LAPORAN RESMI PRAKTIKUM

MIKROBIOLOGI
Isolasi DNA Kromosom

Disusun Oleh:
Nama : Bahtiar Arddun Asyafiq
NIM : K4320015
Kelas : C
Kelompok : Kelompok 12

PROGRAM STUDI PENDIDIKAN BIOLOGI

FAKULTAS KEGURUAN DAN ILMU PENDIDIKAN

UNIVERSITAS SEBELAS MARET

SURAKARTA

2021
 Laporan Resmi Praktikum
Mikrobiologi
 JUDUL: Isolasi DNA Kromosom
 TUJUAN: Mahasiswa dapat melakukan isolasi DNA kromosom pada
bakteri
 PRINSIP KERJA:
1) Tumbuhkan R.sphaeroides Rifr dan R.sphaeroides transkonjugasi semalam di dalam
4-5 ml Sis + 10% LB + antiiotika yang sesuai, 32oC, aerobic.

2) Masukkan 1-5 ml suspensi sel ke dalam tabung mikro dan diputar selama 10 detik.
Buang supernatanya, isilah tabung itu lagi dengan suspensi sel dan putar lagi.

3) Suspensikan pellet sel 567 μL TE kocok/larutkan pellet dengan sempurna.

4) Tambahkan 30 μL 10% SDS dan 3 μL proteinase K (2 mg/mL). campurkan dengan

membolak-balikkan tabung, kemudian inkubasikan pada 37oC selama 1 jam.

5) Tambahkan 0,7 mL fenol : kloroform : isoamilalkohol (25:24:1). Campurkan dengan

cara membolak-balikkan tabung sampai terbentuk emulsi, kemudian putar 5 menit
dalam mikro sentrifus.

6) Pindahkan supernatant dengan hati-hati menggunakan pipet Pasteur atau ujung pipet
mikro 1.000 μL. Hindarkan tercampurnya interfase. Masukkan supernatant pada
tabung mikro yang bersih.

7) Tambahkan 0,6 volume isopropanol untuk mengendapkan DNA. Dengan pelan-pelan

bolak-balikka tabung sampai benang-benang putih terbentuk.

8) Putar dalam sentrifus mikro selama 10 menit.

9) Buanglah supernatant dan tambahkan 1 mL etanol 70% dingin. Putar dalam sentrifus
mikro selama 2-4 menit.

10) Buang supernatant dan keringkan tabung dengan kertas tissue yang bersih, keringkan
pellet DNA dalam desikator 15 menit atau cukup dikeringkan udara 3-4 jam. Kalau
tersedia lyophilizer akan lebih cepat kering.

11) Tambahkan 100 μl 1xTE. Resuspensikan DNA dengan memipet cairan atau mengetuk
tabung mikro dengan jari. DNA harus benar-benar larut sebelum melanjutkan
 pekerjaan berikutnya. Bisa juga tabung berisi DNA itu ditaruh semalam di dalam
kulkas untuk menyempurnakan pelarutan DNA.
 PENGERTIAN ISOLASI DNA
Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari bioteknologi dan biomolekular yang harus dikuasai
di laboratorium. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya
seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Isolasi DNA berguna untuk beberapa
analisis molekuler dan rekayasa genetika seperti genom editing, transformasi dan PCR.
Banyak sekali metode isolasi DNA yang bisa digunakan, akan tetapi pada dasarnya tahapan
dari isolasi DNA pada semua bahan dan semua metode adalah sama, yakni lisis sel atau
jaringan yang efektif, denaturasi kompleks nukleoprotein, dan inaktivasi nuklease (Tan et al,
2009). Isolasi DNA dapat dilakukan pada semua mahluk hidup dan juga virus. Salah satu
tantangan dalam isolasi DNA adalah isolasi DNA pada organisme hewan mamalia. Mamalia
memiliki kompleksifitas jaringan dan organ yang sangat tinggi, sehingga terdapat berbagai
macam kendala yang sering ditemui dalam proses pengerjaan isolasi DNA pada hewan seperti
terlalu banyaknya lipid dan protein yang menyusun suatu jaringan, dan adanya enzim
nuklease pada beberapa organ hewan yang juga dapat merusak asam nukleat (Cseke, 2012).
 MACAM-MACAM TEKNIK ISOLASI DNA
1) Teknik SDS merupakan teknik yang menggunakan metode ekstaksi. Metode ekstraksi
ini di gunakan sebelum proses isolasi DNA dengan dilakukan pembuatan buffer
pengestrak dengan waktu yang bersamaan (Kunriawati, 2013).
2) Teknik pengujian polimorf merupakan teknik yang berdasarkan dengan
amplifikasinya dengan segmen – segmen DNA yang di mana nantinya menggunakan
primer tunggal dalam sekuen nukleotidanya juga dapat ditentukan dari acakan dengan
primer yang tunggal (Kurniawati, 2013)
3) Teknik CTAB merupakan teknik yang mampu menghasilkan sebuah pita DNA yang
memiliki ukuran tebal dan mampu untuk memisahkan DNA dari polisaksarida sebagai
akibat dari perbedaan struktur larutanya. Dalam menggunakan metode ini mampu
menghasilkan RNA dengan tipis dan terdapat fragment DNA (Kurniawati, 2013).
CTAB atau Cetyl trimethylammonium bromide merupakan sejenis deterjen yang
dapat mendegradasi dinding sel, denaturasi protein, memisahkan karbohidrat, merusak
membran sel dan melarutkan DNA. Apabila dinding sel terdegradasi maka semua isi
sel dapat keluar termasuk DNA dan dilepaskan ke dalam buffer ekstraksi. Dalam
proses isolasi DNA tanaman, penambahan senyawa pereduksi seperti merchaptoetanol
 dapat mencegah proses oksidasi senyawa fenolik sehingga menghambat aktivitas
radikal bebas yang dihasilkan oleh oksidasi fenol terhadap asam nukleat.
Merchaptoetanol juga berfungsi untuk melindungi RNA dari senyawa quinon,
disulphide, peroksida, poliphenoksidase, dan protein. Proses pemansan pertama
bertujuan untuk melarutkan CTAB dan mercaptoetanol. Sedangkan pemanasan yang
kedua bertujuan untuk memdegradasi protein dan dinding sel (Tohib, 2012).
 FUNGSI LARUTAN KIMIA
a) Fenol  fenol di gunakan proses isolasi DNA ditambahkan bersamaan dengan
kloroform dan isoamialkohol digunakan untuk permurnian DNA dari esktrak sel.
b) Kloroform  kloroform digunakan dalam proses isolaso DNA yang nantinya
dicampurkan supaya DNA nantinya dapat dipisahkan dengan partikel yang menmpel
dengan menggunakan teknik yang di gunakan sentrifugasi.
c) Isoamiloalkohol  merupakan senaywa yang di gunakan dalam proses isolasi DNA
ditambakna bersamaan dengan fenol dan klorofrom untuk digunakan untuk
memunirkan DNA dari ekstak sel.
d) Isopropanol  isopropanol dalam proses isolasi DNA yang sering digunakan untuk
medium agregasi plasmid DNA tampak atau dapat dilihat.
e) Pelet TE  Pelet TE dalam isolasi DNA berfungsi untuk melarutkan pellet TE
(Puspitaningrum, 2018).
f) SDS  SDS merupakan singkatan dari Sodium Dodecyl Sulphate yang berfungsi
sebagai pelarut membran dan protein yang terdenaturasi.
g) Proteinase - K  Proteinase-K merupakan enzim dalam isolasi DNA digunakan untuk
pemurnian DNA dari kontaminan protein.
h) Etanol  Etanol dalam isolasi DNA digunakan sebagai larutan isotonis supaya DNA
tidak rusak. (Nurhayati & Darmawati, 2017)
 PEMBAHASAN
GAMBAR KETERANGAN
Memasukkan 1 ml suspensi nutrient
Broth ke dalam tabung mikro

Melakukan sentrifugasi tabung mikro

selama 10 menit

membuang supernatan dari tabung

mikro
mensuspensikan pellet TE 565
mikroliter lalu mengocoknya

menambahkan 30 mikroliter 10% SDS

dan 3 mikroliter proteinase K kemudian
mengocoknya hingga tercampur

Menginkubasi pada waterbath dengan

suhu 37 derajat celcius selama 1 jam

Menambah 30 mikroliter
fenol,kloroform,isoamil alkohol dengan
perbandingan 25:24:1 kemudian
mengocoknya
memasukan larutan ke dalam sentrifuge
selama 5 menit

Memindahkan 1000 mikroliter

supernatant ke dalam tabung mikro baru
menggunakan pipet mikro

Menambahkan 0,6 mililiter isopropanol

ke dalam cairan supernatan kemudian
mengocok dengan cara membolak-balik
lalu mensentrifugasi selama 2-4 menit
 Membuang supernatan lalu
menambahkan 1 mililiter etanol 70%
dingin dilanjutkan sentrifugasi selama 2-
4 menit

Membuang kembali supernatan dan

mengeringkannya pada pellet DNA
selama 3-4 jam

Menambahkan 10 mikroliter TE
kemudian dilarutkan dan disimpan di
kulkas semalaman

 FAKTOR PENYEBAB KEGAGALAN ISOLASI DNA (JIKA GAGAL)

1. Dari tahap sentrifugasi yang mungkin membutuhkan waktu yang lebih lama lagi.
2. Kosentrasi dari senyawa yang ada kurang pekat.
 3. Dalam satu koloni bakteri ini mungkin terdapat perbedaan usia dari satu individu dan
individu lainya. Karena dalam satu koloni biasanya belum tentu memiliki umur yang
sama.
4. Dalam perlakuan homogenenisasi pada volume dan kesntrasi dalam zat yang di
gunakan, dan mungkin hal ini mampu menyebabkan perubahan dalam parameter
(Khumairoh et al., 2016)
5. Dari semua tahapan atau dari adanya kerumunan dalam proses berlangsungnya
praktikum bias menyebakan dari terjadi nya factor kegagalan ( Hairuddin, 2015).
6. Dalam pengguana mikropepet yang bergantian bias enyebabkan perubahan konstreasi
zat yang telah di ukur dengan baik.
 KESIMPULAN
Isolasi DNA merupakan teknik dasar dari bioteknologi dan biomolekular yang harus dikuasai
di laboratorium. Isolasi DNA bertujuan untuk memisahkan DNA dari partikel-partikel lainnya
seperti lipid, protein, polisakarida, dan zat lainnya. Pada kegiatan praktikum mikrobiologi
yang di lakukan, pada isolasi DNA pada kelompok 12 mengalmi kegagalan dengan tidak
adanya serabut serabut seperti benang dari DNA. Hal ini di karenakan bias dari bermacam –
macam factor.
 DAFTAR PUSTAKA

Nurhayati, B., & Darmawati, S. (2017). Biologi Sel dan Molekuler.

Puspitaningrum, R. (2018). Genetika molekuler dan aplikasinya.

Hairuddin, R. (2015). Isolasi DNA dan Amplifikasi,(PCR) Genom DNA kopi (Coffea Sp)
Melalui Proses Elektroforesis Gel Poliakrilamid. Dinamika, 4(1).

KHUMAIROH, S., & ROSLIM, D. I. Teknik Isolasi DNA Total pada Tumbuhan Tuntun
Angin (Elaeocarpus floribundus) dari Provinsi Riau. Jurnal Riau Biologia, 1(2), 118-
123.

Murtiyaningsih, H. (2017). Isolasi DNA genom dan identifikasi kekerabatan genetik nanas
menggunakan RAPD (Random Amplified Polimorfic DNA). Agritrop: Jurnal Ilmu-
Ilmu Pertanian (Journal of Agricultural Science), 15(1).

Wirajana, I. N., Yuliana, D. A., & Ratnayani, K. (2013). Isolasi DNA metagenomik dari tanah
hutan mangrove Pantai Suwung Bali. Jurnal Kimia, 7(1), 19-24.

Nugroho, K., Terryana, R. T., Rijzaani, H., & Lestari, P. 2016. Metode Ekstraksi DNA Pada
Jatropha spp. Tanpa Menggunakan Nitrogen Cair. Jurnal Littri. 22(4): 159 – 166.
DOI: http://dx.doi.org/10.21082/littri.v22n4.2016.159-166
 LAMPIRAN
 LEMBAR PENGESAHAN

Surakarta, 28 November 2021

Asisten Praktikum Praktikan

(Ana Atia Rz) (Bahtiar Arddun Asyafiq.)

NIM K43180007 NIM. K4320015