Identificacin de la Inmunoglobulina G en suero bovino y humano purificado mediante Cromatografa de Afinidad, ensayo de cido bicinconnico (BCA) para su cuantificacin

y electroforesis SDS-PAGE para su caracterizacin final.

Ketsia Y. Gonzlez Vzquez Resumen: Las inmunoglobulinas o anticuerpos se encargan de reconocer un antgeno y de enviar seales al interior de la clula B para inducir una respuesta inmunolgica efectiva contra el mismo. Se utilizaron diferentes tcnicas para lograr la identificacin de nuestra protena de inters, inmunoglobulina G en suero humano. La primera tcnica utilizada fue cromatografa de afinidad, su propsito, obtener la IgG purificada; para lograr esto se hicieron tres lavados con amortiguador de unin en los que se indujo la unin de la protena A y la IgG. Posteriormente estas uniones fueron rotas utilizando un amortiguador de elucin en tres eluciones diferentes para as obtener la IgG purificada. Se utiliz un ensayo de BCA para cuantificar la IgG y mediante la realizacin de una curva estndar de concentracin conocida de una protena estndar, en este caso albmina de suero bovino (BSA), se corrigieron los valores obtenidos de las absorbancias de las muestras de IgG con concentracin desconocida. Por ltimo, mediante la electroforesis de poliacrilamida se determin la presencia de la protena de inters en las muestras y de esta forma tambin se comprueba la eficacia de las tcnicas utilizadas anteriormente. Durante la identificacin de la protena de inters se logr purificar la misma, as como conocer la concentracin de esta en la muestra y comprobar su pureza mediante la electroforesis de poliacrilamida donde se presentaron bandas de las cadenas pesadas y livianas de la inmunoglobulina G. Este tipo de pruebas son de mucha ayuda en el campo clnico, ya que ayudan a identificar algunas enfermedades como el virus de inmunodeficiencia humana.

Introduccin: La respuesta inmunolgica humoral es la encargada de proteger al organismo de numerosos patgenos. Los linfocitos B son las clulas que poseen un rol indispensable en esta rama de la respuesta inmunolgica adaptativa, ya que pueden reconocer una gran cantidad de antgenos, incluyendo aquellos que son solubles, por medio de molculas especializadas llamadas anticuerpos o inmunoglobulinas presentes en su superficie. La inmunoglobulina inicialmente se encuentra anclada en la membrana celular donde forma parte del receptor para antgeno de los linfocitos B, el cual se encarga de reconocer el antgeno y de enviar las seales al interior de la clula B para inducir una respuesta inmunolgica efectiva8. Biolgicamente, las inmunoglobulinas (Ig) son glicoprotenas que son producidas por los linfocitos B o sus clulas derivadas, las clulas plasmticas, y que poseen la capacidad de reconocer y unirse especficamente al antgeno que indujo su formacin. Su funcin es inactivar o destruir antgenos en el organismo9. Existen cinco tipos de inmunoglobulina, en las que se encuentran la IgG, IgA, IgM, IgD e IgE. Para nuestro propsito nos estaremos concentrando exclusivamente en la Inmunoglobulina G, esta es la ms pequea y la que ms abunda en el fluido corporal, adems es la nica capaz de atravesar la placenta y brindarle inmunidad al beb. La purificacin, cuantificacin y electroforesis son procesos esenciales para el estudio de una protena, por lo tanto fueron empleados para lograr la identificacin de la IgG. Debido a su estructura, las inmunoglobulinas pueden ser fraccionadas y purificadas por diferentes mtodos, entre los que se encuentra la cromatografa de afinidad. Este proceso consta de una fase mvil y la fase estacionaria. La sustancia de inters quedar enlazada a la fase estacionaria y es mediante este enlace que ocurre la separacin y los dems componentes de la muestra migrarn con la fase mvil. La fase estacionaria

utilizada fue un gel de agarosa con la Protena A y la fase mvil el suero humano que contena la IgG. Existen varias protenas bacterianas (protena A, protena G, protena L) que tienen la capacidad de enlazar anticuerpos con mucha eficiencia. Para el estudio que se llev a cabo en el laboratorio, se utiliz protena A que se encuentra en la pared celular de algunas cepas de la bacteria Staphylococcus aureus10, con el fin de separar de inmunoglobulina G de una muestra de suero bovino. En cuanto a la cuantificacin de una protena se refiere a la cantidad y/o concentracin de protena presente en una muestra, existen diferentes tcnicas para llevar a cabo este proceso1. En este caso se utiliz el ensayo de cido bincinconnico (BCA), el reactivo presente en este ensayo forma un complejo ternario en medio alcalino al unirse al cobre reducido Cu+1, adems, posee una elevada sensibilidad y selectividad en la deteccin colorimtrica, es as la quelacin de un ion cobre por dos molculas de BCA3. Al ocurrir esta reaccin obtenemos un producto de color violeta con absorbancia a 562nm. La intensidad de este color es esencial para nuestro propsito ya que la concentracin de protena y la absorbancia que presente la muestra tienen una relacin lineal, por lo tanto, mientras ms intenso sea el color, mayor concentracin de protena en la muestra y viceversa. El BCA tiene como ventaja que puede detectar pocas concentraciones de la muestra y, adems, presenta alteraciones en los resultados debido a sustancias encontradas usualmente en la preparacin de protenas1. Se prepar una curva estndar de una protena conocida, en este caso albmina de suero bovino (BSA), con concentracin conocida para as poder comparar los resultados obtenidos en el BCA y determinar la concentracin de IgG. La electroforesis es una tcnica que permite la separacin de molculas segn la movilidad de estas en un campo elctrico a travs de una matriz porosa, que finalmente

las separa por tamaos moleculares y carga elctrica, dependiendo de la tcnica que se utilize7. En este caso, se utiliz la tcnica de SDS-PAGE en la cual se mezclan las protenas con el detergente aninico dodecil sulfato de sodio (SDS) en un gel de poliacrilamida, para formar complejos desnaturalizados, cargados negativamente. La electroforesis es utilizada para determinar el peso molecular de una protena. La

determinacin del peso molecular de las protenas mediante SDS-PAGE es vlida cuando se analizan cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos los enlaces disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para su interaccin con el SDS6. Para reducir la protena se utiliz -mercaptoetanol como agente reductor. Este causa que los enlaces disulfuro intra- e inter-catenarios son disociados, la estructura cuaternaria se pierde y las subunidades se separan como cadenas peptdicas individuales6. Por lo tanto, vamos a tener la cadena pesada y la cadena liviana de la inmunoglobulina separadas. La cadena pesada tiene un peso molecular de 50KDa, mientras la cadena liviana tiene un peso de 25KDa, esto resulta en un peso total de 150KDa para la inmunoglobulina sin reducir. En este laboratorio, se analizaron las muestras de las dos maneras: reducidas y sin reducir. La integracin de las tres tcnicas utilizadas tena como fin varios objetivos. En purificacin por cromatografa de columna se pretenda describir las caractersticas estructurales y funcionales de las inmunoglobulinas, as como tcnicas de cromatografa y aislar IgG de una muestra de suero por cromatografa de afinidad. En cuantificacin, se busc describir diversos ensayos de cuantificacin de protenas, comparar y contrastar ventajas y desventajas de stos y se determin la concentracin de inmunoglobulina G purificada de una muestra de suero humano utilizando un ensayo colorimtrico. Mientras que en el laboratorio de electroforesis se pretendi describir los fundamentos de la tcnica de electroforesis de protenas, algunos usos de la electroforesis de protenas y finalmente

se utiliz la electroforesis de protenas en poliacrilamida para separar algunos componentes de las fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad. Materiales y Mtodos: I. Purificacin de inmunoglobulina G de suero por cromatografa de afinidad. A.Preparacin de la protena A en agarosa Se nos entreg 200 L de agarosa la cual contena protena A contenidos en un microtubo de 1.5 mL. La misma estaba equilibrada en amortiguador de unin: 10 mM Tris, pH 7.5. Se centrifug a 3000 RPM por un minuto y luego se descart el sobrenadante. B.Preparacin de la muestra Se desinfect la yema del dedo con alcohol. Luego, se pinch el dedo en el rea desinfectada con una lanceta estril. Se coloc varias gotas de sangre (aprox. 600L) en un microtubo. Despus, se centrifug por 5 min a 10000 RPM. Se removi cuidadosamente el sobrenadante y se mezcl con un volumen igual de amortiguador de unin, 10 mM Tris, pH 7.5, para ajustar la concentracin inica y el pH, para facilitar el enlace entre IgG y la protena A. C.Unin de la IgG a la protena A La muestra diluida de suero fue aadida a la agarosa equilibrada en amortiguador de unin. Se agit la muestra para mezclar bien. Luego, se incub esta mezcla por 15 min a temperatura ambiente agitandose regularmente para evitar el asentamiento de la agarosa. Posterior a la incubacin, se centrifug la muestra durante 5 min a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido y guardado en un microtubo previamente rotulando como FT o flow through, este corresponde a lo que no se enlaz a la protena A. D.Lavado

Se aadi 1.5 mL de amortiguador de unin a la agarosa y se agit el microtubo para remover el material retenido de forma no especfica en la gel. Luego, se centrifug la muestra durante 5 min a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido cuidadosamente y almacenado en un microtubo rotulado como L1, que corresponde al primer lavado. Se repitieron 3 veces estos pasos del lavado teniendo un total de cuatro lavados, rotulados L1, L2, L3 y L4, respectivamente. E.Elucin de la IgG de la protena A Para desprender la IgG de la protena A se aadi a la agarosa 350L de amortiguador de elucin y 100 mM glicina pH 3.0. Luego, se incub la muestra agitndola por 2 min. y se centrifug otros 2 min. a 3000 RPM. El sobrenadante fue removido y almacenado en un microtubo rotulado E1 el cual contena 30L de 1.0 mM Tris, pH 8.8, esto corresponde a la elucin. Este paso fue repetido 2 veces ms obteniendo un total de tres eluciones, rotulados E1, E2 y E3, respectivamente. La muestra de Ig fue recogida en presencia del amortiguador de Tris para subir el pH de la muestra a nivel fisiolgico ya que el pH cido de la elucin pudo haber desnaturalizado el anticuerpo. F.Regeneracin de la protena A en agarosa Para preservar la protena A despus de la elucin a pH cido, se lav la agarosa con solucin salina amortiguada con fosfato (PBS: Phosphate-Buffered Saline). Se aadi 1 ml de 1X PBS a la agarosa y se mezcl bien agitando el microtubo. Luego, fue centrifugado por 2 minutos a 3000 RPM y el sobrenadante fue descartado. Estos pasos fueron repetidos tres veces para obtener tres lavados de regeneracin. Luego de haber regenerado la protena A en 1 X PBS, la misma fue entregada a la instructora del laboratorio. II. Cuantificacin de Inmunoglobulina G de suero

En primer lugar, se tom una placa de micro ensayo. Luego, se le ech a las fosas A, B y C desde la columna 1 a la 8, 10L de la curva estndar ms 200L de reactivo de trabajo. Con esto se calcul la curva estndar lo que nos ayud a calcular luego la concentracin del desconocido. Posteriormente, se aadi 210l de amortiguador de unin a las fosas designadas como blanco. A las elegidas para control se le ech 10L de amortiguador de unin (10 mM Tris, pH 7.5) ms 200L de reactivo de trabajo. Despus, se le adicion 10L de cada una de las muestras de las fracciones de la cromatografa ms 200L de reactivo de trabajo a las fosas designadas para los desconocidos. Cada una de las muestras se prepar en triplicado. Luego que se le aadi cada muestra a cada una de las fosas se cubri la placa con parafina y se dej incubar por 30 minutos a 37C. Una vez pasado este tiempo se le quit la parafina y se ley la absorbancia a 560nm en un microplate reader. III. Electroforesis El gel de poliacrilamida que se utiliz fue preparado entre dos placas de vidrio. La electroforesis se corri verticalmente en presencia de 0.1% SDS, en un sistema de gel discontinuo, donde el gel de corrida est entre una cmara superior y otra inferior, sin contacto directo entre s (Mtodo de Laemmli). El gel de poliacrilamida fue preparado anteriormente por la tcnica de laboratorio y el aparato de electroforesis tena el ensamblaje pertinente. Preparacin de las muestras Para esta parte fueron preparadas las fracciones de la cromatografa de afinidad, la muestra del lavado de L1 y las tres muestras de lavado E1, E2 y E3, adems un control (FT). El marcador fue provisto por la instructora. El volumen total de cada muestra, excepto para FT, fue de 30L, en los cuales se aadi 5l de amortiguador de muestra y

el volumen del inoculo el cual fue de 25 L. Para FT se utiliz el volumen calculado de 3L, se le aadi 5L de amortiguador de muestra y se complet los 30l con amortiguador de corrida. Para desnaturalizar las protenas se hirvieron las muestras a 97C durante 5 minutos, excepto el control. Las muestras de elucin fueron preparadas tanto en condiciones reductoras como en condiciones no reductoras. Con una pipeta se colocaron las muestras en las fosas del gel. En el primer carril del gel se echaron 7L del marcador de peso molecular. En la fosa nmero cuatro que corresponde al vaco se coloco 30L de amortiguador de corrida. Las muestras y marcador fueron colocadas en las fosas como ilustra la Figura 1.

Figura 1: Orden de las muestras para la corrida de electroforesis

1.Marcador, 2. Control (FT), 3. L1, 4. Vaco, 5. E1 reducido, 6. E1 sin reducir, 7. E2 reducido, 8. E2 sin reducir, 9. E3 reducido, 10. E3 sin reducir

Corrida de electroforesis y tincin del gel Cuando todas las muestras estuvieron colocadas en las fosas, se prosigui a ensamblar el equipo. Se sell la cmara de electroforesis y se coloc los cables en los electrodos correspondientes. Luego, se conect la cmara sellada a la fuente de poder y se le aplic un pequeo voltaje a la caja de electroforesis. Posteriormente, se aplic un

voltaje de 120-150V a la cmara de electroforesis hasta que el tinte en el amortiguador de muestra lleg a la parte inferior del gel. Subsiguientemente, una vez terminada la corrida, el voltaje fue reducido a cero y se apag la fuente de voltaje. Luego, se procedi a desconectar la cmara de electroforesis. Despus, se removieron las placas de vidrio y se removi el gel de estas. Finalmente, se ti con solucin teidora (10% cido actico, 50% etanol, 40% agua y 0.05% tinte Coomassie blue) por una hora, luego fue desteido hasta que fueron vistas las bandas de protenas. Resultados:
I. Purificacin de inmunoglobulina

En esta parte se obtuvo la protena purificada por medio de la cromatografa de afinidad. En los sobrenadantes de los lavados se removi todo lo que no se quedo enlazado a la protena. En las eluciones se consigui la inmunoglobulina purificada.
II. Cuantificacin de IgG de suero utilizando ensayo de BCA

Con las absorbancias obtenidas se calcul la absorbancia promedio de las rplicas de cada muestra y la absorbancia corregida (Tabla 1). Esta ltima se determin restndole la absorbancia promedio del control a la absorbancia promedio de cada una de las muestras. Por ejemplo, para la absorbancia promedio: Abs562 promedio = (abs #1 + abs #2 + abs #3)/3 = Abs562 promedio control = (0.097 + 0.096 + 0.097)/3= 0.097nm; para absorbancia corregida: A562 corregida = A562 promedio - A562 promedio del control = A562 corregida L1= 3.975 0.097 = 3.879nm. Los clculos realizados para obtener los datos mostrados en la Tabla 1 se encuentran adjuntos en el Apndice.

Tabla 1: Promedio de absorbancia (Abs) y absorbancia corregida a 562 nm por ensayo de BCA.
Muestra control 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 FT L1 L2 L3 L4 E1 E2 E3 A 562 #1 0.097 0.161 0.163 0.231 0.204 0.286 0.388 0.327 0.719 0.809 2.540 3.930 0.472 0.248 0.141 0.541 0.915 0.178 A 562 #2 A 562 #3 A 562 promedio A 562 corregida 0.096 0.097 0.097 N/A 0.211 0.172 0.181 0.085 0.158 0.138 0.153 0.056 0.174 0.160 0.188 0.092 0.203 0.181 0.196 0.099 0.304 0.309 0.300 0.203 0.277 0.245 0.303 0.207 0.473 0.419 0.406 0.310 0.645 0.733 0.699 0.602 0.848 0.760 0.806 0.709 2.169 2.786 2.498 2.402 3.962 4.034 3.975 3.879 0.489 0.520 0.494 0.397 0.230 0.255 0.244 0.148 0.152 0.197 0.163 0.067 0.518 0.313 0.457 0.361 0.312 0.913 0.713 0.617 0.240 0.227 0.215 0.118

FT: Flow Through, L: Lavado, E: Elucin

Se procedi a construir una grfica titulada Curva Estndar de BSA que comprende de la absorbancia corregida versus la concentracin del estndar (Figura 1). La ecuacin generada por la curva de la Figura 1, y = 0.0004x - 0.1274, se utiliz para determinar las concentraciones de las muestras desconocidas. La ecuacin en la forma y = mx + b, es la ecuacin de una lnea recta; donde y es la absorbancia de la muestra desconocida, m =
0.0004 la pendiente de la lnea recta, x es la concentracin (g/L) de la protena

desconocida y b= -0.1274 el intercepto en y.

Figura 1. Curva Estndar de BSA (albmina de suero bovino). Se prepar la grfica para determinar las concentraciones desconocidas de la inmunoglobulina G. La ecuacin generada es y = 0.0004x - 0.1274, donde y es la absorbancia corregida y x la concentracin de protena en la muestra.

Si despejamos para x la ecuacin generada por la curva, tenemos: x = (y b) / m. Utilizando la ecuacin despejada y sustituyendo los valores de y, b y m correspondientes para cada muestra (b y m son contantes dadas por la ecuacin generada por la grfica) se determina la concentracin de inmunoglobulina G (IgG) en cada muestra. Al obtener la concentracin se puede buscar el volumen inicial (V1) requerido para electroforesis en gel de poliacrilamida (SDS-PAGE). Este volumen se determina usando la formula de dilucin C1V1= C2V2, donde C1 es la concentracin de la protena que se obtuvo al despejar la frmula de la recta, C2 es 0.5 g/l y el volumen final (V2) es 30 l el cual es

aproximadamente el volumen mximo de muestra que se puede aadir a una fosa del gel de poliacrilamida. Los resultados para cada muestra se muestran en la Tabla 2. Los clculos realizados para obtener la concentracin de protena en cada una de las muestras y el volumen inicial se encuentran adjuntos en el Apndice.

Tabla 2: Absorbancia corregida, concentracin de protena en la muestra y volumen inicial requerido para cada muestra en SDS- PAGE.
Muestra A562 corregida [Proteina] g/L Volumen inicial (L)

FT L1 L2 L3 L4 E1 E2 E3

2.402 3.879 0.397 0.148 0.067 0.361 0.617 0.118

6.323 10.015 1.311 0.688 0.485 1.220 1.860 0.614

2.37 1.50 11.44 21.81 30.92 12.29 8.06 24.42

III.Electroforesis SDS-PAGE

En los resultados obtenidos de la electroforesis SDS-PAGE (Figura 2) se puede observar la presencia del marcador de peso molecular utilizado.

Se observ una banda en las fosas 5,7 y 9 las cuales corresponden al peso del anticuerpo completo (cadena pesada ms cadena liviana)

En el carril 4 estaba vaco. En el carril 3 se observaron 4 bandas.

Se observ dos bandas en el 6,8 y 10. Estas corresponden a la cadena pesada, la cual pesa 50KDa, y la cadena liviana que pesa 25KDa.

Figura 2: Electroforesis SDS- PAGE. Para separar la IgG se utiliz -mercaptoetanol que el cual rompe los puentes de azufre presentes en la IgG, generando dos bandas una de 50KDa y una de 25 KDa. En la fosa 6,8 y 10 se observa una sola banda, mientras que las fosas 5, 7 y 9 presentan dos bandas. E1r significa la elucin 1 reducida, igual para E2r y E3r. E1sr significa elucin 1 sin reducir, lo mismo para E2sr y E3sr. Carriles: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

Discusin y Conclusin: Los resultados obtenidos en este trabajo nos indican que la purificacin de la IgG fue exitosa porque se logr cuantificar la misma. Esto nos indica que la tcnica de cromatografa de afinidad demostr ser un mtodo efectivo para la purificacin de una protena, en este caso IgG, en suero humano. En la parte de Cuantificacin de Protena nuestros resultados indican la concentracin de inmunoglobulina G purificada de una muestra de suero utilizando un ensayo colorimtrico. La relacin entre absorbancia y concentracin de protena es una lineal. Para nuestros resultados, la curva estndar de BSA fue bien precisa, ya que

obtuvimos una regresin lineal (R2) cercana a 1. Aunque la curva estndar es precisa, no se obtuvieron los resultados esperados, ya que las concentraciones y

volmenes .................................................................. Esto pudo deberse a que la protena no haba sido regenerada la ltima vez que se utiliz. Sin embargo tampoco que se puede descartar posibles errores experimentales, ya sean errores en algunos pasos o que el microplate reader no estuviera bien calibrado, entre otros. A pesar de los errores el ensayo BCA demostr ser un mtodo de cuantificacin de protenas esencialmente sencillo y rpido, pero es su sensibilidad y tolerancia a muchas sustancias encontradas comnmente en las preparaciones de protenas lo que lo hace nico, ya que en otros tipos de pruebas de cuantificacin estn presentes grandes interferencias las cuales hacen menos precisos los resultados. Este ensayo, adems de lograr sus objetivos, comprob su gran importancia tanto para futuras investigaciones como tambin para el rea clnica, ya que existen un sinnmero de condiciones relacionadas a desniveles de inmunoglobulinas en la sangre que requieren del conocimiento temprano de concentraciones de inmunoglobulinas en la sangre12. Un gran ejemplo es la leucemia, en la cual los niveles de IgG sobrepasan el rango normal de 560 a 1800 mg/dl de IgG en la sangre y este ensayo les provee una valiosa herramienta para su deteccin y control11. Finalmente, para la electroforesis de poliacrilamida con SDS, segn las bandas observadas y el peso relativo de las mismas en los carriles 6, 8 y 10 se obtuvo la protena pura bajo condiciones no reductoras ya que se encontr una sola banda de aproximadamente 150KDa. Esto es as debido a que las protenas no se dividen porque no fueron reducidas, sino que mantienen las cadenas pesadas y las cadenas livianas unidas. El peso aproximado de la cadena pesada es de aproximadamente 50KDa cada una mientras que la cadena liviana es de 25KDa aproximadamente 1. Por lo tanto, la suma

de las dos cadenas pesadas y las dos cadenas livianas que componen la inmunoglobulina tendrn un total de 150KDa aproximadamente. Por otro lado, las protenas en condiciones reductoras, reducen los puentes de disulfuro que tengan las protenas de la muestra entre cada una de las cadenas11 y se reflejan en la electroforesis como dos bandas, una de las cadenas pesadas y otra de las cadenas livianas. Por esta razn los carriles 5, 7 y 9 presentaron dos bandas. La banda en el carril 5 correspondiente a la cadena liviana, no se present claramente en ninguno de los resultados, eso pudo haber sido debido a la cantidad o a alguna sustancia que interfiriera en la reaccin. Sin embargo, se puede concluir que los lavados (rotulados como L) no mostraron unin de la protena ya que la concentracin era menos en cada lavado, mientras que las eluciones s. Esto sustenta los objetivos ya que en los lavados se incluye todo el material que no se adhiri a la gel excepto la protena, mientras que las eluciones son el lavado luego de que la IgG queda separada de la protena A. En este laboratorio se logr aislar IgG de una muestra de suero humano utilizando cromatografa de afinidad. Adems se determin la concentracin de inmunoglobulina utilizando un ensayo colorimtrico, BCA. Por ltimo, se utiliz la electroforesis de protenas en poliacrilamida separar componentes de las fracciones obtenidas por cromatografa de afinidad. Estas tcnicas se utilizan a menudo para identificar enfermedades, como por ejemplo electroforesis la cual se utiliza a menudo en el mbito clnico y se considera la prueba definitiva para determinar si un paciente ha sido infectado por el virus de inmunodeficiencia humana1.

Referencias
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fast quantitation of immunoglobulin G. J Chromatogr A. Apndice: Clculos realizados para obtener los datos en la Tabla 1 y Tabla 2. Muestra Absorbancia Corregida
2.498-0.097 =2.402 3.975-0.097=3.879 0.494-0.097 =0.397 0.244-0.097 =0.148 0.163-0.097 =0.067 0.457-0.097 = 0.361 0.713-0.097 = 0.617 0.215-0.097 = 0.118

Conversin de g/ml a g/l

6322.61000=6.323 10015.1 1000=10.016 1311.01000=1.311 687.667 1000=0.688 485.167 1000=0.485 1220.167 1000=1.220 1860.167 1000=1.860 614.333 1000=0.614

Volumen inicial

Volumen final = 30 l
15l + 15l = 30 l 15l + 15l = 30 l 15l + 15l = 30 l 15l + 15l = 30 l 5l + 25l = 30 l 15l + 15l = 30 l 15l + 15l = 30 l 15l + 15l = 30 l

FT L1 L2 L3 L4 E1 E2 E3

2.37l 1.50 l 11.44 l 21.81 l 30.92 l 12.29 l 8.06 l 24.42 l

Frmulas utilizadas: 1. 2. 3. 4. Absorbancia Corregida = Abs promedio de muestra Abs promedio de control Conversin de g/ml a g/l = Concentracin de protena en g/ml 1000l Volumen inicial (Vi) = CfVf /Ci ; donde Vf = 30 l Cf = 0.5 g/l Volumen final (Vf ) = ___l de amortiguador de muestra + __l de muestra = 30 l