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RB

Glu tpSSU:CrtI

nos

Glu

Psy

nos Ubi1

Pmi

nos LB

Figura 2. Constructos utilizados en la generacin del Arroz Dorado. RB, TDNA borde derecho del T-DNA; Glu, promotor de glutelina con patrn de expresin especfico del endospermo de arroz; tpSSU, pptido seal para localizacin cloroplstica de la pequea sub unidad de la ribulosa bis-fosfato carboxilasa de arveja; nos, terminador de la nopalina sintasa; Psy, fitoeno sintasa de Narcissus pseudonarcissus (GR1) Zea mays (GR2); Ubi1, promotor de poli ubiquitina de maz; Pmi, fosfomanosa isomerasa de E. coli para seleccin positiva; LB, T-DNA borde izquierdo del T-DNA.

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Pyruvate + Glyceraldehyde-3-phosphate DXS 1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate

Dimethylallyl-diphosphate + 3 Isopentenyl-diphosphate GGPPS Geranygeranyl-diphosphate PSY 15-15-Phytoene

CRTI

PDS
9,9-di-cis--Carotene

Vitamin E

ZDS
7,9,9,7-tetra-cis-Lycopene CRTISO All-trans-Lycopene -LCY -LCY, -LCY -Carotene -HYD Zeaxanthin -Carotene -HYD, -HYD Lutein

Figura 1. Biosntesis de caroteno y ingeniera gentica de la ruta metablica en el Arroz Dorado. DXS, 1-deoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa; GGPPS, geranilgeranil-difosfato sintasa; PSY, fitoeno sintasa; CRTI, caroteno desaturasa bacteriana; PDS, fitoeno desaturasa; ZDS, -caroteno desaturasa; CRTISO, caroteno cis-trans-isomerasa; LCY, licopeno ciclasa; HYD, caroteno hidroxilasa. En el Arroz Dorado fueron introducidos dos genes forneos para reconstituir la ruta biosinttica. Todas las demas enzimas estn presentes y activas en el grano de arroz. Los dos transgenes son Psy, de narciso (Narcissus pseudonarcissus) en GR1 maz (Zea mays) en GR2, y CrtI, de la bacteria Erwinia uredovora. CRTI reemplaza a PDS, ZDS and CRTISO. Contrario a las enzimas de origen vegetal, la desaturacin por CRTI procede va intermediarios con estructura alltrans.

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PDVA % aprox 400 g/d Bangladesh Camboya Indonesia Laos Mianmar Vietnam aprox 200 g/d Brunei Burkina Faso China Cuba Guinea Guinea-Bissau Guyana India Corea, DPR Corea, Rep Madagascar Malasia Nepal Filipinas Senegal Sierra Leone Sri Lanka Surinam Tailandia

ICD %

IVAD g/d

28 42 26 42 35 12

71 72 51 66 68 65

55.6 90.3 289 141 86.8 95.8

n.a. 46 12 n.a. 40 31 n.a. 57 n.a. n.a. 42 n.a. 33 23 61 47 n.a. n.a. 22

28 6 29 15 33 42 31 30 34 30 48 30 38 42 30 45 39 27 44

216 65.2 288 125 229 163 55.5 124 191 260 49.7 330 144 106 106 331 34.9 63.6 114

Tabla 1. Sociedades basadas en arroz, estatus de deficiencia e ingesta a de vitamina A partir de la dieta. Los pases han sido divididos en dos grupos, de acuerdo al consumo de arroz per cpita (consumo aproximado de 400 200 gramos de arroz por persona y da). PDVA, prevalencia sub clnica de deficiencia de vitamina A en nios menores de seis; ICD, ingesta calrica total diaria en base a arroz; IVAD, ingesta de vitamina A en base a la dieta. Fuentes: FAO, UNICEF y USDA. La ingesta diaria de retinol recomendada para nios es de 300 g por da.

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- 13 El Arroz Dorado ha pasado ya a travs de muchas pruebas de invernadero y ensayos de campo. El proceso de introgresin con variedades localmente adaptadas est muy avanzado en las Filipinas, en la India, y en Vietnam. Ensayos de biodisponibilidad indican que el beta caroteno del Arroz Dorado se convierte en vitamina A a niveles mejores que los esperados. Aunque las instituciones implicadas estn trabajando de comn acuerdo con los reguladores, an podramos estar a varios aos del uso extenso de esta tecnologa con valor humanitario. En todo caso, se espera que al final prevalecer el pragmatismo y que los costos sern menores que para los cultivos comerciales, como el algodn Bt (Ramaswami y Pray, 2007). Despus de todo, ms de 20 aos de experiencia con cultivos genticamente modificados y que ya cubren ms de 100 millones de hectreas a nivel mundial (Clive, 2006) no han dado lugar a un solo accidente que haya causado dao a la salud o al ambiente. Millares de experimentos de bioseguridad cuidadosamente conducidos y realizados por instituciones de alto prestigio concluyen que no hay riesgo especfico asociado a la tecnologa ms all del inherente al mejoramiento vegetal convencional o a la evolucin natural. Adems, los ecologistas han concluido que la tecnologa del Arroz Dorado no plantea ningn riesgo concebible para el medio ambiente, pues no proporciona ninguna ventaja selectiva adicional al cultivo. El llamado a la creacin de regmenes regulatorios basados sobre la experiencia y el dictado de la ciencia recibe apoyo adicional de un sinnmero de estudios socioeconmicos realizados para predecir el posible impacto de la adopcin del Arroz Dorado. Un informe del Banco Mundial concluy que la adopcin del Arroz Dorado podra mejorar el bienestar en los pases del sudeste asitico por un valor estimado de varios miles de millones de dlares anualmente (Anderson y otros, 2004). Las mejoras de la salud a nivel de la poblacin y la ventaja econmica que esto significara para el pas, seran muchsimo ms grandes que el impacto negativo que la adopcin de la tecnologa transgnica podra tener sobre el comercio debido a restricciones en las importaciones de cultivos transgnicos. De todos modos, en la mayora de los pases en vas de desarrollo, la mayor parte de la produccin de arroz y de otros cultivos se consume localmente (Binenbaum y otros, 2000). En la India y en Bangladesh, ms del 50 por ciento de las muertes de nios menores de cinco podran ser evitadas si el Arroz Dorado fuese adoptado a gran escala (Stein y otros, 2007; Stein y otros, 2006; Zimmermann y Ahmed, 2006; Zimmermann y Qaim, 2004). La recuperacin de la inversin para esta intervencin sera rpida y los costos de mantenimiento mnimos comparados a las intervenciones actuales. Si a esto aadimos los otros cultivos biofortificados a los que haca mencin anteriormente, podramos casi erradicar no slo un foco importante de malnutricin sino romper posiblemente el ciclo vicioso de la pobreza.

- 12 mejorada cocinando las zanahorias y sirvindolas con un poco de aceite (Jayarajan y otros, 1980; Roodenburg y otros, 2000). El cocido generalmente tiene un efecto positivo sobre la biodisponibilidad, y la retencin de carotenoides es alta, como fue demostrado para el camote (Ipomoea batatas) de color naranja (van Jaarsveld y otros, 2005). Un descubrimiento ms reciente es el caso de la coliflor de color naranja, la cual se encuentra ya disponible en el comercio (Brassica oleracea var botrytis). Esta mutacin semi dominante se debe a la insercin de un retrotransposn en el alelo Or (Or de orange) (Lu y otros, 2006). Aunque el rol de este alelo no se conoce totalmente, parece estar implicado en la diferenciacin de proplstidos y otros plstidos sin color a cromoplastos acumuladores de carotenoides. Antes que ejercer una influencia en la biosntesis de carotenoides, Or acta probablemente aumentando la capacidad de secuestramiento de carotenoides. El principio es transferible, como ya fue demostrado a travs de la generacin de papas amarillas expresando el gen Or por transgnesis (Lu y otros, 2006). Desgraciadamente, esta tecnologa por el momento tiene la limitante que las plantas homocigotas no son viables, probablemente a causa de efectos pleiotrpicos. PERSPECTIVAS DORADAS Existe voluntad para explotar el potencial de la biotecnologa verde en beneficio de los pobres en el mundo, tanto en el sector pblico y como en el privado. Sin embargo, sin un enfoque ms realista de los riesgos percibidos en esta tecnologa, los fondos para la investigacin pblica no sern suficientes para sacar provecho de las bondades de la biotecnologa para la gente de escasos recursos. Bajo la interpretacin extrema del principio precautorio, el progreso cientfico no podr culminar en el desarrollo de productos, y amplios sectores de la poblacin no se beneficiaran del gran potencial de la tecnologa. Ojal algunos pases afectados por DVA puedan lanzar variedades de Arroz Dorado localmente adaptadas dentro de pocos aos. Se espera poder lanzar las primeras variedades en el 2011, despus de haber pasado por el proceso regulatorio. Considerando que el Arroz Dorado podra reducir substancialmente la morbilidad y la mortalidad de millones de nios, no es fcil comprender por qu el proyecto no consigue una ayuda internacional ms decidida y que el proceso regulatorio se siga de forma acelerada. A pesar de que durante los ltimos 20 aos se ha acumulado una base extensa de conocimiento en cuanto a la produccin y la comercializacin de plantas genticamente modificadas, se tendrn que gastar cantidades substanciales de tiempo y de dinero para llevar a cabo los ensayos de bioseguridad requeridos. La aprobacin de una nueva lnea transgnica podra costar alrededor de US$4 millones para cumplir con todos los requisitos de toxicologa y alergenicidad, equivalencia bioqumica, efectos ambientales y otras pruebas, y si los reguladores no son sensatos, esto podra repetirse en cada pas donde se quiera introducir el Arroz Dorado (Ramaswami y Pray, 2007).

- 11 banano (Musa spp); http://www.ihbi.qut.edu.au/research/tropical/biofort/), la Universidad Estatal de Ohio, en yuca (Manihot esculenta) (http://www.biocassavaplus.org/), el Africa Biofortified Project, en sorgo (Sorghum bicolor) (http://www.supersorghum.org/), y la Universidad de Freiburg, en arroz (Oryza sativa) (http://www.goldenrice.org/Content5GCGH/GCGH1.html). El proyecto de la Universidad de Freiburg pretende mejorar el Arroz Dorado agregando genes que promovern la acumulacin del hierro, del cinc, de la vitamina E y de una protena de alta calidad alimenticia en el grano. Los otros consorcios mencionados estn persiguiendo metas similares, adems de combinaciones con genes de resistencia a patgenos y de adaptacin a otros estreses biticos y abiticos. En el 2007 se public un artculo sobre ingeniera gentica de la ruta biosinttica del folato en tomate (Daz de la Garza y otros, 2007), caracterstica que podra ser incorporada en algunos de los cultivos mencionados arriba. Como deca anteriormente, para el establecimiento de la biosntesis de carotenoides en cultivos y tejidos muy diversos (granos, races y frutas) ser necesario determinar la presencia o ausencia de genes biosintticos, metablicos y catablicos, caso por caso. Mientras que existen variedades de yuca y banano disponibles con alto contenido de carotenos (Chaves y otros, 2000; Englberger y otros, 2003; Englberger y otros, 2006; Iglesias et al., 1997), el problema en estos casos es que estos cultivos no se prestan al mejoramiento convencional, por la falta de sexualidad en el caso del banano, o por la alta heterocigocidad de la yuca, la cual usualmente se propaga por va vegetativa para poder mantener la caractersticas deseables de las variedades populares. Segn lo mencionado arriba, todos estos cultivos constituyen la base calrica en muchos pases en vas de desarrollo, donde reemplazan al arroz como fuente principal de alimento, y todos estos cultivos, al igual que el arroz, carecen de micronutrientes esenciales suficientes. Es alentador ver que la tecnologa del Arroz Dorado ha desempeado un papel cataltico para otros cultivos, y slo queda esperar que la gente necesitada pronto tenga acceso a una mejor nutricin gracias a estos proyectos y al apoyo de visionarios. JUEGOS NATURALES CON COLOR A veces, en la naturaleza, las mutaciones conducen a la activacin de la biosntesis de carotenoides en un rgano no carotenognico. Este es el caso de la zanahoria (Daucus carota), una planta originaria de Afganistn y trada inicialmente a Europa en varios colores, a excepcin del naranja. Zanahorias que contenan antocianinas de color prpura fueron inicialmente cultivadas en el Mediano y el Lejano Oriente, junto con versiones blancas, rojas, amarillas, verdes y negras. Los holandeses introdujeron una mutante anaranjada en honor a la casa real holandesa, Huis van Oranje-Nassau, en el siglo XVI. La mutacin que conduce a la acumulacin de beta caroteno a niveles de hasta 6 mg/g en base a peso seco de la raz, podra deberse a la segregacin de un inhibidor dominante desconocido (Buishand y Gabelman, 1979). Estas mutantes acumulan grandes cantidades de beta caroteno, aunque su biodisponibilidad es algo baja, ya que se deposita en forma cristalina. La biodisponibilidad puede ser

- 10 la lutena. Para esto se utiliz el mtodo de silenciamiento de RNA en el tubrculo (Diretto y otros, 2006). Utilizando esta metodologa se logr aumentar el contenido del beta caroteno 14 veces. Notablemente, los niveles de lutena no fueron reducidos en estos tubrculos, indicando que la epsilon LCY no es el factor limitante. Un mayor incremento en la produccin de carotenoides en papa fue obtenido introduciendo una mini ruta consistente en tres genes de Erwinia: la fitoeno sintasa (CrtB), la fitoeno desaturasa (CrtI), y la licopeno beta ciclasa (CrtY) (Diretto y otros, 2007). El contenido total de carotenoides aument 20 veces, mientras que el beta caroteno aument 3600 veces, es decir que lleg hasta un contenido de 47 g/g en base a peso seco. Inesperadamente, el fitoeno tambin permaneci alto en estas lneas, lo que sugiere que la desaturacin es el paso limitante, cosa que contrasta con lo encontrado en colza, donde la expresin de CrtI y de CrtB deja tan solo trazas de fitoeno (Ravanello y otros, 2003; Shewmaker y otros, 1999). Otra diferencia es que la expresin de CrtY no conduce a una mayor produccin total de carotenoides. En una colaboracin entre el Tata Energy Research Institute (TERI) y Monsanto en la India, mostaza hind (Brassica juncea), una fuente popular de aceite de cocina en la India, fue transformada con los genes bacterianos Psy y de CrtI usando la tecnologa de Monsanto desarrollada para la transformacin de colza (Brassica napus). La idea detrs de este enfoque es explotar la alta biodisponibilidad del beta caroteno en aceite y utilizar ste como un medio portador altamente eficaz. Actualmente este proyecto est a la espera de la conclusin de un estudio socioeconmico, antes de seguir adelante (Agricultural Biotechnology Support Project, 2003). De manera similar, en un proyecto para el frica financiado por USAID, la universidad estatal de Iowa est desarrollando un Maz Dorado (Zea mays) por medio de la introduccin de los genes bacterianos CrtB (fitoeno sintasa) y CrtI (caroteno desaturasa) (Rodermel y otros, 2006). Se han obtenido lneas capaces de acumular de 4-14 g/g de carotenoides en base a peso seco, lo que corresponde a un 50 por ciento del requerimiento medio estimado (EAR) de vitamina A recomendado para nios por USAID y HarvestPlus. Mientras que en arroz las opciones son limitadas por el hecho de que el embrin se pierde durante el proceso de pulido, en el caso del maz, la deposicin del caroteno se puede dirigir hacia el endospermo o el embrin. La ltima opcin podra facilitar la adopcin del Maz Dorado en regiones donde se prefieren variedades blancas, ya que el endospermo no cambiara de color. Adems, el embrin tiene una concentracin ms alta de lpidos, ofreciendo as un ambiente favorable para los carotenoides y hacindolo tambin ms biodisponible. En el 2005, la Fundacin Bill & Melinda Gates lanz su iniciativa Grand Challenges in Global Health. De los 44 proyectos que estn siendo financiados dentro de esa iniciativa, cuatro son del sector agrcola, y todos ellos trabajan en la biofortificacin de cultivos. Los cuatro proyectos han aceptado el desafo de mejorar la nutricin para promover la salud creando una gama completa de nutrientes biodisponibles en un solo cultivo.' El reto ha sido aceptado por cuatro consorcios internacionales: la Universidad Tecnolgica de Queensland, en

-9de un coordinador de la red, situado estratgicamente en el Instituto de Investigacin Internacional del Arroz (IRRI), en las Filipinas. Si no tomamos en cuenta la inversin en investigacin hecha por la compaa Syngenta, la inversin del sector pblico ha sido relativamente modesta hasta el momento ($2.4 millones durante nueve aos). El desarrollo de un producto comercializable, sin embargo, consume mucho tiempo y requiere de financiamiento adicional substancial. Los fondos necesarios para desarrollar un producto no provienen usualmente del sector pblico, ya que sta no es una acitividad tpica de investigacin acadmica sino un desarrollo comercial, de lo cual usualmente se encarga la industria. Adems, las universidades evalan a los investigadores basndose en la productividad cientfica, y no en productos comerciales. Los costos aumentan an ms dramticamente a la hora de satisfacer los requisitos regulatorios de bioseguridad. Pero una vez que una nueva variedad biofortificada ha sido aprobada y entregada a los agricultores, esta puede desarrollar todo su potencial, ya que la tecnologa est contenida en cada semilla y no requiere de inversin adicional. CULTIVOS DORADOS El logro del Arroz Dorado demuestra que a veces incluso vas metablicas complejas pueden ser reactivadas o reconstituidas, incluso en tejidos en que no se espera que puedan ser acumulados los metabolitos deseados. Este hecho tiene relevancia en el rea de produccin de productos farmacuticos en plantas (Ma y otros, 2005), pero en el contexto de la presente discusin es relevante para los que deseen mejorar la calidad alimenticia de los alimentos, especialmente en lo que respecta al enriquecimiento con micronutrientes. Algunas de las mejores fuentes calricas, ricas en almidones, carecen de cantidades adecuadas de micronutrientes, no slo carotenoides y otras vitaminas, sino tambin minerales y aminocidos esenciales. El Arroz Dorado ha servido como una prueba del concepto de biofortificacin por medio de la ingeniera gentica, y ha inspirado as a otros grupos de investigacin con objetivos similares. Pero mientras que el concepto como tal es transferible, cada cultivo requiere su propia modificacin, dependiendo de la presencia o ausencia de enzimas activas a lo largo de las vas metablicas y catablicas implicadas. La papa es uno de los cultivos ms importantes en el mundo, pero la mayora de los cultivares slo contiene trazas de beta caroteno. Mientras que la especie de papa silvestre Solanum phureja puede contener altos niveles de carotenoides, slo una pequea fraccin consiste de beta caroteno. Una solucin transgnica en este caso podra mejorar la calidad alimenticia de este importante cultivo. Esta hazaa ya ha sido lograda en papa (Solanum tuberosum) gracias a la participacin del laboratorio de Peter Beyer, uno de los inventores del Arroz Dorado. En un caso se obtuvo un aumento del beta caroteno bloqueando la expresin de la licopeno ciclasa (epsilon LCY), y evitando as que esta enzima lleve al licopeno por la rama del alfa caroteno y de

-8La ingesta diaria de vitamina A recomendada para nios de 1-3 aos es de 300 g (aunque la mitad es suficiente para mantener el nivel de vitamina A en la sangre a un nivel saludable) (Institute of Medicine, 2001). Basndonos sobre un cociente de equivalencia de retinol y beta caroteno de 12:1, la mitad de la ingesta diaria sera proporcionada en 72 g de GR2. Esto es perfectamente compatible con los niveles de consumo de arroz en los pases blanco, que estn alrededor de 100-200 g de arroz por nio por da. En principio se podra generar Arroz Dorado en muchas variedades por transformacin gentica de cada una de ellas, pero debido a los rigurosos requisitos regulatorios, la estrategia consiste en utilizar un solo evento transgnico, el cual est siendo cruzado con numerosas variedades locales a travs de varios programas de mejoramiento en pases del Asia (Hoa y otros, 2003). ESTRECHANDO LA MANO AMIGA desarrollo en el marco de un proyecto humanitario. Este ha sido desde el inicio un proyecto de investigacin pblico diseado para reducir la malnutricin en pases en vas de desarrollo. El obstculo de los derechos de propiedad intelectual sobre algunas de las tecnologas utilizadas en la produccin del Arroz Dorado, principalmente bajo la forma de patentes (Kryder y otros, 2000), fue sorteado sin gran dificultad, gracias a la contribucin por parte del sector privado, el cual proporcion licencias libres de regalas para uso humanitario. Este arreglo abri la puerta a colaboraciones con instituciones de investigacin pblicas en los pases blanco, con libertad operacional para desarrollar variedades localmente adaptadas de Arroz Dorado. El Arroz Dorado no interfiere con el uso de variedades tradicionales. La tecnologa se puede integrar en cualquier variedad por medios convencionales en el plazo de cuatro a seis cruzas (que equivalen a dos aos de mejoramiento con la ayuda de marcadores moleculares). Las variedades locales con la tecnologa de Arroz Dorado integrada se convertirn en propiedad de los pequeos agricultores, quienes adems podrn utilizar parte de su cultivo como semilla. Adems, el Arroz Dorado es compatible con el uso de sistemas de cultivo tradicionales; no requiere del uso de ms insumos agrcolas que la variedad parental. Llevar el Arroz Dorado del laboratorio al campo no es un ejercicio trivial. Un grupo de expertos internacionales de instituciones de gran reputacin se encarga de darle al proyecto el delineamiento estratgico. A nivel de pases blanco, una red de instituciones nacionales participa en el desarrollo y la distribucin de variedades localmente adaptadas. Hasta la fecha, la Red de Arroz Dorado incluye a 16 instituciones nacionales en Bangladesh, China, la India, Indonesia, Nepal, las Filipinas, Vietnam, y Surfrica. La red est bajo la direccin estratgica del Comit Humanitario del Arroz Dorado y bajo gerencia

El Arroz Dorado ser puesto a disposicin de los pases en vas de

-7No se han encontrado indicaciones de que la actividad de las LCYs de arroz sea limitante, ya que en ningn momento se encontr acumulacin de licopeno. Por lo tanto, la formacin del pigmento amarillo en Arroz Dorado es el resultado de ciclasas intrnsecas activas. Ningn tipo de retroalimentacin parece afectar la expresin de los genes carotenognicos presentes en arroz, ya que el nivel de todos los mRNA correspondientes se mantienen constantes. El flujo de substrato hacia cualquier rama de la formacin de xantfilas es controlado por las dos LCYs, las cuales convierten el licopeno en beta caroteno (beta beta caroteno) y alfa caroteno (beta epsilon caroteno). Sin embargo, el nivel de transcripcin de las ciclasas no cambia. Esto sugiere que el cociente ismerico en licopeno determina la probabilidad de formacin del anillo beta o epsilon, en este caso conduciendo a una formacin preferencial de beta caroteno y la disminucin de lutena. DESARROLLO DE UN PRODUCTO COMERCIALIZABLE grano de arroz y en ausencia de una dieta ms variada, el prototipo de Arroz Dorado no podra cubrir los requisitos diarios de provitamina A de la poblacin blanco. En algunas poblaciones rurales de Bangladesh, por ejemplo, ms del 80 por ciento de la fuente calrica diaria consta de arroz. El primer Arroz Dorado mejorado, se denomin GR1, y contena el gen Psy del narciso y el gen CrtI, como en el prototipo. En GR1 ambos genes fueron expresados especficamente en el endospermo, bajo el control del promotor de la glutelina (una protena de almacenaje del grano de arroz), y no de forma constitutiva, como en el prototipo. Esto se hizo para evitar cualquier interferencia con la capacidad fotosinttica de las hojas debido a la posible disminucin de la lutena, segn lo que mencionbamos ms arriba (Al-Babili y Beyer, 2005). Los niveles de carotenoides obtenidos con GR1 en el campo fueron de 6 g/g en promedio, casi cuatro veces ms que en el prototipo. Se piensa que este contenido de carotenos podra cubrir los valores recomendados por los nutricionistas para los nios, si en nuestros clculos incluimos la ingestin con la dieta diaria de una modesta cantidad de verduras y pescado u otras fuentes animales, como es el caso en las dietas de las zonas rurales en los pases del Asia sur oriental. En rutas biosintticas complejas generalmente existe un paso limitante, que en este caso es PSY. Por lo tanto, se compararon genes Psy de diversas fuentes vegetales. La introduccion de genes de maz y arroz expresados en el endospermo dieron los mejores resultados, lo que condujo al desarrollo de GR2 usando el gen del maz (Paine y otros, 2005). Se obtuvieron lneas de GR2 que acumulaban altas cantidades de carotenoides. Una lnea aceptable para fines regulatorios alcanz un contenido de carotenoid de 37 g/g, 80 por ciento del cual era beta caroteno (algunas lneas con insertos no perfectos acumulaban muchos ms carotenos). Esto representa un aumento de 23 veces sobre el prototipo.

Desde un principio se reconoci que con 1.6 g/g de beta caroteno en el

-6de la configuracin all-trans del licopeno. Estos resultados son apoyados por el incremento de mRNAs y de protenas carotenognicas en flores de narciso como consecuencia de la inhibicin de LCY, lo que conlleva a una acumulacin del licopeno all-trans y de carotenoides (Al-Babili y otros, 1999). El endospermo del arroz exhibe niveles bajos de todos los mRNAs requeridos para la formacin de la xantfila, es decir PSY, PDS, ZDS, CRTISO, beta y epsilon LCY, y beta HYD, aunque en vista de la sensibilidad del mtodo de PCR usado, la transcripcin de PSY se puede considerar prcticamente ausente, lo que concuerda con el hecho de que la introduccin de PSY es requerida pero no suficiente para producir el fenotipo dorado. Tambin la PDS y la ZDS se expresan probablemente a niveles demasiado bajos como para conferir el fenotipo dorado. La expresin endospermo especfica del sistema PDS/ZDS (en vez de CRTI) en arroz, llev a la formacin de niveles comparables de carotenoides con color. Esto demuestra que el endospermo de arroz contiene los requisitos complejos necesarios para garantizar la funcin de las desaturasas vegetales. La PDS requiere de una cadena redox, a base de quinonas, una quinona reductasa, y oxgeno molecular como aceptador de electrones terminales (Beyer y otros, 1989; Mayer y otros, 1990; Nievelstein y otros, 1995) al cual est ligada a travs de una oxidasa (ver Kuntz, 2004). Esta va redox es especialmente importante en tejidos no verdes que contienen carotenoides, como el endospermo, mientras que se piensa que el transporte fotosinttico de electrones desempea un papel anlogo en el cloroplasto. Sin embargo, CRTI fue el transgen de preferencia, por encima de las desaturasas vegetales, debido a su multifuncionalidad y su requerimiento mnimo de cofactores. Se ha demostrado que, en contraste con PSY, la actividad de CRTI no es limitante, ya que es capaz de desaturar grandes cantidades de fitoeno, lo que lleva a una acumulacin del beta caroteno (Paine y otros, 2005). La secuencia primaria de CRTI no est relacionada con las desaturarasas vegetales. Esto explica en parte sus requisitos ms simples en cuanto a cofactores, y su alta eficacia en el endospermo del arroz. Por otra parte, CRTISO, que es tambin activa en el endospermo del arroz, parece haberse derivado de CRTI (Isaacson y otros, 2002; Park y otros, 2002). An cuando la expresin de PSY, PDS, y ZDS en el endospermo del arroz establece la va poli-cis de la desaturacin del caroteno, el caroteno formado se encuentra predominantemente en la forma all-trans. Adems, el endospermo de las plantas transformadas con el gen CrtI muestra un cociente isomrico idntico de beta carotenos, indicando que la CRTISO del arroz determina este cociente (Isaacson y otros, 2004). La actividad de CRTISO es tambin responsable de la formacin de los grupos cclicos en los extremos del caroteno. En su ausencia, los carotenoides cclicos y las xantfilas derivadas no se formaran en tejidos no verdes, como se ha demostrado en la mutante tangerine de tomate y en etioplastos de la mutante ccr2 de Arabidopsis; ambas carecen de una CRTISO funcional (Isaacson y otros, 2002; Park y otros, 2002).

-5pertenecen. GGDP y su precursor isopentenil difosfato se sintetizan a partir de productos de la gliclisis. Los derivados de GGDP son sometidos a reacciones de isoprenilacin y ciclizacin, lo que puede llevar a la biosntesis de muchos productos con funciones importantes, como los tocoferoles (vitamina E), tocotrienoles, carotenoides, el cido abscsico (una fitohormona implicada en procesos reguladores, como la dormancia de los brotes y de la semilla, y a varias respuestas a estreses), al cido giberlico (otra fitohormona, responsable del crecimiento y elongacin celular), la clorofila y otros componentes de la maquinaria fotosinttica. Segn lo indicado arriba, los genes fueron introducidos en el arroz uno por uno o en combinacin. La fitoeno sintasa (Psy) del narciso (Narcissus pseudonarcissus), que utiliza GGDP para formar el fitoeno, un caroteno sin color con un cromforo de tipo trieno (Burkhardt y otros, 1997), solamente condujo a la acumulacin del fitoeno, pero no a derivados desaturados (Burkhardt y otros, 1997). Esto indica que por lo menos faltaba una desaturasa. Semejantemente, la expresin de la caroteno desaturasa (CrtI), obtenida de la bacteria Erwinia uredovora, y que produce el conjugado completamente desaturado llamado licopeno, no produjo ningn color en el endospermo del arroz, debido a la ausencia de fitoeno. Licopeno es la molcula precursora del beta caroteno, el cual se forma por procesos enzimticos en los cuales se agregan cuatro enlaces dobles y se lleva a cabo la ciclizacin de ambos extremos de la molcula. Sin embargo, los dos genes, Psy y CrtI en conjunto s condujeron finalmente a la generacin del primer prototipo de Arroz Dorado en 1999 (Ye y otros, 2000). El licopeno es un pigmento rojo, debido a la presencia de un cromforo a base de undecaeno. Es adems un producto intermedio en granos de arroz que expresan las enzimas PSY y CRTI, pero est virtualmente ausente, porque es utilizado como substrato en la generacin de beta caroteno y otros carotenoides oxigenados, tales como lutena y zeaxantina. El patrn de carotenoides observado en el endospermo revel que la licopeno ciclasa (LCY) y las alfa y beta caroteno hidroxilasas (HYD) estn presentes en el endospermo del arroz, mientras que PSY y una o ambas fitoeno desaturasas (la fitoeno desaturasa PDS y la zeta caroteno desaturasa ZDS) no estn presentes (Schaub y otros, 2005). Un mecanismo alterno para la activacin de la ruta, observado en el tomate (Solanum lycopersicum) pero no en arroz, es la induccin retroalimentada de los genes biosintticos, debido a la presencia de los transgenes. En este caso CRTI slo condujo a un aumento del beta caroteno mas no del licopeno, y la actividad de los genes biosintticos endgenos fue inducida, a excepcin de PSY, la cual fue reprimida (Rmer y otros, 2000). La induccin por CRTI podra basarse en el hecho de que las desaturasas de la planta, PDS y ZDS, juntas producen prolicopeno, es decir la configuracin tetra-cis del licopeno (Bartley y otros, 1999), ste es luego isomerizado y pasa a la configuracin trans gracias a la actividad de la licopeno cis-trans isomerasa (CRTISO), una enzima de esta ruta recientemente identificada (Isaacson y otros, 2004; Isaacson y otros, 2002; Park y otros, 2002). En cambio, el CRTI bacteriano conduce a la formacin exclusiva

-4Esta hazaa fue posible gracias a los adelantos en la biotecnologa verde durante las dos dcadas pasadas. El Arroz Dorado es el resultado de una colaboracin entre los laboratorios de los profesores Ingo Potrykus, del Instituto Federal de Tecnologa, Suiza, y Peter Beyer, de la Universidad de Freiburg, Alemania. Lneas mejoradas con ms alto contenido de beta caroteno fueron desarrolladas gracias a una colaboracin con la compaa Syngenta. La meta de esta colaboracin pblico-privada era producir suficiente beta caroteno en el arroz para suplir la dosis diaria recomendada para nios y adultos por igual. LA GENERACIN DEL ARROZ DORADO

Durante la dcada de los 80 se sentaron las bases para la generacin de las

plantas transgnicas. Igualmente, durante esta poca y gracias al trabajo de muchos grupos de investigacin, se acumul el conocimiento necesario para armar el rompecabezas de la ruta biosinttica de los carotenoides. La generacin del primer prototipo de Arroz Dorado requiri de un esfuerzo concertado de siete aos que culmin en 1999. La ambiciosa meta de Potrykus y Beyer era la de poner a andar la maquinaria biosinttica de los carotenoides en el grano de arroz y obligarlo a producir y acumular un pigmento que hasta entonces slo se encontraba en tejidos verdes, contra el escepticismo de muchos expertos. Los tejidos carotenognicos no slo poseen rutas metablicas activas, incluyendo la presencia de molculas precursoras, sino tambin mecanismos para su almacenamiento, como por ejemplo por medio de cristalizacin, formacin de gotitas lipdicas, secuestramiento en las membranas, o complejos con protenas. El endospermo del grano de arroz, rico en almidn, es muy bajo en lpidos y carece aparentemente de los medios necesarios para almacenar carotenoides. Otro factor desconocido en el endospermo del arroz era la presencia y cantidad de molculas precursoras para la produccin de carotenoides En pocas palabras, la tecnologa del Arroz Dorado se basa en el simple principio de que a pesar de que las plantas de arroz sintetizan el beta caroteno en el follaje pero no en el grano, la mayora de las enzimas para su biosntesis estn presentes en el grano. La adicin de tan solo dos genes fue suficiente para reconstituir la ruta biosinttica y para que el grano acumulase beta caroteno en el endospermo. Estos hechos no estaban nada claros en 1992, cuando comenz el proyecto, y algunas de las herramientas para determinar expresiones muy bajar de genes fueron desarrolladas mucho ms tarde. Por estas razones, los genes responsables de la biosntesis del beta caroteno fueron introducidos uno por uno, individualmente y en combinacin, hasta que, en 1999, se logr producir el primer prototipo de Arroz Dorado (Ye y otros, 2000). Desde entonces se ha logrado producir carotenoides en varias especies vegetales, siguiendo varias rutas, como por ejemplo, aumentando la produccin de molculas precursoras o bloqueando la sntesis de enzimas capaces de metabolizar los productos deseados (Fraser y Bramley, 2004; Giuliano y otros, 2000). El geranilgeranil difosfato (GGDP) es una molcula clave en la biosntesis de los isoprenoides, una clase de molculas a la cual los carotenoides tambin

-3La DVA es comn en la gente de escasos recursos, cuya nutricin depende principalmente de cultivos ricos en almidones como fuente energtica principal o casi nica, ya que la mayora de estos cultivos, tales como el arroz, el sorgo, la yuca o el banano, no contiene el beta caroteno (provitamina A), que nuestro cuerpo puede almacenar y luego convertir en vitamina A, segn la necesite. Para la mitad de la poblacin mundial, el arroz es elemento esencial de la dieta, y para la mitad de esta fraccin el arroz representa incluso la fuente energtica principal (Tabla 1). La situacin es similar para otros cultivos de zonas tropicales, como la yuca y el banano en el frica. La dependencia de la poblacin de estos cultivos como las fuentes principales de alimentacin por lo tanto conduce necesariamente a DVA y a otras deficiencias de micronutrientes, afectando ms seriamente a los nios y a las mujeres embarazadas. Los cultivos ricos en beta caroteno podran reducir substancialmente la DVA en la poblacin. El arroz y otros cultivos son ricos en carotenos en el follaje, donde hay actividad fotosinttica, pero no en las partes comestibles ricas en almidones, donde la biosntesis de los carotenos es nula. Por esta razn, la nica va para lograrlo es utilizando ingeniera gentica. En el caso del arroz, existen variedades rojas y amarillas, pero stas no contienen beta caroteno, sino otros pigmentos sin valor vitamnico. El grano de arroz sin pulir contiene algunos nutrientes de alto valor nutritivo, como la vitamina B y lpidos esenciales. Y son justamente los lpidos los que hacen necesario pulir el grano, ya que su oxidacin durante el tiempo de almacenaje causa rancidez, afectando de este modo el sabor y el olor del grano. Las plantas verdes producen carotenoides en el follaje y a menudo en las flores. Muchos de ellos constituyen la base de pigmentos atractivos de color naranja, amarillo y rojo. Entre los carotenoides producidos en plantas se encuentra el beta caroteno, el cual representa la mejor fuente vegetal de vitamina A. En el organismo, una oxigenasa procesa el beta caroteno, convirtindolo en dos molculas de retinol (vitamina A). No todas las fuentes de provitamina A son igualmente buenas. El alfa caroteno, por ejemplo, slo da lugar a una molcula con actividad de vitamina A. Adems, la eficacia de la bioconversin puede variar, dependiendo de la biodisponibilidad de la provitamina. Esta puede variar entre un cociente estequiomtrico de 6:1 para frutas como la papaya (o sea slo la sexta parte del beta caroteno es convertida en retinol), a 24:1 para las verduras de hojas grandes, donde los carotenoides pueden estar fuertemente ligados a matrices complejas y por lo tanto son de difcil acceso al sistema digestivo y pasan por el intestino casi intactos. Las fuentes de nutricin animales proveen directamente vitamina A (retinol), y no provitamina A, lo que conlleva a una alta biodisponibilidad. El cociente de conversin ms eficiente de 2:1 se obtiene ingiriendo beta caroteno disuelto en aceite. El endospermo del grano de arroz es un tejido donde no hay fotosntesis y por lo tanto la biosntesis de carotenoides es nula. En el Arroz Dorado, la ruta biosinttica de los carotenoides ha sido reactivada gracias a la introduccin gracias al reemplazo de los genes inactivos gracias a la transformacin gentica.

-2El proyecto del Arroz Dorado naci con la idea de aliviar el problema de la deficiencia de la vitamina A (DVA), debido a la magnitud del problema y al impacto que una intervencin acertada podra tener. Anualmente, medio milln de personas, especialmente nios menores de cinco, pierde la visin como consecuencia de la DVA, y en promedio la mitad de stos muere en el transcurso de un ao a causa de distintas enfermedades. La DVA afecta seriamente el sistema inmune y por lo tanto est directamente implicada en gran parte de estas muertes. La mayora de estas muertes es innecesaria, ya que se trata de enfermedades comunes, como el sarampin y otras enfermedades infecciosas, que de no ser por el sistema inmune afectado, no seran mortales (Caulfield et al., 2004). Se ha calculado que simples medidas preventivas, como la lactacin, combinadas con la suplementacin de vitamina A y cinc, podra reducir la mortalidad en un 25 por ciento (UNICEF, 2003). Varios programas internacionales de suplementacin, la fortificacin industrial y diversificacin de la dieta, han producido mejoras substanciales, pero todos tienen dificultad en lograr una cobertura amplia de la poblacin y, sobre todo, sostenibilidad. La suplementacin requiere de la disponibilidad de los micronutrientes necesarios, generalmente en forma de cpsulas, mientras que la fortificacin industrial implica la adicin de micronutrientes a comestibles procesados centralmente, como por ejemplo la adicin de vitamina A a los aceites comestibles o a la mantequilla. Las actividades de suplementacin requieren adems de una logstica que involucra a decenas de miles de ayudantes en cada pas, para poder hacer llegar las cpsulas a la poblacin blanco. Las campaas de suplementacin son muy costosas en trminos logsticos, an cuando stas a menudo se combinan con campaas de vacunacin. En pases pequeos, como Nepal o Ghana, los costos ascienden a aproximadamente dos millones de dlares por ao (MOST and USAID Micronutrient Program, 2004). Las campaas se deberan realizar preferiblemente por lo menos dos veces cada ao. La realidad es que, a nivel global, alrededor del 45 por ciento de los nios no reciben ninguna suplementacin (UNICEF, 2003). Ambos enfoques, fortificacin y suplementacin, tienen dificultades en alcanzar a las poblaciones rurales en zonas remotas, y dependen de una inyeccin permanente de fondos. La biofortificacin representa un enfoque alternativo y adems sostenible. Se basa en el desarrollo de cultivos capaces de producir y acumular los micronutrientes deseados en las partes comestibles de las plantas. Este enfoque ofrece una oportunidad nica para lograr una cobertura ms inclusiva, especialmente de los sectores ms pobres de la sociedad que dependen sobre todo de la agricultura para su sustento. Los cultivos biofortificados pueden ser obtenidos por medio de mejoramiento convencional de los cultivos ms importantes para la alimentacin, siempre y cuando exista variabilidad gentica en el germoplasma de la especie en cuestin. Si este no es el caso, se podrn generar lneas de base gentica mejorada por mutagnesis o ingeniera gentica.

Arroz Dorado y Biofortificacin contra la Malnutricin

Jorge E. Mayer1 El Arroz Dorado es sin duda el cultivo transgnico mejor conocido en el mundo, aunque otros proyectos estn siguiendo el ejemplo para generar cultivos biofortificados con varios micronutrientes esenciales. El Arroz Dorado es un producto transgnico de segunda generacin, es decir, con valor aadido para el consumidor en lo concerniente al mejoramiento de la calidad nutricional. El Arroz Dorado fue desarrollado para contribuir a combatir el problema de la deficiencia de vitamina A (DVA), la cual afecta a casi la mitad de la poblacin mundial, especialmente a nios pequeos en los pases en desarrollo. La expresin clnica de la DVA no slo se limita a ceguera nocturna y xeroftalmia, sino que expresa en un incremento de la susceptibilidad a diversas enfermedades, y por ende de morbilidad y mortalidad. Mientras que programas de suplementacin y fortificacin contribuyen exitosamente a reducir la carga humanitaria y socioeconmica, urge la creacin de cultivos biofortificados, capaces de suplir de manera sustentable los micronutrientes necesarios a las poblaciones blanco. La biotecnologa verde y el constante progreso en el entendimiento de las rutas metablicas responsables de la biosntesis y acumulacin de los micronutrientes a nivel bioqumico y molecular, han preparado el camino para no slo solucionar el problema de la DVA, sino que tambin el de la deficiencia de los micronutrientes hierro, zinc, vitamina E, folato y aminocidos esenciales. Con el presente artculo pretendo proporcionar una visin general del progreso del proyecto del Arroz Dorado, as como del estado de proyectos afines en biofortificacin.

INTRODUCCION

Segn lo estimado por la Organizacin de la Naciones Unidas para la

Agricultura y la Alimentacin (FAO), en la actualidad existen alrededor de 800 millones de personas en 98 pases en vas de desarrollo que no consiguen suficientes alimentos para llevar una vida normal, sana y activa da a da. Alrededor de diez millones de nios mueren a causa de desnutricin cada ao, la mayora debido a mltiples deficiencias en micronutrientes (Jones et al., 2003). Las deficiencias alimentarias con el ms alto impacto en morbilidad y mortalidad son la carencia de hierro, cinc, yodo y vitamina A (Welch and Graham, 2004).

PhD, MIP Law, Trade Marks Attorney; Manager Germplasm Enhancement, Grains Research and Development Corporation, Canberra, Australia. Email j.mayer@grdc.com.au