BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Mineral merupakan salah satu zat gizi kebutuhan tubuh manusia yang

mempunyai peranan penting dalam pemeliharaan fungsi tubuh, seperti untuk

pengaturan kerja enzim-enzim, pemeliharaan keseimbangan asam-basa,

membantu pembentukan ikatan yang memerlukan mineral seperti pembentukan

hemoglobin. Mineral digolongkan atas mineral makro dan mineral mikro. Mineral

mikro terdapat dalam jumlah sangat kecil di dalam tubuh, namun mempunyai

peranan esensial untuk kehidupan, kesehatan, dan reproduksi. Yang termasuk

mineral mikro antara lain: besi, seng, iodium, selenium, tembaga, mangan, flour,

krom, molibden, arsen dan lain-lain (Almatsier, 2004).

Besi merupakan mineral mikro yang paling banyak terdapat di dalam

tubuh manusia dan hewan, yaitu sebanyak 3-5 gram di dalam tubuh manusia

dewasa. Besi mempunyai beberapa fungsi esensial di dalam tubuh untuk

mendorong pertumbuhan dan menjaga kesehatan yaitu: sebagai alat angkut

oksigen dari paru-paru ke jaringan tubuh, sebagai alat angkut elektron di dalam

sel, dan sebagai bagian terpadu berbagai reaksi enzim di dalam jaringan tubuh

(Almatsier, 2004). Di dalam tubuh sebagian besar Fe dapat terkonjugasi dengan

protein, dan terdapat dalam bentuk fero atau feri. Bentuk aktif zat besi biasanya

terdapat sebagai fero, sedangkan bentuk inaktif adalah sebagai feri (Sediaoetama,

2008). Fero dalam tubuh berperan dalam proses respirasi sel serta sebagai

kofaktor enzim yang terlibat dalam reaksi oksidasi dan reduksi untuk produksi

energi yang terdapat pada semua sel tubuh. Fero merupakan unsur penting bagi

1
 2

makhluk hidup (Widowati , dkk, 2008).

Kekurangan zat besi dalam tubuh dapat menyebabkan anemia defisiensi

besi dan anemia dapat diketahui dari kadar hemoglobin seseorang. Kadar

hemoglobin normal pada pria dewasa 13 g/100 ml dan untuk wanita 12 g/100 ml.

Kekurangan besi banyak dialami para ibu yang sedang mengandung, menyusui

dan wanita yang sedang haid (Winarno, 2004). Kelebihan Fe juga tidak baik,

konsumsi Fe berlebihan berakibat pada meningkatnya feritin dan hemosiderin

juga meningkat dalam sel hati. Hemosiderin akan masuk ke dalam sel parenkim

organ lain misalnya pankreas, otot jantung, dan ginjal sehingga dalam

hemosiderin akan tertimbun dalam organ-organ tersebut dan merusak kerja organ.

(Widowati, dkk, 2008)

Berbagai bahan makanan sebagai sumber mineral besi adalah daging,

kuning telur, kacang-kacangan dan sayur-sayuran berwarna hijau, contohnya daun

bayam hijau. Selain mengandung besi daun bayam hijau juga banyak

mengandung garam-garam mineral yang penting seperti kalsium dan fosfor, dan

vitamin A, B dan C (Sunarjono, 2003). Masyarakat umumnya mengkonsumsi

daun bayam hijau yang telah diolah menjadi masakan dengan berbagai cara,

antara lain direbus atau dikukus. Hal ini kemungkinan dapat menurunkan manfaat

daun bayam hijau untuk kesehatan, karena kemungkinan senyawa kimia yang

terkandung di dalamnya, terutama besi akan berkurang/rusak.

Di dalam beberapa literatur besi dapat dianalisis dengan menggunakan

beberapa metode, antara lain gravimetri, volumetri, spektrofotometri serapan atom

dan secara spektrofotometri sinar tampak dengan penambahan pereaksi untuk

menghasilkan senyawa yang berwarna stabil dalam beberapa menit (Vogel, 1989).
 3

Berdasarkan uraian di atas, maka peneliti menentukan kadar besi di dalam daun

bayam hijau bayam hijau, yang telah dikukus, dan yang telah direbus sebagaimana

lazimnya diolah dan dikonsumsi oleh masyarakat. Pada penelitian ini penetapan

kadar besi dilakukan dengan metode spektrofotometri sinar tampak menggunakan

pereaksi o-fenantrolin dalam suasana asam setelah ditambahkan hidroksilamin,

karena metode ini lebih praktis, dan dapat digunakan untuk kadar yang kecil.

Untuk memastikan keabsahan metode spektrofotometri sinar tampak yang

digunakan pada penentuan kadar besi di dalam sampel dilakukan uji validasi

metode, yaitu uji akurasi (ketepatan), uji presisi (keseksamaan), dan uji sensitifitas

alat yaitu uji Limit Of Detection (LOD) dan Limit Of Quantitation (LOQ). Untuk

mengetahui terdapatnya perbedaan besi yang signifikan di dalam sampel daun

bayam hijau bayam hijau, di dalam daun bayam hijau rebus, dan di dalam daun

bayam hijau kukus, dilakukan uji analis varian (ANAVA) dan uji beda nyata

terkecil (BNT) (Rohman, 2007).

1.2 Perumusan Masalah

Berdasarkan latar belakang dapat dirumuskan masalah sebagai berikut:

a. Berapakah kadar besi pada daun bayam hijau yang masih bayam hijau dan di

dalam daun bayam hijau yang telah direbus atau yang telah dikukus ?

b. Apakah terdapat perbedaan kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih

bayam hijau dan kadar besi di dalam daun bayam hijau yang telah direbus

atau yang telah dikukus ?

c. Apakah metode spektrofotometri sinar tampak, menggunakan pereaksi o-

fenantrolin dalam suasana asam sulfat 5 N, akurat untuk penetapan kadar besi

di dalam daun bayam hijau ?

 4

1.3 Hipotesis

Adapun yang menjadi hipotesis penelitian adalah:

a. Terdapat kadar besi yang cukup tinggi di dalam daun bayam hijau yang masih

bayam hijau, daun bayam hijau yang telah direbus atau yang telah dikukus.

b. Terdapat perbedaan kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih bayam

hijau dan kasar besi di dalam daun bayam hijau yang telah direbus atau yang

telah dikukus.

c. Metode spektrofotometri sinar tampak menggunakan pereaksi o-fenantrolin

dalam suasana asam sulfat 5 N, akurat untuk penetapan kadar besi di dalam

daun bayam hijau.

1.3 Tujuan Penelitian

Adapun tujuan penelitian adalah:

a. Untuk mengetahui kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih bayam

hijau dan di dalam daun bayam hijau yang telah direbus atau yang telah

dikukus.

b. Untuk mengetahui perbedaan kadar besi di dalam daun bayam hijau yang

masih bayam hijau dan di dalam daun bayam hijau yang telah direbus atau

yang telah dikukus.

c. Untuk mengetahui metode spektrofotometri sinar tampak, menggunakan

pereaksi o-fenantrolin dalam suasana asam, akurat untuk penetapan kadar

besi di dalam daun bayam hijau.

1.4 Manfaat Penelitian

Hasil penelitian ini diharapkan bermanfaat sebagai sumber informasi

tentang kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih bayam hijau dan
 5

yang telah direbus atau dikukus sebagaimana lazimnya dikonsumsi

masyarakat.
 BAB II

METODOLOGI PENELITIAN

2.1 Jenis Penelitian

Penelitian ini merupakan peelitian eksperimental, yaitu menentukan kadar

besi di dalam daun bayam hijau (sebagai variabel terikat), yang masih bayam

hijau, yang telah direbus dan yang telah dikukus sebagaimana lazimnya digunakan

oleh masyarakat (sebagai variabel bebas). Penetapan kadar besi dilakukan secara

spektrofotometri sinar tampak, menggunakan pereaksi o-fenantrolin dalam

suasana asam sulfat 5 N.

2.2 Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Penelitian Universitas Tjut Nyak

Dhien Medan dimulai dari bulan Maret sampai Mei 2016.

2.3 Determinasi Tumbuhan

Determinasi tumbuhan dilakukan di Herbarium Medanense (MEDA),

Universitas Sumatera Utara, Medan.

2.4 Alat-alat, Bahan-bahan dan Sampel

2.4.1 Alat-alat

Spektrofotometer UV-Visible (Shimadzu 1800), neraca analitik (Mettler

Teledo®), hot plate, neraca analitik (Bueco Germany®), blender (Miyako®), dan

alat-alat gelas laboratorium lainnya.

2.4.2 Bahan-bahan

Bahan-bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah air suling,

akuabides, dan bahan-bahan kimia berkualitas proanalisa keluaran Merck, yaitu:

fero amonium sulfat, o-fenantrolin, hidroksilamin, kalium permanganat, asam

6
 7

sulfat, asam oksalat, asam nitrat, amonium asetat, asam asetat glasial, natrium

hidroksida, kalium heksasianoferat (II).

2.4.3 Sampel

Sampel yang diuji dalam penelitian ini adalah daun bayam hijau yang

segar dibeli di pagi hari pada pedagang sayur-sayuran di pasar Sei Sikambing,

Medan. Secara acak sederhana dan purposif yaitu metode pengambilan sampel

ditentukan atas dasar pertimbangan bahwa sampel yang tidak terambil mempunyai

karakteristik yang sama dengan sampel yang diteliti (Sudjana, 2005).

2.5 Pembuatan Larutan Pereaksi

2.5.1 Asam klorida 10%

Diukur 10 ml HCl pekat dimasukkan ke dalam beker gelas yang telah

berisi 50 ml akuabides, diaduk dan diencerkan dengan akuabides sampai 100 ml

(DepKes RI, 2014).

2.5.2 Larutan orto-fenantrolin 0,02% b/v

Ditimbang 100 mg 1,10-ortofenantrolin monohidrat dan dilarutkan dalam

50 ml akuades sambil diaduk dan dipanaskan sampai 80oC (tidak sampai

mendidih).

2.5.3 Larutan buffer asetat

Ditimbang 15,42 gram amonium asetat ditambahkan 11 ml asam asetat

glasial dan akuades sampai 200 ml (Ditjen POM, 2014).

2.5.4 Larutan hidroksilamin 10% b/v

Ditimbang 10 g hidroksilamin dilarutkan dengan akuades sampai 100 ml

(Ditjen POM, 2014).

 8

2.5.5 Larutan asam sulfat 10% v/v

Ke dalam 500 ml akuades ditambahkan 100 ml asam sulfat pekat, sambil

diaduk. Jika campuran menjadi terlalu panas, tunggu 5 menit sebelum meneruskan

pengenceran, pengenceran dilakukan dengan hati-hati sampai diperoleh larutan

sebanyak 1000 ml (Ditjen POM, 2014).

2.5.6 Larutan standar kalium permanganat 0,1 N

Ditimbang 790,0 mg kalium permanganat dan dilarutkan dengan akuades

secukupnya hingga 250 ml, dididihkan selama 15 menit, disaring dan ditutup,

dibiarkan selama 2 hari lalu disaring dengan kertas saring (Ditjen POM, 2014).

2.5.7 Larutan standar asam oksalat 0,1 N

Ditimbang seksama 630 mg asam oksalat kemudian dimasukkan ke

dalam labu tentukur 100 ml dan dilarutkan dengan akuades lalu dicukupkan

hingga tanda batas (Ditjen POM, 2014).

2.5.8 Larutan asam nitrat 5 N

Larutan asam nitrat 65% b/v sebanyak 350 ml diencerkan dengan air

suling hingga 1000 ml (Ditjen POM, 2014).

2.5.9 Larutan kalium heksasianoferat (II)

Sebanyak 10 gram kalium heksasianoferat (II) K4[Fe(CN)6] dilarutkan

dalam akuades sampai 100 ml (Ditjen POM, 2014).

2.5.10 Pembuatan akuades bebas karbon dioksida

Sebanyak 1 liter akuades dalam beaker glass dididihkan selama 10 menit

untuk menghilangkan karbon dioksida yang larut dalam air, didiamkan sampai

dingin sambil ditutup agar tidak menyerap kembali karbon dioksida dari udara.
 9

2.5.11 Larutan natrium hidroksida 1 N

Ditimbang 40 g natrium hidroksida dilarutkan dengan akuades bebas

karbon dioksida sampai 1000 ml (Ditjen POM, 2014).

2.6 Pembakuan larutan standar kalium permanganat 0,1 N

Dipipet 10 ml larutan standar asam oksalat dimasukkan ke dalam labu

Erlenmeyer ditambahkan 10 ml asam sulfat 10%, dipanaskan sampai suhu larutan

60oC-70oC dititrasi dengan larutan kalium permanganat yang akan ditentukan

normalitasnya sampai terjadi warna ungu muda, dicatat volume kalium

permanganat, diulangi pekerjaan 2 kali, dan dihitung normalitas kalium

permanganat.

2.7 Rancangan Penelitian

2.7.1 Penyiapan sampel

Daun bayam hijau segar dicuci bersih dengan air mengalir hingga tidak

terdapat kotoran yang tertinggal, lalu dibilas dengan akuades, ditiriskan dan

dikeringkan di atas kertas saring, selanjutnya dihaluskan dengan menggunakan

blender.

2.7.2 Destruksi sampel secara destruksi basah

Sampel yang telah dihaluskan ditimbang seksama 130,0000 g,

dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer, ditambahkan 30 ml asam nitrat 5 N,

kemudian dipanaskan di atas pemanas listrik hingga mendidih selama lebih

kurang 30 menit dan larutan menjadi jernih. Dengan cara yang sama dilakukan

untuk sampel yang telah dikukus dan direbus dengan cara lazimnya digunakan

oleh masyarakat.
 10

2.7.3 Pembuatan larutan sampel

Larutan hasil destruksi disaring dan dimasukan ke dalam labu tentukur

100 ml. Residu di atas kertas saring dibilas sebanyak 3 kali sampai fliltratnya

negatif terhadap besi (diuji dengan penambahan hidroksilamin ditambahkan

ortofenantolin). Kumpulan filtratnya dicukupkan volumenya dengan akuabides

hingga garis tanda. Lalu disaring dengan kertas saring Whatmann no. 42 dengan

membuang lebih kurang 10 ml filtrat pertama dan selanjutnya ditampung ke

dalam labu Erlenmeyer lain. Larutan ini digunakan untuk uji kualitatif dan

kuantitatif.

2.8 Analisis Kualitatif besi

Menurut Vogel (1985), analisis kualitatif besi dapat dilakukan dengan

pereaksi hidroksilamin ditambahkan o-fenantrolin, natrium hidroksida, dan

kalium heksasianoferat (II).

1. Ke dalam tabung reaksi ditambahkan 2 ml sampel (hasil destruksi),

kemudian ditambahkan 1 ml hidroksilamin dan 1 ml o-fenantrolin maka

akan terbentuk warna merah berarti mengandung Fe.

2. Ke dalam tabung reaksi dimasukan 2 ml sampel (hasil destruksi), kemudian

ditambahkan 3 tetes larutan natrium hidroksida 1N maka akan terbentuk

endapan coklat.

3. Ke dalam tabung reaksi dimasukkan 2 ml sampel (hasil destruksi),

kemudian ditambahkan 3 tetes kalium heksasianoferat (II) maka akan

terbentuk warna biru tua.

2.9 Analisis Kuantitatif Besi

Analisis kuantitatif besi di dalam sampel daun bayam hijau dilakukan

 11

secara spektrofotometri sinar tampak dengan tahapan kerja: Penetapan kemurnian

fero (II) ammonium sulfat baku, pembuatan larutan induk baku fero (II) amonium

sulfat, penentuan kurva serapan maksimum larutan baku fero (II) amonium sulfat,

penentuan waktu kerja (Operating Time), penentuan linieritas kurva kalibrasi dan

persamaan garis regresi, pengukuran absorbansi sampel, menghitung kadar besi di

dalam sampel, analisa Varian (ANAVA), dan uji validasi metode.

2.9.1 Penetapan kadar/kemurnian fero (II) ammonium sulfat baku secara

Permanganometri

Oleh karena pada penelitian ini tidak menggunakan senyawa fero (II)

BPFI sebagai baku pembanding, tetapi menggunakan fero (II) ammonium sulfa

baku dan belum diketahui kemurniannya, maka perlu dilakukan penentuan

kemurniannya dengan cara penetapan kadar, dapat dilakukan dengan cara titrasi

permanganometeri yaitu: Ditimbang seksama 390 mg Fero (II) amonium sulfat

baku (BM = 392,14), dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer dilarutkan dengan

10 ml asam sulfat 10%, dipanaskan sampai suhu larutan 60oC-70oC, kemudian

dititrasi dengan larutan standar kalium permanganat sampai terjadi warna ungu

muda, dicatat volume larutan kalium permanganat, diulangi pekerjaan 5 kali, dan

dihitung kadar fero (II) amonium sulfat baku

2.9.2 Pembuatan larutan induk baku fero (II) amonium sulfat

Ditimbang fero (II) amonium sulfat setara dengan 100 mg fero

(diperhitungkan sesuai kadar baku fero (II) amonium sulfat poin 2.9.1), kemudian

dimasukkan ke dalam labu tentukur 100 ml, dilarutkan dengan sedikit asam sulfat

10% dan dicukupkan dengan akuabides sampai garis tanda, sehingga diperoleh

larutan induk baku I (LIB I) dengan konsentrasi fero (II) =

 12

100 mg ×1000
= 1000 µg /ml
100 ml

Dipipet 1 ml larutan baku I (1000 µg/ml) dimasukkan ke dalam labu tentukur 100

ml dan dicukupkan dengan akuabides sampai garis tanda sehingga diperoleh

larutan baku II (LIB II) dengan konsentrasi

1ml × 1000 µ g/ml

= 10 µg /ml
100 ml

2.9.3 Pembuatan kurva serapan maksimum larutan fero fenantrolin

Dipipet 12,0 ml larutan baku II fero (II) amonium sulfat (10 µg/ml),

ditambahkan 2 ml asam klorida 10% dan 2 ml hidroksilamin 10 % dididihkan

pada suhu 60-70oC, dipindahkan ke dalam labu tentukur 50 ml ditambahkan 5 ml

larutan buffer asetat dan 2 ml o-fenantrolin, kemudian dicukupkan dengan

akuabides sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan konsentrasi fero (II) =

2,4 µg/ml. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang 400-800 nm,

sebagai blanko digunakan campuran larutan pereaksi 2 ml asam klorida 10%, 2 ml

hidroksilamin, dan 2 ml o-fenantrolin. Diperoleh serapan maksimum sebagai

panjang gelombang maksimum larutan fero fenantrolin.

2.9.4 Penentuan waktu kerja

Dipipet 12,0 ml larutan baku II fero (II) amonium sulfat (10 µg/ml),

ditambahkan 2 ml asam klorida 10% dan 2 ml hidroksilamin 10 %, dididihkan

pada suhu 60-70oC, dipindahkan ke dalam labu tentukur 50 ml ditambahkan 5 ml

larutan buffer asetat dan 2 ml o-fenantrolin, kemudian dicukupkan dengan

akuabides sampai garis tanda sehingga diperoleh larutan konsentrasi fero (II) =

2,4 µg/ml. Kemudian diukur absorbansinya pada panjang gelombang maksimum

yang diperoleh (pada poin 2.9.3), mulai 1 menit sampai 30 menit dengan interval
 13

waktu 1 menit, sebagai blanko digunakan campuran larutan pereaksi 2 ml asam

klorida 10%, 2 ml hidroksilamin, dan 2 ml o-fenantrolin. Diperoleh absorbansi

yang stabil sebagai waktu kerja yang baik.

2.9.5 Pembuatan kurva kalibrasi larutan fero fenentrolin

Dipipet 6 ml, 8 ml, 10 ml, 12 ml, 14 ml, 16 ml larutan induk baku II (10

µg/ml), masing-masing ditambahkan 2 ml asam klorida 10% dan 2 ml

hidroksilamin, dididihkan pada suhu 60-70oC, dipindahkan ke dalam labu tentukur

50 ml, masing-masing ditambahkan 5 ml larutan buffer asetat dan 2 ml

o-fenantrolin, kemudian dicukupkan dengan akuabides sampai garis tanda

sehingga diperoleh larutan konsentrasi fero (II) 1,2 µg/ml, 1,6 µg/ml, 2,0 µg/ml,

2,4 µg/ml, 2,8µg/ml, 3,2 µg/ml. Didiamkan selama beberapa menit sesuai dengan

waktu kerja yang diperoleh (pada poin 2.9.5). Kemudian diukur absorbansinya

pada panjang gelombang maksimum yang diperoleh (pada poin 2.9.3), sebagai

blanko digunakan campuran larutan pereaksi 2 ml asam klorida 10%, 2 ml

hidroksilamin, dan 2 ml o-fenantrolin. Maka diperoleh kurva kalibrasi dan

dihitung persamaan garis regresi.

2.9.6 Pengukuran absorbansi sampel

Dipipet 5,0 ml larutan sampel yang telah dipersiapkan dengan destruksi

basah (ditimbang seksama 130,0000 g, lalu didestruksi basah dengan penambahan

asam nitrat dan dicukupkan sampai 100 ml), dimasukkan ke dalam labu tentukur

50 ml, ditambahkan 2 ml larutan hidroksilamin 10 % dan 5 ml larutan buffer

asetat pH 3,2-3,3, dan dipanaskan sampai suhu 60oC-70oC setelah dingin

ditambahkan 2 ml o-fenantrolin, dan dicukupkan dengan akuabides sampai garis

tanda. Didiamkan selama beberapa menit sesuai dengan waktu kerja yang
 14

diperoleh (pada poin 2.9.5). Kemudian diukur absorbansinya pada panjang

gelombang maksimum yang diperoleh (pada poin 2.9.3), sebagai blanko

digunakan campuran larutan pereaksi 2 ml asam klorida 10%, 2 ml hidroksilamin,

dan 2 ml o-fenantrolin. Diperoleh absorbansi sampel, dan diulangi pengerjaan

sampai 6 kali dan dihitung konsentrasi besi di dalam sampel menggunakan

persamaan garis regresi, dan selanjutnya digunakan untuk menghitung kadar besi

di dalam sampel (mg/100g) dengan rumus :

Kons. perolehan besi( µg/ml) x Vol .larutan sampel(ml)

x pengenceran x 100
Bobot sampel yang ditimbang ( mg ) x 1000

(mg/100g)

2.10 Analisis Data

2.11.1 Menghitung simpangan baku (Standar Deviasi)

Untuk menghitung standar deviasi dapat digunakan rumus:

SD =
√ ∑ ( X− X )2
n−1

Keterangan :

SD = Standar deviasi x X̄ = Kadar rata-rata sampel

X = Kadar sampel n = Jumlah perlakuan

Untuk menghitung t hitung dapat digunakan rumus:

x−x t X− X̄ x−x
t hitung = hitung = t hitung =
SD/ √ n SD/ √ n SD / √ n

Keterangan :

X̄ = Kadar rata-rata sampel

X = Kadar sampel
 15

SD = Standar deviasi

n = Jumlah Perlakuan

Untuk mengetahui semua data yang diperoleh dapat diterima atau ditolak

disimpulkan dengan melihat thitung dan ttabel dengan dasar penerimaan dan

penolakan data adalah:

Data diterima jika : thitung<ttabel

Data ditolak jika : thitung> ttabel

Untuk menghitung kadar sebenarnya dengan taraf kepercayaan 99%, dan

SD
kesalahan α = 0,01; dk = n-1, dapat digunakan rumus: = X ± t (1-1/2α dk) x
√n
Keterangan:

µ = Interval kepercayaan

SD = Standar deviasi

dk = derajat kebebasan (n-1)

t = harga t tabel sesuai dk (n-1)

α = tingkat kepercayaan

n = jumlah perlakuan

x X̄ = kadar rata-rata sampel

2.11.2 Uji validasi metode analisis

Uji validasi metode dilakukan dengan uji akurasi (kecermatan), uji presisi

(keseksamaan), dan uji sensitivitas yaitu Limit of Detection (LOD) dan Limit of

Quantitation (LOD).

2.11.2.1 Uji Akurasi

Uji akurasi dilakukan dengan cara pengujian perolehan kembali (recovery)

analit yang ditambahkan, Pada penelitian ini dilakukan dengan metode

penambahan bahan baku (standard addition method), karena sampel yang diuji
 16

berupa sediaan yang sulit diketahui komposisi yang sebenarnya, dilakukan

dengan membuat rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%. Setiap rentang spesifik

mengandung 70% analit dan 30% bahan baku masing-masing dikerjakan dengan 3

replikasi. Kemudian ditentukan kadar besi sebelum dan sesudah ditambahkan

baku fero (II) amonium sulfat. Penetapan kadar besi dilakukan dengan cara yang

sama pada penetapan kadar besi di dalam sampel. Persen perolehan kembali

(recovery) dihitung menggunakan rumus: Persen recovery =

Bobot besi( setelah ditambah baku−sebelum ditambah baku)

x 100%
Bobot besi yang ditambahkan

2.11.2.2 Uji Keseksamaan (Presisi)

Uji keseksamaan/presisi dilakukan dengan menghitung simpangan baku

relatif (RSD) atau koefisien variasi (CV), dari hasil replikasi pada pengujian

persen recovery, menggunakan rumus sebagai berikut:

Standar deviasi
x 100 %
Persen recovery rata−rata
Secara umum standar deviasi relatif (RSD) tidak lebih dari 2,5% (Gandjar,

Rohman, 2007, Harmita, 2004).

2.11.2.3 Uji Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ)

Batas deteksi merupakan jumlah terkecil analit dalam sampel yang dapat

di deteksi yang masih memberikan respon signifikan. Sedangkan batas kuantitasi

merupakan kuantitas terkecil analit dalam sampel yang masih dapat memenuhi

kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004). Penentuan batas deteksi suatu

metode berbeda-beda tergantung pada metode analisis. Pada analisis yang tidak

menggunakan instrumen batas tersebut ditentukan dengan mendeteksi analit

dalam sampel pada pengenceran bertingkat. Pada analisis instrumen batas deteksi

dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung
 17

simpangan baku respon blanko, dapat digunakan untuk perhitungan menggunakan

rumus:

k x Sb
Q= .
Sl

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

k = 3 untuk batas deteksi (LOD), dan 10 untuk batas kuantitasi (LOQ).

Sb = simpangan baku respon analitik dari blanko

Sl = arah garis linear

Batas deteksi dan kuantitasi dapat dihitung secara statistik melalui garis

regresi linier dari kurva kalibrasi. Nilai pengukuran akan sama dengan nilai b pada

persamaan garis linear y = a + bx, sedangkan simpangan baku blanko sama

dengan simpangan baku residual (Sy/x)2.

Menurut Harmita (2004), batas deteksi dan batas kuantitasi ini dapat

dihitung dengan rumus sebagai berikut:

SY / X=
√ ∑ ( y − yi)2
(n−2)
3 xSY / X
LOD=
slope
10 xSY / X
LOQ=
slope

2.11.2.4 Menghitung analisa varian

a. Taraf nyata (a) dan nilai F tabel:

Perulangan (k)

Ulangan n1; n2 ; n3;... ; nk

Jumlah perulangan (N) = n1 + n2 + n3+... + nk

Derajat bebas (DB) perulangan (V1) = k – 1

Derajat bebas (DB) eror (V2) = k(n-1)

 18

Pada uji tabel F, DB perulangan (V1) DB eror (V2) 1%,5%

b. Kriteria pengujian

1. Apabila F0 < Ftabel (5%) tidak terdapat perbedaan perolehan kadar besi di

dalam sampel daun bayam hijau, yang telah direbus, dan yang telah

dikukus, maka tidak dilakukan uji BNT (Beda Nyata Terkecil).

2. Apabila Ftabel (5%) < F0< Ftabel (1%), terdapat perbedaan perolehan kadar

kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau bayam hijau, yang telah

direbus, dan yang telah dikukus, maka perlu dilakukan uji BNT (Bukti

Nyata Terkecil).

3. Apabila F0 > Ftabel (1%) terdapat perbedaan perolehan kadar besi di dalam

sampel daun bayam hijau bayam hijau, yang telah direbus, dan yang telah

dikukus maka perlu dilakukan uji BNT (Beda Nyata Terkecil).

c. Perhitungan analisa varian

Dengan menggunakan analisa varian diperoleh faktor koreksi:

2
( jumlahT )
Faktor koreksi (FK) =
jumlahk

Jumlah koreksi total (JKT) = (jumlah ulangan)2 – FK

2
jumlah (T )
Jumlah koreksi kolom (JKK) =
jumlahk
Jumlah koreksi eror (JKE) = JKT – JKK
JKK
RKE =
DBkolom
JKK
RKE =
DBerror

RKK
Sehingga diperoleh : F0 =
RKE

d. Perhitungan uji BNT (Beda Nyata Terkecil)

 19

Nilai BNT a = ta x SD

Nilai dari ta di peroleh dari tabel

Sedangkan nilai standar deviasi diperoleh dengan menggunakan rumus:

SD =
√ 2 KTG
k

Keterangan:

SD = Standard deviasi

k = perulangan

KTG = koreksi total galat

Kemudian dari perhitungan dibuat suatu kesimpulan:

1. Bila BNT hitung < BNT tabel (5%), tidak terdapat perbedaan yang nyata

perolehan kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau bayam hijau, yang

telah direbus, dan yang telah dikukus.

2. Bila BNT tabel < BNT tabel < BNT tabel (1%), maka terdapat perbedaan

perolehan kadar kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau bayam hijau,

yang telah direbus, dan yang telah dikukus.

3. Bila BNT hitung > BNT tabel (5%), maka terdapat perbedaan perolehan kadar

besi di dalam sampel daun bayam hijau bayam hijau, yang telah direbus, dan

yang telah dikukus (Hasan, 2005).

 BAB III

HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1 Penentuan Kemurniaan fero (II) amonium sulfat sebagai baku

pembanding
Oleh karena fero (II) amonium sulfat yang digunakan sebagai bahan baku

pembanding dalam penelitian ini bukan baku BPFI, dan belum diketahui

kemurniannya, maka perlu dilakukan penentuan kemurniaannnya dengan cara

penentuan kadar menggunakan metode permanganometri. Dari hasil penentuan

kemurnian fero (II) amonium sulfat, diperoleh 99,61%. Data hasil penentuan

kemurnian fero (II) amonium sulfat dapat dilihat pada Lampiran 5 halaman 36.

3.2 Identifikasi Besi (Uji Kualitatif)

Uji kualitatif yang dilakukan dengan menggunakan pereaksi

hidroksilamin dan o-fenantrolin larutan uji memberikan warna merah, dengan

pereaksi natrium hidroksida akan membentuk endapan coklat, dan dengan

pereaksi kalium heksasianoferat (II) memberikan warna biru tua, hasil

selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 3 halaman 34.

3.3 Penentuan Panjang Gelombang Maksimum

Penentuan panjang gelombang maksimum senyawa kompleks fero

fenantrolin dilakukan dengan mengukur serapan maksimum menggunakan

spektrofotometer sinar tampak dari larutan baku fero (II) amonium sulfat dengan

konsentrasi Fe (II) = 2,40 µg/ml setelah pemnambahan ortofenantrolin terbentuk

senyawa komplsks fero-fenantrolin berwarna merah, pada rentang panjang

gelombang maksimum 400-800 nm. Hasil pengukuran kurva absorbansi

maksimum pada penentuan panjang gelombang maksimum senyawa kompleks

20
 21

ferofenantrolin dapat dilihat pada Gambar 1 berikut:

0,3810

510,00

rement Properties No P/V Wavelength Abs Description

ngth Range (nm): 400.00 to 800.00 1 510,00 0,3810
peed: Fast
ng Interval: 0,2Gambar 1. Kurva Serapan Larutan Baku Fero Dengan Konsentrasi 2,4 µg/ml
amplin Interval: Disabled
mode: Single Gambar 1 di atas menunjukkan hasil dari pengukuran yang dilakukan
ment Properties
diperoleh serapan maksimum 0,3810 pada panjang gelombang 510,00 nm.
ment Type: UV-1800 Series
Absorbance
Panjang gelombang ini sesuai dengan literatur, yaitu pada rentang 500-560 nm
th: 1.0 nm
ource Change Wavelength: 340.8 nm
change:
yang merupakan rentang panjang gelombang untuk warna komplementer merah
Normal

ment Properties: anggur (Gandjar, 2007). Maka hasil yang diperoleh sudah baik, sehingga
ment: 6-Cell
r of cell 2 pengukuran absorbansi selanjutnya dapat dilakukan pada panjang gelombang

ion] 510,00 nm.

old 0.001000
4 3.4 Penentuan Waktu Kerja
olate Disabled
e Disabled Untuk mengetahui waktu yang dibutuhkan pada hasil reaksi pembentukan

e Preparayion Properties] kompleks fero dengan pereaksi o-fenantrolin memberikan serapan yang stabil,
300 ppm
e dilakukan penentuan waktu kerja. Penentuan waktu kerja dilakukan dengan
n
ength mengukur serapan dari larutan induk baku fero (II) dengan konsentrasi 2,4 μ g/ml
nal Inforamtion
pada panjang gelombang 510,00 nm selama 30 menit mulai dari 1 menit dengan
 22

rentang waktu satu menit. Hasil pengukuran absorbansi yang stabil sebagai waktu

kerja senyawa kompleks ferofenantrolin dapat dilihat pada Gambar 2 berikut ini:
Time Course Graph
0,4430

0,4420
Abs

0,4410

0,4400

0,4390

0,4380
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00
24,00 30,00

Time (Minute )

Gambar 2. Kurva Penentuan Waktu Kerja Larutan Baku Fero (II)-fenantrolin

Gambar 2 di atas menunjukkan hasil dari pengukuran absorbansi pada

berbagai waktu, diperoleh absorbansi yang stabil yaitu 0,4409 pada menit ke-15

hingga menit ke-24. Maka pekerjaan pengukuran absorbansi selanjutnya dapat

digunakan pada waktu kerja mulai menit ke 15 sampai 24.

3.5 Penentuan Linieritas Kurva Kalibrasi

Penentuan kurva kalibrasi larutan fero dilakukan dengan cara mengukur

serapan larutan kompleks fero-fenantrolin dengan konsentrasi fero (II): 1,2 µg/ml;

1,6 µg/ml; 2,0 µg/ml; 2,4 µg/ml; 2,8 µg/ml; dan 3,2 µg/ml yang ditambahkan

pereaksi orto-fenantrolin, kemudian diukur pada panjang gelombang 510,00 nm

dalam waktu kerja di sekitar menit ke-15 sampai ke-24. Hasil pengukuran kurva

kalibrasi dapat dilihat pada Tabel 1 dan Gambar 3 berikut:

 23

Tabel 1.Hasil Pengukuran Kurva Kalibrasi Larutan Baku Fero-fenantrolin

No Konsentrasi(µg/ml) Absorbans
1. 0,000 0,0000
2. 1,200 0,2270
3. 1,600 0,3140
4. 2,000 0,3790
5. 2,400 0,4640
6. 2,800 0,5250
7. 3,200 0,6080

Standard curve
0.7000

0,6000

0,4000
Abs

0,2000

0,0000
0,00 1,00 2,00 3,00 3.20
Connc (mcg/ml)

Gambar 3. Kurva kalibrasi

Persamaan garis regresi diperoleh: Y = 0,18934 X + 0,00259 dengan

koefisien korelasi(r2) = Correlation Coefficient = 0,9991

Tabel 1 dan Gambar 3 di atas menunjukkan bahwa dari hasil pengukuran

absorbansi larutan besi baku diperoleh dengan koefisien korelasinya = 0,9991 dan

persamaan garis regresi diperoleh Y = 0,18934X + 0,00259, maka dapat

disimpulkan bahwa terdapat hubungan linear yang baik antara konsentrasi dan

serapan kurva kalibrasi yang diperoleh dengan hukum Lambert–Beer, yaitu kurva

baku berupa garis lurus. Kemiringan garis ini setara dengan ab, dan karena b

merupakan tebal kuvet maka nilai a atau absorptivitas dapat dihitung (Gandjar,

2007).
 24

3.6 Penetapan Kadar Besi Dalam Sampel

Penetapan kadar besi dilakukan dengan menggunakan metode

spektrofotometri sinar tampak. Sampel yang telah didestruksi basah berupa ion

besi yang direduksi dengan hidroksilamin dan o-fenantrolin dalam suasana asam

membentuk kompleks ferofenantrolin yang bewarna merah anggur dan stabil

selama lebih kurang 9 menit, mulai dari menit ke-15 sampai ke-24, dengan

panjang gelombang 510,00 nm, diperoleh absorbansi sampel.

Kemudian dihitung konsentrasi besi di dalam sampel menggunakan

persamaan garis regresi, selanjutnya dihitung kadarnya, dilanjutkan dengan

perhitungan statistik dengan distribusi t pada tingkat kepercayaan 99% (α = 0,01).

Contoh perhitungan kadar besi di dalam sampel dapat dilihat pada Lampiran 13,

halaman 44. Data selengkapnya dapat dilihat pada Lampiran 17, halaman 51, dan

hasilnya dapat dilihat pada Tabel 2 dan Gambar 4 di bawah ini:

Tabel 2. Hasil Analisis Kadar Besi Pada Daun Bayam hijau

N
o Sampel Kadar besi (%)
Daun bayam hijau bayam
1 hijau 2,756 ± 0,054
2 Daun bayam hijau kukus 2,734 ± 0,013
3 Daun bayam hijau rebus 1,005 ± 0,010
Kadar Besi total

2,756 2,734
3.000
(mg/100g)

2.000 1,005

1.000

0.000
Daun bayam mentah Daun bayam kukus Daunbayam rebus

Sampel Daun Bayam

Gambar 4. Histogram kadar besi pada daun bayam hijau
 25

Tabel 2 dan Gambar 4 di atas menunjukkan hasil analisis kadar besi dari

sampel daun bayam hijau, terlihat bahwa kadar besi di antara sampel daun bayam

hijau yang bayam hijau, telah direbus, dan telah dikukus terdapat perbedaan.

Kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau yang masih bayam hijau lebih

tinggi dibandingkan dengan di dalam sampel yang telah direbus atau telah

dikukus.

Menurut berbagai referensi dinyatakan bahwa kadar besi di dalam daun

bayam hijau berkisar 2,9 mg/100 g (Depkes, 1990), kadar besi di dalam daun

bayam hijau dari hasil penelitian diperoleh lebih kecil dibandingkan dengan

referensi. Hal ini kemungkinan disebabkan oleh terdapatnya perbedaan tempat

tumbuh tanaman, iklim, jenis tanah, alat dan metode yang digunakan pada analisa.

Untuk mengetahui perbedaan yang kadar besi yang diperoleh dari berbagai

kelompok perlakuan ini, bermakna secara signifikan, perlu dilakukan uji statistik,

dan dapat dilakukan melalui uji analisa varian (ANAVA) dan uji beda nyata

terkecil (BNT).

3.7 Uji Analisa Varian (ANAVA) dan Uji Beda Nyata Terkecil (BNT).

Uji analisa varian (ANAVA) dan beda nyata terkecil (BNT) dilakukan

untuk melihat perbedaan perolehan kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau

yang masih bayam hijau, yang telah direbus dan yang telah dikukus. Data

perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 18 halaman 52 sampai 54, hasil uji

ANAVA dapat dilihat pada Tabel 3.

 26

Tabel 3. Data Hasil Uji ANAVA (Analisa Sidik Ragam dengan Uji F)

F Tabel
SK JK DB RK F0
5% 1%
Rata- rata kolom 12,119 5 2,42374
Error 0,006 18 0,00032 7490,98 5,06 3,11
Total 12,125 23 2,42406

Tabel 3 di atas menunjukkan bahwa F0 = 7490,98 > F 5% (5,30) = 5,06

dan F 1% (5,30) = 3,11, maka terdapat perbedaan yang sangat signifikan

perolehan kadar besi di antara sampel daun bayam hijau yang bayam hijau, daun

bayam hijau yang telah dikukus, dan daun bayam hijau yang telah direbus. Oleh

karena terdapat perbedaan perolehan kadar besi yang sangat signifikan,

dilanjutkan pengujian dengan uji beda nyata terkecil (BNT) untuk mengetahui

perolehan kadar besi dari sampel/kondisimana yang berbeda di antara seluruh

sampel/kondisi yang dilakukan satu sama lainnya, dan juga untuk mengetahui

terdapatnya sampel/kondisi yang tidak menghasilkan perbedaan kadar besi yang

berbeda secara signifikan. Perhitungan uji BNT selengkapnya dapat dilihat pada

Lampiran 18 halaman 52 sampai 54, Hasilnya dapat dilihat pada Tabel 4

berikut:

Tabel 4. Data Hasil Uji BNT (Beda Nyata Terkecil)

Beda dengan
Kadar besi rata-rata Daun bayam
Sampel Daun bayam
(mg/100 g) hijau bayam
hijau kukus
hijau
Daun bayam hijau
- -
bayam hijau 2,7564
Daun bayam hijau
0,0226 -
kukus 2,7338
Daun bayam hijau
1,7518 1,7292
rebus 1,0046
BNT 0,05 = 0,0218 BNT 0,01 = 0,0299
 27

Hasil uji BNT dapat disimpulkan;

1. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang bayam hijau lebih tinggi

dibandingkan dengan kadar besi di dalam daun bayam hijau yang telah

dikukus, dan terdapat perbedaan yang nyata.

2. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih bayam hijau lebih tinggi

dibandingkan dengan daun bayam hijau yang telah direbus, dan terdapat

perbedaan yang sangat nyata.

3. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang telah dikukus lebih tinggi

dibandingkan dengan daun bayam hijau yang telah direbus, dan terdapat

perbedaan yang sangat nyata.

Dari keseluruhan hasil uji penentuan besi di dalam daun bayam hijau, dapat

dilihat untuk mendapatkan kadar besi yang tinggi sebaiknya dikonsumsi dalam

keadaan bayam hijau dan segar yang saat ini juga banyak digemari masyarakat

diminum dalam bentuk jus. Namun jika dilakukan pengolahan sebaiknya

dilakukan dengan cara pengukusan, tidak dilakukan perebusan, karena dengan

perbusan penurunan kadar besi sangat signifikan. Hal ini disebabkan bahwa kadar

besi dalam daun bayam hijau terlarut dalam air panas sehubungan dengan sifat

kelarutan besi dalam bentuk senyawa garam adalah mudah larut dalam air panas.

3.8 Validasi Metode Analisis

3.8.1 Uji perolehan kembali (Recovery)

Validasi metode dilakukan dengan cara uji akurasi, uji presisi, dan uji

sensitifitas yaitu Uji Limit of Detection (LOD) dan Limit of Quantitation (LOQ).

Uji akurasi untuk mengetahui metode spektrofotometri sinar tampak dengan o-

fenantrolin pada penentuan kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau akurat.
 28

Uji ini dapat dilakukan dengan parameter perolehan kembali (persen

recovery) (Harmita, 2004), dilakukan dengan cara penambahan baku pembanding

(standard addition method), yaitu dengan cara penambahan sejumlah tertentu

baku besi secara kuantitatif ke dalam sejumlah sampel kemudian dianalisis

perolehan kembali baku yang ditambahkan tersebut. Selanjutnya uji presisi

ditentukan dengan cara menghitung relatif standar deviasi (RSD).

Uji akurasi dilakukan dengan membuat 3 konsentrasi analit dengan

rentang spesifik 80%, 100%, dan 120%. Setiap rentang spesifik mengandung 70%

analit dan 30% bahan baku pembanding masing-masing dikerjakan dengan 3

replikasi. Data dan perhitungan uji perolehan kembali (% recovery) dapat dilihat

pada Lampiran 19 sampai 21, halaman 55 sampai 59. Hasil dapat dilihat pada

Tabel 5 berikut:

Tabel 5. Data Hasil Uji Validasi Penetapan Kadar Besi Di Dalam Sampel Daun
Bayam hijau

Perolehan Bobot Perolehan Bobot

Baku Besi yang Persen
Rentang Besi sebelum Besi setelah
Ditambahkan recovery
spesifik penambahan penambahan
(mg) (%)
Besi baku (mg) Besi baku (mg)
2,82 4,03 101,23
80% 2,80 4,02 1,200 101,23
2,83 4,02 99,03
3,49 5,00 100,35
100% 3,50 5,02 1,500 101,23
3,52 5,01 99,47
4,20 6,03 101,23
120% 4,22 6,00 1,800 99,03
4,22 6,00 99,03

Persen recovery rata-rata = 100,20%

Standar deviasi = 1,06

Standardeviasi
Relatif standar deviasi = x 100%
Persen recovery rata−rata
 29

1,06
Relatif standar deviasi = x 100% =1,05%
100,20
Dari uji perolehan kembali yang dilakukan, didapat persen perolehan

kembali sebesar 100,20%. Maka dapat disimpulkan bahwa metode yang dilakukan

memberikan akurasi pada rentang yang dapat diterima yaitu 98-102% (Harmita,

2004).

3.8.2 Simpangan baku relatif

Untuk menetapkan presisi dari metode yang digunakan maka dilakukan

perhitungan simpangan baku relatif (Relative Standard Deviation). Pada

penelitian ini diperoleh RSD sebesar 1,05%. Kriteria seksama dapat diterima jika

diperoleh simpangan baku relatif 2% atau kurang (Harmita, 2004). Hasil yang

diperoleh menunjukkan bahwa metode yang dilakukan memiliki potensi yang

baik. Perhitungan dapat dilihat pada lampiran 21, halaman 59.

3.8.3 Penentuan Batas Deteksi ( Limit of Detection) dan Batas Kuantitasi

(Limit of Quantitation)

Batas deteksi merupakan parameter uji batas yang dilakukan untuk

mendeteksi jumlah terkecil analit dalam sampel yang masih memberikan respon

signifikan dibandingkan dengan blanko. Sedangkan batas kuantitas merupakan

batas terkecil yang masih memenuhi kriteria cermat dan seksama (Harmita, 2004).

Dari hasil perhitungan diperoleh batas deteksi (LOD) sebesar 0,151 µg/ml

dan batas kuantitasi (LOQ) sebesar 0,502 µg/ml. Hasil pengukuran konsentrasi

sampel seluruhnya sangat baik karena diperoleh di atas harga LOQ. Perhitungan

dapat dilihat pada Lampiran 22, halaman 60.

 30

BAB IV

KESIMPULAN DAN SARAN

4.1 Kesimpulan

Berdasarkan penelitian yang dilakukan, maka dapat disimpulkan bahwa:

1. Kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau yang masih mentah adalah

2,756 ± 0,054 mg/100g, yang telah dikukus = 2,734 ± 0,013 mg/100g, dan

yang telah direbus = 1,005 ± 0,010 mg/100g g

2. Kadar besi di dalam daun bayam hijau lebih tinggi dibandingkan dengan di

dalam daun bayam hijau yang telah direbus dan yang telah dikukus. Tidak

berbeda nyata antara bayam hijau mentah dengan yang dikukus, berbeda sangat

nyata dengan yang direbus. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang telah

dikukus lebih tinggi, dibandingkan dengan kadar besi di dalam daun bayam

hijau yang telah direbus dan terdapat perbedaan yang sangat nyata.

3. Metode spektrofotometri sinar tampak, menggunakan pereaksi o-fenantrolin,

setelah penambahan hidroksilamin dalam suasana asam, akurat untuk

penetapan kadar besi di dalam daun bayam hijau, persen recovery = 100,20%,

relatif standar deviasi (RSD) = 1,05%, dan hasil pengukuran konsentrasi

sampel seluruhnya di atas harga LOQ (Limit of Quantity) = 0,502 µg/ml

4.2 Saran

Kepada peneliti berikutnya agar melakukan penelitian kandungan zat gizi

lain di dalam daun bayam hijau. Disarankan bagi masyarakat jika ingin

mengkonsumsi daun bayam hijau, lebih baik mengkonsumsi daun bayam hijau
 31

yang masih mentah atau yang dikukus karena kadar besi lebih tinggi dari pada di

dalam daun bayam hijau rebus.

 DAFTAR PUSTAKA

Almatsier, S. (2004.) Prinsip Dasar Ilmu Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka

Umum.
Ditjen POM. (1979). Farmakope Indonesia. Edisi Ketiga. Jakarta: Departemen
Kesehatan Republik Indonesia. Halaman 651, 772.
Ditjen POM. (1995). Farmakope Indonesia. Edisi Ke-empat. Jakarta: Departemen
Kesehatan RI. Halaman 1061.
Ermer, J., dan McB. Miller, J.H. (2005). Method Validation in Pharmaceutical
Analysis. A Giude to Best Practice. Weinheim: Wiley-VCH. Halaman 89.
Gandjar, I.G., dan Rohman, A. (2007). Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta:
Pustaka Pelajar. Halaman 223, 235-236,240-243, 262, 464.
Harmita. (2004). Petunjuk Pelaksanaan Validasi Metoda dan Cara
Perhitungannya. Jakarta: Departemen Farmasi FMIPA UI. Halaman 119,
130, 131.
Sediaoetama, Ahmad Djaeni. (2008). Ilmu Gizi. Jakarta: Dian Rakyat.
Sudjana. (2005). Metode Statistika. Edisi Keenam. Bandung: Penerbit Tarsito.
Halaman 371.
Suhardjo. (1992). Prinsip-prinsip Ilmu Gizi.Yogyakarta: Kanisius.
Sunarjono, H. (2003). Bertanam 30 Jenis Sayuran. Jakarta: Penebar Swadaya.
Vogel, A.I. (1979). Textbook Of Macro And Semimicro Qualitative Inorganic
Analysis. Penerjemah: Setiono,L.,dan Pudjaatmaka, A.H.(1985).Buku Teks
Vogel Kimia Analisis Anorganik Kualitatif. Edisi kelima. Bagian I. Jakarta:
PT Kalman Media Pustaka. Halaman 378-379.
Widowati, W.,dkk. (2008). Efek Toksik Logam. Yogyakarta: ANDI

Winarno, F.G. (2004). Kimia Pangan dan Gizi. Jakarta: PT Gramedia Pustaka
Utama

32
31
 33

Lampiran1.Surat Hasil Identifikasi Tanaman Bayam hijau

 34

Lampiran 2. Gambar Sampel Tanaman Bayam hijau

 35

Lampiran 3. Hasil Uji Kualitatif Besi Di dalam Sampel Daun Bayam hijau

1 2 3 4

Keterangan:

1. Blanko (sampel)

2. Sampel + hidroksilamin dan o-fenantrolin = warna merah

3. Sampel + NaOH = endapan coklat

4. Sampel kalium heksasianoferat (II) = warna biru tua

 36

Lampiran 4. Pembuatan dan Pembakuan Larutan Kalium Permanganat

I. Pembuatan larutan KMnO4

Berdasarkan reaksi: MnO4 + 8H+ + 5e → Mn2++ 4H2O,

Maka KMnO4 1 M = 5 N
BM KMnO 4 158,03
BM KMnO4 = 158,03, maka BE = = = 31,606
5 5
Dibuat larutan 0,1 N sebanyak 250 ml
Bobot (g)
Normalitas =
BE
250 ml
Bobot KMnO4 yang ditimbang = 0,1000 x 31,606 x = 0,7902 g
1000 ml
Ditimbang KMnO4 sebanyak 790,0 mg dilarutkan sampai 250 ml
2. Pembuatan asam oksalat 0,1 N
H2C2O4. 2H2O : 1 M = 2 N karena asam oksalat bervalensi 2
BM asam oksalat (H2C2O4. 2H2O) = 126,07
BM H 2 C 2 O 4 126,07
Maka BE asam oksalat = = = 63,035
2 2
Dibuat larutan 0,1 N sebanyak 100 ml
100 ml
Ditimbang asam oksalat = 0,1000 x 63,035 x = 0,630 g
1000 ml
Dilarutkan dengan akuades sampai 100 ml
0,630 g 1000 ml
Normalitas asam oksalat = x = 0,0999 N
63,035 100 ml
3. Pembakuan larutan kalium permanganat
V1 x N1 = V2 x N2
Volume larutan asam oksalat = 10,00 ml
Normalitas asam oksalat = 0,0999 N
Volume titrasi kalium permanganat
V1 = 10,05 ml
V2 = 10,05 ml V = 10,20 ml
V3 = 9,95 ml
(10,05+10,05+9,95)ml
Volume kalium permanganat rata-rata = = 10,20 ml
3
 37

10,00 ml x 0,0999 N
Normalitas kalium permanganat = = 0,0997 N
10,20 ml
Lampiran 5. Penetapan Kadar Baku Fero (II) Amonium Sulfat Secara
Permanganometri

Berat fero (II) amonium sulfat yang ditimbang =

390,0 mg
390,5 mg
390,0 mg
BM fero amonium sulfat: 392,14
Normalitas KMnO4: 0,0997 N
Volume kalium permanganat pada titrasi:
V1 = 9,95 ml
V2 = 9,90 ml
V3 = 9,95 ml

Kadar (kemurnian) fero (II) amonium sulfat

V . KMn O 4 x KMn O 4 x BM fero ( II ) amonium sulfat
= x 100%
Bobot Fe ( II ) amonium sulfat
9,95 ml x 0,0997 N x 392,14
1. x 100% = 99,78%
390,0
9,90 ml x 0,0997 N x 392,14
2. x 100% = 99,28%
390,5
9,95 ml x 0,0997 N x 392,14
3. x 100% = 99,78%
390,0

Jadi kadar (kemurnian) fero (II) amonium sulfat

(99,78+ 99,28+99,78)%
= = 99,61 %
3
 38

Lampiran 6. Perhitungan Penimbangan Fero (II) Amonium Sulfat Untuk

Pembuatan Larutan Induk Baku

Kadar fero (II) amonium sulfat yang diperoleh = 99,61 %

BM Fe (II) amonium sulfat = 392,14 BA Fe = 56

Ditimbang fero (II) amonium sulfat setara dengan 100 mg Fe (II), maka fero (II)

amonium sulfat yang ditimbang:

BM fe ( II ) amonium sulfat
= x kemurnian x bobot yang diinginkan
B A Fe ( II )
392,14 100
= x x 100 mg = 702,99 mg
56 99,61
Jadi fero (II) amonium sulfat yang ditimbang adalah 702,99 mg
Dilarutkan sampai dengan akuades sampai 100 ml maka diperoleh larutan induk
100 mg x 1000
baku I Fe konsentrasi = = 1000 µg/ml
100 ml
Selanjutnya dipipet 1 ml, diencerkan dengan dengan akuades sampai 100 ml maka
diperoleh larutan induk baku II Fe konsentrasi
1ml x 1000 µg /ml
= = 10µg/ml
100 ml
Selanjutnya dibuat berbagai konsentrasi: 1,20 µg/ml; 1,60 µg/ml; 2,00 µg/ml; 2,40

µg/ml; 2,80 µg/ml; dan 3,20 µg/ml, sebanyak 50 ml sebagai berikut:

6 ml x 10 µg/ml
1. = 1,20 µg/ml
50 ml

8 ml x 10 µg/ml
2. = 1,60 µg/ml
50 ml

10 ml x 10 µg /ml
3.
50 ml
= 2,00 µg/ml

12ml x 10 µg /ml
4. = 2,40 µg/ml
50 ml

14 ml x 10 µg/ml
5. = 2,80 µg/ml
50 ml
 39

16 ml x 10 µg /ml
6. = 3,20 µg/ml
50 ml

Lampiran 7. Gambar Bagan Kerja Mencari Panjang Gelombang Maksimum,

Operating Time, Dan Kurva Kalibrasi Larutan Fero Fenantrolin

Fero (II) amonium sulfat baku setara dengan 100 mg Fe

Dilarutkan dengan akuades di dalam labu tentukur 100 ml, di

Larutan induk baku I fe (1000 µg/ml) Dipipet 1 ml dimasukkan dalam labu tentukur 100 ml, dicuku
/ml)

Dipipet 6 ml; 8 ml; 10 ml; 12 ml; 14 ml; 16 ml di + k

Larutan induk baku II Fe
(10 µg/ml)
/ml)

Dipipet 12 ml di + kan 2 ml HCl (p) dan 2 ml hidroksilamin dididihkan pada suhu 60-70°C dan dipi

Dipipet 12 ml di + kan 2 ml HCl (p) dan 2 ml hidroksi

Diperoleh resapan panjang Diperoleh

gelombangwaktu kerja yangDiperoleh
maksimum baik (operating
kurva kalibrasi
time) dan persamaan garis regresi
40
 41

Lampiran 8. Bagan Kerja Penetapan Kadar Besi Di Dalam Sampel Daun Bayam
hijau Secara Spektrofotometri Sinar Tampak

Ditimbang 130,0000 g
sampel
Dimasukkan ke dalam cawan penguap, ditambahkan
dengan 5 ml HNO3 5 N, dipanskan di atas api langsung
ditambahkan 5 ml akuades dan dipanaskna sampai
larutan menjadi jernih,disaring ke dalam labu tentukur
100 ml, dicukupkan sampai garis tanda.

Larutan sampel

Dipipet sebanyak 5,00 ml di + kan 2 ml HCl (p) dan

2 ml hidroksilamin dididihkan pada suhu 60-70°C
dan dipindahkan ke labu tentukur 50 ml di + kan 5
ml larutan buffer asetat dan 2 ml o-fenantrolin
dicukupkan dengan akuades sampai garis
tanda,dibiarkan beberapa menit sesuai waktu
kerja,diukur pada panjang gelombang maksimum.

Diperoleh data absorbansi

Dihitung konsentrasi besi di dalam sampel

menggunakan persamaan garis regresi

Diperoleh konsentrasi besi di dalam sampel

Dihitung kadar besi di dalam sampel

Diperoleh kadar besi di dalam sampel Diuji secara statistik

 42

Lampiran 9. Kurva Absorbansi Maksimum Larutan Fero (II) Fenantrolin

Spectrum peak pick Report 13/04/2016 15:53:15

Data Set : Kurva Serapan Fe 2,0 ppm - Raw Data

Measurement Properties No P/V Wavelength Abs Description

Wavelength Range (nm): 400.00 to 800.00 1 510,00 0,3810
Scan Speed: Fast
Sampling Interval: 0,2
Auto Samplin Interval: Disabled
Scan mode: Single

Instrument Properties
Instrument Type: UV-1800 Series
Measuring:Mode: Absorbance
Slit Width: 1.0 nm
Light Source Change Wavelength: 340.8 nm
S/R Exchange: Normal

Attachment Properties:
Attachment: 6-Cell
Bumber of cell 2

[Operation]
Threshold 0.001000
Points 4
Inter Polate Disabled
Average Disabled

[Sample Preparayion Properties]

Weight 300 ppm
Volume
Dilotion
Path Length
Additional Inforamtion

Page 1 / 1
 43

Lampiran 10. Kurva Waktu Kerja (Operating Time) Larutan Fero Fenantrolin

Active Time Course Graph Report '01/21/2005 01:01:05

13/04/2016 AM PM
10:25:65

Data Set : Storage 14654 - RawData - C:\Documents and Settings\user1\My

Documents\Penelitian Mahasiswa UTND\2016\Rizka Habibah\ot.kin

Time Course Graph

0,4430

0,4420
Abs

0,4410

0,4400

0,4390

0,4380
0,00 5,00 10,00 15,00 20,00 25,00 30,00

Time (Minute )

Page 1 /1
 44

Lampiran 11. Kurva Kalibrasi Larutan Fero fenantrolin

Standard Table Report 13/04/2016 16:52:65 PM

FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Rizka Habibah\Kurva

Kalibrasi Fe Baru1.pho .

Standard curve
0.7000

0,6000

0,4000
Abs

0,2000

0,0000
0,000 1,000 2,000 3.000
3,000 3.200
Connc (mcg/ml)

Y = 0,18934 + 0,00259
r2 Correlation Coefficient = 0,9998
r2 Multiple Correlation Coefficient = 0,9991

Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL527.50 Wgt.Factor Comments
1 blanko Standard 0,000 0,0000 1,000
2 Titik 1 Standard 20,000 0,2150 1,000
3 Titik 2 Standard 30,000 0,3320 1,000
4 Titik 3 Standard 40,000 0,4425 1,000
5 Titik 4 Standard 50,000 0,5490 1,000
6 Titik 5 Standard 60,000 0,6475 1,000
7

Page 1 / 1
 45

Lampiran 12. Perhitungan Persamaan Garis Regresi Larutan Baku Besi

Konsentras Absorbans
X2 Y2 XY
STD i (X) i (Y)
STD-1 0,00 0,000 0,0000 0,0000 0,0000
STD-2 1,20 0,227 1,4400 0,0515 0,2724
STD-3 1,60 0,314 2,5600 0,0986 0,5024
STD-4 2,00 0,379 4,0000 0,1436 0,7580
STD-5 2,40 0,464 5,7600 0,2153 1,1136
STD-6 2,80 0,525 7,8400 0,2756 1,4700
STD-7 3,20 0,608 10,2400 0,3697 1,9456
Σ Y2
ΣX ΣY Σ X2 = Σ XY
= 13,20 = 2,5170 = 31,8400 1,1544 = 6,0620
Rata-rata = 1,6667 = 0,31817

∑ XY −¿ (∑ X )( ∑ Y ) /n ¿
a =
∑ x2 −¿ ( ∑ X ) 2 ¿

∑ XY −¿ (∑ X )(∑ Y ) /n ¿
a =
∑ x2 −¿ ( ∑ X ) 2 ¿
6,062−( 13,200 ) x(2,517)/7
a =
31,840−( 13,20 ) 2/7
1,3157
a =
6,9486
= 0,1893

b = Y- aX
b = 0,3182 - (0,1893 x 0,0018)
= 0,00259
Persamaan garis regresi: Y = aX + b
Persamaan garis regresi: Y = 0,189342X + 0,002596

Perhitungan korelasi:

r=
6,0620−(13,20 x 2,5170)/7
r =
√¿¿

6,0620−5,5374
r =
√2,80 x 0,09847
 46

0,5246
r = 0,52451 = 0,9991
Lampiran 13.Contoh Perhitungan Kadar Besi Di Dalam Sampel Daun Bayam
Hijau

Diambil contoh data dari sampel daun bayam hijau mentah

Ditimbang sampel = 130,0000g

Dilarutkan sampai 100 ml, dipipet 3,00 ml diencerkan dalam sampai 50 ml

Diukur absorbansi nya diperoleh : A = 0,409

Persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi:

Y = 0,18934 X + 0,00259

0,409−0,00259
Konsentrasi perolehan besi(X) = = 2,146 μg/ml
0,18934
Kadar besi yang diperoleh (mg/100g bahan)

Kons. besi perolehan(µg/ml) x Vol .larutan sampel(ml)

= x pengenceran x 100
Bobot sampel yang ditimbang ( mg ) x 1000

2,146 µg /ml x 100 ml 50,00 ml

= x x 100 = 2,752 mg/100g
( 130,0025 x 1000 ) 3,00 ml

Dengan cara yang sama dihitung kadar besi untuk pengulangan pekerjaan

6 kali dan untuk sampel lainnya. Data dan hasil perhitungan selengkapnya dapat

dilihat pada Lampiran 17.

 47

Lampiran 14. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
Dalam Sampel Daun Bayam hijau Mentah

1. Perhitungan Standar Deviasi dan t hitung

Kadar besi
No.
(mg/100g)
X - X̄ ( X − X̄ )2
1. 2,752 -0,00449 0,00002
2. 2,772 0,01580 0,00025
3. 2,806 0,04964 0,00246
4. 2,725 -0,03160 0,00100
5. 2,718 -0,03837 0,00147
6. 2,765 0,00902 0,00008
∑X = 16,538 mg/100g
N=6
X̄ = 2,756 mg/100g ∑ ( X − X̄ )2 = 0,00529
Standar deviasi (SD) =√ ∑ ¿ ¿ ¿ ¿

Standar deviasi (SD) =

√ 0,00529
5
= 0,033

Dasar penolakan data adalah apabila thitung > ttabel dengan tingkat kepercayaan 99%
α = 0,01; n = 6, dk = 5 dan ttabel = 4,032

| X−X| |2,752−2,756|
0,00449
1. thitung = SD = 0,033 = = 0,338
0,01328
√n √6
| X−X| |2,772−2,756|
0,01580
2. thitung = SD = 0,033 = = 1,190
0,01328
√n √6
| X−X| |2,806−2,756|
0,04964
3. thitung = SD = 0,033 = = 3,739
0,01328
√n √6
| X−X| |2,725−2,756|
0,03160
4. thitung = SD = 0,033 = = 2,380
0,01328
√n √6
| X−X| |2,718−2,756|
0,03837
5. thitung = SD = 0,033 = = 2,890
0,01328
√n √6
 48

| X−X| |2,785−2,756|
0,00902
6. thitung = SD = 0,033 = = 0,679
0,01328
√n √6
Seluruh thitung dari ke-6 perlakuan < ttabel, berarti semua data ini dapat diterima.
Lampiran 14. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
dalam Sampel Daun Bayam Hijau Mentah (Lanjutan)

2. Menghitung kadar besisebenarnya =

Std. Deviasi
Kadar besi rata-rata ± t (1 – ½ α.dk) x √n
Kadar besi rata-rata ( X̄ ) =2,756 mg/100g

Standar deviasi (SD) = 0,033

Sd
Kadar besi sebenarnya = X̄ ± t (1 – ½ α.dk) x √ 6
0,033
Kadar besisebenarnya =2,756 mg/100g ± 4,032 x
2,449
Kadar besisebenarnya = (2,756 ± 0,054) mg/100 g
 49

Lampiran 15. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
Dalam Sampel Daun Bayam Hijau Kukus

1. Perhitungan Standar Deviasi dan t hitung

Kadar besi
No.
(mg/100g)
X - X̄ ( X − X̄ )2
1. 2,745 0,01128 0,00013
2. 2,738 0,00453 0,00002
3. 2,738 0,00450 0,00002
4. 2,725 -0,00905 0,00008
5. 2,732 -0,00224 0,00001
6. 2,725 -0,00905 0,00008
∑X = 16,403 mg/100g
N=6
X̄ = 2,734 mg/100g ∑ ( X − X̄ )2 = 0,00034
Standar deviasi (SD) =√ ∑ ¿ ¿ ¿ ¿

Standar deviasi (SD) =

√ 0,00034
5
= 0,008

Dasar penolakan data adalah apabila thitung > ttabel dengan tingkat kepercayaan 99%

α = 0,01; n = 6, dk = 5 dan ttabel = 4,032

| X−X| |2,745−2,734|
0,01128
1. thitung = SD = 0,008 = = 3,369
0,00335
√n √6
| X−X| |2,738−2,734|
0,00453
2. thitung = SD = 0,008 = = 1,352
0,00335
√n √6
| X−X| |2,738−2,734|
0,00450
3. thitung = SD = 0,008 = = 1,343
0,00335
√n √6
| X−X| |2,725−2,734|
0,00905
4. thitung = SD = 0,008 = = 2,702
0,00335
√n √6
| X−X| |2,732−2,734|
0,00224
5. thitung = SD = 0,008 = = 0,670
0,00335
√n √6
| X−X| |2,725−2,734|
0,00905
6. thitung = SD = 0,008 = = 2,702
0,00335
√n √6
 50

Seluruh thitung dari ke-6 perlakuan < ttabel, berarti semua data ini dapat diterima.
Lampiran 15. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
dalam Sampel Daun Bayam Hijau Kukus (Lanjutan)

1. Menghitung kadar besi sebenarnya =

Std. Deviasi
Kadar besi rata-rata ± t (1 – ½ α.dk) x √n
Kadar besi rata-rata ( X̄ ) = 2,734 mg/100g

Standar deviasi (SD) = 0,008

Sd
Kadar besi sebenarnya = X̄ ± t (1 – ½ α.dk) x √ 6
0,008
Kadar besi sebenarnya = 2,734mg/100g ± 4,032 x
2,449
Kadar besi sebenarnya = (2,734± 0,013) mg/100 g
 51

Lampiran 16. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
Dalam Sampel Daun Bayam Hijau Rebus

2. Perhitungan Standar Deviasi dan t hitung

Kadar besi
No.
(mg/100g)
X - X̄ ( X − X̄ )2
1. 1,014 0,00948 0,00009
2. 1,009 0,00406 0,00002
3. 0,998 -0,00677 0,00005
4. 1,006 0,00135 0,00000
5. 1,003 -0,00136 0,00000
6. 0,998 -0,00677 0,00005
∑X = 6,028 mg/100g
N=6
X̄ = 1,005 mg/100g ∑ ( X − X̄ )2 = 0,00020
Standar deviasi (SD) =√ ∑ ¿ ¿ ¿ ¿

Standar deviasi (SD) =

√ 0,00020
5
= 0,006

Dasar penolakan data adalah apabila thitung > ttabel dengan tingkat kepercayaan 99%
α = 0,01; n = 6, dk = 5 dan ttabel = 4,032

| X−X| |1,014−1,005|
0,00958
1. thitung = SD = 0,006 = = 3,656
0,00259
√n √6
| X−X| |1,009−1,005|
0,00406
2. thitung = SD = 0,006 = = 1,567
0,00259
√n √6
| X−X| |0,998−0,517|
0,00677
3. thitung = SD = 0,006 = = 2,610
0,00259
√n √6
| X−X| |1,006−1,005|
0,00135
4. thitung = SD = 0,006 = = 0,521
0,00259
√n √6
| X−X| |1,003−1,005|
0,00136
5. thitung = SD = 0,006 = = 0,524
0,00259
√n √6
 52

| X−X| |0,998−0,517|
0,00677
6. thitung = SD = 0,006 = = 3,610
0,00259
√n √6

Seluruh thitung dari ke-6 perlakuan < ttabel, berarti semua data ini dapat diterima.
Lampiran 16. Perhitungan Data Secara Statistik Hasil Penetapan Kadar Besi Di
dalam Sampel Daun Bayam hijau Rebus (Lanjutan)

2. Menghitung kadar besi sebenarnya =

Std. Deviasi
Kadar besi rata-rata ± t (1 – ½ α.dk) x √n
Kadar besi rata-rata ( X̄ ) = 1,005 mg/100g

Standar deviasi (SD) = 0,007

Sd
Kadar besi sebenarnya = X̄ ± t (1 – ½ α.dk) x √ 6
0,006
Kadar besisebenarnya = 1,005 mg/100g ± 4,032 x
2,449
Kadar besi sebenarnya = (1,005 ± 0,010) mg/100 g
 53

Lampiran 17. Data Hasil Penetapan Kadar Besi Di Dalam Sampel Daun Bayam
Hijau

Berat Faktor Absor Perolehan

Kadar besi
Sampel sampel Pengen bansi konsentrasi
(mg//100g)
(g) ceran (X) besi (µg//ml)
130,0000 50 ml/3 ml 0,409 2,146 2,752
130,0010 50 ml/3 ml 0,412 2,162 2,772
1.
130,0015 50 ml/3 ml 0,417 2,189 2,806
Daun bayam
hijau 130,0010 50 ml/3 ml 0,405 2,125 2,725
mentah 130,0010 50 ml/3 ml 0,404 2,120 2,718
130,0015 50 ml/3 ml 0,411 2,157 2,765
Kadar rata-rata besi di dalam sampel = 2,756 mg/100g
Standar deviasi = 0,033
Kadar besi sebenarnya di dalam sampel = (2,756 ± 0,054) mg/100g
130,0010 50 ml/3 ml 0,408 2,141 2,745
130,0010 50 ml/3 ml 0,407 2,136 2,738
2. 130,0015 50 ml/3 ml 0,407 2,136 2,738
Daun bayam
130,0015 50 ml/3 ml 0,405 2,125 2,725
hijau kukus
130,0000 50 ml/3 ml 0,406 2,131 2,732
130,0000 50 ml/3 ml 0,405 2,125 2,725
Kadar rata-rata besi di dalam sampel = 2,734 mg/100g
Standar deviasi = 0,008
Kadar besi sebenarnya di dalam sampel = (2,734 ± 0,013) mg/100g
130,0005 50 ml/7,5 ml 0,377 1,977 1,014
130,0005 50 ml/7,5 ml 0,375 1,967 1,009
3. 130,0000 50 ml/7,5 ml 0,371 1,946 0,998
Daun bayam
130,0010 50 ml/7,5 ml 0,374 1,962 1,006
hijau rebus
130,0010 50 ml/7,5 ml 0,373 1,956 1,003
130,0000 50 ml/7,5 ml 0,371 1,946 0,998
Kadar rata-rata besi di dalam sampel = 1,005 mg/100g
Standar deviasi = 0,006
Kadar besi sebenarnya di dalam sampel = (1,005 ± 0,010) mg/100g
 54

Lampiran 18. Uji ANAVA dan BNT

Uji Analisa Varian (ANAVA) dilakukan untuk melihat perbedaan

perolehan kadar besi yang ditentukan pada sampel daun bayam hijau yang masih

mentah, yang telah direbus dan yang telah dikukus.

Formulasi Hipotesis

1. Taraf nyata (α) dan nilaiF tabel

Perlakuan (k) = 3
Ulangan n1 = 6; n2 = 6; n3 = 6
Jumlah pengulangan (N) = 6 + 6 + 6 = 18
Derajat Bebas (DB) perlakuan (v1) = k -1 = 6 – 1 = 5
Derajat Bebas (DB) error (v2) = k (n –1) = 6 x (3 –1) = 12
Pada tabel uji F (5;12), 1% = 5,06 ; 5% = 3,11

2. Kriteria Pengujian
Apabila F- hitung lebih kecil dari F uji, kesimpulannya tidak berbeda.
Bila lebih kecil dari 3,11 tidak berbeda nyata
Bila lebih besar dari 5,06 berbeda sangat nyata
Bila lebih kecil dari 5,06 dan lebih besar dari 3,11 berbeda nyata.

3. Analisa Varian
k=6
n1 = 6; n2 = 6; n3 = 6 ........> N = 18

Data perolehan kadarbesi sebagai berikut:

Kadar besi (mg/100g)
Sampel Uji Ulangan Total Rata - (T)2
1 2 3 4 5 6 (T) rata
Daun bayam
2,71
hijau 2,752 2,772 2,806 2,725 2,765 16,538 2,756 273,51
8
mentah
Daun bayam 2,73
2,745 2,738 2,738 2,725 2,725 16,403 2,734 269,05
hijau kukus 2
Daun bayam 1,00
1,014 1,009 0,998 1,006 0,998 6,028 1,005 36,33
hijau rebus 3
JUMLAH 38,968 6,495 578,893
 55

Lampiran 18. Uji ANAVA dan BNT (Lanjutan)

(Jumlah T)2 = (38,97)2 = 1.518,54

( Jumlah T )2 1.518,54
Faktor koreksi (FK) = = = 84,36
Jumlah replikasi ( N) 18
Jumlah (Replikasi)²
= {(2,752)2 + (2,772)2 + (2,806)2 + (2,725)2 + (2,718)2 + (2,765)2 + (2,745)2 +
(2,738)2 + (2,738)2 + (2,725)2 + (2,732)2 + (2,725)2 + (1,014)2 + (1,009)2 +
(0,998)2 + (1,06)2 + (1,003)2 + (0,998)2
= 96,488

Jumlah Kuadarat Total (JKT) = Jumlah (Replikasi)2- FK

= 96,488– 84,36= 12,125

Jumlah(T )2
Jumlah Koreksi Kolom (JKK) = - FK
replikasi
578,893
= - 84,36 = 12,119
6

Jumlah Koreksi Eror (JKE) = JKT - JKK = 12,125– 12,119 = 0,006

Tabel ANOVA: Analisa sidik ragam dengan uji F

F Tabel
SK JK DB RK F0
5% 1%
Rata- rata kolom 12,119 5 2,42374
Error 0,006 18 0,00032 7490,98 5,06 3,11
Total 12,125 23 2,42406

Kesimpulan:

Oleh karena F0 = 7490,98> F 5% (5,30) = 5,06 dan F 1% (5,30) = 3,11,

maka terdapat perbedaan yang sangat signifikan perolehan kadar besi di antara

sampel daun bayam hijau bayam hijau, daun bayam hijau yang telah direbus, dan

daun bayam hijau yang telahdikukus. Selanjutnya dilakukan uji BNT (Beda Nyata

Terkecil).
 56

Lampiran 18. Uji ANAVA dan BNT (Lanjutan)

Perhitungan Uji beda nyata tekecil (BNT) sebagai berikut:

Kuadrat Total Galat ( KTG) = Error yang diperoleh dari uji ANAVA = 0,00032
Jumlah perlakuan (v) = 18, Replikasi (r) = 6
Di tabel dapat dilihat: t 0,05 (18) = 2,101
t 0,01 (18) = 2,878

√
2 KTG
Sd = r = √ 2(0,00032 )
6 = 0,00104
BNT 0,05 = 2,101 x 0,00104 = 0,0218
BNT 0,01 = 2,878 x 0,00104 = 0,0299

Bila hasil perhitungan lebih kecil dari tabel BNT, maka disimpulkan terdapat
perbedaan yang nyata kadar besi di antara sampel daun bayam hijau yang diuji.
Diperoleh hasil sebagai berikut:
Beda dengan
Kadar besi rata-rata Daun bayam
Sampel Daun bayam
(mg/100 g) hijau bayam
hijau kukus
hijau
Daun bayam hijau
- -
mentah 2,7564
Daun bayam hijau
0,0226 -
kukus 2,7338
Daun bayam hijau
1,7518 1,7292
rebus 1,0046
BNT 0,05 = 0,0218 BNT 0,01 = 0,0299
Kesimpulan:

1. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih mentah lebih tinggi
dibandingkan dengan daun bayam hijau yang telah dikukus, tetapi tidak
terdapat perbedaan yang nyata
2. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang masih mentah lebih tinggi
dibandingkan dengan yang telah direbus, dan berbeda sangat nyata
3. Kadar besi di dalam daun bayam hijau yang telah dikukus lebih tinggi
dibandingkan dengan daun bayam hijau yang telah direbus, dan terdapat
 57

perbedaan yang sangat nyata

Lampiran 19. Perhitungan Analit Dan Bahan Baku Untuk Uji Persen Recovery

Diambil data dari sampel daun bayam hijau yang masih bayam hijau
Uji recovery dilakukan dengan 3 rentang spesifik: 80%, 100%, dan 120%
Tiap rentang terdiri dari campuran 70% analit dan 30% baku
Dipersiapkan larutan baku fero (II) amonium sulfat setara dengan konsentrasi besi
(Fe) = 1 mg/ml
Kadar fero (II) amonium sulfat yang diperoleh = 99,61 %
BM Fe (II) amonium sulfat = 392,14 BA Fe = 56
Ditimbang fero (II) amonium sulfat setara dengan 100 mg Fe (II), maka Fero (II)
amonium sulfat yang ditimbang:
BM Fe ( II ) Amonium sulfat
= x kemurnian x bobot yang diinginkan
B A Fe ( II )
392,14 100
= x x 100 mg = 702,99 mg
56 99,61
Dilarutkan sampai 100 ml, maka diperoleh larutan besi (Fe) baku dengan
100 mg
konsentrasi besi = = 1 mg/ml
100 ml

Rentang spesifik 80%

Diperhitungkan bobot daun bayam hijau yang ditimbang setara dengan 5,00 mg

besi

80
Besi 80% = x 5,0 mg = 4,00 mg
100
70
Analit (besi dalam sampel) 70 % = x 4,00 mg = 2,800 mg
100
30
Besi baku 30 % = x 4,00 mg = 12,00 mg
100
Kadar besi yang diperoleh pada hasil penetapan kadar = 2,756 mg/100g
Sampel ditimbang setara dengan 2,80 mg besi =

Bobot setara besi yang ditimbang(mg)

x Bobot sampel (g)
Bobot besi di dalam sampel (mg)
2,800 mg
= x 100 g = 101,5965 g
2,756 mg
 58

Besi baku yang ditambahkan = 1,20 mg. Dipipet sebanyak 1,20 ml dari larutan
baku Fe (II) amonium sulfat setara dengan dengan besi konsentrasi = 1 mg/ml
Rentang spesifik 100%

Diperhitungkan bobot daun bayam hijau yang ditimbang setara dengan 5,00 mg
besi
100
Besi 80% = x 5,0 mg = 5,00 mg
100
70
Analit (besi dalam sampel) 70 % = x 5,00 mg = 3,500 mg
100
30
Besi baku 30 % = x 5,00 mg = 1,50 mg
100
Kadar besi yang diperoleh pada hasil penetapan kadar = 2,756 mg/100g
Sampel ditimbang setara dengan 3,50 mg besi =

Bobot setara besi yang ditimbang(mg)

x Bobot sampel (g)
Bobot besi di dalam sampel (mg)
3,500 mg
= x 100 g = 126,0056 g
2,756 mg

Besi baku yang ditambahkan = 1,50 mg. Dipipet sebanyak 1,50 ml dari larutan
baku Fe (II) amonium sulfat setara dengan dengan besi konsentrasi = 1 mg/ml

Rentang spesifik 120%

Diperhitungkan bobot daun bayam hijau yang ditimbang setara dengan 5,00 mg
besi
120
Besi 80% = x 5,0 mg = 6,00 mg
100
70
Analit (besi dalam sampel) 70 % = x 6,00 mg = 4,200 mg
100
30
Besi baku 30 % = x 6,000 mg = 1,80 mg
100
Kadar besi yang diperoleh pada hasil penetapan kadar = 2,756 mg/100g
Sampel ditimbang setara dengan 4,200 mg besi =

Bobot setara besi yang ditimbang(mg)

x Bobot sampel (g)
Bobot besi di dalam sampel (mg)
4,200 mg
= x 100 g = 152,3948 g
2,756 mg
 59

Besi baku yang ditambahkan = 1,80 mg. Dipipet sebanyak 1,80 ml dari larutan
baku Fe (II) amonium sulfat setara dengan dengan besi konsentrasi = 1 mg/ml

Masing- masing campuran rentang 80%, 100%, dan 120%, Dikerjakan

penetapan kadar besi dengan cara kerja yang sama dengan penetapan kadar besi di

dalam sampel untuk masing masing sebelum dan setelah ditambahkan larutan fero

(II) amonium sulfat baku yaitu setelah dipreparasi secara destruksi basah,

dilarutkan sampai 100 ml.

Kemudian dipipet 2 ml ditambahkan 2 ml HCl (p) dan 2 ml hidroksilamin

dididihkan pada suhu 60-70°C dan dipindahkan secara kuantitatif ke labu tentukur

50 ml dan ditambahkan 5 ml larutan buffer asetat dan 2 ml o-fenantrolin

dicukupkan dengan akuades sampai garis tanda. Selanjutnya dibiarkan beberapa

menit sesuai waktu kerja, diukur pada panjang gelombang maksimum. Dikerjakan

dengan cara yang sama sebelum dan setelah ditambahkan baku fero (II) amonium

sulfat. Dihitung persen recovery besi menggunakan rumus:

Persen recovery:

Bobot perolehan besi ( mg ) (setelah di +baku−sebelum di +baku)

= x 100%
Bobot besi yang ditambahkan(mg)
 60

Lampiran 20. Contoh Perhitungan Persen Recovery

Diambil sebagai contoh data dari rentang 80%

1. Sebelum penambahan baku

Sampel yang telah ditimbang setara dengan 2,80 mg besi dilarutkan sampai
volume = 100 ml. Dipipet 2,00 ml diencerkan sampai 50 ml
Persamaan regresi yang diperoleh dari kurva kalibrasi:Y= 0,18934X + 0,00259
Absorbansi yang diperoleh sebelum ditambah baku = 0,216
0,216−0,00259
Konsentrasi perolehan besi (X) = = 1,127 μg/ml
0,18934
Bobot Besi sebelum ditambah baku :
1,127 μg /ml x 100 ml 50 ml
= x = 2,82 mg
1000 2,0 ml

2. Setelah penambahan baku

Sampel yang telah ditimbang setara dengan 2,80 mg besi, ditambahkan baku
setara dengan 1,20 mg besi, dilarutkan sampai volume = 100 ml. Dipipet
sebanyak 2,00 ml diencerkan sampai 50 ml
Absorbansi yang diperoleh setelah ditambah baku = 0,308
0,308−0,00259
Konsentrasi perolehan besi (X) = = 1,613 μg/ml
0,18934
Bobot Besi setelah ditambah baku:
1,613 μg /ml x 100 ml 50 ml
= x = 4,03 mg
1000 2,0 ml

Larutan baku Fe (II) amonium sulfat ditambahkan setara dengan 1,20 mg besi

Persen recovery:

Bobot perolehan besi ( mg ) (setelah di +baku−sebelum di +baku)

= x 100%
Bobot besi yang ditambahkan(mg)

4,03 mg−2,82 mg
= x 100% = 101,23 %
1,2 mg

Dihitung dengan cara yang sama untuk replikasi masing-masing rentang 3 kali,

sehingga berjumlah 9 kali. Data hasil perhitungan dapat dilihat pada Lampiran 21
 61

Lampiran 21.Data Dan Hasil Perhitungan Persen Recovery Besi

Sebelum ditambahkan baku Setelah ditambahkan baku

Besibaku
Ren Konsn Konsn Persen
Bobot Bobot yang
tang trasi besi trasi recoveri
Absor besi yang Absor besi yang ditambah
spesifik yang besiyang (%)
bansi diperoleh bansi diperoleh kan (mg)
diperoleh diperoleh
(mg) (mg)
(µg/ml) (µg/ml)

0,216 1,127 2,82 0,308 1,613 4,03 1,20 101,23

80%
0,215 1,122 2,80 0,307 1,608 4,02 1,20 101,23

0,217 1,132 2,83 0,307 1,608 4,02 1,20 99,03

0,267 1,396 3,49 0,381 1,999 5,00 1,50 100,35

100%
0,268 1,402 3,50 0,383 2,009 5,02 1,50 101,23

0,269 1,407 3,52 0,382 2,004 5,01 1,50 99,47

0,321 1,682 4,20 0,459 2,411 6,03 1,80 101,23

120%
0,322 1,687 4,22 0,457 2,400 6,00 1,80 99,03

0,322 1,687 4,22 0,457 2,400 6,00 1,80 99,03

Persen recovery rata-rata = 100,20

Standar deviasi = 1,06
Standar deviasi
Relatif standar deviasi (% RSD) = x 100%
Persen recovery rata−rata

1,06
Relatif standar deviasi (% RSD) = x 100% = 1,05%
100,20

Persen recovery besi yang diperoleh adalah 100,20% dengan nilai presisi (% RSD

= 1,05%). Menurut Harmita (2004), bahwa uji perolehan kembali dapat diterima

bila berada pada rentang 98%-10 2%, sehingga dapat disimpulkan bahwa metode

spektrofotometri sinar tampak dengan pereeaksi ortofenantrolin setelah

 62

penambahan hidroksilamin dalam suasana asam memberikan hasil yang akurat

untuk penetapan kadar besi di dalam sampel daun bayam hijau. Relatif standar

deviasi (% RSD) diperoleh di bawah 1,05% (di bawah 2,50%), maka dapat

disimpulkan pekerjaan yang dilakukan teliti.

 63

Lampiran 22. Perhitungan LOD dan LOQ Pada Penentuan Kadar Besi Secara
Spektrofotometri Sinar Tampak

Persamaan garis regresi: Y = 0,18934 X + 0,00259

Konsentrasi Hasil
N Absorbansi
Standar (X) perhitungan Y- Yi (Y - Yi)2
O (Y)
µg/ml (Yi)
1 0,000 0,000 -0,00259 0,003 0,000007
2 1,200 0,227 0,22462 0,002 0,000006
3 1,600 0,314 0,30035 0,014 0,000186
4 2,000 0,379 0,37609 0,003 0,000008
5 2,400 0,464 0,45183 0,012 0,000148
6 2,800 0,525 0,52756 -0,003 0,000007
∑ (Y −Yi )2 = 0,000362

√
2
(Y −Yi)
SY/X =
n−2

=
√ 0,000362
6−2
= √ 0,0000905
= 0,0095
3 x S Y / X❑
LOD =
Slop
3 x 0,0095
= = 0,151 µg/ml
0,18934
10 x S Y / X ❑
LOQ =
Slop
10 x 0,0095
= = 0,502 µg/ml
0,18934

Kesimpulan: Metode spektrofotometri sinar tampak yang digunakan dan

perlakuan pengukuran yang dilakukan sangat baik karena

perolehan konsentrasi besi hasil pengukuran pada penetapan

kadar besi di dalam sampel yang diuji seluruhnya berada di atas

harga LOQ (di atas 0,502µg/ml).

 64

Lampiran 23. Hasil Pengukuran Absorbansi Sampel Daun Bayam hijau Bayam
hijau

Standard Table Report 26/04/2015 12:37.59

` FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Habibah\Bayam

Mentah.pho .

Sample Graph

2,250

2,200
Conc. (mg/l)

2,150

2,100

2,050
1 2 3 4 5 6

Squence No.
Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 2,146 0,409
2 Sampel 2 Unknown 2,162 0,412
3 Sampel 3 Unknown 2,189 0,417
4 Sampel 4 Unknown 2,125 0,405
5 Sampel 5 Unknown 2,120 0,404
6 Sampel 6 Unknown 2,157 0,411
7

Page 1 / 1
 65

Lampiran 24. Hasil Pengukuran Absorbansi Sampel Daun Bayam hijau Kukus

Standard Table Report 23/04/2015 15:54:41

` FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Habibah\Bayam

Kukus.pho .

Sample Graph

2,300

2,200
Conc. (mg/l)

2,100

2,000
1 2 3 4 5 6

Squence No.
Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 2,141 0,408
2 Sampel 2 Unknown 2,136 0,407
3 Sampel 3 Unknown 2,136 0,407
4 Sampel 4 Unknown 2,125 0,405
5 Sampel 5 Unknown 2,131 0,406
6 Sampel 6 Unknown 2,125 0,405
7

Page 1 / 1
 66

Lampiran 25. Hasil Pengukuran Absorbansi Sampel Daun Bayam hijau Rebus

Standard Table Report 26/04/2015 18:06:06

` FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Habibah\Bayam

Rebus.pho .

Sample Graph

2,050

2,000
Conc. (mg/l)

1,950

1,900
1 2 3 4 5 6

Squence No.
Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 1,977 0,377
2 Sampel 2 Unknown 1,967 0,375
3 Sampel 3 Unknown 1,946 0,371
4 Sampel 4 Unknown 1,962 0,374
5 Sampel 5 Unknown 1,956 0,373
6 Sampel 6 Unknown 1,946 0,371
7

Page 1 / 1
 67

Lampiran 26. Hasil Pengukuran Absorbansi Pada Penentuan Recovery Besi

Rentang 80% Pada Sampel Daun Bayam hijau Bayam hijau

Standard Table Report 02/05/2015 13:42:12

FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Rizka

Habibah\Validasi Rentang 80%.pho .

Sample Graph

1,800

1,600
Conc. (mg/l)

1,400

1,200

1,000
1 2 3 4 5 6

Squence No.

Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 1,127 0,216
2 Sampel 2 Unknown 1,122 0,215
3 Sampel 3 Unknown 1,132 0,217
4 Sampel 4 Unknown 1,613 0,308
5 Sampel 5 Unknown 1,608 0,307
6 Sampel 6 Unknown 1,608 0,307
7

Page 1 / 1
 68

Lampiran 27. Hasil Pengukuran Absorbansi Pada Penentuan Recovery Besi

Rentang 100% Pada Sampel Daun Bayam hijau Bayam hijau

Standard Table Report 03/05/2015 10:49:23

FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Taufik\Validasi\Validasi

Rentang 100%.pho .

Sample Graph

2,200

1,900
Conc. (mg/l)

1,600

1,300

1,000
1 2 3 4 5 6

Squence No.

Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 1,407 0,269
2 Sampel 2 Unknown 1,412 0,270
3 Sampel 3 Unknown 1,402 0,268
4 Sampel 4 Unknown 1,993 0,380
5 Sampel 5 Unknown 2,009 0,383
6 Sampel 6 Unknown 1,999 0,381
7

Page 1 / 1
 69

Lampiran 28. Hasil Pengukuran Absorbansi Pada Penentuan Recovery Besi

Rentang 120% Pada Sampel Daun Bayam hijau Bayam hijau

Standard Table Report 03/05/2015 10:38:00

FILE NAME :C:\ Program Files\Shimadzu\UVProbe\Data\Penelitian\2016\Rizka

Habibah\Validasi Rentang 120%.pho .

Sample Graph

2,600

2,300
Conc. (mg/l)

2,000

1,700

1,400
1 2 3 4 5 6

Squence No.

Sample Table
Sample ID Type Ex Conc WL510.0 Comments
1 Sampel 1 Unknown 1,682 0,321
2 Sampel 2 Unknown 1,687 0,322
3 Sampel 3 Unknown 1,687 0,322
4 Sampel 4 Unknown 2,411 0,459
5 Sampel 5 Unknown 2,400 0,457
6 Sampel 6 Unknown 2,400 0,457
7

Page 1 / 1
 70

Lampiran 29. Nilai Distribusi t