ISOLASI DNA BAKTERI 1

Untuk mengisolasi komponen makromolekular dari bakteri, kita harus melakukan

tiga hal. Pertama, kita harus merusak dinding sel dari bakteri dan membran selnya untuk
membantu ekstrasi dari komponen yang kita kehendaki. Kedua, harus bekerja pada kondisi
yang baik hingga dapat menghambat atau menghacurkan turunan enzim yang dihasilkan
dalam perusakan bakteri. Ketiga, harus menggunakan prosedur pemisahan yang
menghasilkan makromolekul yang kita kehendaki.
Prosedur kerja isolasi DNA bakteri berdasarkan eksperimen dari Makmur pada tahun
1961 adalah sebagai berikut.
1. Sel-sel bakteri dirusak dengan perlakuan awal dengan enzim putih telur, lisosim yang
menghidrolisis dinding bakteri. Hasil dari melemahnya dinding sel bakteri adalah
mudahnya memberikan kejutan osmotic. Akhirnya dinding sel bakteri akan
mengalami lisis dalam lingkungan hipotonik.
2. Penambahan deterjen yang mengandung natrium dudocyl sulfat atau SDS akan
melengkapi lisisnya bakteri dengan merusak residu membran bakteri. SDS juga
menhambat aktivitas enzimatis yang berbahaya seperti nukleasis dibandingkan reaksi
denaturasi dari deterjen.
3. Agen pengkhelat sitrat dan EDTA lebih jauh menghambat nukleolisis dengan
mengembalikan ion logam divalen yang diperlukan untuk aktivitas inti. Metode
eksperimen ini menggunakan beberapa macam metode pemisahan yang dapat
memurnikan DNA yang terdapat pada sel bakteri.
4. Secara khusus ion perklorat dapat memisahkan protein dari DNA.
5. Kemudian kloroform isoamyl alkohol digunakan untuk denaturasi protein lebih jauh
untuk sentrifugasi yang berbeda.
6. Kemudian DNA akan diubah secara selektif selama penambahan etanol yang
membuat menggulungnya serat panjang DNA dari makromolekul yang lain misalnya
RNA dan protein yang terkoagulasi dalam bentuk nonserat.
7. DNA kasar yang diperoleh, akhirnya dilarutkan dan direpresipitasi dengan
isopropanol di bawah kondisi yang hanya mendukung persipitasi DNA. 
 ISOLASI DNA BAKTERI 2
Dapat diketahui bahwa dalam proses mengisolasi plasmid dari suatu bakteri, ada tiga
tahap penting yang perlu dilakukan, yaitu
1. Lisis membran sel bakteri
Proses lisis diawali dengan adanya pemberian SDS + NaOH dimana SDS (sodium
dodesil sulphate) merupakan deterjen yang berperan untuk melisis dinding atau
membran sel yang terdiri dari lipid (fosfolipid) dan NaOH sebagai larutan basa
berfungsi untuk denaturasi protein atau DNA (DNA double strain menjadi single
strain). Terjadinya proses lisis ditandai dengan terbentuknya lendir. Kemudian larutan
disentrifugasi untuk diambil supernatannya berupa lautan suspensi.
2. Ektraksi DNA
Pada larutan suspensi sebelum diekstraksi, terdapat senyawa DNA plasmid, RNA,
Protein, Senyawa Organik dan Komponen Lipid. Ekstraksi dilakukan dengan adanya
penambahan PCI (Phenol-Chloroform-Isoamyl Alcohol) dengan tujuan untuk
memisahkan antara DNA dan komponen lainnya dimana Phenol-Chloroform
berfungsi sebagai pelarut dari senyawa organik dan komponen lipid. Dengan
dilakukannya ekstraksi menggunakan PCI maka setelah disentrifugasi terbentuklah 3
fase dimana terdiri dari fase air yang ada di paling atas tempat DNA plasmid berada,
protein yang terkoagulasi di fase yang ada di tengah dan fase Phenol-Chloroform
yang ada di paling bawah karena sifat chloroform yang berat jenisnya besar.
3. Pengendapan DNA.
Fase air yang diambil kemudian diendapkan menggunakan sodium acetat untuk
menciptakan kondisi netral dan alcohol untuk mengikat air yang sebelumnya terikat
pada DNA sehingga DNA mengendap dengan sentrifugasi. Pelet yang didapat
kemudian dimurnikan dengan penambahan etanol 70% yang kemudian disentrifugasi
lagi untuk didapatkan pelet. Pada tahap ini tidak perlu dilakukan resuspensi karena
apabila dilakukan resuspensi DNA akan sulit mengendap karena pH nya tidak netral
lagi. Penambahan RNase dapat diberikan untuk menghilangkan sisa-sisa fragmen
RNA setelah dilakukan pemurnian dan proses vakum dengan bantuan larutan buffer
TE ataupun dH2O.
 ISOLASI DNA BAKTERI 3
A. Alat dan Bahan
1. Strain bakteri sampel
2. Medium Luria Bertani (LB) agar dan LB cair
3. Bufer Sodium Tris-EDTA (STE)
4. Lisozim
5. Buffer lisis
6. CI (kloroform Isoamil alkohol)
7. Fenol
8. Na asetat
9. Etanol absolut
10. Etanol 70%
11. Buffer TE
12. akuades
13. shaker-incubator tipe EFM-60 (Seiwa Rico, Ltd.)
14. Microsentrifuga (dingin)
15. Tabung mikrosentrifuga
16. Sarung tangan
17. Seperangkat mikropipet beserta tipnya (Bio-Rad dan Axygen Scientific)
18. Lemari pendingin
19. Kertas tisu
20. Kamera Digital
B. Cara Kerja
Isolasi DNA kromosom dilakukan menggunakan metode lysis alkali (Wang).
1. Kultur semalam bakteri dikultivasi ke media LB cair 25 ml dengan cara
memindahkan satu koloni bakteri ke media LB cair. Inkubasi dilakukan di dalam
shaker-incubator dengan kecepatan rotasi 150 rpm pada suhu 37oC selama 16 jam
(semalam).
2. Sebanyak 3 ml kultur hasil inkubasi 16 jam diambil dan dimasukkan ke dalam
tabung mikrosentrifuga kemudian dilakukan sentrifugasi dengan kecepatan 5.700
x g selama 5 menit.
3. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan diperoleh pellet sel bakteri, kemudian
pellet diresuspensi dengan 1 ml larutan STE dengan cara vortex dan
disentrifugasi dengan kecepatan 5.700 x g selama 5 menit.
4. Supernatan dibuang kembali dan pellet diresuspensi dengan 200 µl lisozim
dengan cara vortex dan diinkubasi pada suhu 37 0C selama satu jam.
5. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi satu jam ditambah 200 µl buffer lisis,
diresuspensi dengan cara dibolak-balik.
6. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah 100 µl CI dan 100 µl fenol dingin,
diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000
rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
7. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan ke tabung mikrosentrifuga dan
diperkirakan besar volemenya.
8. Proses selanjutnya ke dalam tabung ditambah CI sebanyak 1x volume supernatan,
diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kecepatan tinggi 13.000
rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
9. Lapisan paling atas dari supernatan dipindahkan kembali ke tabung
mikrosentrifuga yang baru dan diperkirakan besar volemenya.
10. Supernatan tersebut ditambah Na asetat dan etanol absolut masing-masing
sebanyak 0,1 volume supernatan dan 2x volume supernatan.
11. Campuran larutan tersebut diresuspensi dan dilakukan inkubasi pada suhu -20 0C
selama 2 jam.
12. Tabung mikrosentrifuga hasil inkubasi 2 jam disentrifugasi kecepatan tinggi
13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
13. Supernatan yang dihasilkan dibuang dan ke dalam tabung ditambahkan 500 µl
etanol 70%, diresuspensi dengan cara dibolak-balik dan disentrifugasi kembali
dengan kecepatan 13.000 rpm pada suhu 4 0C selama 10 menit.
14. Supernatan dibuang kembali, tabung dikeringkan, ditambah 50 µl TE dan
diresuspensi dengan cara dibolak-balik. Suspensi yang diperoleh adalah suspensi
DNA kromosom bakteri.