PRACTICA 6 EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA ACTIVIDAD DE UNA ENZIMA

La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura se eleva debido al incremento de la energa cintica de la energa de las molculas reactantes. Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera energtica para romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria. A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de accin. Los limites de actividad para la mayor parte de las enzimas tiene lugar entre los 10 C y 50C; la temperatura optima para las enzimas en el cuerpo se hall alrededor de 37C. El factor por el cual un proceso biolgico aumenta para un incremento de temperatura de 10C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas vara entre 1.5 y 3 La enzima a utilizar en esta practica ser la pepsina la cual es una proteasa, una enzima digestiva que degrada las protenas en el estmago; las otras enzimas digestivas importantes son la tripsina y la quimotripsina. Fue la primera enzima animal en ser descubierta, por Theodor Schwann en 1836. La pepsina se produce en el estmago, acta sobre las protenas degradndolas, y proporciona pptidos y aminocidos en un ambiente muy cido. El pepsingeno es un precursor de la pepsina, cuan do acta el HCl sobre el pepsingeno, ste pierde aminocidos y queda como pepsina, de forma que ya puede actuar como proteasa. La pepsina es ms activa con un pH de entre 2 y 4. Se desactiva permane ntemente con un pH superior a 6 EXPERIMENTO 1
y y

Determinacin de la Temperatura ptima de Pepsina . Factor de calibracin 0.319

Temperatura (C) 0 20 37 65 92 Absorbancia 1 0.890 0.886 0.893 0.944 0.944 Absorbancia 2 0.427 0.270 0.007 0.005 0.217 Absorbancia Neta 0.326 0.586 0.957 1.090 0.745 ACTIVIDAD ENZIMATICA -0.032219 0.100804 0.30305 0.346115 0.168432

Tubos 1y1 2y2 3y3 4y4 5y5

Actividad enzimatica con respecto al tiempo

0.4

0.35 0.3
0.25 0.2

0.15 0.1
0.05 0 -0.05 0 20 40 60 80 100

-0.1

FIGURA 1. Una vez terminado el experimento, se acomodaron los datos de manera que se pueda construir una grafica que muestre la tendencia enzimtica en relacin a la temperatura.

CONCLUSION: La elevacin de la temperatura incrementa la velocidad de una reaccin catalizada por enzimas. Al principio la velocidad de reaccin aumenta cuando la temperatura se eleva debido al incremento de la energa cintica de la energa de las molculas reactantes. Sin embargo, al final, la energa cintica de la enzima excede a la barrera energtica para romper los enlaces dbiles de hidrogeno que conservan su estructura secundaria y terciaria. A esta temperatura predomina la desnaturalizacin con prdida precipitada de la actividad cataltica. Por tanto las enzimas muestran una temperatura ptima de accin. Los limites de actividad para la mayor parte de las e nzimas tiene lugar entre los 10C y 50C; la temperatura optima para las enzimas en el cuerpo se hall an alrededor de 37C. pero la PEPSINA trabajo mejor a los 60C. El factor por el cual un proceso biolgico aumenta para un incremento de temperatura de 10C es el coeficiente de temperatura o Q10. El Q10 para la mayor parte de las enzimas vara entre 1.5 y 3.

Los resultados de la actividad enzimtica de la meza 1 fueron de: 0.331, 0.620, 0.879, 0.989, 0.727.

VARIACIONES DE LA PCR
y

PCR-TAIL: La PCR termal de entrelazado asimtrico es usada para aislar una secuencia desconocida que flanquea una secuencia conocida.

PCR touchdown: Se trata de una variante de la PCR que se emplea cuando se desconoce la secuencia exacta de los extremos de la sec uencia a amplificar, de modo que se asume que puede existir alguna base desapareada PCR especfica de alelo: Esta tcnica de diagnstico o clonacin es usada para identificar o utilizar los polimorfismos de una sola base (SNPs). Amplificacin dependiente de helicasa: Esta tcnica es muy parecida a la PCR convencional, pero en ella se emplea la enzima helicasa y una temperatura constante en lugar de la polimerasa de ADN y los ciclos repetidos de desnaturalizacin -extensin. PCR hot-start: Esta tcnica reduce la amplificacin inespecfica d urante las etapas iniciales de la PCR. PCR especfica de intersecuencia (ISSR): Se trata de un mtodo de PCR para su uso en huella gentica , que amplifica regiones entre repeticiones de secuencia simple para producir una huella gentica nica de longitudes de fragmento amplificadas. PCR inversa: Es un mtodo usado para poder realizar la PCR cuando slo es conocida una secuencia interna. Muy til en la identificacin de se cuencias que flanquean insertos genmicos. PCR mediada por ligacin: Este mtodo usa pequeos linkers de ADN ligados al ADN de inters y mltiples primers hibridando estos linkers. PCR "assembly": Consiste en la sntesis artificial de largas secuencias d e ADN, realizando para ello la PCR en un fondo de oligonucletidos largos con secuencias solapantes cortas. PCR asimtrica: Es usada para amplificar preferentemente una cadena del ADN original con respecto a la otra. PCR de colonia: Mediante esta tcnica , colonias de bacterias Escherichia coli pueden ser rpidamente examinadas para construcciones viables de vectores de ADN. PCR especfica de metilacin (MSP): Se usa para detectar metilaciones en islas CpG de ADN gen mico. Amplificacin Mltiple Dependiente de Sonda (Multiplex Ligation dependent Probe Amplification o MLPA): Permite amplificar varias secuencias objetivo con un nico par de primers, evitando as las limitaciones de resolucin de la PCR mltiplex.

PCR cuantitativa: Es usada para medir la cantidad de un producto de PCR (preferentemente en tiempo real). en el alineamiento cebador -secuencia. Su finalidad es reducir el fondo no especfico bajando gradualmente la temperatura de hibridacin a lo largo del progreso de la PCR. PAN-AC: Este mtodo usa condiciones isotermas para la amplificacin, y puede ser usado en c lulas vivas.