar, con la siguiente composicin: extracto carne, de 3.0 g/L; peptona, 5.0 g R ; agar, 15 g k ; a un pH = 6.8. El medio de cultivo lquido se prepar de la siguiente manera: Solucin A: FeSO, o7H,O, 0.05 g/L; K,HPO, ,1.74 g/L; (NH,),SO, , 2.0 d ; L ekracto de levadura, 1.O @L. Solucin B: MgSO,, 1.5 g/L. Solucin C: glucosa, 2.0 g/L. Cada solucin se esteriliz por separado, y posteriormente las soluciones se mezclaron bajo condiciones aspticas ajustando el pH final a 8.0 (*0.5), con KOH al 50% o H2S0, al 50%.
Precultivo I: Un matraz Erlenmeyer de 125 ml con 50 ml del medio de cultivo estril fue inoculado con las clulas contenidas en una placa de agar icon crecimiento o desarrollo por ms de 72 h), e incubado a 28-30Ccon agitacin rotatoria (200rpm) por 24 h. Precultivo /I: El contenido del matraz de la etapa del precultivoI fue aspticamente trasvasado a un matraz Erlenmeyer de 250 ml, el cual contena 100 ml del mismo medio decultivo esteril; el matraz se incub a 28-3OoC con agitacin rotatoria (200 rprn) por 24 h. Biotransfarmacinde/ alcohol hrfurlico: Se adicionaron, en condiciones aspticas, 150 mg de alcohol furfurflico al precultivo 11, utilizando N,Ndimetilformamidacomo codisolvente y adicionando n-octano como segunda fase. La mezcla se agit a 28-30C durante 25 h. Eaislamiento del producto l se realiz6 llevando la mezcla de reaccin a pH cido con HCI al 20%, saturando con NaCI y filtrando sobre celita; el liquidose extrajo con acetatode etilo, se sec6 sobre sulfato desodio anhidro, se filtr6 y el disolvente se evapor a presi6n reducida; finalmente se purific por recristalizacin de agua, pf=125-7OC (informado, 1301400(36). La identificacin del cido furoico se efectu porc d comparando con muestra autntica,y los espectros de FTIR, RMN-H y masas fueron idnticos a 10s publicados (37-39). Biotransformacin de/ furfural: S adicioe naron, en condiciones aspticas, 1O mg 0 de furfural al precultivo 11, utilizando N,Ndimetilformamida como codisolvente y adicionando n-octano como segunda fase. La mezcla se agit a 28-30C durante 1O h. El aislamiento del producto se realiz llevando la mezcla de reaccina pH cido con HCI al 20%, saturando con NaCl y filtrando sobre celita; el lquido se extrajo con acetato de etilo, se sec sobre sulfato de sodio anhidro, se filtr y el disolvente se evapor a presin reducida, se purific por extraccincidoheutro, recristalizndose de agua, pit125-7C. La identificacindel cido furoico se efectu por ccf comparando con muestra autntica, y los espectros de FTIR, RMN-H y
I
E alcohol furiurlico (150 mg) 25 h, de l 5otransformacin produjeron 87.7 mg .51.3%)de cido iuroico, despus de *ecristaliracinde agua.
E furfural (100 mg) y 1O h de l 3iotransformaciny purificacin por 2xtraccin cidoheutro produjeron 83.2 n g (71.36%)del cido furoico; despues de wristalizacin de agua. S prob la estabilidad del cido e iuroico (50 mg) en las condiciones de oiotransformacin durante25 h recuperndose 75.8% del cido. Con este experimento se demostr cierta estabilidad deeste Justrato enel medio de reaccibn y la poca afinidad del microorganismo por 6 , a 1 diferencia de los reportes mencionados anteriormente parael caso de Neurospora (2)y otros microorganismos(3-5).
En la literatura se indica que el furfural puede autooxidarse en ciertas condiciones de reaccibn ( 4 0 1 , lo que nos condujo a del probar la estabilidad aldehdo en nuestras condiciones de trabajo, sin la presencia del microorganismo (prueba blanco). La recuperacin de solamente el 36.2% del material inicial nos conduce a pensar que podraestarse llevando a cabo un proceso similar de autooxidacin. La biotransformacin de furfurala cid0 furoico con Nocardia cora//ina nos permite inferir que la ruta seguidapor el alcohol es primero la biotransformacin al aldehdo furfural y la posterior oxidacin de &e al cido furoico correspondiente; es evidente que el mejor rendimiento para preparar el cido furoico es a partir del aldehido. El anillo furnico es fcilmente oxidable por el aire en presencia de luz; esta sensibilidad se hizo manifiesta en el caso del blanco (aldehdoms medio), dado el bajo porcentajedel aldehdo recuperado, tan d o 36.2%, sin quese observe la formacin del cido furoico. Las condiciones de biotransformacin aqu reportadas favorecen una oxidacin limpia del alcohol furiurlico y del furfural.
CONCLUSIONES Una de las ventajas de la biotransformacin
con este microorganismo es la proteccin del ambiente. Adems, no se observa el proceso reversible de la reduccin del producto obtenidoni ladestruccin del anillo heterocclico con laNocardia corallina, como ha ocurrido con otros microorganismos. S aprecia la viabilidad de esta e metodologfa, ya que se puede partir indistintamente del alcohol o del aldehdo correspondiente, conduciendo aresultados reproducibles. Cabe hacer notar que &te el primer es reporte de la preparacin del cido furoico por mtodos microbiolgicos.
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RECONOCIMIENTOS
AI Consejo Nacional de CienciaTecnologia por el y apoyo brindado para el desarrollo este trabajo. por de medio del Programa de Apoyo aProyectos de Investigaci6n (0491 P-89506)y el Prugrama de Fomento al Posgrado (PFP/200/93).Se agradece al M. en C. Atilano C u n W Camllo la realizaci6nde l o s espectms de RMN-'H en esta universidad.
KITS DEDIAGNOSTICO NO APQOBADOS i a FDA advierte sobre la exiFtencia de "kits" no aprobador. para diagnsticoen casa. La Agencia para los Alimentos y Medicamentos(FDA por sus siglas en ingls), advierte a consumidores y arma. ' cCuticos sobre dos no aprobados y fraudulentos kits de diagnstico para uso en casa distribuidos por Lei-Home Access Care, que es una divisin de BiotecnologaJinGreen, Inc., en Synnyvale, California. Uno de los kits de diagnsticoes promovido atravs de Internetcomo "Personal HIV Test Kit" y se llama "LeiHome Access HIV Test". Eotro kit de l diagnstico esta etiquetado como "InHome-Hepatitis A Test Kit". La FDA recomienda que cualquiera de estos dos kits no aprobados de diagnstico sean retirados de las farmacias y tiendas que distribuyenestos productos al consurnidor. Actualmente la nica prueba domstica aprobada para detectar virus que causa el la enfermedad delSlDA se distribuye en Estados Unidosy se llama "Home Access HIV-1 Test System" (tambin llamado Home Access Express HIV-1 Test System), producido por Home Access Health Corp., Hoffman States. Con este sistema domstico el consumidor puede enviar por correo una muestra de sangre seca, obtenida a partir de la picadura un dedo, a un en
primer paso por el hgado v deja de estar presente en la c-ircuiacin sistmlca. S ei i me:abolisrno es inhibido o sawado. el proirirmacoalcanza la circuiacin y proionga el intervalo QT en uc ECC. Este predispone a a:ritmias ventriculares que pueden avanzara iibrilacin ventricuiar y la muerte. Es importante recordar que la probabilidad de muertees muy bajay que Fuente: Internet, httpd/www.fda.gov la prevencin arritmias puede lograrse de con el uso correcto dela terfenadina. As, ANTlHlSTAMfNlCOS QUE NO CAUSAN la terfenadina no debe administrarse a SUEO pacientes con problemas cardiacosy con La Terfenadina es un antihistamnico no enfermedades hepticas; la dosis mxima sedante usado para reducirla fiebre. debe ser de 120 mg al diaen adultos y no Cuando se usa adecuadamente, la debe administrarse enconjunto conlos terfedamina tieneun ndice de seguridad siguientes frmacos: ketoconazol, alto, pero cuandose administra a pacientes itraconazol, antifngicos relacionados con con enfermedades cardiacas hepticas en o los imidazoles, eritromicina, claritromicina sobrdosis o con la interaccin de otros y otros antibiticos relacionados con los o frnxos, puede producir graves fatales macrlidos. arritmias cardiacas. Por esta razn se Existen alternativas de antihistaminicos recornienda siempre consultar informala no sedantes que pueden reemplazar la a cir! que sobreel producto se tiene terfenadina sin la prescripcin mdica: dis;onible sobre cmo prescribir la astemizol (Hisrnanal), cetririna (Zirtek) y terfenadina, sobretodo para prevenir Loratadina (Clarityn). Sin embargo, la enfermedades cardiacas. informacin quese tiene sobre el astemizol La terfenadina es un profrmaco quees est bajo revisin que puede causar ya trallaformadoen el organismo en un serios problemas cardiacos en ciertas metabolito cido (fexofenadina), cual es el circunstancias. responsable de los efectos teraputicos. En Fuente: Internet hnpd/www.fda.gov es muchas circunstancias, la terfenadina Para informacin adicional, dirigirse a: completamente metabolizada por efecto de morher9servidor.unam.mx laboratorio para suanlisis. Los resultados, confidenciales y altamente confiables,se obtienen posteriormente por telfono, con k zsistencia psicoigica en caso de el que consuktidor as lo solicite. Algo muy importznte es que la FDA no ha aprobado ningn kitde diagnbstico de estetipo para la hepatitis.
Con motivo de su XXX aniversario, la AsocixirM $5000.00 en efectivo al mejor traba& Farmacuticas en nmeros 4 los Nos es grato comunicar a nuestroak artculo intitulado:
"Preparacin del cido

cuyos autores sonlos investigadores Hector Luna, Norbert0 Man. Remedios Sanchez, del Departamento Sistemas Biolgicos de Universz la Xochimilco. El artculo premiadose public en el nmero correspondiente a s%?& lo del 997. Vayan nuestras ms calurosas felicitaciones a ganadores. los
RECONOCIMIENTOS Y PREMIO
La Asociacin Farmacutica Mexicana, A. C.

Otorga el presente
QI Herminia Prez
Por haber sido acreedora del Premio al mejor Trabajo de Investigacin intitulado:
PREPARACI~N DEL CIDO FURICOPOR OXIDACI~N MICROBIOL~GICA

Publicado en la Revista Mexicana de Ciencias Farmacuticas en 1997.
"POR LA SUPERACIN TCNICA Y CIENTFICA"
n
" .
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c.3
W
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H
H
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Oxidacin Microbiolgica de Alcoholes por

DOCTOR EN CIENCIAS BIOLOGICAS

HERMINIA INES PEREZ MENDEZ

EL DOCTORADO EN CJENCIAS BIOLGJCAS DE LA UNIVERSIDAD AUTNOMA

CONSEJO, CON EL CONVENIO NMERO PFP-200-93.

Q.1. HERMlNlA INS PREZ MNDEZ.

El da 10 de Noviembre del ao de 1998

Tutor: DR. HECTOR MANUEL LUNA CONTLA.

Asesor: DR. ANGEL HORACIO SANDOVAL Y TRUJILLO

Asesor: DR. LUIS ANGEL MALDONADO GRANIEL

Dedicatoria: A mi madre: Elisa Mndez Vda. de Prez

A la memoria de mi padre: Dionisio Prez Capdevila

A mis hermanos: Eleuterio, Betty y Alejandro

41 68 99 102 104 105 113 118

El objetivo principal del presentetrabajoesestudiar

oxidacin microbiolgica de alcoholes porNocardia corallina B-276.

5 alcoholes allicos solamente dos produjeron los cidos,

no fueron biotransformados.Dentro de lossubstratos 4

el 2-naftilcarbinol y el cis19 y 71 % de rendimiento,

verbenol produjeron los productos esperados en respectivamente.

se probaron, soiamente de uno

ellos produjo lactona la

esperada en 42 YOde rendimiento.

versatilidad y limitaciones de laoxidacindealcoholes viabilidad de sta

alcohol o del aldehdo,

conduciendo a resultados reproducibles.

Adems se describen estudios iniciales de la inmovilizacin de

y su utilizacin en la oxidacin microbiolgica

descrita anteriormente, substrato.

para estos estudios

se uso al alcohol furfurlico como

Oxidation is one of the main tools

also one of the methods withmore

reason new methodologies, as microbial oxidation, are always welcome.

The main objective of this work is the determination of the

scope and limitations of

and 7 diols, in a lmmol

of the biotransformation were one that produced the

allylic alcohols tested, only two

of them gave the carboxylic acid in yields

furfurilic alcohol was successfully oxidized to

All products were purified (by crystallization or chromatography) and characterized

viability ofthis used asstarting

methodology, because eitherthealcoholorthealdehydecanbe materials, obtaining reproducible results.

application to the microbial oxidation

described above. In these studies thefurfurilic alcohol was used as substrate.

La creciente preocupacin la por proteccin

del ambiente, ha impulsado a la si no esque,no,

investigacin hacia la generacin de procesosqumicosmenos, contaminantes. Como un ejemplo problemtica de esta

estn los procesos

no puede ser usado eficientemente, por

creado la Por lo anterior se ha

inquietud de generar procesos oxidacin de

alcoholes allicos. Lo anteriornosindujoaestudiar

Con la finalidad de facilitar el manejo de este tipo de biotransformaciones se aplicadoprocedimientosdeinmovilizacin de lasclulas

m i ~ r o b i a n a s ,esta va ~'~ la reutilizacindelas la

permite una mejormanipulacindelabiomasa,ademsde clulasinvolucradas en el procesooxidativo.

mejores estrategias para alcanzar los objetivos planteados en este trabajo.

substrato puede ser metabolizado,peroenalgunoscasoslaconversin lugarsingananciadeenerga(comensalismo).Unproceso

industrial puede ser

de substratos, generalmente relacionados estructuralmente.

Especificidad de sitio (regioespecificidad): Si existen en la molcula varios

grupos funcionales de un tipodeterminado,lasenzimassolamenteafectanuna posicin especfica.

Estereoespecificidad: Si se utiliza una mezcla racmica material como de un enantimeroconvertido. es