EXTRACCION DE RNA CON TRIZOL: Reactivos Trizol (en la puerta de la heladera) Cloroformo (en armario de RNA) Isopropanol (en

freezer de la heladera) Mortero Nitrogeno lquido Vasitos tergopol Etanol 75% fro (absoluto merck) Bistur Jeringa puncin Aguja puncin Formol 10% Frasquitos histolgicos Solucin fisiolgica Equipo de ciruga Hielo Uretano o eter Papel aluminio Agua miliQ esteril Colocar el Etanol 75% en el freezer. 1- Rotular los tubos adecuadamente y colocar 500 ul de Trizol. Pesar. 2- HOMOGENIZACION: Raspar el hgado congelado con el bistur, armar una tortita con Nitrgeno lquido y colocar en el tubo correspondiente (evitar que se formen grumos). Vorterear rpidamente. Pesar. Calcular los mg de tejido. Pesamos entre 40-60 mg de tejido y le agregamos la cantidad adecuada de Trizol (considerando 0.5 ml Trizol por 35 mg de tejido). Tomar 0.5 ml del homogenado y trasvasar a tubo nuevo. 3- SEPARACION DE FASES: Incubar 5 min a 15-30 C para permitir la completa disociacin de los complejos nucleoproteicos. Agregar 0,1 ml de Cloroformo a cada tubo (0,2 ml de cloroformo por 1 ml de trizol). Tapar correctamente los tubos. Agitar vigorosamente con la mano por 15 seg e incubar por 23 min a 15-30C. Centrifugar a no ms que 12000 g por 15 min a 2-8 C. Luego de la centrifugacin, las mezclas se separan en una fase inferior roja (fenol-cloroformo), una interfase y una fase superior incolora acuosa. El RNA permanece en la fase superior acuosa. El volumen de la fase superior es 0.3 mL, el 60% del volumen de trizol usado para la homogenizacin. 4- PRECIPITACION DEL RNA: Transferir la fase superior a un tubo nuevo. Agregar 0,75 ml alcohol isopropilico a cada tubo (1,5 ml de isopropilico por ml de trizol). Incubar a -20 C overnight. Centrifugar a no ms de 12000 g por 10 min a 4 C. 5- LAVADO DEL RNA: Remover el sobrenadante. Lavar el pellet de RNA una vez con 500 ul Etanol 75 % (adicionar al menos 1 ml de etanol por ml de trizol usado). Mezclar con vortex y centrifugar a no ms que 7500 g por 5 min a 2-8 C. 6- REDISOLUCION DEL RNA: secar brevemente el pellet al aire, 10 minutos. Es importante no dejar que el pellet se seque completamente, para evitar que disminuya su solubilidad. Las muestras de RNA parcialmente disueltas tiene una relacin Abs 260nm/ Abs 280nm < 1,6. Disolver (con pipeta cuidadosamente) el RNA en agua MQ (50 ul) e incubar por 10 min a 55-60 C. Centrifugar a 7500 g por 5 min. Trasvasar y fraccionar en tubos nuevos. Guardar a -70C.