MODUL PRAKTIKUM

REKAYASA GENETIKA

Disusun Oleh :

Dr. Ir. Joni Kusnadi, M.Si

Ir. Aji Sutrisno, M.Sc., PhD
Agustin Krisna Wardani, STP., M.Si., PhD
Mochamad Nurcholis, STP., MP., PhD
Feronika Heppy Sriherfyna, STP., MP
Rhytia Ayu C. Putri, STP., MP., M.Sc
Freini Dessi Effendi, STP., MP., M.Sc

JURUSAN TEKNOLOGI HASIL PERTANIAN

FAKULTAS TEKNOLOGI PERTANIAN
UNIVERSITAS BRAWIJAYA
MALANG
2020
 DAFTAR ISI

Daftar Isi......................................................................................................................................2
Peraturan Praktikum...................................................................................................................3
Deskripsi Praktikum....................................................................................................................6
Isolasi DNA Genomik dan Plasmid..............................................................................................7
Isolasi DNA Target Menggunakan Metode PCR........................................................................14
Pembuatan Sel Kompeten dan Teknik Transformasi Plasmid..................................................18
Konfirmasi Keberhasilan Transformasi ....................................................................................22
Pembuatan Reagen...................................................................................................................26
Daftar Pustaka...........................................................................................................................28

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 2

 PERATURAN PRAKTIKUM

1. Mahasiswa/peserta/praktikan yang boleh mengikuti praktikum Rekayasa Genetika

adalah yang telah mengisi KRS untuk mata praktikum Rekayasa Genetika yang diampu
oleh Dosen Jurusan Teknologi Hasil Pertanian-FTP-UB.
2. Setiap mahasiswa wajib hadir tepat pada waktu yang telah ditentukan. Apabila peserta
terlambat lebih dari 10 menit dari waktu tersebut, maka tidak diperkenankan untuk
mengikuti praktikum pada hari itu.
3. Setiap mahasiswa wajib membaca modul praktikum dan mengerjakan tugas pre-lab
termasuk membuat diagram alir kerja yang diserahkan kepada asisten sebelum
memasuki laboratorium.
4. Selama mengikuti praktikum, mahasiswa wajib memakai jas laboratorium yang
dikancingkan untuk menghindari kemungkinan terjadinya kontaminasi, infeksi dan
sebagainya.
5. Selama praktikum, mahasiswa wajib melepas sepatu ketika memasuki laboratorium
mikrobiologi dan dilarang memakai kaos oblong.
6. Selama praktikum, mahasiswa dilarang makan, minum, atau merokok di dalam
laboratorium.
7. Mahasiswa dilarang makan/minum dengan menggunakan alat laboratorium.
8. Selama praktikum, mahasiswa dilarang keluar laboratorium tanpa seijin asisten
praktikum, kecuali pada saat ishoma.
9. Sebelum melaksanakan praktikum, setiap kelompok mahasiswa diwajibkan membuat
daftar bon alat gelas yang dipinjam dan diserahkan ke asisten praktikum.
10. Alat-alat yang akan digunakan dalam praktikum harus dalam keadaan bersih dan steril.
11. Mahasiswa wajib mengetahui cara pemakaian peralatan laboratorium sebelum
menggunakannya, bila perlu menanyakan ke petugas atau laboran.
12. Sebelum praktikum dimulai, meja kerja harus dibersihkan dengan disinfektan (detol)
atau alkohol 70% atau 200 ppm klorin.
13. Selama praktikum, meja atau peralatan yang terkena kultur mikrobia harus dibersihkan
dengan disinfektan (detol) atau alkohol 70%.
14. Selama bekerja di laboratorium, mahasiswa sebaiknya menghindari untuk mengusap
(menyentuh) mulut, telinga, hidung, mata ataupun muka.
15. Mahasiswa dilarang menggunakan mulut untuk mengambil cairan atau biakan mikrobia.
Hal ini bertujuan untuk menghindari kemungkinan masuknya bahan yang berbahaya
(bahan kimia atau mikrobia) ke dalam tubuh.
16. Mahasiswa dilarang membuang biakan yang masih hidup atau media ke dalam bak
pencuci atau sembarang tempat pembuangan, tetapi dibuang di tempat khusus yang
telah disediakan.
17. Biakan mikrobia yang tidak terpakai lagi, harus dibuang/diletakkan di tempat khusus
yang telah disediakan atau disterilkan dengan otoklaf kemudian segera dicuci.
18. Setiap peserta praktikum harus mengembalikan alat-alat yang telah dipakai dalam
keadaan bersih dan kering serta mengembalikan ke lemari atau loker yang telah
disediakan. Asisten wajib mengecek terlebih dahulu alat yang telah digunakan pada
saat praktikum.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 3

19. Bagi peserta yang memecahkan alat, maka harus mengganti alat tersebut (maksimal 1
bulan dari waktu kejadian pecahnya alat).
20. Setiap peserta harus mengembalikan bahan-bahan yang diambil ke tempat semula
dengan tertib.
21. Setiap mahasiswa harus bertanggung jawab terhadap kebersihan laboratorium sesudah
praktikum selesai, termasuk membersihkan meja kerja dengan desinfektan.
22. Sebelum meninggalkan laboratorium, peserta dianjurkan untuk mencuci tangan dengan
sabun dan air mengalir.
23. Apabila terjadi kecelakaan (tertusuk, terluka, tubuh terkena bahan kimia) segera
melapor ke petugas laboratorium.
24. Setiap kelompok mahasiswa wajib membuat laporan sementara praktikum yang berisi
data pengamatan selama praktikum dan ditandatangani oleh asisten. Laporan
sementara digunakan sebagai data penyusunan laporan praktikum dan wajib
dilampirkan pada laporan praktikum.
25. Data dari masing-masing kelompok harus ditabulasi (sharing data) dan setiap peserta
membahas data semua kelompok.
26. Setelah mengikuti praktikum setiap kelompok praktikum diwajibkan mengisi lembar
kerja praktikum yang berisi data pengamatan selama praktikum dan pertanyaan dalam
lembar kerja praktikum dijawab.
27. Laporan dikumpulkan 6 hari setelah data hasil praktikum didapatkan.
28. Peserta praktikum dilarang membawa laporan praktikum mahasiswa angkatan
sebelumnya ke dalam ruang praktikum.
29. Bagi mahasiswa yang tidak dapat mengikuti praktikum harus meminta ijin kepada
koordinator praktikum maksimal H-2 praktikum untuk mengganti jadwal di bab yang
sama, namun di kelas yang berbeda.
30. Mahasiswa yang tidak mengikuti praktikum lebih dari satu kali maka dinyatakan tidak
lulus praktikum.
31. Mahasiswa yang tidak mengumpulkan laporan praktikum lebih dari dua kali dinyatakan
tidak lulus praktikum.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 4

 Sanksi Pelanggaran Praktikum Rekayasa Genetika

1. Setiap peserta harus hadir tepat pada waktu yang telah ditentukan. Apabila peserta
terlambat, maka akan dikenakan -2 tiap menit pada nilai laporan. Apabila peserta
terlambat lebih dari 5 menit, maka peserta tidak diperkenankan mengikuti praktikum
di hari tersebut, kecuali telah mendapat izin dari dosen pengampu.
2. Mahasiswa tidak diperkenankan mengoperasikan gadget selama praktikum, apabila
melanggar -30.
3. Pre-lab, laporan praktikum, dan logbook ditulis tangan menggunakan bolpoin
bertinta warna biru pada kertas A4. Menggunakan border (warna biru) dengan
margin 3,2,2,2 ditulis tangan. Tulisan rapih dan dapat dibaca, tulisan yang tidak
terbaca akan mempengaruhi nilai. Tiap lembar diberi header berisi nama, nim,
kelompok, ditulis tangan. Tanpa header -1 per halaman. Satu paragraf min 3 kalimat.
4. Ketauan plagiat, nilai akan dibagi sejumlah orang yang sama.
5. Cover menggunakan kertas berwarna ungu, ketidaksesuaian pada cover -2.
6. Menyontek pada saat pretest/postest -30 tanpa peringatan.
7. Cek loker dan preparasi minimal dilakukan oleh 2 orang tiap kelompok, dengan
toleransi keterlambatan 10 menit. Kelompok yang tidak melakukan cek loker dan
preparasi tidak diperkenankan mengikuti praktikum.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 5

 DESKRIPSI PRAKTIKUM BIOTEKNOLOGI REKAYASA GENETIKA

A. Deskripsi Mata Ajaran Praktikum

Materi praktikum yang akan dilakukan meliputi : isolasi DNA genomik dan plasmid,
amplifikasi DNA dengan metode Polymerase Chain Reaction (PCR), teknik transformasi
plasmid ke dalam sel inang, dan teknik konfirmasi keberhasilan proses transformasi

B. Tujuan Instruksional Umum

Setelah menyelesaikan mata praktikum ini mahasiswa diharapkan akan memiliki skill
atau keterampilan untuk mengisolasi DNA genomik dan plasmid, mampu melakukan
isolasi DNA target menggunakan PCR, melakukan teknik transformasi plasmid ke dalam
sel inang baik menggunakan metode heat shock maupun elektroporasi, melakukan uji
untuk mengetahui keberhasilan proses transformasi serta menganalisis data hasil
praktikum.

C. Materi Praktikum
1) Isolasi DNA Genomik dan Plasmid
2) Amplifikasi DNA Metode Polymerase Chain Reaction (PCR)
3) Pembuatan Sel Kompeten dan Teknik Transformasi Plasmid
4) Konfirmasi Keberhasilan Transformasi

D. Penilaian Hasil Belajar

No Komponen Bobot
1 Pre/Post test 20%
Laporan Praktikum:
2 a. pre-lab (10%) 30%
b. laporan akhir (20%)
3 Aktifitas Praktikum 20%
4 UAP 30%
Total 100 %

Hasil penilaian dalam bentuk huruf, yaitu:

A : ≥ 80 C : ≥60 - 64
B+ : ≥75 - 79 D+ : ≥55 - 59
B : ≥70 - 74 D : ≥50 - 54
C+ : ≥65 - 69 E : ≥0 – 49

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 6

 1 ISOLASI DNA GENOMIK & PLASMID

A. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk:
1. Mengisolasi DNA genomik.
2. Mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA genomik hasil isolasi.
3. Mengisolasi DNA plasmid.
4. Mengetahui konsentrasi dan kemurnian DNA plasmid hasil isolasi.

B. INDIKATOR BELAJAR
Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu:
1. Mengaplikasikan teknik isolasi DNA genomik.
2. Mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA genomik dan plasmid hasil isolasi.
3. Mengaplikasikan teknik isolasi DNA plasmid.
4. Mengukur konsentrasi dan kemurnian DNA plasmid dan plasmid hasil isolasi.

C. LANDASAN TEORI
DNA merupakan pembawa materi genetik bagi hampir semua makhluk hidup
yang ekspresinya dipengaruhi oleh lingkungan internal atau eksternal seperti
perkembangan fisik atau perilaku organisme itu sendiri. Molekul DNA membawa
informasi hereditas dari sel dan komponen protein (molekul-molekul histon) dari
kromosom. Menurut Clark and Pazdernik (2012), DNA merupakan polimer nukleotida
pembawa gen yang terdiri dari komponen gula deoksiribosa, gugus fosfat dan basa
nitrogen, untai berbentuk “double helix” dan antar nukleotidanya dihubungkan oleh
ikatan 5’-3’ fosfodiester.
Dalam analisa biologi molekuler, tahap awal dan essensial yang harus dilakukan
yaitu isolasi DNA. Menurut Surzycky (2000), isolasi DNA dengan berat molekul yang
tinggi menjadi sangat penting seiring dengan meningkatnya permintaan di bidang DNA
fingerprinting, RFLP, konstruksi genom atau sequencing libraries dan analisa PCR dalam
laboratorium penelitian maupun industri. Isolasi DNA dapat dilakukan dari tanaman,
hewan maupun bagian tubuh manusia. Isolasi DNA dilakukan dengan merusak dinding
sel dan membran inti, kemudian dilanjutkan dengan pemisahan DNA dari berbagai
komponen sel yang lain, selanjutnya dipisahkan dari kontaminan lain seperti RNA
maupun protein.
Isolasi DNA yang dilakukan pada praktikum ini yaitu dari sel bakteri Escherichia
coli dan Lactobacillus plantarum. Penggunaan kedua jenis isolat tersebut didasarkan atas
perbedaan Gram. Escherichia coli merupakan bakteri Gram (-) sedangkan Lactobacillus
plantarum merupakan Gram (+). Kedua jenis isolat ini akan dibandingkan kemurnian
DNA dan visualisasinya dengan uji kuantitatif dan kualitatif. Uji kualitatif dilakukan
dengan elektroforesis gel agarosa, sedangkan uji kuantitatif dengan spektrofotometer
UV-Vis. Nilai kemurnian DNA yang tinggi (range antara 1,8-2,0) merupakan salah satu
acuan untuk tahap teknik biologi molekuler berikutnya.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 7

 DNA Plasmid
DNA plasmid memiliki karakteristik kecil, sirkuler/melingkar, DNA
ekstrakromosom pada beberapa bakteri. Secara alamiah, plasmid berukuran cukup
besar yakni sekitar kurang dari 1.000 bp sampai lebih dari 200 kbp. Akan tetapi plasmid
yang sering digunakan untuk teknik rekayasa genetika yaitu berkisar antara 4-5 kbp.
Apabila dibandingkan dengan ukuran DNA kromosom Escherichia coli yaitu sebesar
4000 kbp, ukuran plasmid jauh lebih kecil. Karakteristik lain dari plasmid yaitu
mengandung gen resisten terhadap antibiotik, dimana pada bakteri normal, gen ini
tidak tersedia. DNA plasmid di dalam bakteri memiliki konfigurasi supercoiled/terpilin
seperti pita karet. Ketika diisolasi, konfigurasi DNA plasmid dapat berbentuk supercoiled
atau berubah menjadi relaxed (ketika mengalami katalisis oleh enzim DNAse pada salah
satu bagiannnya) atau dapat juga berbentuk linier.
Melalui proses transfer plasmid, bakteri akan memperoleh karakteristik baru.
Beberapa ahli rekayasa genetika telah mengembangkan penggunaan enzim restriksi
untuk memotong dan menyambung gen ke dalam plasmid. Plasmid tersebut kemudian
dipindahkan ke dalam sel bakteri atau inang. Selanjutnya bakteri akan menggunakan
gen hasil rekombinasi untuk menghasilkan protein. Ketersediaan jumlah DNA plasmid
dalam jumlah besar memiliki beberpa peranan, diantaranya pembuatan probe DNA,
penentuan urutan DNA, membuat gen termutasi.
Prosedur yang sering digunakan dalam isolasi DNA bakteri sangat banyak dan
bervariasi. Salah satu metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi DNA plasmid
yaitu metode “Minipreps / Alkaline Lysis”. Proses isolasi dilakukan untuk jumlah kultur
setara dengan 1,5 ml. Metode ini biasanya dilakukan sebagai penelitian pendahuluan
dalam mendeteksi keberadaan plasmid pada bakteri atau mengetahui fragmen DNA
plasmid yang diinginkan.

Menghitung Konsentrasi DNA Genomik dan Plasmid (Sambrook dan Russell, 2001)

Konsentrasi DNA genomik = A260 x FP x 50 µg/mL

Konsentrasi DNA plasmid = A260 x FP x 50 µg/mL

D. KEGIATAN PRAKTIKUM
1. Bahan Praktikum
a. Isolasi DNA Genomik Bakteri
 Kultur mikroorganisme : Lactobacillus plantarum dan Escherichia coli
 LB (1% pepton, 0,5% yeast ekstrak, 1% NaCl)
 TE buffer (10 mM tris-Cl pH 8 dan 1 mM EDTA pH 8)
 Lisozim konsentrasi 10 mg/mL dalam 10 mM tris-Cl pH 8
 Proteinase-K konsentrasi 1 mg/mL dalam larutan STEP
 Tris buffer fenol (saturated phenol) pH 8
 Na-asetat 3 M
 Etanol absolut (Ice cold)
 Kloroform : isoamil alkohol (24 : 1)
 Etanol 70%
 RNAse
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 8
  ddH2O steril
 Agarosa
 Gelred 1x
 Marker DNA 1Kb
 Loading buffer
 Kapas
 Kertas payung
 Akuades
 Spirtus
 Karet
 Es batu

b. Isolasi DNA Plasmid

 Kultur mikroorganisme: Escherichia coli DH5α rekombinan (berisi pUC18)
 LB (1% pepton, 0,5% yeast ekstrak, 1% NaCl)
 Larutan ampisilin stok 100 mg/mL.
 Solution I steril (50 mM glukosa, 10 mM EDTA pH 8, 25 mM tris-Cl pH 8)
 Solution II steril (0,2 M NaOH, 1% SDS dibuat fresh saat praktikum)
 Solution III steril (60 ml larutan 5M potasium asetat, 11,5 mL asam asetat
glasial, dan 28,5 mL aquades)
 Ice cold isopropanol
 Ice cold etanol 70%
 RNAse (1 mg/mL dalam Tris-HCl 10 mM pH 8)
 ddH2O steril
 TE buffer (10 mM tris-Cl pH 8 dan 1 mM EDTA pH 8)
 Agarosa
 Gelred 1x
 Marker DNA 1Kb
 Loading buffer
 Kapas
 Kertas payung
 Etanol 70%
 Akuades
 Spirtus
 Karet
 Plastik
 Es batu

2. Peralatan Praktikum
a. Isolasi Genomik DNA Bakteri
 Waterbath shaker
 Sentrifuse dingin
 Freezer -20oC
 Falcon tube
 Ice box
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 9
  Mikropipet
 Mikrotip
 Seperangkat alat elektroforesis DNA
 Konsentrator
 Inkubator
 Spektrofotometer
 UV Iluminator

b. Isolasi DNA Plasmid

 Shaker inkubator
 Sentrifuse dingin
 Freezer -20oC
 Falcon tube
 Ice box
 Mikropipet
 Mikrotip
 Seperangkat alat elektroforesis DNA
 Konsentrator
 Spektrofotometer
 UV Iluminator

3. Prosedur Kerja
Prosedur Isolasi DNA Genomik (Sambrook and Russel Modifikasi, 2001)
a. Sebanyak 1 koloni tunggal dari biakan cawan petri diinokulasi ke dalam 10 ml
medium LB cair steril, lalu diinkubasi pada suhu 37 oC selama 24 jam untuk E. coli
dan pada 10 ml medium MRSB steril, lalu diinkubasi suhu 30oC dengan selama 24
jam untuk L. Plantarum.
b. Kultur bakteri disentrifuse pada kecepatan 6.000 rpm suhu 4 oC selama 5 menit,
lalu supernatan dibuang.
c. Pelet diresuspensi dalam 1 mL TE buffer, kemudian disentrifuse pada kecepatan
6.000 rpm suhu 4oC selama 5 menit, lalu supernatan dibuang.
d. Pelet dibekukan pada suhu -20oC selama satu jam.
e. Sebanyak 100 µl lisozim ditambahkan pada pelet beku, lalu dicairkan pada suhu
ruang dan dihomogenkan dengan metode tapping. Perhatian: Selalu letakkan
lisozim pada wadah berisi es, agar enzim tidak rusak! Siapkan lisozim secara
fresh.
f. Setelah pelet mencair, suspensi diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit.
g. sebanyak 200 µl proteinase-K ditambahkan ke dalam suspensi pelet, diinkubasi
pada suhu 50oC selama 1 jam (sesekali dibolak-balik perlahan setiap 10 menit).
Perhatian: Selalu letakkan proteinase-K pada wadah berisi es, agar enzim tidak
rusak! Siapkan proteinase-K secara fresh. Bubuk SDS beracun jika terhirup dan
dapat menyebabkan iritasi. NaOH bersifat korosif. Selalu gunakan sarung
tangan dan masker!
h. Sebanyak 400 µl TE buffer ditambahkan ke dalam suspensi, campur dengan
tapping.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 10

 i. Sebanyak 700 µl tris buffer fenol ditambahkan, dicampur selama 5 menit pada
suhu ruang dengan cara inversion/dibolak-balik perlahan (jangan divorteks).
Perhatian: Fenol merupakan bahan kimia yang bersifat KOROSIF, MUDAH
TERBAKAR, dan BERACUN jika terhirup. Gunakan sarung tangan, dan masker!
Jika terkena kulit, segera bilas menggunakan air mengalir dan jangan sampai
terkena mata!
j. Suspensi kemudian disentrifuse pada suhu 4oC kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit (DNA berada diatas). Ulangi tahapan sentrifuse pada kecepatan dan waktu
yang sama.
k. Ambil fase atas (kurang lebih 700 µl) dengan tip steril (jangan sampai terambil
bagian tengah atau fase intermediet), kemudian fase atas tersebut ditransfer ke
falcon tube baru. Perhatian: Fase tengah jangan sampai terambil. Apabila fase
tengah terambil, tahap penambahan tris buffer dan sentrifuse diulang.
l. Sebanyak 700 µl tris buffer fenol ditambahkan ke dalam tube yang berisi DNA,
dicampur selama 5 menit pada suhu ruang dengan cara inversion/dibolak-balik
perlahan (jangan divorteks).
m. Suspensi kemudian disentrifuse pada suhu 4oC kecepatan 10.000 rpm selama 15
menit (DNA berada diatas). Ulangi tahapan sentrifuse pada kecepatan dan waktu
yang sama.
n. Transfer sebanyak 500 µl fase atas (larutan DNA) ke dalam tube steril baru.
o. Tambahkan kloroform : isoamilalkohol sebanyak 1 kali dari volume suspensi
tahap sebelumnya (500 µl) ke dalam tube, kemudian dibolak balik perlahan pada
suhu ruang selama 5 menit (jangan divortex), kemudian dilakukan sentrifugasi
10.000 rpm selama 15 menit. Ulangi tahapan sentrifuse pada kecepatan dan
waktu yang sama. Perhatian: Fase tengah jangan sampai terambil. Kloroform
merupakan senyawa KARSINOGEN dan BERACUN jika terhirup. Jangan sampai
terkena mata. Gunakan sarung tangan, dan masker!
p. Transfer sebanyak 400 µl fase atas (larutan DNA) ke dalam tube steril baru.
q. Tambahkan 5 µl RNAse ke dalam 500 µl fase atas (larutan DNA), kemudian
campur dengan cara inversion, dan diinkubasi pada suhu 37 oC selama 30 menit.
Perhatian: Selalu letakkan RNAse pada wadah berisi es, agar enzim tidak rusak!
r. Tambahkan Na-asetat 3 M sebanyak 0,1x volume sampel (40 µl). DNA akan
mengalami presipitasi pada tahapan ini.
s. Tambahkan etanol absolut dingin sebanyak 2x volume tahap sebelumnya (880
µl), lalu bolak-balik tube. DNA terlihat seperti benang panjang.
t. Sentrifugasi pada suhu 4oC, kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit untuk
mengendapkan DNA. Buang supernatan yang dihasilkan.
u. Endapan atau pelet DNA dibilas dengan 70% etanol dingin. Sentrifugasi pada
suhu 4oC, kecepatan 10.000 rpm selama 15 menit untuk mengendapkan DNA.
Ulangi tahapan pencucian dengan 70% etanol dan disentrifuse kembali dengan
kecepatan dan waktu yang sama.
v. Pelet DNA dikeringkan pada konsentrator atau oven suhu 55 oC selama 5-10
menit sampai sisa alkohol menguap.
w. Pelet DNA dilarutkan dalam 30-300 µL TE buffer (tergantung banyaknya pelet
DNA yang diperoleh).

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 11

 x. Larutan DNA disimpan di suhu -20oC. Perhatian: Hindari untuk melakukan
freeze-thaw berulang, untuk menjaga kestabilan DNA, dan selalu simpan pada
es jika dikeluarkan dari freezer!
y. sebanyak 4 µL DNA dilakukan pengecekan menggunakan elektroforesis gel
agarosa, kemudian dianalisa konsentrasi dan kemurnian DNA secara
spektrofotometrik.

Prosedur Ekstraksi Plasmid Skala Kecil (Mini Preparation) dengan Metode Alkali
(Modifikasi Sambrook and Russel, 2001)
a. Sebanyak 1 koloni tunggal E.coli rekombinan dari lempeng agar diambil dan
dibiakkan pada 4 mL medium LB steril + ampisilin pada suhu 37oC selama 16-18
jam. Perhatian: konsentrasi akhir ampisilin adalah 100µg/mL
b. Sebanyak 1.5 ml kultur E.coli rekombinan dimasukkan pada microtube dan
disentrifuse menggunakan 6.000 rpm, 4oC selama 5 menit.
c. Supernatan yang dihasilkan dibuang, dan pelet bakteri dibiarkan tetap dalam
microtube.
d. Sebanyak 100 µL solution I steril ditambahkan ke dalam falcon tube, kemudian
dilakukan vorteks sampai seluruh pelet tercampur sempurna, lalu dibiarkan
dalam suhu ruang selama 5 menit.
e. Sebanyak 200 µL solution II steril ditambahkan ke dalam falcon tube dan
dibolak-balik secara perlahan, lalu diinkubasi di es selama tepat 5 menit.
Suspensi akan menjadi bening, dan pada tutup tube akan nampak benang-
benang yang lengket. Perhatian: inkubasi terlalu lama akan menyebabkan
meningkatnya kontaminasi DNA genomik.
Perhatian: Bubuk SDS beracun jika terhirup dan dapat menyebabkan iritasi.
NaOH bersifat korosif. Selalu gunakan sarung tangan dan masker!
f. Sebanyak 150 µL solution III steril ditambahkan ke dalam falcon tube dan
dikocok dengan cepat dan kuat, kemudian diinkubasi di es selama 5 menit.
Perhatian: Asam asetat glasial bersifat korosif dan menyebabkan iritasi pada
mata dan kulit. Selalu gunakan sarung tangan, masker dan lemari
asam!
g. Microtube berisi campuran solution I, II, III kemudian dilakukan sentrifugasi pada
10.000 rpm, 4oC selama 15 menit. Ulangi tahapan sentrifugasi pada kecepatan
dan lama waktu yang sama. Lalu supernatan (kira-kira 400 µL) diambil hati-hati
dan dipindahkan ke falcon tube baru. Perhatian: jangan sampai endapan ikut
terbawa.
h. Sebanyak 300 µL ice cold isopropanol ditambahkan ke dalam tube tersebut,
kemudian tube dibolak balik.
i. Kemudian falcon tube didiamkan pada suhu ruang selama 30 menit.
j. Lakukan sentrifugasi pada 10.000 rpm, suhu 4oC selama 15 menit. Ulangi
tahapan sentrifugasi pada kecepatan dan lama waktu yang sama.supernatan
dibuang.
k. Pelet DNA dicuci dengan menambahkan 500 µL ice cold 70% etanol ke dalam
tube eppendorf kemudian disentrifuse menggunakan 10.000 rpm 4oC selama 15
menit dan supernatan dibuang. Lakukan sebanyak 2 kali.
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 12
 l. Pelet DNA dikeringkan pada konsentrator suhu sampai alkohol menguap dan
tidak berbau.
m. DNA plasmid pelet dilarutkan dengan 30-50 µL TE buffer (tergantung banyaknya
pelet DNA)
n. Tambahkan 5 µL RNAse diinkubasi pada suhu 37oC selama 30 menit.
o. DNA plasmid kemudian disimpan pada -20oC.
Perhatian: Hindari untuk melakukan freeze-thaw berulang, untuk menjaga
kestabilan DNA, dan selalu simpan pada es jika dikeluarkan dari
freezer!
p. Sebanyak 4 µL DNA dilakukan pengecekan menggunakan elektroforesis gel
agarosa, kemudian dianalisa konsentrasi dan kemurnian DNA secara
spektrofotometrik.
Perhatian: Etidium bromida yang digunakan pada elektroforesis DNA bersifat
karsinogenik. Selalu gunakan sarung tangan! Etidium bromida
rusak karena panas dan cahaya, simpan dalam wadah gelap!

Penentuan Konsentrasi dan Kemurnian DNA dengan Spektrofotometer (modifikasi

Sambrook and Russell, 2001)
a. 500 µL larutan sampel DNA yang telah diencerkan dimasukkan ke dalam kuvet
(5µL DNA ditambah dengan 495µL ddH2O), blanko yaitu 500 µL ddH2O.
b. Diukur serapan DNA dengan spektrofotometer pada panjang gelombang 260 nm
dan 280 nm.
c. konsentrasi DNA dihitung dengan rumus : A 260 x FP x 50 g/mL. Nilai A260 = 1
menunjukkan konsentrasi DNA untai ganda sebesar 50g/mL.
d. Kemurnian DNA dihitung dengan rumus : A 260 / A 280

ISOLASI DNA TARGET MENGGUNAKAN

2 METODE
Modul Praktikum Rekayasa PCR
Genetika 2020 13
A. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk:
1. Melakukan proses amplifikasi atau perbanyakan molekul DNA Lactobacillus
plantarum menggunakan alat PCR.
2. Melakukan konfirmasi keberhasilan proses amplifikasi DNA.

B. INDIKATOR BELAJAR
Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu:
1. Mengaplikasikan teknik amplifikasi DNA dengan metode PCR.
2. Mengkonfirmasi keberhasilan proses amplifikasi DNA.

C. LANDASAN TEORI
Polymerase chain reaction (PCR) ditemukan oleh Dr. Kary Mullis pada tahun
1983. Pada saat itu, ia bekerja di Cetus Corporation, salah satu perusahaan bioteknologi
pertama. Kemudian pada tahun 1993, ia menerima Hadiah Nobel dalam bidang Kimia
"for his invention of the polymerase chain reaction method" (Najafov and Hoxhaj,
2017). PCR telah merevolusi bidang biologi molekuler karena sebelumnya hanya ada
satu cara mengamplifikasi DNA yaitu menggunakan bakteri untuk membuat Salinan
DNA. Oleh karena itu, merupakan cikal bakal banyak teknologi biologi molekuler, antara
lain sequencing, cloning dan rekayasa genetika (Clark, et al., 2018).
PCR merupakan proses enzimatik di mana wilayah spesifik DNA direplikasi
berulang-ulang untuk menghasilkan banyak salinan dari urutan tertentu (Butler, 2012).
PCR didefinisikan sebagai teknik mengamplifikasi DNA dengan siklus berulang dari
pemisahan untaian dan replikasi DNA secara in vitro (Clark, et al., 2018). PCR sangat
sensitif karena hanya dengan sedikit DNA dari satu sel dapat menghasilkan produk yang
jumlahnya cukup untuk kloning, sequencing, ataupun analisa lainnya (Clark and
Pazdernik, 2012).
Metode PCR terdiri atas tiga tahap dasar pada setiap satu siklus (cycle), yaitu
denaturasi (denaturation), penempelan primer (primer annealing), dan elongasi
(elongation). Pertama, tahap denaturasi, template DNA di denaturasi dengan suhu
tinggi digunakan untuk menghentikan semua reaksi enzimatis dan memisahkan untai
ganda DNA menjadi untai tunggal. Suhu yang biasa digunakan adalah sekitar 90 oC
selama satu atau dua menit. Tahap kedua (primer annealing), suhu diturunkan menjadi
50-60oC, untuk memberikan waktu primer oligonukleotida menempel pada posisi
tertentu di template DNA. Tahap tersebut merupakan tahap yang paling kritis, karena
jika primer dapat menempel pada posisi target yang diinginkan pada cetakan, maka
diharapkan akan diperoleh sintesis produk PCR yang diinginkan. Tahap ketiga (elongasi),
suhu ditingkatkan menjadi 70oC selama satu atau dua menit untuk memberikan waktu
enzim thermostable polymerase bekerja secara optimum mensintesis segmen DNA
target dimulai dari primer hingga DNA baru menjadi lengkap. DNA disintesis dari ujung
5’ menuju 3’ pada kedua strand baru (Clark and Pazdernik, 2012). Suhu dan waktu
dapat berbeda tergantung pada bahan-bahan yang digunakan.

D. KEGIATAN PRAKTIKUM
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 14
 Amplifikasi dengan PCR
1. Bahan Praktikum
 Aquabidest / Milli-Q water steril
 Mix PCR (KAPA SYBR Fast qPCR Mastermix (2X) Kit ABI Prism®)
terdiri dari: KAPA SYBR FAST DNA Polymerase, reaction buffer, dNTPs, SYBR Green I dye,
and MgCl2 at a final concentration of 2.5 mM. Where noted, Master Mixes contain
instrument-specific reference dyes.
 Template DNA / target DNA Lactobacillus plantarum
 Forward dan reverse primers untuk Bakteri Asam Laktat
reverse primers  Sequence - mlb16
5’ – GGC TGC TGG CAC GTA GTT AG - 3’
forward primers  Sequence - plb16
5’ – AGA GTT TGA TCC TGG CTC AQ – 3’
 Es batu serut

2. Peralatan Praktikum
 Mesin PCR
 Mikropipet
 Mikrotip steril
 Microtube steril

3. Prosedur Kerja Amplifikasi dengan PCR (Sambrook and Russell, 2001 modifikasi)
a. Siapkan sampel dan Buffer mix PCR disiapkan dengan komposisi :
Komponen Tabung (Micro-tube)
1 2 3 4
Template DNA (pRY121 DNA, 2µg/ml) 3 µL 3 µL 3 µL 3 µL
atau coloni Lactobacillus plantarum
10x Buffer mix PCR 10 µL 10 µL 10 µL 10 µL
Pimer Forward plb16, 10 µM 1 µL 1 µL - -
Primer Reverse mlb16, 10 µM 1 µL - 1 µL -
ddH2O steril 10 µL 11 µL 11 µL 12 µL
TOTAL 25 µL 25 µL 25 µL 25 µL
Perhatian: Bahan PCR harus selalu ditempatkan pada wadah berisi es setelah
dikeluarkan dari freezer.
b. Program temperatur ”hot start” pada mesin PCR diset sebagai berikut
denaturasi awal 94oC 2 menit, denaturasi siklus 94oC 30 detik, penempelan
primer siklus 53-60oC 45 detik, elongasi DNA siklus 72 oC 2 menit. Masing-masing
siklus diulang sebanyak 30-35 kali.
c. Proses total amplifikasi (30 siklus) berlangsung selama kurang lebih 2,5-3 jam.
d. Hasil amplifikasi (ampliokon) disimpan pada suhu -20 oC. Sebagian hasil
amplifikasi (5 µL fragmen PCR, 1 µL loading dye) dikonfirmasi dengan
elektroforesis agarosa.

Elektroforesis DNA menggunakan gel agarosa (Sambrook & Russell, 2001)

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 15
 1. Bahan Praktikum
 Agarosa
 Sampel DNA
 1x TAE buffer
 loading dye
 DNA marker 1Kb
 Larutan EtBr stok 10 mg/ml

2. Peralatan Praktikum
 Set peralatan elektroforesis gel agarose
 Power supply
 Mikropipet
 Mikrotip
 Sarung tangan latex
 UV illuminator
 Kompor listrik
 Erlenmeyer
 Timbangan analitik.

3. Prosedur Kerja Elektroforesis DNA

Perhatian: Semua pekerjaan harus dilakukan menggunakan sarung tangan latex
a. Bersihkan set peralatan elektroforesis gel agarosa menggunakan air mengalir.
b. Larutkan 0,8% agarosa dalam 1xTAE buffer. Panaskan hingga agarosa terlarut
sempurna.
c. Tambahkan 4 µl EtBr pada larutan 0,8% agarosa hangat.
d. Tuangkan larutan agarosa hangat pada cetakan agarosa set peralatan
elektroforesis.
e. Segera pasang sisir pada set elektroforesis gel agarosa, beri jarak 1-1,5 cm dari
dasar alat.
f. Perhatikan apakah terdapat gelembung atau tidak. Jika terdapat gelembung,
gunakan ujung mikrotip untuk menghilangkan gelembung.
g. Biarkan 30-45 menit hingga memadat sempurna.
h. Tuangkan sedikit 1xTAE buffer diatas gel agarosa, kemudian angkat sisir dari gel
agarosa padat secara hati-hati.
i. Tuangkan 1x TAE buffer hingga gel agorosa terputup secara sempurna oleh TAE
buffer.
j. Campur sampel DNA dengan 0,2x volume 6x loading dye.
k. Load perlahan campuran sampel DNA dan loading dye lubang gel agarosa
dengan menggunakan mikropipet.
l. Tutup set peralatan elektroforesis dan hubungkan dengan power supply.
m. Jalankan proses elektroforesis menggunakan daya 80-100 V.

n. Deteksi keberadaan DNA menggunakan UV illuminator, kemudian abadikan

hasil visualisasinya.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 16

 Perhatian: Sinar UV dapat merusak retina mata dan menyebabkan mutasi
DNA. Lindungi mata dan kulit saat menggunakan UV iluminator.
Jangan menatap lampu UV terlalu lama atau gunakan goggles.
o. Analisis hasil visualisasi elektroforesis DNA dengan cara membandingkan
dengan marker DNA.
Perhatian: simpan marker DNA pada freezer atau wadah berisi es batu untuk
mencegah kerusakan.

3 PEMBUATAN SEL KOMPETEN DAN TEKNIK

TRANSFORMASI PLASMID
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 17
A. TUJUAN
Praktikum ini bertujuan untuk:
1. Melakukan proses transformasi plasmid ke dalam sel inang bakteri menggunakan
metode heat shock.
2. Melakukan proses transformasi plasmid ke dalam sel inang bakteri menggunakan
metode elektroporasi.

B. INDIKATOR BELAJAR
Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu:
1. Mengaplikasikan teknik transformasi plasmid ke dalam sel inang bakteri (metode
heat shock).
2. Mengaplikasikan teknik transformasi plasmid ke dalam sel inang bakteri (metode
elektroporasi).
3. Mengatahui perbedaan transformasi menggunakan metode heat shock dan
elektroporasi.

C. LANDASAN TEORI
Sel Kompeten
Sel Kompeten adalah sel bakteri atau yeast yang telah mengalami perubahan
dalam hal tingkat permeabilitasnya. Artinya membran sel dari bakteri atau yeast
tersebut mampu dilewati oleh plasmid DNA, sehingga DNA yang telah masuk tersebut
akan bertambah dan bertambah seiring pembelahan sel mikroba tersebut. Larutan yang
digunakan untuk mengubah struktur tingkat permeabilitas membran tersebut adalah
larutan garam, seperti CaCl2, MgCl2, dan LiCl2. Garam CaCl2 akan mempengaruhi
porositas membran sel sehingga pada saat terjadi lonjakan suhu membran menjadi
tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi dapat masuk ke dalam sel.

Transformasi
Transformasi merupakan metode untuk membawa DNA heterolog ke dalam
suatu organisme (misalnya bakteri Escherichia coli). DNA heterolog ini pada banyak
kasus merupakan plasmid yang mengandung gen target yang diinginkan. Setelah proses
transformasi, organisme hasil transformasi disebut dengan GMO (Organisme yang
termodifikasi secara genetik). Mikroorganisme yang termodifikasi secara genetik dapat
mengalami peningkatan karakteristik dari sifat alaminya. Metode transformasi dapat
digunakan untuk menghasilkan atau mengekspresikan sejumlah besar protein
rekombinan yang diinginkan. Salah satu contohnya yaitu plasmid yang mengandung gen
penyandi protein β-Galactosidase. Metode transformasi yag sering digunakan adalah
metode heat shock dan metode elektroporasi.

Transformasi Metode Heat Shock

Transformasi menggunakan metode heat shock dilakukan dengan cara
pemberian kejut panas pada suhu 42 C selama kurang lebih 45-50 detik. Prinsip dari
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 18
 proses tersebut adalah terjadi lonjakan suhu dari 0° C ke 42° C terhadap sel yang telah
diberi perlakuan CaCl2. Perlakuan CaCl2 ini dilakukan dalam pembuatan sel kompeten.
Garam CaCl2 akan mempengaruhi porositas membran sel sehingga pada saat terjadi
lonjakan suhu membran menjadi tidak selektif terhadap molekul asing dan produk ligasi
dapat masuk ke dalam sel. Sel kemudian dikultur dalam media tumbuh LB selama 1,5 - 2
jam untuk memperbanyak jumlah sel dan memberi kesempatan kepada sel untuk
mengekspresikan marka seleksi dari plasmid yang dibawanya. Setelah itu sel disebar
pada media seleksi LA.

Transformasi Metode Elektroporasi

Elektroporasi merupakan metode yang menggunakan kejutan listrik untuk
memperbesar pori-pori membran sel sehingga dapat meningkatkan permeabilitas
membran. Untuk melakukan metode ini, sel harus terlebih dahulu ditumbuhkan pada
media hingga mencapai masa di sekitar pertengahan fase log. Lalu sinyal elektrik akan
menginduksi perbesaran pori-pori membran sehingga molekul yang berukuran kecil
seperti DNA dapat masuk. Efisiensi dari metode ini berbanding terbalik dengan
peningkatan ukuran plasmid. Metode ini juga dapat digunakan untuk
mentransformasikan DNA ke dalam bakteri gram negatif dan positif lainnya (tidak hanya
E. coli).

D. KEGIATAN PRAKTIKUM
1. Bahan Praktikum
a. Pembuatan Sel Kompeten
 Kultur mikroorganisme: E. coli DH5α
 Luria Bertani Broth steril tanpa antibiotik
 100 mM CaCl2 steril
 100 mM MgCl2 steril
 Solution A (85 mM CaCl2, 15% gliserol v/v) steril
 Es Batu
 Alkohol 70%
 Aquades
 Sprirtus

b. Transformasi dengan Metode Heat Shock

 Sel kompeten E. coli DH5α
 Plasmid PUC18
 SOC Media steril (2% Tryptone, 0,5% Yeast Ekstrak, 10 mM NaCl, 2,5 mM
KCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukosa)
 Luria Bertani Agar dengan Ampisilin (konsentrasi akhir ampisilin 100 µg/mL)
 Alkohol 70%
 Akuades
 Spirtus
 Es Batu

2. Peralatan Praktikum
a. Pembuatan Sel Kompeten
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 19
  Inkubator
 Waterbath shaker
 Mikropipet
 Mikrotip
 Falcon tube
 Sentrifuge
 Spektrofotometer
 Icebox
 LAF
 Vortex

b. Transformasi dengan Metode Heat Shock

 Ice box
 Micro-tube steril
 Sentrifuse
 Waterbath shaker
 Botol semprot
 Mikropipet
 Mikrotip steril

3. Prosedur Kerja
Pembuatan Sel Kompeten E. coli DH5α
a. Simpan semua larutan 100 mM CaCl2 steril, 100 mM MgCl2 steril, Solution A
steril pada refrigerator serta falcon tube steril, mikrotube steril, mikrotip steril
pada freezer. Perhatian: semua alat dan bahan yang digunakan pada
pembuatan sel kompeten harus dipertahankan agar tetap dingin.
b. Inokulasikan 1 koloni E. coli DH5α tanpa plasmid ke dalam 2 ml LB broth tanpa
antibiotik, diinkubasi 12 jam pada 37°C (starter).
c. Inokulasikan 2 ml starter pada 100 ml LB broth tanpa antibiotik, inkubasi pada
37°C.
d. Ukur OD600 hingga mencapai 0,34 - 0,4 setiap jam dan setiap 20 menit setelah
mencapai OD600 0,2. Perhatian: Jika OD melebihi 0,4 maka prosedur di atas
harus diulang.
e. Setelah OD600 mencapai 0,34-0,4 simpan kultur pada wadah berisi es batu hingga
dingin.
f. Masukkan pada falcon tube dan lakukan sentrifugasi pada 4°C, 3000 rpm (2000x
g) selama 15 menit, buang supernatannya.
g. Letakkan larutan MgCl2 dan CaCl2 pada wadah berisi es batu agar tetap dingin.
h. Resuspend dengan 30 ml MgCl2 dingin , lalu lakukan sentrifugasi pada 4°C, 3000
rpm (2000x g) selama 15 menit, buang supernatannya. Lakukan sebanyak 2 kali.
i. Resuspend dengan 30 ml CaCl2 dingin, sentrifugasi pada 4°C, 3000 rpm (2000x g)
selama 15 menit, buang supernatannya. Lakukan sebanyak 3 kali.
j. Resuspend dengan 30 ml Solution A dingin, sentrifugasi pada pada 4°C, 2100
rpm (1000x g) selama 10 menit, buang supernatannya.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 20

 k. Resuspend dengan 1-2 ml ice cold Solution A, pipeting hingga tercampur merata.
Perhatian: lakukan pipeting dengan perlahan agar sel tidak pecah.
l. letakkan sel kompeten pada mikrotube. Masing-masing mikrotube berisi 100 µL
sel kompeten dan disimpan pada freezer -80°C.
m. Lakukan pengujian sel kompeten dengan cara transformasi plasmid. metode
heat shock dan ditumbuhkan pada media LB Ampisilin Agar dan LB Agar tanpa
antibiotik.
n. Sel kompeten siap digunakan.

Transformasi dengan Metode Heat Shock (Sambrook and Russell, 2001 modifikasi)
a. Cairkan mikrotube berisi 100 µL sel kompeten E. coli DH5α di dalam wadah
berisi es batu. Perhatian: Jangan mencairkan sel kompeten pada suhu ruang.
b. Sebanyak 5 µL plasmid pUC18 ditambahkan pada mikrotube berisi sel kompeten,
ketuk-ketuk mikrotube perlahan agar tercampur. Perhatian: jangan divortex.
c. Segera letakkan mikrotube pada wadah berisi es batu selama 3 menit.
d. Segera letakkan mikrotube pada waterbath suhu 42oC selama 90 detik.
e. Segera letakkan kembali mikrotube pada wadah berisi es selama 10 menit.
f. Tambahkan 400 µL media SOC broth steril.
g. Inkubasi mikrotube selama 1 jam pada suhu 37oC dengan kecepatan agitasi 225
rpm.
h. Tumbuhkan pada media LB agar dengan ampisilin dengan menggunakan metode
spread plate.
i. Lakukan spread hingga cairan kultur di atas LB agar ampisilin mengering
sempurna. Perhatian: Ampisilin rusak pada suhu tinggi, hindarkan dari panas.
j. Lakukan inkubasi pada suhu 37°C selama 12-14 jam. Perhatian: inkubasi lebih
dari 14 jam akan memicu terbentuknya koloni satelit.
k. Lakukan pengamatan pada koloni yang tumbuh.

4 KONFIRMASI KEBERHASILAN
TRANSFORMASI
A. TUJUAN
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 21
 Praktikum ini bertujuan untuk:
1. Melakukan uji konfirmasi keberhasilan proses transformasi plasmid ke dalam sel
inang bakteri menggunakan seleksi antibiotik.
2. Melakukan uji konfirmasi keberhasilan proses ligasi plasmid ke dalam sel inang
bakteri menggunakan blue white selection.
3. Melakukan proses konfirmasi keberhasilan proses ligasi plasmid ke dalam sel inang
bakteri menggunakan colony PCR.

B. INDIKATOR BELAJAR
Setelah menyelesaikan praktikum ini, mahasiswa diharapkan mampu:
1. Mengaplikasikan teknik konfimasi keberhasilan transformasi plasmid ke dalam sel
inang bakteri (metode seleksi antibiotik).
2. Mengaplikasikan teknik konfirmasi keberhasilan ligasi plasmid ke dalam sel inang
bakteri (metode blue white selection).
3. Mengaplikasikan teknik teknik konfirmasi keberhasilan ligasi plasmid ke dalam sel
inang bakteri (metode colony PCR).

C. LANDASAN TEORI
Tingkat keberhasilan proses transformasi haruslah diuji, untuk membedakan sel
kompeten yang telah dan tidak menerima plasmid. Ada beberapa metode yang dapat
dilakukan untuk menguji tingkat keberhasilan proses transformasi. Metode yang sering
digunakan antara lain adalah seleksi menggunakan media yang mengandung antibiotik,
blue white selection, koloni PCR, pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi,
SDS Page, western blot dan masih banyak yang lain.

Seleksi Menggunakan Antibiotik

Sel kompeten yang menerima plasmid, dapat tumbuh dengan baik pada media
yang mengandung antibiotik. Fenomena ini dikarenakan, plasmid tersebut mengandung
gen resisten terhadap antibiotik, misalnya: sel kompeten Escherichia coli yang
menerima plasmid yang mengandung gen resisten ampisilin, akan tumbuh dengan baik
pada media LB yang mengandung ampisilin 100µg/mL. Bakteri ini memiliki enzim
penyandi protein beta-laktamase yang mampu mengkatalisis substrat ampisilin. Suatu
plasmid dapat memiliki satu atau lebih gen resisten terhadap antibiotik, tergantung
pada jenis dan konstruksi plasmid tersebut. Pemilihan antibiotik yang digunakan untuk
uji keberhasilan proses transformasi harus disesuaikan dengan gen resisten antibiotik
yang dimiliki oleh plasmid yang digunakan.

Efisiensi Transformasi
Efisiensi transformasi kontrol positif (Zhiming Tu dkk, 2005)

Jumlah koloni x pengenceran x volume kultur total

volume kultur yg disebar x Jumlah vektor y ang ditransformasi

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 22

 Enzim Restriksi
Enzim Restriksi adalah suatu enzim yang bisa memotong untaian DNA secara spesifik
sesuai dengan urutan yang dikenalinya. Urutan nukleotida yang dikenali tersebut
bersifat palindromik, yaitu suatu urutan DNA yang sama jika dibaca dengan arah
berlawanan pada setiap untainya. Oleh karena itu, posisi pemotongan di dalam molekul
DNA dapat diprediksi sehingga memungkinkan segmen DNA tertentu dipotong dari
molekul DNA yang lebih panjang. Kemampuan memotong urutan DNA tertentu ini
sangat penting dalam kloning gen dan seluruh aspek lain teknologi DNA rekombinan.

Gambar 1. Peta enzim restriksi pada plasmid pUC18

Enzim restriksi memotong DNA dalam dua cara dan hasil yang berbeda, yaitu:
1. Hasil pemotongan berujung tumpul  (blunt end), Enzim ini memotong secara
simetris antara kedua utas DNA sehingga menghasilkan ujung tumpul. Contoh:
SmaI.
2. Hasil pemotongan berujung lancip atau lengket (sticky end), Pola seperti ini lebih
mudah menempel dengan pasangan DNA nya karena adanya ikatan basa antara
ujung-ujung yang menggantung. Contoh: BamHI.

D. KEGIATAN PRAKTIKUM
1. Bahan Praktikum
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 23
 a. Seleksi menggunakan antibiotik
 Luria Bertani Agar steril dengan ampisislin konsentrasi akhir 100 µg/mL
 Alkohol 70%
 Spirtus

b. Seleksi pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi

 Plasmid pUC18 yang telah diekstrak dari bakteri transforman positif
 LB broth Ampisilin konsentrasi akhir 100 µg/mL
 Enzim ScaI
 Enzim HindIII
 Agarosa
 1x TAE Buffer
 Marker DNA 500kb
 Etidium bromida stok 10 mg/mL
 Loading dye

2. Peralatan Praktikum
a. Seleksi menggunakan antibiotik
 Spreader
 Bunsen
 Mikropipet
 Mikrotip steril
 Inkubator
 Jarum ose

b. Seleksi pemotongan plasmid menggunakan enzim restriksi

 Mikrotube steril
 Mikrotip steril
 Mikropipet
 Set elektroforesis
 UV iluminator

3. Prosedur Kerja
Seleksi menggunakan aktibiotik
a. Siapkan cawan hasil inokulasi produk transformasi dan hitung efisiensi
transformasinya.
b. Inokulasikan setiap koloni transforman positif yang terbentuk setelah
transformasi pada LB ampisilin agar menggunakan metode streak plate.
Perhatian: Ampisilin rusak pada suhu tinggi, hindarkan dari panas.

c. Inkubasi pada suhu 37°C selama 12-14 jam. Perhatian: inkubasi lebih dari 14
jam akan memicu terbentuknya koloni satelit.
d. Amati koloni transforman positif yang tumbuh.

Analisis Plasmid Rekombinan menggunakan Enzim Restriksi

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 24

 a. Tumbuhkan 1 ose koloni transforman positif pada 4 mL LB broth ampisilin dan
ikubasi pada suhu 37°C selama 12-14 jam. Perhatian: inkubasi lebih dari 14 jam
akan memicu terbentuknya koloni satelit.
b. Pindahkan pada falcon tube dan lakukan sentrifugasi pada 6000 rpm, 4oC selama
5 menit, buang supernatannya.
c. Lakukan prosedur ekstraksi plasmid menggunakan metode “alkaline lysis”.
d. Ambil plasmid hasil ekstraksi dengan menggunakan mikropipet dan encerkan
sesuai tabel berikut:
Komponen Mikrotube
1 2 3 4
Sampel Plasmid Amp res 8 µl 8 µl 8 µl 8 µl
Buffer pereaksi 1 µl 1 µl 1 µl 1 µl
Enzim restriksi ScaI 0,5 µl - 0,5 µl -
Enzim restriksi HindIII 0,5 µl - - 0,5 µl
Perhatian: simpan enzim restriksi pada freezer atau wadah berisi es untuk
mencegah kerusakan.
e. Inkubasikan pada suhu 370C selama 2 jam.
f. Cek hasil pemotongan menggunakan elektroforesis agarosa dan gunakan
seluruh volume reaksi sampel.
g. Amati pita hasil pemotongan yang terbentuk menggunakan UV iluminator,
bandingkan kesesuaian ukuran pita yang terbentuk dengan marker DNA.

Pembuatan Larutan / Bufer /Medium

Larutan/bufer/medium Komposisi bahan kimia dan Pembuatan
1. Media Luria Bertani 1% pepton, 0,5% yeast ekstrak, 1% NaCl
2. TE buffer 10 mM tris-Cl pH 8, 1 mM EDTA pH 8
3. Lisozim 20 mg/mL dalam TE buffer
4. Tris Buffer fenol pH 8 Cairkan fenol kristal pada waterbath suhu 65°C. Tambahkan
Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 25
 0,5 M Tris-Cl pH 8 sebanyak 1 x volume fenol yang
digunakan, campur menggunakan stirer selama 15 menit
kemudian buang fase atas enggunakan pipet kaca. Lakukan
sebanyak 2 kali. Kemudian tambahkan 0,1 M Tris-Cl pH 8
sebanyak 1 x volume fenol yang digunakan, campur
menggunakan stirer selama 15 menit kemudian buang fase
atas enggunakan pipet kaca. Lakukan sebanyak 2 kali. Cek pH
menggunakan kertas lakmus, jangan menggunakan pH
meter. Fenol akan menguap selama proses, jadi gunakan
volume awal fenol 2,5 kali lipat dari yang diinginkan. Simpan
pada botol kaca gelap.
5. Kloroform : isoamil 24 ml kloroform ditambahkan dengan 1 ml isoamil alkohol.
alkohol Simpan pada botol kaca gelap.
6. Etidium bromida 10 mg/ml, gunakan aquades steril dan letakkan pada
mikrotube yang telah dilapisi oleh aluminium foil.
7. Ampisilin stok 100 mg/mL, gunakan aquades steril dan saring menggunakan
milipore filter warna biru. Simpan pada freezer.
8. Solution I 50 mM glukosa, 10 mM EDTA pH 8, 25 mM tris-Cl pH 8.
Gunakan larutan stok 1 M Tris-Cl pH 8 dan larutan stok 0,5 M
EDTA pH 8. Simpan pada botol kaca gelap.
9. Solution II 0,2 M NaOH, 1% SDS dibuat fresh saat praktikum. Simpan
pada botol kaca gelap.
10. Solution III 60 ml 5 mL potasium asetat, 11,5 mL asam asetat glasial,
28,5 mL aquades. Simpan pada botol kaca gelap.
11. Solution A 85 mM CaCl2, 15% gliserol v/v. Simpan pada botol kaca gelap.
12. Buffer TAE 50 x dan Sebanyak 242 g Tris, 100 mL EDTA 0,5 M (pH 8) dan 57,1 mL
1x CH3COOH ditambahkan aquades hingga volumenya menjadi
1000 mL. Untuk bufer TAE 1x, sebanyak 20 mL TAE 50 x
ditambahkan aquades hingga 1000 mL
13. Buffer Loading dye Bromofenol biru 0,25% (v/v) ditimbang sebanyak 0,01 gram,
6x ditambah dengan gliserol 30% (b/v) sebanyak 1,2 mL,
kemudian ditambahkan dengan ddH2O steril hingga volume
akhir 4 MmL. Simpan pada freezer.
14. SOC Media 2% Tryptone, 0,5% Yeast Ekstrak, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl,
10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukosa.
15. RNAse (DNAse free) Sebanyak 1 mg RNAse ditimbang secara aseptis, kemudian
dilarutkan dalam 1 mL Tris-Cl 10 mM pH 8. Simpan pada
freezer.
16. Medium LB cair Sebanyak 1 g pepton, 0,5 g ekstrak khamir dan 1 g NaCl
ditambahkan aquades hingga 90 mL lalu dicampur dengan
menggunakan magnetic stirrer sampai homogen. pH diukur
hingga bernilai 7,2 lalu ditambahkan aquades hingga volume
akhir mencapai 100 mL. Larutan disterilisasi dengan autoklaf
pada suhu 121oC
17. Agarosa 0,8% Sebanyak 0,2 gram agarosa ditimbang,kemudian dilarutkan

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 26

 dalam 25 mL TAE 1x. Setelah tercampur dipanaskan dengan
microwave selama 2 menit. Setelah dingin dituang ke dalam
cetakan, dan ditunggu hingga memadat (sekitar 50 menit)
18. Lisozim 10 mg/mL Sebanyak 10 mg lisozim ditimbang secara aseptis dan
dilarutkan ke dalam 1 mL pelarut (ddH 2O atau buffer atau
Tris HCl) yang sesuai dengan analisa). Selalu dibuat sesaat
sebelum digunakan. Simpan dalam freezer.
19. Proteinase-K Sebanyak 1 mg proteinase-K ditimbang secara aseptis,
1mg/mL kemudian dilarutkan ke dalam 1 mL STEP buffer. Selalu
larutkan pada STEP sesaat sebelum digunakan. Simpan
dalam freezer.
20. STEP buffer Disiapkan SDS konsentrasi 0,5%, Tris-Cl 50 mM pH 7,5 dan
EDTA 0,4 M. Simpan pada botol kaca gelap.
21. 1 M Tris-Cl pH 8 stok 60,57 g Tris base dilarutkan pada 400 ml aquades, adjust pH
menggunakan HCl pekat hingga pH 8 kemudian tambahkan
aquades hingga 500 ml. Simpan pada botol kaca gelap.
22. 0,5 M EDTA pH 8 14, 612 g EDTA dilarutkan pada 60 ml aquades, adjust pH
stok menggunakan NaOH butir hingga PH 8 kemudian tambahkan
aquades hingga 100 ml. EDTA tidak akan larut, hingga pH
mencapai 8. Simpan pada botol kaca gelap.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 27

 DAFTAR PUSTAKA

Ashmaig A., Hasan A., Gaali E., E. 2009. Identification of Lactic Acid Bacteria Isolated from
Traditional Sudanese Fermented Camel’s Milk. African Journal of Microbiology
Research Vol. 3(8) pp. 451-457.

Ausubel, I. and Frederick, M. 1990. Current Protocols in Molecular Biology. Greene

Publishing Associates and Wiley-Interscience.

Butler, John M. 2012. Advanced Topics in Forensic DNA Typing: Methodology. Elsevier
Science Publishing Co. Inc. San Diego.

Clark, David P. and Pazdernik, Nanette J. 2012. Molecular Biology (Second Edition). Elsevier
Taiwan Inc. Taiwan.

Clark, David P., Pazdernik, Nanette J. and McGehee, Michelle. 2018. Molecular Biology
(Third Edition). Elsevier Inc. Academic Cell. Elsevier Inc. USA

Davis, L., M. Kuehl and J. Battey. 1994. Basic Methods in Molecular Biology 2 nd edition.
Appleton and lange. Norwalk XIV.

Dugas, M.J.; Gagnon, F.; Ladouceur, R. dan Freeston, M.H. 1998. Generalized anxiety
disorder: a preliminary test of a conceptual model. Behaviour Research and Therapy
36, pp. 215–226.

Hadiutomo, R.S. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium. Gramedia. Jakarta.

Hsu, J.T., S. Das & S. Mohapatra. 1996. Polymerase Chain Reaction Engineering.
Biotechnology and Bioengineering. 55 (2): 359—366.

Lay, B.W. 1994. Analisis Mikroba di Laboratorium. PT Raja Grafindo Persada. Jakarta.

Lehninger, A.L. 1982. Principles of Biochemistry (Dasar-dasar Biokimia). Alih bahasa :

Maggy Thenawijaya. Erlangga. Jakarta.

Najafov, Ayaz and Hoxhaj, Gerta. 2017. PCR Guru. An Ultimate Benchtop Reference for
Molecular Biologist. Elsevier Academic Press Inc. United States.

Nicholl, D.S.T. 1994. An Introduction to Genetic Engineering. Cambridge University Press.

Melbourne.

Palumbi, S.R. 1996. Nucleid Acids II: The Polymerase Chain Reaction. Dalam: Hillis, D.M.,
Moritz, C. & B.K. Mable (eds.). 1996. Molecular systematics. 2nd ed. Sinauer
Associates, Inc., Sunderland: xvi.

Pelczar, M.J.Jr. and E.S.C. Chan. 1972. Laboratory Exercices in Microbiology. Mc Graw Hill
Book Company. New York.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 28

Pelczar, M.J.Jr. dan E.S.C. Chan. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Erlangga. Jakarta.

Promega. 1996. Protocols and Applications Guide. 3rd edition. Promega Corporation. USA.

Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning a laboratory manual vol 1. 3rd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York.

Sambrook, J. and D.W. Russell. 2001. Molecular cloning a laboratory manual vol 1. 3rd ed.
Cold Spring Harbor Laboratory Press: Cold Spring Harbor, New York

Scheppler, J.A., P.E. Cassin and R.M. Gambier. 2000. Biotechnology Explorations : Applying
the Fundamentals. American Society for Microbiology (ASM) Press. Washington DC.

Schiegel, H.G. dan Karin S. 1994. Mikrobiologi Umum. UGM Press. Jogjakarta.

Sharrocks, A.D. 1994. The design of primers for PCR. Dalam: Griffin, H.G. & A.M. Griffin
(eds.). 1994. PCR technology: Current innovations. CRC Press. Boca Raton

Surzycki, S. 2000. Basic Technique in Molecular Biology. Springer-Verlag Press. Berlin.

Watson, J.D., M. Gilman., J. Witkowski and M. Zoller. 1998. Recombinant DNA 2nd edition.
W.H. Freeman and Company-Madison Avenue. New York.

Yuwono, T. 2005. Biologi Molekular. Erlangga. Jakarta.

Modul Praktikum Rekayasa Genetika 2020 29