Seorang peneliti menemukan sebuah spesies tanaman baru.

Tanaman tsb belum pernah

diketahui sebelumnya. Dan ia ingin mengetahui tnmn apakah itu? Si penelliti bermaksud
memanfaatkan markah molekuler/penanda molekuler untuk mengidentifikasi spesies atau
kekerabatan dri spesies tsb.

Markah molekuler merupakan uatu

fragmen yang spesifik
(protein atau DNA) yang dapat diidentifikasi dan
ditemukan dalam lokasi yang spesifik dalam genom
spesies/individu tertentu
Markah molekuler ini bisa berbeda beda bagi setiap spesies atau masing2 individu shg dpt
dikatakan sbg finger print/sidik jari secara molekuler. Konsep dasar marka molekuler adalah
bahwa satu individu memiliki runutan DNA yang unik terhadap individu lain sehingga perbedaan
tersebut dapat digunakan sebagai penanda.

Sifat → STABIL
Kelebihan marka molekuler dalam melakukan seleksi adalah sifatnya yang stabil, tidak terpengaruh
oleh fase pertumbuhan maupun kondisi lingkungan. Susunan gen dari individu akan tetap sama
pada berbagai fase pertumbuhan maupun kondisi lingkungan yang berbeda.

Penanda molekuler yang baik harus memenuhi beberapa persyaratan sebagai berikut : mempunyai
tingkat polimorfisme yang tinggi; bersifat codominant (dapat membedakan antara homozygot dan
heterozygot); terdapat secara random sepanjang genom; reproducible (hasil relatif sama jika
diulang); mudah, cepat dan murah dalam deteksi; tingkat resolusi yang tinggi dengan jumlah
sampel yang besar; serta non-destruktif.

RFLP atau Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP)

adalah Suatu penanda DNA didasarkan pada perbedaan situs
pemotongan oleh enzim endonuklease retriksi (RE). Polimorfisme adalah
Suatu populasi spesies yang memiliki dua atau lebih ciri fenotip yang berbeda

Enzim restriksi memotong DNA dalam 2 cara dan hasil yang berbeda, yaitu:

1. Hasil pemotongan berujung tumpul (blunt atau flush end)

Enzim ini memotong secara simetris antara kedua utas DNA maka menciptakan
ujung tumpul. Contoh enzim yang menghasilkan pola seperti ini ialah SmaI (Sma
one)

2. Hasil pemotongan berujung lancip atau lengket (sticky atau cohesive

ends)
Pola seperti ini lebih mudah melekat (annealing) dengan pasangan DNA nya
sebab adanya ikatan basa antara ujung-ujung yang menggantung. Memotong
dengan asimetris. Contoh: BamHI (Bam H one), HindIII (hin D three)
Ada beberapa enzim retriksi dengan situs pemotongan yang berbeda

Tanda panah merah menunjukan situs pemotongan pada masing-masing enzim retriksi

Penamaan

Escherichia - nama genus

Coli  nama spesies

RY13  nama strain

TAHAP RFLP:

DNA diisolasi lalu diberi salah satu enzim retriksi. Enzim retriksi akan memotong fragmen-fragmen
DNA pada sekuen sekuen DNA sesuai dengan situs pemotongannya

menghasilkan fragmen-fragmen atau potongan-potongan DNA

potongan-potongan DNA tersebut kemudian akan dideteksi dengan

elektroforesis gel agarosa

masing-masing spesies dapat menghasilkan potongan dengan panjang yang

berbeda-beda ditunjukkan dengan pita-pita pada elektroforesis

pemisahan fragmen DNA dengan elektroforesis bergerak dari muatan negatif

kematan positif
DNA merupakan molekul bermuatan negatif sehingga potongan daerah yang
lebih kecil akan bergerak menuju muatan positif sedangkan potongan yang
lebih besar akan tertambat pada gel sehingga akan muncul dekat dengan
muatan negatif

pada contoh berikut spesies a&b dan D menunjukkan kemiripan

 Berikut ini adalah langkah-langkah penggunaan RFLP dalam DNA Typing Menurut
Abuzenadah (2009):
1.    Ekstraksi: Langkah pertama dalam DNA typing adalah ekstraksi DNA dari sampel.
Sampel bisa didapatkan dari darah, air liur, sperma atau beberapa zat biologis
lainnya. Kemudian di amplifikasi dengan teknik PCR
2.    Produksi Restriksi Fragmen: DNA yang dimurnikan kemudian dipotong menjadi
fragmen-fragmen oleh enzim restriksi.
3.    Elektroforesis: Fragmen restriksi memiliki muatan negatif dan dapat dipisahkan
dengan teknik yang disebut gel elektroforesis, yang akan memisahkan potongan DNA
berdasarkan ukurannya. Sampel DNA yang telah diberi perlakuan enzim restriksi,
ditempatkan di jalur terpisah pada lempengan gel elektroforesis yang ditempatkan
pada medan listrik. Fragmen akan berpindah ke arah elektroda positif, fragmen yang
lebih kecil bergerak lebih cepat daripada fragmen yang lebih besar, sehingga dapat
memisahkan sampel DNA ke dalam band atau “pita” yang berbeda.
4.    Deteksi: Band-band tersebut dapat divisualisasikan menggunakan pewarna
luminescent. Pendekatan untuk DNA Typing diperlukan sampel dalam jumlah cukup
besar dari bahan biologisnya, hal ini bertujuan untuk mendapatkan hasil lebih baik
dan data yang lebih masuk akal.

RAPD

Atau Random Amplification of Polymorphic DNA

Aplikasi PCR yang digunakan untuk untuk mendeteksi adanya suatu

polimorfisme DNA dalam suatu populasi atau antarpopulasi

Prinsip kerja →  mengaplikasikan PCR tetapi fragmen genom yang

diperbanyak bersifat acak. dengan satu atau banyak primer pada arbitrary
sequence (sekuens tidak tentu).

Teknik RAPD yang umum dipakai memerlukan oligonukleotida sintesis pendek, berukuran sekitar 10

basa dari sekuens acak

Tidak membutuhkan pengetahuan mengenai DNA sequence yg

dianalisis
TAHAP:

1. Dna diisolasi dri sample dan digunakan sbg template dna

2. Dilakukan Pcr dgn bbrp primer
3. Primer melekat scr acak disepanjang template dna
4. Dan akn teramplifikasi shg trbntk bbrp fragmen dna
5. Fragmen” tsb dideteksi dg elektroforesis,yg akn menghasilkan pita pita sesuai fariasi
panjang fragmen yang dihasilkan
6.        Pada conoh, sampel a dan b menunjukan beberapa kemiripan pd genom.
Ditunjukan oleh pita yang sama pada elektroforesis.(yg dilingkar oranye)
Mikrosatelit dikenal pula sebagai SSR atau Simple Sequence Repeats. Dalam bidang genetika
manusia, khususnya dalam aplikasi di bidang kedokteran forensik, mikrosatelit dikenal
sebagai STR atau Short Tandem Repeats.

dikenal sebagai pengulangan tandem pendek atau mikrosatelit adalah salah satu penanda
molekuler
mikrosatelit adalah saluran dna berulang di mana motif dna tertentu yang dapat berkisar
dari satu sampai enam atau lebih pasangan basa diulang biasanya tiga sampai seratus
kali tergantung pada spesies

prinsip sebagai jenis pengulangan bilangan tandem variabel prinsipnya berputar di sekitar
pengulangan set dinukleotida, trinukleotida atau terkadang pengulangan tetranukleotida

diagram menunjukkan ilustrasi satelit mikro di dinukleotida

polimorfisme terjadi ketika urutan atas memiliki beberapa pengulangan dinukleotida sedangkan
untai bawah memiliki sembilan pengulangan

seperti di gambar, ssr dapat berupa simple atau compond atau interrupted

Biasanya, hanya satu jenis pengulangan yang terlihat, namun dalam beberapa kasus juga
ditemukan lebih dari satu pengulangan

ssr yang terputus di akhir, memiliki nukleotida acak yang menyelinap a di antara unit berulang
yang akan mengganggu ssr, daerah berulang pendek ini biasanya terjadi di daerah non-coding
dari genom yang dikenal sebagai intron sehingga biasanya tidak menyebabkan mutasi atau
penyakit.

namun ada ssr trinukleotida yang terletak di akson pengkode

dalam kasus yang jarang ssrs di wilayah pengkodean juga diketahui menyebabkan penyakit
misalnya penyakit Huntington terjadi ketika pengulangan trinukleotida c-a-g melampaui jumlah
salinan normal

analisis dilakukan dengan mengekstraksi DNA inti dari sel-sel sampel yang diminati, kemudian
mengamplifikasi daerah polimorfik spesifik dari DNA yang diekstraksi melalui PCR . Setelah urutan
ini diamplifikasi, kemudian dilakukan elektroforesis,  yang akan memungkinkan analis untuk
menentukan berapa banyak pengulangan urutan mikrosatelit yang dimaksud. Jika DNA diselesaikan
dengan elektroforesis gel, DNA dapat divisualisasikan baik dengan  silver staining (sensitivitas
rendah, aman, murah), atau  intercalating dye seperti etidium bromida .(cukup sensitif, risiko
kesehatan sedang, murah), atau seperti kebanyakan laboratorium forensik modern
menggunakan, pewarna fluoresen (sangat sensitif, aman, mahal).

ISSR
ISSR melibatkan penggunaan sekuen mikrosatelit sebagai primer dalam
reaksi PCR untuk menghasilkan marka multilokus. ISSR merupakan metode yang
sederhana dan cepat, yang mengkombinasikan keuntungan SSR (Simple Sequence
Repeats) dan AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) dan
keuniversalan RAPD.
Marka ISSR sangat polimorfik dan berguna untuk mempelajari keragaman genetik,
filogeni, tagging gen, pemetaan genom, dan biologi evolusi. ISSR memiliki
reproduksibilitas tinggi karena pengg unaan primer yang lebih panjang (16 – 25
basa nukleotida) dibandingkan primer RAPD (10 basa nukleotida), yang
memungkinkan penggunaan suhu annealing yang tinggi (45 – 60o C).
Teknik ISSR sangat mirip dengan teknik random amplifikasi DNA polimorfik (RAPD),
kecuali bahwa primer ISSR dirancang dari daerah mikrosatelit.

Tahapnya yaitu dengan amplifikasi daerah DNA yang terletak di antara sekuens berulang yang
berdekatan dengan menggunakan primer tunggal panjang yang terdiri dari sekuens berulang 16-18
pasangan basa (bp) yang ditambatkan, pada ujung 3' atau 5', ke 2-4 nukleotida yang berubah-ubah.

Kemudian di elektroforesis untuk dilihat ada atau tidaknya fragmen dengan ukuran tertentu.