HPLC

Kromatografi Cair Kinerja Tinggi

 Kemampuan yang diharapkan:

Mahasiswa mampu memahami tentang

HPLC atau KCKT
 Kriteria
Mampu memahami prinsip kerja alat
HPLC
Memahami fungsi peralatan
Mampu menangani cara penyiapan
sampel dan interpretasi hasilnya
 MATERI
1. Pembagian /Klasifikasi HPLC
2. Penggunaan /manfaat
3. Skema alat HPLC
4. Penjelasan masing-masing fungsi
 1. Klasifikasi berdasarkan
Mekanisme
Kromatografi adsorpsi
(adsorption chromatography)

Kromatografi Partisi
(partition chromatography)

Kromatografi Pertukaran ion

(ion exchange Chromatography)

Size Exclusion Chromatography (SEC)

Kromatografi Permeasi Gel; Kromatografi Filtrasi Gel
 Klasifikasi Kromatografi

Sumber: Ghosh dan Bhattacharya, 2009; Sopyan, 2009; De Lux Putra, 2004; Grob dan Barry, 2004; Gritter, et al., 1991
Seleksi Tipe Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (HPLC)
 Keunggulan HPLC
Kolom HPLC dpt dipakai berulangkali
tanpa perlu diregenerasi (diperbaharui)
Tercapainya pemisahan yg memuaskan
pd kolom
Dpt dioperasikan secara otomatis
Waktu analisis relatif singkat
HPLC The most frequently used technique

High Performance
HP High Pressure

L Liquid
Cairan sebagai Fase gerak

Chromatography
C  Teknik Pemisahan
 Berdasarkan sifat kimia Pemisahan
SEC
NP Size
Normal Exclusion
Phase (GPC, GFC)

RP
HILIC Ion
IE
Suppression
Ion
Reversed Ion pairing
Exchange
Phase HPLC

Dilakukan dengan instrumen HPLC yang sama,

tergantung dari kolom yang digunakan
 2. PENGGUNAAN/Manfaat
• Untuk senyawa organik yang tidak stabil bila dipanaskan

Prinsip
• Terdiri dari fasa diam, dg permukaan aktifnya berupa
padatan, larutan, resin penukar ion atau polimer berpori
• Fasa diam ditempatkan pd kolom serta dialiri fasa gerak
cair dg aliran yg diatur oleh pompa
• Terjadi Kompetisi 2 fasa
• Dilakukan pada T rendah
• Elusinya pada tekanan tinggi (hingga 5000 psi atau 300
atm)
HPLC PRINCIPLE
3 .Skema Alat HPLC
HPLC MACHINE
HPLC MACHINE
 Peralatan HPLC

Tempat Tempat
pelarut
pompa injeksi Kolom Detektor Rekorder
sampel
 Fasa gerak (pelarut)
• Membutuhkan cukup banyak pelarut
• Sebelum pelarut digunakan dilakukan
degassing utk mengeluarkan gas terlarut yg
tdk diinginkan
• Adanya gas dlm pelarut dpt bereaksi dg fasa
gerak/fasa diam, dpt mengganggu krj detektor
• Fasa gerak harus bebas dari partikel debu krn
partikel2 kecil yg terbawa ke dalam pompa
atau masuk dlm kolom akan mempercepat
rusak pompa atau menyumbat kolom
• Fasa gerak disaring dg penyaring khusus yg
diameter porinya ± 0,45µm
Kriteria pemilihan fase gerak
1. Viskositas
pelarut dengan viskosias rendah menghasilkan
tekanan yang lebih rendah dibandingkan pelarut
dengan viskositas tinggi pada suatu kecepatan
alir tertentu. Viskositas rendah juga
memungkinkan kromatografi yang lebih cepat
karena perpindahan masa berlangsung lebih
cepat.
2. Transparansi terhadap uv
jika detektor uv yang digunakan maka fase gerak
harus transparan secara sempurna pada panjang
gelombang yang digunakan. Transparansi garam-
garam buffer, reagen-reagen pasangan iondan
bahan tambahan lain juga harus diperhatikan.
3. Indeks bias
penting jika detektor indeks bias yang
digunakan. Perbedaan indeks bias
antara pelarut dengan sampel harus
besar jika bekerja dengan batas-batas
deteksi tertentu.
4. Titik didih
titik didih fase gerak yang rendah
diperlukan jika eluat akan dilakukan
pemprosesan lebih lanjut supaya
memudahkan dalam penguapannya. Di
satu sisi pelarut dengan tekanan uap
tinggi (TD tinggi) pada suhu kamar
5. Kemurnian
tidak adanya senyawa yang mengganggu pada
bentuk deteksi yang digunakan, tidak adanya
senyawa yang mengganggu elusi gradien (berguna
untuk meningkatkan resolusi campuran yang
kompleks terutama jika sampel mempunyai kisaran
polaritas yang luas), tidak adanya residu non-volatile
dalam kasus pemisahan preparatif.
6.Lembam (inert) terkait dengan senyawa-senyawa
sampel
fase gerak harus tidak bereaksi sama sekali dengan
campuran sampel. Jika sampel yang sianalisis sangat
peka terhadap oksidasi maka fase gerak dapat
ditambah senyawa antioksidan.
7. Toksisitas
seorang analis harus menghindari penggunaan
produk yang toksik semaksimal mungkin. Pelarut
terklorinasi dapat melepaskan gas fosfen yang sangat
toksik. Toluen harus menggantikan benzena yang
bersifat karsinogenik, kapanpun dimungkinkan.
8. Harga
Fase gerak yang paling sering digunakan untuk
pemisahan dengan fase terbalik adalah campuran
larutan buffer dengan metanol atau campuran air
dengan asetonitril.
Untuk fase normal, fase gerak yang sering digunakan
adalah campuran pelarut hidrokarbon dengan pelarut
yang terklorisasi atau menggunakan pelarut jenis
alkohol.
 Fase Gerak

Fase Gerak Polaritas indeks

Toluen 2,4

Kloro benzen 2,7

Etil eter 2,8

Etil asetat 4,4

Aseton 5,1

Metanol 5,1
Asetonitril 5,8
Air 10,2
 Sistem Pompa
Tekanan sampai 6000 psi
Kontrol aliran 0,1-10 mL/menit
 HPLC: Berdasarkan komposisi fase gerak

Isokratik (Isocratic elution):

 Komposisi fase gerak tetap

Gradien (Gradient elution):

 Komposisi fase gerak berubah-ubah

Elusi gradien
% Solven B

Elusi Isokratik

Waktu (menit)
 Elusi gradien
 Apabila suatu campuran senyawa yang kompleks
ingin dianalisa yang terdiri dari komponen-komponen
yang mempunyai afinitas yang sangat berbeda, sering
didapatkan pemisahan yang tidak sempurna apabila
digunakan sistim isokratik
 Untuk memecahkan persoalan ini komposisi fasa
gerak dapat diubah selama proses pemisahan sesuai
dengan tingkat affinitas masing-masing komponen 
elusi gradien
Gradien elusi, dpt menggunakan lebih
dari dua pelarut yg secara otomatis dpt
diubah komposisinya sesuai
kebutuhan, sehingga diperoleh
pemisahan yg baik walau
menggunakan dua pompa
 Gradient Analysis
Keuntungan:
 Lebih baik untuk sampel campuran
 Memiliki resolusi yang lebih baik
 Kapasitas puncak lebih baik

Kerugian
 HPLC yang lebih kompleks
 Pengembangan Metode analisis dan implementasi
yang lebih rumit
 Penyesuaian kolom dengan fase gerak membutuhkan
waktu sehingga analisis menjadi
 Pengendali aliran(flow controller)

Dpt menstabilkan aliran fasa gerak

akibat perubahan tekanan gas,
temperatur, viskositas
Isokratik, cara pemrograman fasa gerak
yg hanya memerlukan 1 macam
komposisi pelarut baik pelarut tunggal
maupun pelarut campuran. Jika
digunakan 2 jenis pelarut maka
diperlukan 2 pompa utk mengatur
pelarut agar komposisinya tetap
selama pemisahan
 Alat Injeksi
Dirancang khusus sebab sistem HPLC
mempunyaai tekanan sangat tinggi
Bbrp HPLC dilengkapi peralatan injeksi
sampel yg dpt memasukkan sampel
secara otomatis sekaligus menjalankan
peralatan lain yg terangkai dlm sistem
tsb,dikenal auto injector. Alat ini
mampu menangani sampel dlm jumlah
puluhan buah
Injector
Skema Penyuntikan Sampel Metode Valve
 Kolom
Tidak memerlukan suhu yg tinggi krn
sifat ikatan kimia thd fasa diam sangat
sensitif thd suhu tinggi
Fasa diam berikatan kimia dg lapisan
pendukung
Contoh 3,5 atau 10 µm silika hidrolisis
yg dilapiskan dg siloxan
R1

Si O
n

R2
Normal phase HPLC :
nonpolar solvent/polar colums.
Contoh R=hidrokarbon
Reversed phase HPLC :
polar solvent/nonpolar column.
Contoh R = cyano(C2H4CN)
diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH)
amino (C3H6NH2)
 Detektor
Karakteristik detektor :
Tingginya sensitivitas yaitu lebih dari
0,1 µg sampel dlm 1 cm3
Tidak merusak sampel
Tidak sensitif thd perubahan
temperatur dan perubahan kecepatan
aliran fasa gerak
 Detektor Yang Paling Sering Digunakan pada KCKT

Sumber: Dong, 2006; Angelika, et al., 2001; Snyder dan Kirkland, 1979.
 Detektor Fotometer (UV, IR,
Fluoresence)
• Detektor UV dikhususkan pada senyawa yg
memiliki serapan maksimum di daerah UV
yaitu senyawa yg memiliki elektron ikatan ᴨ
dan elektron non ikatan seperti olefin,
aromatik, dan senyawa yang mengandung
gugus –C=O, -C=S, -N=O dan –N=N-
• Detektor IR dapat dipakai untuk mendeteksi
beberapa panjang gelombang yg dapat diatur
menurut gugus fungsinya. Panjang
gelombang tersebut pada daerah 4000-690
cm-1
Detektor fluoresence dipakai untuk
senyawa yg memiliki tingkat selektifitas
tinggi pada senyawa yg berfluoresence.
Senyawa ini umumnya memiliki
struktur siklik konyugasi spt
polinuklear aromatik, asam amino
aromatik, phenol, quinolin
 Detektor Refraktometer
Perbedaan detektor ini dari yg lain
adalah mampu memonitor perbedaan
indeks refraksi yg tdp dlm gasa gerak
dan fasa gerak-sampel ketika keluar
dari dalam kolom
Deteksi mampu dilakukan hingga
konsentrasi 1 ppm dlm larutan
 Detektor Konduktometer
Didasarkan pd adanya perbedaan daya
hantar listrik dari larutan yg
melewatinya
Khusus digunakan utk mengukur
larutan elektrolit yaitu pd kromatografi
penukar ion
Fasa geraknya biasanya air atau
larutan buffer
 Rekorder
Menggambarkan kromatogram
berdasarkan hasil yg diberikan oleh
detektor
Kolom HPLC
Kolom HPLC Berbagai ukuran
Teknik KCKT
- Pelarut
- Elusi dalam bentuk isokratik/gradien
- Kolom :
Silika Si–OH
Amino Si– (CH2)3 – NH2
Siano Si– (CH2)3 – CN
Diol Si– (CH2)2 – O – CH2 – CH – CH2
OH OH
RP-2 Si– (CH3)2
RP-8 Si– (CH2)7 – CH3
RP-18 Si– (CH2)7 – CH3
 R R R R
HO Si OH Si O Si O Si

O O O OH O O

Si O Si O Si O Si O Si
PERMUKAAN SILIKA
MACAM FASA GUGUS R

SILIKA – OH
RP – 2 – CH2 – CH3

RP – 8 – (CH2)7 – CH3
RP – 18 – (CH2)17 – CH3

AMINA – (CH2)3 – NH2

SIANO – (CH2)3 – C ≡ N
DIOL – (CH2)3 – O – CH2 – CH – CH2
I I
OH OH
 HPLC Fase Normal
 NP-HPLC: fase gerak non polar,
fase diam polar
 Disebut juga kromatografi
adsorpsi (adsorption
chromatography)
 Pemisahan didasarkan atas
adsorpsi/desorpsi analit pada
fase diam polar (silika atau
alumina)
 Analit polar lebih tertahan
daripada analit non polar karena
gugus silanol pada silika.
 HPLC Fase terbalik
 RP-HPLC: fase gerak polar,
fase diam non polar
 Pemisahan didasarkan atas
koefisien partisi analit dalam
fase diam dan fase gerak
 Urutan elusi: analit polar
terelusi lebih dahulu, analit
non polar terelusi terakhir
 Untuk pemisahan analit non
polar (non ionik)
 Untuk analit yang dapat
terionisasi (ionik) dapat
dianalisis dengan RP-HPLC
menggunakan pengaturan pH
fase gerak atau teknik
pasangan ion (ion-pair).
 Ion Exchange HPLC

 Pemisahan didasarkan atas

pertukaran ion analit dengan
ion dari gugus fungsi bahan
pendukung padat fase diam
 Contoh Fase diam: senyawa
sulfonate (penukar kation);
ammonium kuarterner
(penukar anion)
 Fase gerak: dapar
 Aplikasi: analisis ion, asam-
asam amino, protein/peptida,
polinukleotida
 Size Exclusion HPLC
 Untuk pemisahan
makromolekul (BM >
10000).
 Disebut GFC jika
digunakan untuk
pemisahan molekul
biologis yang larut air
 Fase gerak umumnya
toluen dan
tetrahidrofuran.
Pemisahan Kromatografi Cair
 Sekedar Ilustrasi

Unidha ke Unand
MALL

Restaurant FINISH
START
 Chromatogram

tR-B
Respon Detektor 

tR-A
Peak A Peak B

height

0 1 2 3 4 5 6 7
Waktu (menit) width

Area =
width x height
2

Waktu retensi kromatogram merupakan karakteristik suatu

senyawa tetapi tidak khas/ unik
 Dari Kromatogram diketahui:
Data :
 Kromatogram  tR: waktu retensi (retention
time)
 (parameter kualitatif)
tR-1
Respon Detektor

 Luas puncak = Peak area

tR-2  parameter kuantitatif

 Tinggi puncak (Peak height)

parameter kuantitatif
waktu
 Width = lebar puncak

Retention volume (VR)

VR = tR × F Relative Retention Time (RRT) = tR2/tR1
 Retensi senyawa yang tidak ditahan
tM = to adalah waktu retensi zat yang tak
tertahan oleh fase diam
 VM = dead volume
 tM = Hold-Up time = dead time
 tR’ = tR – tM = adjusted retention time
 Lebar Puncak (w)
 Lebar garis dasar (baseline) = Wb
 Lebar tengah puncak (W0.5)
Tailing, Fronting & Symmetry Peak

a b
 Tailing Factor (USP)
Tailing Factor (Tf) = Symmetry Factor (As)

Tf = 1.0  Puncak simetri

Tf < 1.0  fronting
Tf > 2.0  tailing
 Hukum Van Deemter
H = A + B/m + C. m
 A= difusi Eddy; B=difusi longitudinal; C=
perpindahan massa; m=kecepatan fase gerak
Hukum Van Deemter
 Eddy Diffusion

A = 2 l dp
• disebut difusi Eddy
• l tergantung pada distribusi
ukuran partikel
• Jika ukuran partikel packing seragam
 l kecil
• dp = diameter partikel packing
 Longitudinal Diffusion (B)

B/u = 2gDM/u

• g = konstan tergantung mutu packing

• DM = koefisien difusi fase gerak

• Berbanding terbalik dengan laju alir fase gerak
 Mass Transfer (Cs + Cm)

H = A + B/u + (Cs + Cm)u

CS = fS(k’)df2 / DS

CM = fM(k’)dp2 / DM

• DM = koefisien difusi fase gerak

• DS = koefisien difusi fase diam
• df = film thickness
• dp = diameter partikel
• Berbanding lurus dengan laju alir fase gerak
Parameter Optimasi Metode hplc
 Analit

Inter-
aksi

Fase Fase
Diam Gerak