MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA

DEPARTAMENTO DE QUMICA BIOLGICA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

GUA DE TRABAJOS PRCTICOS 2010

TP N1 A) MTODOS DE ESTERILIZACIN OBJETIVO Adquirir experiencia en el manejo de equipos de esterilizacin y aplicar mtodos de desinfeccin y esterilizacin empleando distintos agentes fsicos o qumicos. Agentes fsicos Calor hmedo (autoclave) El alumno se familiarizar con el uso del autoclave que incluye: 1- Preparacin del material a autoclavar. 2- Carga del autoclave con el material a esterilizar o decontaminar. 3- Cierre del autoclave y encendido. 4- Eliminacin del aire contenido en su interior (hasta emisin de chorro continuo de vapor por la espita o vlvula de descarga). 5- Cierre de la vlvula de descarga y control hasta llegar a la presin de esterilizacin deseada. 6- Control del tiempo de esterilizacin requerido. 7- Apagado del autoclave. 8- Apertura de la vlvula para igualar presiones. 9- Retirado y secado del material autoclavado. Se esterilizarn distintos materiales de vidrio y otros que resistan la temperatura, como as tambin soluciones y medios de cultivo. Tambin se decontaminar material que contenga cultivos bacterianos (en especial cultivos de microorganismos que forman esporas). Se harn controles de esterilidad despus del autoclavado para verificar que el proceso fue eficiente. Calor seco (horno) 1- Preparacin del material a hornear. 2- Carga del horno. 3- Control hasta llegar a la temperatura de esterilizacin. 4- Control del tiempo de esterilizacin. 5- Apagado, enfriado y apertura del horno. Se esterilizarn materiales que no puedan ser autoclavados y/o que resistan altas temperaturas. Incineracin por llama El alumno adquirir prctica en el flameado de la boca de botellas, frascos y tubos y en la esterilizacin y decontaminacin del ansa que se emplea para transferir cultivos bacterianos. Radiacin ultravioleta Se emplear la radiacin ultravioleta como agente desinfectante o esterilizante. Se pondrn debajo de la luz U.V. objetos que no puedan autoclavarse ni hornearse ( Ej: tapas plsticas, membranas filtrantes, etc.). Filtracin Se proceder a esterilizar lquidos que contienen componentes sensibles al calor como protenas, vitaminas, antibiticos y soluciones salinas definidas.

Se emplearn filtros de celulosa utilizando vaco o presin positiva. Agentes qumicos Se emplearn distintos agentes germicidas y desinfectantes (soluciones de hipoclorito de sodio, cloroxilenol, formaldehdo, etc.) para desinfectar superficies. Se analizar la reduccin de la cantidad de microorganismos presentes en una mesada de trabajo, pasando un hisopo con el que se sembrarn placas conteniendo agar nutritivo, antes y despus de haber sido tratada con el desinfectante en cuestin. Bibliografa: Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J., Lee, J.J., Microbes in action. A laboratory manual of microbiology. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edicin, Captulo 5, 1991. Tortora G.J., Funke B.R., Case C.L. Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia SA, Zaragoza Espaa, 1993. Vullo D.L., Wachsman M.B., Alch L.E. Microbiologa en Prctica. Editorial Atlante S.R.L. Buenos Aires, 2000.

B) MICROORGANISMOS DEL MEDIO AMBIENTE (OBSERVACIN MACROSCPICA) OBJETIVOS - Observar la gran variedad de microorganismos presentes en el medio ambiente (laboratorio de T.P.), determinando las diferentes morfologas de colonias que se obtienen. - Poner de manifiesto la necesidad de trabajar en estricta esterilidad en microbiologa debido a la gran facilidad con que se puede contaminar el material de trabajo. DESARROLLO DEL PRCTICO 1- Exponer placas con agar nutritivo al medio ambiente durante distintos tiempos. 2- Estriar con un hisopo previamente pasado por la mesada de trabajo sobre una placa con agar nutritivo. 3- Incubar las placas a temperatura ambiente hasta la clase siguiente. 4- Observar las colonias obtenidas y describirlas teniendo en cuenta las siguientes caractersticas: .Forma: puntiforme, circular, rizoide, irregular, filamentosa. .Tamao: grande (ms de 3 mm), mediana (2-3 mm), pequea (1-2 mm) .Color .Borde: entero, ondulado, lobulado, filamentoso, ondeado .Elevacin: plano, elevado, convexo, pulvinado, umbonado .Superficie: suave, brillante, rugosa, plegada, seca, polvorienta

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C) TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS OBJETIVOS - Adquirir experiencia en el manejo de los materiales y tcnicas bsicas que se utilizarn a lo largo del curso de trabajos prcticos. - Reforzar los conocimientos previos sobre el trabajo de laboratorio en condiciones de esterilidad. Coordinar la operativa de trabajo en el laboratorio y las normas de seguridad. DESARROLLO DEL PRCTICO - En todos los prcticos que se realicen en condiciones de esterilidad se debe, en primer lugar, limpiar el rea de trabajo de la mesada con alguna sustancia desinfectante y encender el mechero. - Preparar placas de Petri con agar nutritivo fundido y mantenido a 45 C. - Esperar que el medio solidifique y luego secar las placas invertidas en estufa a 37 C. -Preparar y rotular tubos de hemlisis para realizar diluciones seriadas al dcimo desde 10-1 hasta 10-3. - Colocar en cada tubo 1,8 ml de solucin fisiolgica estril siguiendo las instrucciones del docente en cuanto al trabajo en esterilidad. - Agregar al tubo rotulado 10-1 0,2 ml de una solucin estril. Descartar la pipeta. Homogeneizar en agitador. Con una nueva pipeta tomar 0,3 ml del tubo anterior y descargar 0,2 ml de esta dilucin (10-1) en el tubo rotulado 10-2. Continuar haciendo las diluciones hasta 10-3. - A partir de la dilucin 10-3 sembrar: a) con ansa por estriado sobre agar nutritivo b) con pipeta (0,1 ml) y posterior rastrillado sobre agar nutritivo - Incubar las placas INVERTIDAS en cuarto estufa a 37C hasta la clase siguiente.

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Procedimiento para preparar una placa por volcado (aislamiento en profundidad). A) Fundir el medio contenido en un tubo y luego enfriarlo hasta que se lo pueda tomar con la mano sin quemarse. B) Flamear el ansa C) y D) Transferir microorganismos al medio con el ansa. E) Agitar rotando el tubo entre las manos para que se homogeinice bien. F) Volcar en una placa de Petri estril. G) Agitar con un movimiento rotatorio hasta asegurar una buena distribucin. H) Incubar boca abajo. Un mtodo alternativo muy usado es volcar en la placa vaca una suspensin bacteriana y luego con el medio fundido y enfriado segn A) volcarlo y efectuar los pasos G) y H).

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Procedimiento para obtener colonias aisladas estriando en placa: A) Flamear el ansa B) Obtener un inculo con ella (en forma estril) C) Estriar con el ansa en medio estril contenido en una placa de Petri siguiendo uno de los modelos mostrados en D.

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Siembra en agar inclinado (pico de flauta) por estra. A) Flamear el ansa B) Obtener material a sembrar C) Apoyar el ansa sobre la superficie del agar y estriar con el diseo mostrado en D)

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Inoculacin por puncin A) Flamear un ansa recta B) Sumergirla una vez fra, en una suspensin bacteriana C) Punzar cuidadosamente en el centro del tubo hasta el fondo y retirar el ansa cuidadosamente tratando de recorrer el mismo camino que para la inoculacin. D) Flamear el ansa E) Incubar el tubo

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T.P.N2 EVALUACIN DE LA DIVERSIDAD MICROBIANA EN UNA MUESTRA NATURAL Columna de Winogradsky Introduccin A diferencia de los estudios realizados por Luis Pasteur y Roberto Koch sobre cultivos puros, dos famosos microbilogos: Sergei N. Winogradsky (1856-1953) y Martinus Willem Beijerinck (18511931), fueron los primeros en estudiar las relaciones entre diferentes tipos de microorganismos que conviven en un mismo habitat y cuyas poblaciones se mezclan. Una demostracin simple de laboratorio - la columna de Winogradsky- ilustra cmo diferentes microorganismos interactan entre s, de forma tal que la actividad metablica de un microorganismo posibilita el crecimiento de otros y viceversa. Estas columnas, que llevan el nombre del microbilogo ruso que las utiliz por primera vez, son sistemas completos autoreciclables, puestos en marcha solamente por energa lumnica. Inicialmente, todos los microorganismos estn presentes en muy baja proporcin, pero cuando la columna se incuba por 2 o 3 meses, los distintos tipos de microorganismos proliferan y ocupan distintas zonas en donde las condiciones ambientales favorecen sus actividades especficas. La columna de Winogradsky es una demostracin clsica de cmo los microorganismos ocupan micrositios altamente especficos de acuerdo a sus tolerancias ambientales y sus requerimientos de carbono y energa. Adems, la columna permite ver cmo los elementos minerales son reciclados tal como ocurre en los ambientes naturales. En este trabajo prctico, se enfoca principalmente la utilizacin del azufre por los distintos microorganismos, pero realizando pequeas modificaciones se pueden estudiar ciclos equivalentes para el nitrgeno, carbono y otros elementos. OBJETIVOS Los alumnos debern: 1- Armar una columna de Winogradsky. 2- Observar y describir la sucesin temporal de microorganismos en la columna. Material de laboratorio Muestra de barro de un arroyo, lago, pantano o costa de mar o ro (aproximadamente 100150 gr de sedimento superficial o subsuperficial). Recipiente alto de paredes trasparentes y rectas (botellas plsticas o probetas de vidrio. Tapn de goma o cobertura plstica. Pipetas de vidrio, portaobjetos, cubreobjetos, cajas de Petri. Medios de cultivo de enriquecimiento, selectivos y diferenciales, colorantes, reactivos para realizar pruebas bioqumicas. Papel de filtro o en su defecto papel de diario finamente cortado. 6 gr de cada una de las siguientes sales: CaCO3 , CaSO4 , CaHPO4.

Procedimiento 1- Colectar una cantidad de tierra o barro para llenar el recipiente hasta una altura aproximada de 10 cm. Remover las piedras, ramas o partculas grandes del material en estudio. Mezclarlo con las sales y el papel finamente cortado.

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2- Colocar la mezcla en un recipiente adecuado (en nuestro caso una probeta de vidrio de 500 ml) y aadir suficiente agua destilada hasta aproximadamente 3 5 cm del borde. Revolver la mezcla para eliminar burbujas de aire. 3- Marcar el nivel de agua y cubrir la boca de la probeta con una envoltura plstica para reducir la evaporacin. Puede ser necesario reponer agua para mantener el nivel original. 4- Incubar a temperatura ambiente cerca de una ventana para que reciba una adecuada cantidad de luz, pero no excesiva. 5- Observar la columna semanalmente, anotando cualquier cambio de aspecto (color, crecimiento microbiano, etc.).

Gua para la interpretacin de la columna de Winogradsky Una columna ideal de Winogradsky se podra representar con el siguiente esquema:

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Apndice Medios de enriquecimiento y condiciones de cultivo para aislar las especies representativas de uno o ms grupos fotosintticos. Organismos a ser enriquecidos Bacterias verde azuladas Bacterias verdes del azufre Bacterias prpuras del azufre Bacterias prpuras Fuente de C orgnica ninguna ninguna Sales inorgnicas ninguna Atmsfera aerobia o aerobia + 5%CO2 ninguna ninguna ninguna pH 6,0 - 8,0 7,5 8,0 - 8,5 7,0 - 7,5

NH4Cl: 1,0 Na2S.9H2O: 2,0 NaHCO3: 5,0 ninguna NH4Cl: 1,0 Na2S.9H2O: 1,0 NaHCO3: 5,0 malato de sodio: NH4Cl: 1,0 5,0 extracto de levadura: 0,5

El medio basal contiene: MgSO4.7H2O................................... 0,2 K2HPO4........................................... 1,0 FeSO4.7H2O.................................... 0,01 CaCl2................................................ 0,02 MnCl2.4H2O.................................... 0,002 NaMoO4.2H2O................................ 0,001 NaCl................................................. 0,5 La concentracin de los componentes de los medios se expresa en gr/l. Medio ambiente: iluminacin constante y 25 - 30 C. Las tcnicas de coloracin y las pruebas bioqumicas estn detalladas en las guas correspondientes a esos temas. Bibliografia Brock, T. D., Madigan, M. T. Microbiologa. Sexta edicin. Prentice Hall Hispanoamericana S.A. 1993. Seeley, H. W. Jr., VanDemark, P. J., Lee, J. J.: Microbes in action. A Laboratory Manual of Microbiology. W. H. Freeman and Company New York. Fourth Edition. 1991. Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L.: Introduccin a la Microbiologa. Editorial Acribia, S.A. Zaragoza, Espaa. 1993. Vullo, D., Wachsman, M., Alche, L. Microbiologa en Prctica. Manual de tcnicas de laboratorio para la enseanza de Microbiologa bsica y aplicada. Primera edicin Editorial Atlante S.R.L., Buenos Aires, 2000.

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T.P N3 OBSERVACIN MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS OBJETIVOS Entrenamiento en preparacin de extendidos y realizacin de coloraciones. Observacin microscpica de morfologa y agrupamientos bacterianos. Microorganismos a usar Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus Streptococcus faecalis Micrococcus luteus Bacillus subtilis Bacillus cereus Bacillus sphaericus Mycobacterium phlei 1-Preparacin de extendidos y coloracin por el mtodo de Gram. a-Rotular convenientemente cada uno de los portaobjetos. b-Preparar extendidos de los microorganismos indicados por el docente. Tomar material de la colonia elegida, con un ansa previamente esterilizada a la llama y suspender este material en una gota de agua colocada en la mitad del portaobjetos. Extender el material sobre toda la superficie del portaobjeto. c-Dejar secar al aire junto a la llama del mechero. d-Fijar con calor pasando el preparado por sobre la llama SIN QUEMARLO. e-Cubrir el extendido con una solucin del colorante cristal violeta. Dejar en contacto 2 minutos. f-Volcar el colorante. Cubrir con solucin de lugol. Dejar en contacto durante 2 minutos. g-Decolorar con alcohol-acetona (exhaustivamente). Lavar con agua. h-Cubrir con safranina (colorante de contraste). Dejar en contacto 1 minuto. Lavar con agua. i-Secar j-Observar al microscopio ptico con objetivo de inmersin. Se debern reconocer las caractersticas morfolgicas y tintoriales de las distintas bacterias. El alumno deber informar el agrupamiento, forma, coloracin, pudiendo utilizar como gua para dicha descripcin la siguiente clasificacin: Forma: esfrica (COCOS) alargada (BACILOS) bacilos cortos (COCOBACILOS) aislado (individual) diplos tetradas cadenas racimos empalizada

Agrupamiento:

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2-Coloracin de cido resistencia OBJETIVO: Deteccin en materiales biolgicos de especies de Mycobacterium y/o Nocardia que pueden ser patgenas. Se vincula a una peculiar composicin de las paredes en estas bacterias. INSTRUCCIONES: 1-Preparar extendidos de los microorganismos a estudiar. 2-Fijar con calor. 3-Cubrir todo el porta con fucsina bsica fenolada (carbolfucsina) 4-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos ms. Si se seca alguna parte del porta, agregar colorante sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente. 5-Lavar con agua. 6-Decolorar con alcohol-cido hasta que no se desprenda ms colorante. 7-Lavar con agua. 8-Cubrir el extendido con azul de metileno. Dejar en contacto durante 30 segundos. 9-Lavar con agua. Secar. 10-Observar con objetivo de inmersin. Solucin de Ziehl (Fucsina fenicada) 1-Fucsina bsica Alcohol etlico 2-Fenol Agua destilada Mezclar soluciones 1 y 2. Alcohol cido HCl (densidad 1.19) Alcohol etlico Solucin de azul de metileno Azul de metileno Agua destilada 3-Coloracin de esporas. OBJETIVO: Esta tcnica permite distinguir las esporas, del cuerpo vegetativo del microorganismo, como as tambin ver su localizacin y forma. INSTRUCCIONES: 1-Prepare un extendido del microorganismo. 1.4 g 100 ml 3 ml 97 ml 0.3 g 10 ml 5g 95 ml

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2-Fijar por calor y cubrir todo el portaobjeto con una solucin de verde de Malaquita. 3-Calentar hasta emisin de vapores y seguir dicho calentamiento durante 3 minutos (no permitir que se seque el colorante. Si esto ocurriera, agregar colorante, sobre el preexistente y no sobre la parte seca, hasta cubrirlo nuevamente.) 4-Lavar con agua y cubrir con solucin de Safranina. Dejar actuar 1 minuto. Lavar con agua, secar y observar con objetivo de inmersin. 5-Informar: morfologa, color y tipo de espora. Solucin de Verde de Malaquita. Verde de Malaquita al 5 % en agua destilada. Solucin de Safranina Safranina 0.5 g en agua destilada. 4) Tincin negativa INSTRUCCIONES 1-Colocar una pequea gota de tinta china en la parte central del portaobjetos. 2-Utilizando el ansa, colocar una gota de la suspensin de microorganismos sobre la tinta china. 3-Colocar sobre el preparado un cubreobjeto para que se forme un film (tinta-cultivo) 4-Observar con objetivo de inmersin. ACLARACIN: Los tiempos que aparecen en los protocolos de las tinciones en la gua de T.P. son los que figuran en los kits comerciales. Si se utilizan los colorantes en otra concentracin, puede ser que dichos tiempos se modifiquen. BIBLIOGRAFA Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia, Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edicin, 1993

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T.P.N4 RECUENTO DE CLULAS VIABLES OBJETIVO: Determinar las unidades formadoras de colonias de una muestra de bacterias por el mtodo de recuento en placa. INTRODUCCIN TERICA El mtodo de recuento en placa se utiliza a menudo para contar slo las clulas vivas (capaces de dividirse). En el mtodo de placa extendida, una muestra pequea (generalmente 0.1 ml) se extiende en esterilidad sobre la superficie de una caja de cultivo con agar que contiene medio adecuado y se incuba hasta que las colonias sean visibles a simple vista. Se infiere que cada colonia se origin de una sola clula, entonces contando el nmero de colonias se puede calcular la cantidad de clulas viables de la muestra. Para minimizar errores al calcular el tamao de la poblacin se ha determinado prcticamente que debe haber entre 30 y 300 colonias por caja de cultivo, por eso para suspensiones densas es necesario realizar diluciones del cultivo. El tamao de la poblacin se calcula usando la siguiente frmula: ufc/ml = N / vol x dil donde: ufc:unidades formadoras de colonias N: nmero promedio de colonias obtenidas para una dilucin dada. vol: volumen de inculo dil: dilucin MATERIALES -cultivo bacteriano -solucin fisiolgica -agar nutritivo -material de vidrio estril (tubos, pipetas, placas de Petri) MTODO 1- Hacer diluciones seriadas al dcimo de las muestras a titular: dil.(-1) 0.1 ml muestra + 0.9 ml solucin fisiolgica dil.(-2) 0.1 ml dil(-1) + 0.9 ml solucin fisiolgica dil.(N) 0.1 ml dil.(N-1) + 0.9 ml dilucin fisiolgica 2- Sembrar por rastrillado 0.1 ml de cada dilucin en placas de Petri con agar nutritivo (cada dilucin se siembra por duplicado). 3- Las placas se incuban 24 - 48 horas en estufa a 37 C. 4- Contar las colonias obtenidas en cada placa.

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5- Elegir la dilucin en la cual se hayan obtenido entre 30 y 300 colonias y calcular las unidades formadoras de colonias (ufc) segn la frmula: 6- Tomar 1 ml de la muestra original (a partir de la cual se hicieron las diluciones) y medir la densidad ptica en un espectrofotmetro a 600 nm. 7- Comparar los resultados obtenidos de ufc/ml y D.O., entre los distintos microorganismos utilizados. Bibliografa 1- Seeley, H.W.Jr.; Vandermark, P.J. , Lee, J.J., Microbes in action. A laboratory manual of microbiology. Editores W. H. Freeman and Company, Cuarta Edicin, Captulo 5, 1991. 2- Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edicin, 1993

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T.P.N5 AISLAMIENTO DE DISTINTAS ESPECIES BACTERIANAS Para aislar un microorganismo de la naturaleza, se debe conocer previamente los requerimientos nutricionales y las condiciones ambientales ptimas para su crecimiento. Los alumnos debern buscar en la bibliografa, las caractersticas metablicas y el hbitat de los microorganismos que se van a utilizar. OBJETIVO: Aislamiento y posterior identificacin de distintas especies bacterianas a partir de diferentes muestras. METODOLOGA: Para el aislamiento de las distintas especies se va a seguir el siguiente esquema: - Inocular la muestra en un caldo de enriquecimiento (que puede o no ser selectivo al mismo tiempo), para favorecer el crecimiento del microorganismo de inters. - Incubar a temperatura y tiempo adecuados. - Tomar una muestra del caldo ya crecido y estriar con un ansa en un medio slido que sea selectivo, para inhibir la flora acompaante del microorganismo que quiero aislar, y obtener colonias del mismo. Este medio puede a la vez ser diferencial (se diferencian cepas o especies bacterianas en base a alguna caracterstica de las colonias). - Incubar a temperatura y tiempo adecuados. - Observar crecimiento de colonias aisladas. Luego del aislamiento se har un repique de alguna de las colonias obtenidas a un agar nutritivo para hacer una coloracin de Gram. Posteriormente se identificarn los microorganismos en base a las pruebas bioqumicas y a las otras tcnicas de coloracin. Aislamiento de Enterobacterias 1- Tomar 1ml de muestra de agua y sembrar en caldo Mac Conkey 1X en tubos con campanita de Durham. 2- Incubar durante 48 hs. a 37C. 3-Observar crecimiento (la formacin de gas y viraje del indicador Azul de Bromocresol a amarillo indica probable presencia de E. coli). 4- Tomar una muestra con el ansa y estriar sobre placas con agar EMB. 5- Incubar durante 24 hs. a 37 C. 6- Observar colonias con distinta morfologa y color. Aislamiento de Pseudomonas sp. 1- Sembrar 1 ml. de agua en caldo M9. 2- Incubar 48 hs. a 37 C. 3- Si se observa crecimiento, tomar una muestra con el ansa y estriar sobre una placa con agar Cetrimida. 4-Incubar 48 hs a 42C. 5- Observar crecimiento de colonias con pigmento verde

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Aislamiento de Bacillus sp. 1- Agregar 10 g. de arroz (una cucharada) a 30 ml de solucin fisiolgica estril. 2- Agitar durante 15 minutos. 3- Calentar a 80 C durante 5 minutos. 4- Tomar 1 ml. del sobrenadante y pasarlo a un tubo con caldo nutritivo. 5- Incubar 48 hs. a 37 C. 6- Estriar en agar Mossel (selectivo y diferencial) 7- Incubar 48 hs. a 37 C 8- Observar el crecimiento de colonias con un halo rosa y precipitado de lecitina (B. cereus, manitol -, lecitinasa +) y colonias con halo amarillo sin precipitado (B. subtilis, manitol +, lecitinasa -). Aislamiento de Lactobacillus sp 1- Realizar diluciones de yogur en solucin fisiolgica y sembrar 0,1 ml de cada dilucin en agar MRS 2-Incubar 48 horas a 37 C en anaerobiosis. 3- Calcular el recuento de bacterias lcticas del yogur y observar los distintos fenotipos de colonia crecidos en el agar MRS. 4- Seleccionar 2 fenotipos de colonias diferentes y a partir de ellas sembrar por estra con ansa en agar Rogosa. 5- Incubar en condiciones de anaerobiosis a 37 C. Bibliografa Brock, T.D.; Smith, D.W. & Madigan, M.T. Microbiologia Prentice Hall Hispanoamericana S.A., Sexta Edicin, 1993

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T.P.N6 PRUEBAS BIOQUIMICAS Se trata de un conjunto de reacciones basadas en el metabolismo de los microorganismos. Entre otros aspectos, se analiza la accin de la bacteria sobre los hidratos de carbono (qu fuente de carbono utiliza, en qu condiciones, cmo la utiliza, qu productos se obtienen), la liberacin de exoenzimas, metabolitos y toxinas al medio de cultivo, la motilidad, etc. A partir del conocimiento del metabolismo, las pruebas bioqumicas nos permiten determinar el gnero y la especie de la bacteria en estudio. Esta identificacin debe hacerse a partir de un cultivo puro y fresco (18-24 horas). Hay que tener en cuenta, adems, que las caractersticas metablicas de los microorganismos pueden variar en funcin de distintos factores de manera que para realizar una caracterizacin confiable es necesario realizar las pruebas en condiciones estandarizadas (en cuanto al inculo, los reactivos, las condiciones de incubacin y el tiempo de lectura) y utilizar ms de una prueba en cada caso. La eleccin de las mismas se har en base a la familia en estudio, lo cual se ir determinando en el curso del aislamiento. Las pruebas ms comunmente utilizadas son: 1) Prueba de oxidasa Esta prueba sirve para la determinacin de la presencia de la enzima citocromo oxidasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar enterobacterias, distintas especies de Streptococcus, Staphylococcus y Micrococcus (-) de algunas especies de Pseudomonas u Aeromonas (+). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tiras de papel de filtro impregnadas en reactivo de Kovacs (1 naftol + dimetilparafenilendiamina). - ansa. Procedimiento: 1.- Levantar con el ansa una colonia del cultivo puro. 2.- Aplicar dicha colonia sobre la tira de papel de filtro embebida con el reactivo de Kovacs, asegurndose de extender bien el material. 3.- Esperar 5-10 segundos y observar la coloracin. Interpretacin de resultados: * Prueba positiva: la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs vira al color azul por oxidacin de dicho compuesto a azul de indofenol. * Prueba negativa: el color de la tira de papel de filtro embebida en reactivo de Kovacs no se modifica. 2) Prueba de catalasa Esta prueba sirve para comprobar la presencia de la enzima catalasa en preparaciones de microorganismos. Permite diferenciar:

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A) gneros: Streptococcus (-) de Micrococcus (+) y/o Staphylococcus (+); Bacillus (+) de Clostridium (-) y Corynebacterium (+) de Erysipelothrix (-), siendo excepciones en este ltimo caso, Corynebacterium pyogenes (-) y Corynebacterium haemolyticum (-). B) especies: Moraxella bovis (variable) y Moraxella kingii (-) de otras especies de Moraxella (+). Materiales: - Cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - ansa. - portaobjetos limpios. - agua estril. - agua oxigenada fresca. Procedimiento: 1.- Colocar una gota de agua en un portaobjetos limpio. 2.- Colocar dos ansadas del cultivo a probar sobre la gota de agua y hacer una suspensin espesa (no dejar secar). 3.- Agregar 2 o 3 gotas de agua oxigenada fresca. 4.- Observar los resultados. Interpretacin de resultados: * Prueba positiva: formacin inmediata de burbujas bien visibles (desprendimiento de O2). * Prueba negativa: no hay formacin de burbujas (no se forma O2). 3) Prueba de licuefaccin de la gelatina Esta prueba sirve para determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas de tipo proteoltico (gelatinasas) que licuan la gelatina. Permite diferenciar especies: Staphylococcus aureus (+) de Staphylococcus epidermidis (lento y +) y especies de Micrococcus (variables y lentas); Listeria monocytogenes (-) de Corynebacterium ulcerans (+), Corynebacterium haemolyticum (+) y Corynebacterium pyogenes (variable). Tambin ayuda a identificar: Serratia liquefaciens (+), Serratia marcescens (+), Pseudomona aeruginosa (+, rpida) y especies de Flavobacterium (+). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - ansa. - tubos de hemlisis con gelatina nutritiva. Procedimiento: 1.- Inocular por puncin los tubos conteniendo gelatina nutritiva. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37 oC durante 48 horas. 3.- Colocar en heladera 2 horas y luego observar licuacin y crecimiento. Interpretacin de resultados: * Prueba positiva: a) tubo inoculado: medio lquido. b) tubo control: medio se mantiene slido. * Prueba negativa: a) tubo inoculado: el medio se mantiene slido. Volver a incubar un tiempo adicional. b) Tubo control: el medio se mantiene slido.

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4) Prueba de reduccin de nitratos Esta prueba permite determinar la capacidad de un organismo de reducir el nitrato en nitritos o en nitrgeno libre. Sirve para identificar miembros de la familia Enterobacteriaceae (por lo general +) y diferenciar: 1.- Haemophilus ducreyi (-) y Haemophilus vaginalis (-) de otras especies de Haemophilus (+). 2.- Branhanella catarrhalis (+) y Neisseria mucosa (+) de otras especies de Neisseria(-) Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo nitrato. - Reactivo A: solucin de dimetilnaftilamina 0,6%. - Reactivo B: solucin de cido sulfanlico 0,8%. - polvo o limaduras de cinc. Procedimiento: 1.- Inocular tubos de caldo nitrato con el microorganismo que se desea estudiar. 2.- Incubar durante 18-24 horas a 37 oC. 3.- Determinar nitritos: Fase I: - Agregar directamente al cultivo en caldo nitrato, 1 ml de reactivo A y 1 ml de reactivo B. - Agitar bien. - Esperar 30 segundos y observar coloracin. Si el resultado fuera positivo, la prueba se da por terminada. Si el resultado fuera negativo, continuar con la fase II. Fase II: - Agregar al tubo que ya contiene los reactivos A y B una pizca de polvo de cinc. - Agitar bien. - Esperar 30 segundos y observar coloracin. Interpretacin de los resultados: A) Fase I: * Prueba positiva: color rosado a rojo intenso porque el nitrato ha sido reducido a nitrito por el organismo. * Prueba negativa: no se observa cambio de color. B) Fase II (prueba de la reduccin del cinc): * Prueba positiva: no se observa cambio de color, por ausencia de nitrato en el medio, lo cual indica que el organismo redujo el nitrato en nitrito y luego redujo nuevamente el nitrito. * Prueba negativa: color rosado a rojo intenso, por presencia de nitrato que no ha sido reducido por el organismo. El cinc redujo el nitrato en nitrito. 5) Prueba del agar hierro de Kligler Permite determinar la capacidad de un microorganismo de metabolizar un hidrato de carbono especfico incorporado a un medio de crecimiento bsico as como la de producir gas y cido sulfhdrico. Se utiliza para identificar diferentes especies bacterianas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae.

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Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos en pico de flauta con agar hierro de Kligler, pH=7,4. - ansa. Procedimineto: 1.- Inocular cada uno de los microorganismos aislados por puncin y por estra en el mismo tubo de medio agar hierro de Kligler. 2.- Incubar a 37 oC durante 18-24 horas. 3.- Observar entre las 18 horas y las 24 horas de cultivo (ni antes ni despus). Interpretacin de resultados: La utilizacin de un hidrato de carbono implica la liberacin al medio de productos cidos capaces de ser detectados por un indicador de pH. Si el microorganismo es incapaz de utilizar el hidrato de carbono, consume las peptonas del medio liberando productos que alcalinizan el medio. Cuando se interpretan los resultados de esta prueba deben analizarse los siguientes aspectos: A) Utilizacin del hidrato de carbono: * Si el microrganismo en estudio slo fermenta la glucosa: a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo. b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo. * Si el microorganismo en estudio es capaz de fermentar tanto la glucosa como la lactosa: a) en superficie: reaccin cida, color amarillo. b) en profundidad: reaccin cida, color amarillo. * Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa ni la lactosa (no entrico): a) en superficie: reaccin alcalina, color rojo. b) en profundidad: si el microorganismo es aerobio no se observa crecimiento ni cambio de color; si el microorganismo es facultativo, reaccin alcalina, color rojo. * Si el microorganismo en estudio no es capaz de fermentar la glucosa pero si de oxidarla: a) en superficie: reaccin cida a tiempos cortos y luego alcalina, color rojo. b) en profundidad: no se observa crecimiento ni cambio de color. B) Produccin de gas: * Si el microorganismo en estudio es aerognico, la produccin de H2 y CO2 se manifiesta mediante la formacin de una o varias burbujas o el desprendimiento del medio del fondo del tubo dejando un rea clara. * Si el microorganismo en estudio es anaerognico, no hay produccin de gases. C) Produccin de cido sulfhdrico (SH2): * Si el microorganismo en estudio produce este cido, se manifestar por la presencia de un precipitado negro de sulfuro de hierro en la parte profunda del tubo. * Si el microorganismo en estudio no produce este cido, se manifestar por la ausencia de dicho precipitado. 6) Prueba de extraccin de pigmento con cloroformo Esta prueba bioqumica permite investigar los pigmentos producido por cepas de Pseudomonas. Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo nutritivo. - ansa. - cloroformo

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Procedimiento: 1.- Sembrar el microorganismo en estudio en caldo nutritivo. 2.- Incubar a 37 oC. 3.- Agregar 1 ml de cloroformo al contenido del tubo y agitar. 4.- Observar los resultados. Interpretacin de resultados: * Prueba positiva: la fase clorofrmica toma color azul verdoso por extraccin de piocianina. * Prueba negativa: la fase clorofrmica permanece amarilla (no se extrajo pigmento). 7) Prueba de hidrlisis de almidn Permite investigar la presencia en el microorganismo en estudio de una enzima capaz de hidrolizar el almidn. Esta enzima es muy comn en distintos miembros del gnero Bacillus. Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - placas de Petri con agar almidn. - ansa. - lugol. Procedimiento: 1.- Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa con agar almidn. 2.- Incubar a 37 oC hasta observar desarrollo. 3.- Inundar la placa con lugol. 4.- Dejar actuar 10 minutos. 5.- Observar la coloracin. Interpretacin de resultados: * Prueba positiva: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobre fondo azul. * Prueba negativa: ausencia de halos; coloracin azul alrededor de las colonias (presencia de complejo Iodo-almidn). 8) IMViC Son cuatro pruebas que se utilizan para distinguir bacterias coliformes entre si. Las pruebas son: Indol, Rojo de Metilo, Voges Proskauer y Citrato. Investigacin de la produccin de Indol. Con esta prueba bioqumica se mide la capacidad del microorganismo de producir indol a partir de la molcula de triptofano. Sirve para diferenciar Escherichia coli y distintas especies del gnero Edwarsiella (+) de especies de los gneros Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo triptona. - ansa.

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- reactivo de Kovacs: alcohol amlico + paradimetilbenzal- dehdo en medio cido. Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo triptona. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37 oC durante 48 horas. 3.- Determinar la presencia de indol utilizando el reactivo de Kovacs. Para ello, colocar en un tubo de ensayo 1 ml de medio, agregar 0,1 ml de reactivo y dejar reposar hasta la formacin de un anillo. 6.- Observar coloracin. Interpretacin de los resultados * Prueba positiva: un anillo rojo en la superficie del medio en la capa alcohlica (corresponde a la formacin de un compuesto quinnico coloreado derivado del indol). * Prueba negativa: anillo amarillo en la superficie del medio en la capa alcohlica (ausencia de indol en medio de cultivo). Investigacin de la produccin de acetil metil carbinol (Voges Proskahuer) y cidos (rojo de metilo). Con estas dos pruebas se estudia qu tipo de fermentacin (butilengliclica o cido mixta) realiza el microorganismo en estudio. La prueba de Voges-Proskauer sirve para comprobar la capacidad de algunos organismos de producir un producto final neutro, el acetilmetilcarbinol (acetona) a partir de la fermentacin (butilengliclica) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar Klebsiella pneumoniae y Enterobacter (+) de Escherichia coli y otras especies de Klebsiella (-). La prueba del rojo de metilo sirve para comprobar la capacidad de un organismo de producir y mantener estables los productos terminales cidos de la fermentacin (cido mixta) de la glucosa. Esta prueba permite diferenciar Escherichia coli (+) de distintas especies pertenecientes a los gneros Enterobacter y Klebsiella (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo glucosa fosfato. - ansa. - reactivos para la determinacin de acetil-metil-carbinol (solucin alcohlica de naftol al 5% y KOH al 40%). - reactivos para la determinacin de cido (solucin de rojo de metilo 0,1%). Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo glucosa fosfato. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37oC durante 48 horas. 3.- Dividir el contenido de cada uno de los tubos en dos partes iguales. En una mitad, investigar la presencia de acetil-metil-carbinol y en la otra la presencia de cidos. - Para determinar acetil-metil-Carbinol: a) Agregar 0.6 ml de solucin alcohlica de naftol al 5%. b) Agregar 0,2 ml de solucin de KOH al 40%. c) Agitar y dejar en reposo 5-10 minutos. d) Observar la coloracin resultado. - Para determinar cidos: a) Agregar al cultivo 10 gotas de solucin de rojo de metilo 0,1%. b) Observar la coloracin.

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Interpretacin de resultados: Voges-Proskauer * Prueba positiva: color rojo rosado en la superficie del medio (presencia de acetona). * Prueba negativa: sin cambio de color (color amarillo) en la superficie del medio. Rojo de Metilo * Prueba positiva: el cultivo es lo suficientemente cido como para permitir que el reactivo rojo de metilo mantenga un color rojo definido (pH= 4,4) en la superficie del medio. * Prueba negativa: color amarillo (pH= 6) en la superficie del medio. Investigacin del aprovechamiento de citrato Se usa para determinar la capacidad del microorganismo para utilizar citrato como nica fuente de carbono. Permite diferenciar especies de Salmonella, Klebsiella y Enterobacter (+) de Escherichia coli y especies de Edwarsiella, Yersinia, Actinobacillus (-). Materiales: - cultivos puros de bacterias crecidos 18-24 horas en agar nutritivo. - tubos con caldo citrato de Koser. - ansa. Procedimiento: 1.- Inocular tubos conteniendo caldo citrato de Koser. Dejar un tubo sin inocular como control. 2.- Incubar a 37oC durante 48 horas. 3.- Observar la presencia o ausencia de crecimiento. Interpretacin del resultado: * Prueba positiva: hay crecimiento (turbidez). * Prueba negativa: ausencia de crecimiento.

Bibliografa Mac Faddin, J. F., Pruebas Bioqumicas para la identificacin de bacterias. Editorial Mdica Panamericana, Buenos Aires, Argentina, 1980.

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SISTEMAS MULTIPRUEBAS PARA LA IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS 1) SISTEMA API 20E PARA ENTEROBACTERIAS Descripcin general: Es un sistema miniaturizado de las pruebas convencionales que se emplean para la identificacin de enterobacterias y otras bacterias Gram negativas. Se trata de microtubos con sustratos deshidratados a los que se les agrega una suspensin bacteriana y se incuban durante 18 a 24 hs. a 37 C. En cada microtubo se halla incorporado un sistema indicador. Al cabo del tiempo de incubacin ese sistema es afectado por metabolitos de la bacteria o por reactivos agregados. Se registran los resultados obtenidos en cada microtubo y en base a ellos se identifica la bacteria en cuestin. Instrucciones para el uso del sistema: a)- Agregar 5 ml. de agua en la base de la caja antes de sacar la tira. Esto sirve para mantener una atmsfera hmeda durante la incubacin. b)- Picar con el ansa una colonia y resuspender en un tubo con solucin fisiolgica estril. Agitar con vortex. c)- Ubicar la tira en la bandeja con agua. d)- Sembrar muy suavemente la suspensin bacteriana con pipeta Pasteur. Para ello se debe tener en cuenta lo siguiente: cada microtubo est compuesto por un tubo y una cpula y la cantidad de inculo a agregar a cada uno depende del tipo de prueba. Para el llenado se inclina la bandeja y se apoya la punta de la pipeta contra un costado de la cpula. Cada uno de los 20 microtubos se llenan hasta el volumen del tubo. Los microtubos correspondientes a las pruebas CIT, VP y GEL se llenan completamente (tubo + cpula). Aquellos correspondientes a las pruebas cuyos nombres estn subrayados se llenan hasta el volumen del tubo y luego se completa el volumen de la cpula con aceite mineral. e)- Incubar entre 18 y 24 hs. a 37 C. f)- Luego de la incubacin, se anotan los resultados obtenidos en todas las pruebas que no requieran el agregado de reactivos. Si el microtubo de glucosa es negativo (azul o verde), se debe contar el total de ensayos positivos. Pueden entonces presentarse las siguientes alternativas: 1)- Si dicho nmero es menor o igual a 2, se reincuba 18-24 hs. a 37 C. 2)- Si el nmero es mayor que 2 se agregan los reactivos a las pruebas que correspondan, se realiza la prueba de oxidasa (ver ms adelante) y se anotan todos los resultados obtenidos. Si el ensayo de glucosa es positivo (amarillo) al cabo de las primeras 18-24 hs. de incubacin, se procede de la misma forma que en el caso de la alternativa 2) del prrafo anterior. g)- Identificacin de la bacteria por comparacin de los resultados obtenidos con una tabla. Caractersticas de las pruebas e interpretacin de resultados. ONPG: determina la actividad de la enzima -galactosidasa. -galactosidasa ONPG---------------------------------------------ortonitrofenol (Orto-nitrofenil(amarillo) -D-galactopiransido) Reaccin positiva: amarillo. Reaccin negativa: incoloro.

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ADH: determina actividad de la enzima arginina dehidrolasa. ADH arginina---------------------------ornitina + NH4 + CO2 El amonio produce un cambio en el pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reaccin positiva: rojo. Reaccin negativa: amarillo. LDC: determina actividad de la enzima lisina decarboxilasa. LDC lisina------------------------------cadaverina (amina) La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reaccin positiva: rojo. Reaccin negativa: amarillo. ODC: determina actividad de la enzima ornitina decarboxilasa. ODC ornitina---------------------------putrescina (amina) La amina produce un cambio de pH y un viraje del indicador del amarillo al rojo. Reaccin positiva: rojo. Reaccin negativa: amarillo. CIT: determina la capacidad de la bacteria de usar el citrato como nica fuente de carbono. El consumo del citrato produce un aumento de pH y un viraje del indicador de verde a azul. Reaccin positiva: azul. Reaccin negativa: verde. H2S: determina la capacidad de la bacteria de reducir el tiosulfato a H2S para reducir la tensin de oxgeno. El H2S se combina con sales de hierro y forma un precipitado negro. Reaccin positiva: precipitado negro. Reaccin negativa: ausencia de precipitado. URE: determina la actividad de la enzima ureasa. ureasa urea---------------------------NH4 El amonio produce un cambio de pH y un viraje del indicador de amarillo a rojo si se observa entre las 18 hs. y las 24 hs., o de naranja a rojo si se observa entre las 36 y 48 hs.

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Reaccin positiva: rojo o naranja. Reaccin negativa: amarillo. TDA: determina la actividad de la enzima triptofano deaminasa. TDA triptofano-----------------------indolpirvico + NH4 Al final de la incubacin se agrega una gota de cloruro frrico al 10%. El cido indolpirvico produce un color rojo-amarronado en presencia del mismo. Reaccin positiva: rojo-amarronado. Reaccin negativa: amarillo. IND: determina la capacidad de la bacteria de metabolizar el triptofano. triptofanasa triptofano------------------------indol Al final de la incubacin se agrega una gota del reactivo de Kovacs. La reaccin debe ser leda dentro de los dos minutos de agregado el mismo. El indol se combina con el p-dimetilamino benzaldehdo presente en el reactivo y se forma una quinona de color rojo violceo. Reaccin positiva: color rojo. Reaccin negativa: amarillo. VP: Determina la presencia de acetona como intermediario en el metabolismo de la glucosa. Al final de la incubacin se agrega una gota de KOH al 40% y luego una gota de alfa-naftol. Se esperan 10 minutos antes de observar el resultado. Reaccin positiva: rojo Reaccin negativa: incoloro Reduccin de nitratos: Determina la capacidad del microorganismo de reducir el nitrato a nitrito o a nitrgeno libre. La prueba se lleva a cabo en el mismo microtubo que la de glucosa. Adems de anotar el resultado de dicha prueba, se observa si hay burbujas, lo cual indica que se redujeron los nitratos a nitrgeno gaseoso. Se agregan dos gotas de cido sulfanlico al 0.8% y dos gotas de N,N- dimetil- naftilamina. Se espran de 2-3 minutos. Si hay nitritos en el medio, los mismos forman un complejo de color rojo con los reactivos. Los resultados negativos se confirman agregando zinc al microtubo. Los nitratos son reducidos por el zinc dando un color rosa anaranjado. Si no hay un cambio de color, es porque los nitratos fueron reducidos primeramente a nitritos y posteriormente a N2 o a alguna amina aerognica.

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GEL: Determina la activiada de la enzima gelatinasa. La licuefaccin de la gelatina por esta enzima libera un pigmento negro que difunde al medio. Reaccin positiva: difusin del pigmento negro Reaccin negativa: no hay difusin. GLU, MAN, INO, SOR, RHA, SAC, MEL, AMY, ARA: Determinan la capacidad de un organismo anaerbico de fermentar el carbohidrato o la de un organismo aerbico de oxidarlo. GLU: glucosa, MAN: manitol, INO: inositol, SOR: sorbitol, RHA: ramnosa, SAC: sacarosa, MEL: melibiosa, AMY: amigdalina, ARA: arabinosa. Como consecuencia de la utilizacin del carbohidrato, se forman productos cidos. El descenso de pH produce un viraje del indicador de azul a amarillo. MAN; INO; SOR: determina la actividad de la enzima catalasa. 2 H2O2 2 H2O + O2 (gas)

La reaccin se lleva a cabo en los mismos microtubos utilizados para MAN; INO y SOR. Despus de leer los resultados de dichas reacciones, se agrega una gota de H2O2 al 1.5% a cada tubo. Se espera de 1-2 minutos y se observa si hay formacin de burbujas. Reaccin positiva: formacin de burbujas Reaccin negativa: no se forman burbujas Prueba de oxidasa: Se embebe un papel de filtro con una suspensin bacteriana similar a la utilizada para inocular los microtubos. Se agrega una gota de clorhidrato de tetrametil-pfenildiamina al 1%. Si la reaccin es positiva, el rea del papel que contiene la suspensin de bacterias toma un color prpura dentro de los 30 segundos. Si la reaccin es negativa no se registra ningn cambio de color.

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T.P.N7 RASTREO DE CEPAS PRODUCTORAS DE DE ENZIMAS INTERS BIOTECNOLGICO Objetivos: Determinar la capacidad de los microorganismos aislados en el TP anterior de producir enzimas de inters industrial utilizando ensayos en placa y verificar actividad a distintas temperaturas de incubacin. Introduccin: En el siguiente trabajo prctico se estudiar la capacidad de los microorganismos aislados de diversas fuentes de producir enzimas que se utilizan en la industria en general. Principalmente se seleccionarn aquellos que tengan una mayor actividad con respecto a los controles empleados y a distintas temperaturas de incubacin. Adems cuando sea posible se utilizar dicha caracterstica para la identificacin de los mismos. Las enzimas se producen comercialmente desde fines del siglo pasado y a partir de la dcada del 60 comienza la produccin masiva con microorganismos. Los microorganismos ofrecen grandes ventajas como sistemas de produccin de enzimas, dada su alta velocidad de sntesis, alto rendimiento de conversin de sustrato en protena enzimtica, gran versatilidad y mayor simplicidad en la manipulacin ambiental y gentica de su capacidad productiva. Las enzimas de uso industrial, son mayoritariamente hidrolasas extracelulares de estructura simple, estables y sin requerimientos de cofactores disociables para su actividad. Estas enzimas son producidas por las bacterias como respuestas adaptativas de fase estacionaria que le sirven para la provisin de nutrientes en condiciones de hambreado extremo como lo es la situacin en su hbitat natural. Mientras que para las bacterias Gram positivas la exportacin al extracelular esta facilitada por carecer de membrana externa, las Gram negativas presentan complejos sistemas de secrecin para atravesar la capa externa de LPS. Adems existen diferentes niveles de control gentico de la expresin de estas actividades, que han sido ampliamente estudiados. Uno de los problemas de las enzimas es su inestabilidad, siendo particularmente sensibles a la temperatura; de manera que la vida media puede llegar a ser muy corta o su actividad baja en temperaturas ambiente. En la siguiente tabla se muestra las enzimas de produccin microbiana que sern rastreadas y su campo de aplicacin industrial:
Nombre de la enzima y reaccin catalizada -Amilasa Hidrlisis de almidn Proteasa Hidrlisis de protenas Lipasa Hidrlisis de lpidos Origen microbiano Bacillus, Aspergillus, otros hongos Bacillus y otras bacterias, tambin hongos Pseudomonas y Hongos Campo de aplicacin industrial Obtencin de jarabe de glucosa; eliminacin del apresto del almidn Aditivos de productos de lavado; curtidos Curtidos, aditivos de productos de lavado

Metodologa: Para todas las actividades que se evaluaran se empleara el sistema de deteccin en placa de halos de degradacin. Esto se realiza en forma directa por inspeccin de la placa o por revelado especifico que produce diferencias en la coloracin en las zonas degradadas respecto del fondo no hidrolizado. En todos los casos se comparara la actividad con respecto a los controles empleados. Estas comparaciones requieren que exista un desarrollo microbiano similar para evaluar cuantitativamente los resultados a distintas temperaturas de incubacin.

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1) Produccin de amilasas. El almidn es un polisacrido de reserva complejo. Almidn es un polmero de glucosa en enlace glucosidico lineal (amilasa) -1,4 o ramificado (amilopectina) -1,6. Un test cualitativo para determinar su presencia es la aparicin de un color azul luego de la adicin de una solucin de ioduro de potasio/ I2. Luego de la hidrlisis del almidn, los productos de clivaje (dextrinas, maltosa y glucosa) no dan este color. Este principio ser utilizado para testear la hidrlisis del almidn en este trabajo. La capacidad de un microorganismo de hidrolizar el almidn esta asociada a la enzima alfa-amilasa extracelular. Esta sirve como criterio de identificacin de aislamientos desconocidos. 1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placas de Agar Almidn. Inocular dos placas con microorganismos control, Escherichia coli y Bacillus subtillis. 2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo. 3. Testear la hidrlisis del almidn por accin del microorganismo cubriendo la superficie de la placa con una solucin de ioduro de potasio/ I2 (lugol) 4. Dejar actuar 10 minutos. 5. Observar la coloracin: halos de degradacin (marrones o transparentes) alrededor de las colonias sobre fondo azul. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura. 2) Produccin de proteasas Muchas bacterias pueden degradar diversas protenas y utilizar los pptidos y aminocidos resultantes como fuente de energa y para sintetizar sus propias protenas. Un ejemplo es la hidrlisis de la casena. La casena existe en la leche como una suspensin coloidal que da a la leche su aspecto opaco. Muchas bacterias producen enzimas que hidrolizan esta protena dando derivados solubles y transparentes. La ruptura de protenas a veces llamada peptonizacin, es til en la identificacin de especies microbianas. 1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa de Agar Leche Inocular dos placas control con Escherichia coli y Bacillus subtillis. 2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs o hasta observar desarrollo. 3. Colocar las placas sobre una superficie negra y analizar la presencia o ausencia de zonas claras (halos de degradacin) alrededor del rea de crecimiento de los microorganismos testeados. Comparar con los controles ensayados y en cada temperatura.

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3) Produccin de lipasas Las lipasas tienen la capacidad de hidrolizar fosfolpidos, como los presentes en las lecitinas de la yema del huevo. El clivaje de las uniones fosfoester por accin de la Fosfolipasa C forma un diglicrido insoluble en agua. Esta actividad enzimtica puede ser detectada por una zona de opalescencia en el medio alrededor de la masa celular. Otra posible accin enzimtica es la de la Fosfolipasa A, dando un producto soluble en agua (lisolecitina), que en cambio se observa como una zona transparente alrededor de la masa celular. Los fosfolpidos son componentes mayoritarios y funcionales de las membranas celulares. La capacidad de hidrlisis de fosfolpidos de clulas huspedes es un factor importante de virulencia de las bacterias que la poseen y por lo tanto su determinacin es una herramienta utilizada para caracterizar e identificar miembros de los gneros Pseudomonas, Staphylococcus, Bacillus y Clostridium. 1. Sembrar el microorganismo en estudio por estra en una placa de Agar Yema de huevo. Inocular placas control con Bacillus cereus, Steptomyces sp, Pseudomonas aeruginosa y Escherichia coli. 2. Incubar a 22, 30 y 42 oC durante 48 hs. o hasta observar desarrollo. 3. Observar la presencia o ausencia de halos de precipitado insoluble o traslcido alrededor del rea de crecimiento de los microorganismos testeados.

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T.P.N8 ANLISIS MICROBIOLGICO DE AGUAS INTRODUCCIN Uno de los principales requisitos para que el agua sea apta para consumo es que est libre de bacterias patgenas para el hombre. Generalmente, los anlisis de rutina no estn dirigidos a la bsqueda directa de microorganismos causantes de enfermedades que se transmiten a travs del agua (ej: fiebre tifoidea, clera, etc.). Por lo general se busca detectar la presencia de microorganismos caractersticos del intestino de mamferos. La presencia de stos indicara contaminacin fecal en las fuentes de agua utilizadas. Asimismo se utiliza como indicador de contaminacin el recuento de bacterias totales. OBJETIVO - Determinacin de la presencia de bacterias coliformes en agua para establecer si es apta para consumo humano. Para sto, se determinarn las bacterias coliformes totales, y entre stas se discriminarn las que son de procedencia fecal de las que no lo son. MATERIALES Y MTODOS - Caldo Brila Fluorocult (Merck) (ver al final) de simple y doble concentracin - Caldo Citrato de Koser - Tubos de ensayo con campanitas de Durham - Baos o estufas a 37 C . - Luz U.V. Fundamentos del mtodo En un primer ensayo se busca detectar la presencia de bacterias coliformes totales, basndose en la capacidad de dichos organismos de fermentar lactosa con la produccin de cido y gas. Se considera indicador positivo la produccin de gas, dado que otros microorganismos (no coliformes) son capaces de producir acidez y no gas. Un segundo paso consiste en la diferenciacin entre las bacterias coliformes de origen fecal y no fecal. El primer grupo est representado por E. coli fecal cuyo hbitat es el intestino humano y el de otros animales. El segundo grupo, antiguamente llamado IAC, est representado por bacterias cuyo origen es el suelo y la vegetacin (Escherichia sp., Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella). Finalmente, la cuantificacin se hace por el mtodo del nmero ms probable, que es un mtodo estadstico basado en la teora de las probabilidades de Poisson. Para ello se tiene en cuenta el nmero de porciones de la muestra que se siembra en el medio original de crecimiento y el nmero de dichas porciones que contienen coliformes. El volumen de las porciones a sembrar y el nmero de diluciones consecutivas a realizar, depende del conocimiento que se tenga del grado de contaminacin del agua. De cualquier forma, los volmenes debern ser tales que: 1) Todos o la mayora de los tubos de la mayor dilucin hayan dado negativos a la produccin de gas en el Caldo Brila a 37 C. 2) Todos o la mayora de los tubos de la menor dilucin hayan dado positivos a dicho ensayo Para que el agua de una fuente dada pueda ser considerada potable desde el punto de vista microbiolgico, las bacterias presentes en la muestra no deben superar los siguientes valores: Coliformes totales: < 2.2 coliformes/100 ml Coliformes fecales: 0 coliformes/100 ml

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Prctica: A) Determinacin de coliformes totales: 1) Se siembran por triplicado en tubos de fermentacin que contienen 10 ml de Caldo Brila , 10, 1 y 0.1 ml de la muestra de agua. Las siembras que se hagan con un volumen de 10 ml, se harn en un volumen igual de caldo de cultivo de doble concentracin. Las siembras que se hagan con un volumen igual o menor a 1 ml, se harn directamente en 5 ml de caldo de cultivo de simple concentracin. 2) Se incuban los tubos sembrados a 37 C durante 48 hrs. 3) Se observan los tubos a las 48 horas. Se considera resultado positivo la produccin de gas (debido a la fermentacin de la lactosa) que ocupe ms de 1/3 del volumen de la campanita de Durham. 4) Se anota la cantidad de tubos positivos de cada dilucin. Se selecciona mediante un criterio adecuado la combinacin de tubos con la que se continuar el anlisis. B) Diferenciacin de las bacterias coliformes de origen no fecal y fecal: Coliformes de origen no fecal: A partir de los tubos que dieron positivo (produccin de gas) se siembran, con ansa recta, tubos conteniendo caldo Citrato de Koser y se los incuba a 37 C por 48 horas. Solo los coliformes no fecales pueden crecer utilizando el Citrato como nica fuente de carbono a esa temperatura. Un resultado positivo en estos tubos se evidencia por la aparicin de turbidez. Coliformes de origen fecal: En los tubos positivos, la deteccin de la presencia de E. coli se efecta mediante fluorescencia al iluminar con luz U.V.. Para confirmar el ensayo se utilizan como indicadores la formacin de gas y la prueba del indol utilizando el reactivo de Kovacs. Un resultado positivo ( presencia de gas, viraje del reactivo de Kovacs al rojo y fluorescencia a la luz U.V.)), estara indicando la presencia de E. coli. Se observan y anotan los tubos positivos de cada dilucin. Clculos e Informe: Con todos los resultados obtenidos, se buscan los datos en las tablas de nmeros ms probables y se confecciona un informe Mediante un simple clculo de proporcionalidad, se puede obtener a partir de los datos de la tabla las concentraciones de las coliformes fecales y no fecales: Coliformes fecales = X. a/(a+b) Coliformes no fecales = X. b/(a+b) Siendo: X: Nmero ms probable de coliformes segn las tablas de probabilidad. a: Nmero ms probable de coliformes fecales b: Nmero ms probable de coliformes no fecales X, a y b estn referidos a un volumen de 100ml, por lo tanto los resultados se informarn como el Nmero ms probable de bacterias por 100ml de agua. Medio de cultivo para la demostracin rpida de E. coli mediante fluorescencia. Fundamento Al margen de ciertas especies de Salmonella y Shigella, la bacteria Escherichia coli, es la nica especie perteneciente al grupo de las Enterobacterias que posee la enzima -D-glucuronidasa. Esta enzima es capaz de escindir el sustrato 4-metilumbeliferil--D-glucurnido (MUG), formando 4metilumbeliferona. Esta sustancia se caracteriza por ser fluorescente al iluminarse con luz U.V., lo

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que permite su deteccin fcilmente. Este hecho es, al mismo tiempo, un indicador de la presencia de E. coli. Caldo Brila Fluorocult Composicin (g/litro) Peptona ......................................................10,0 Lactosa........................................................10,0 Verde Brillante.............................................0,0133 L-Triptofano................................................1,0 Bilis de buey desecada..................................20,0 MUG............................................................0,1 Bibliografa: 1) Brock. T.D., Smith D.W. & Madigan M.T. " Microbiologa" 4ta. edicin . pp 637-647. 1984 2) Seeley H.W., Vandemark P.J & Lee J.J. " Microbes in action (A laboratory manual of microbiology)" 4th. edition chapter 12. 1991 3) Ferramola R." Examen bacteriolgico de aguas". Editorial el Ateneo. 1947.

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T.P. N 9 FORMACIN DE BIOFILMS BACTERIANOS INTRODUCCIN En los ltimos aos se ha demostrado que muchas bacterias en ambientes naturales, clnicos e industriales no se encuentran como clulas planctnicas estudiadas tpicamente el laboratorio, sino que se unen a superficies formando estructuras denominadas biofilms. Los biofilms se definen como poblaciones o comunidades microbianas unidas a una superficie que puede ser bitica o abitica. La formacin de los mismos depende de muchos factores de la superficie y ambientales tales como las caractersticas de sustrato, el inculo y la disponibilidad de nutrientes. Los microorganismos que habitan estas estructuras poseen una alta resistencia a diversos factores, incluyendo los bactericidas, por lo que algunos problemas derivados de los biofilms, en muchos casos, son difciles de solucionar. Entre las ventajas que representa este modo de vida para los microorganismos se encuentran la mayor disponibilidad de nutrientes cerca del soporte o superficie, la capacidad de promover el intercambio gentico y, en el caso de los patgenos, el incremento de la proteccin frente a las defensas del hospedador. Adems de las ventajas mencionadas, este modo de vida constituye una defensa frente a la predacin en ambientes naturales y en el caso de suelos tambin frente a la desecacin. El conocimiento de las caractersticas de los biofilms resulta de utilidad en estudios aplicados de biorremediacin y en algunos procesos como la biocatlisis. Por otra parte, los microorganismos formadores de biofilms provocan problemas en redes de distribucin de agua y otras caeras como las del transporte de petrleo o combustibles, tienen importancia en fenmenos de biocorrosin y desde el punto de vista clnico son frecuentemente responsables de las inflamaciones asociadas a los catteres, etc. OBJETIVO Analizar la capacidad de formacin de biofilms en Pseudomonas putida y Escherichia coli. Existe una gran variedad de sistemas disponibles para evaluar la formacin de biofilms bacterianos. Como un primer paso para estudiar la capacidad de formacin de los mismos se utilizarn microplacas de 96 pocillos fondo en U estriles para evaluar la unin de las bacterias a una superficie abitica. Est tcnica se emplea para analizar biofilms estticos. PROCEDIMIENTO Inocular 3-5 ml de caldo de cultivo con las bacterias de inters e incubar hasta fase estacionaria. Medir la densidad ptica (DO). Diluir los cultivos en caldo nutritivo fresco hasta DO600nm=0,025 e inocular 5 pocillos con 150 l de cada cultivo. Llenar 5 pocillos con el medio de cultivo utilizado. Tapar la microplaca. Incubar durante 24-48 h a 30C. Observar el crecimiento en los pocillos sembrados y ausencia en los controles. Retirar con pipeta cuidadosamente (sin tocar las paredes ni el fondo) el medio de cultivo para eliminar las clulas planctnicas. Lavar los pocillos con agua. Teir con 150 l de cristal violeta (0,1%), dejar en contacto con el colorante 20 min. Retirar el colorante que no se haya unido a las clulas y observar el patrn de unin. Lavar el exceso de colorante con agua.

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Solubilizar el colorante con 200 l de etanol (95%) a temperatura ambiente durante 10-15 min. Transvasar el contenido de los pocillos a una placa de 96 pocillos fondo plano y cuantificar midiendo la DO a 500-600 nm utilizando un lector de ELISA. Con esta metodologa se comparar la capacidad de formacin de biofilms en Pseudomonas putida y Escherichia coli. BIBLIOGRAFA O`Toole, G.A. and R. Kolter. (1998). Initiation of biofilm formation in Pseudomonas fluorescens WCS365 proceeds via multiple, convergent signaling pathways: a genetic analysis. Molecular microbiology, 28:449-461. Palmer J, Flint, S and J. Brooks, (2007) Bacterial cell attachment, the beginning of a biofilm. J Ind Microbiol Biotechnol (2007) 34:577588

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T.P. N 10 Parte A: PREPARACIN DE STOCKS Y TITULACIN DE BACTERIFAGOS OBJETIVOS - Preparacin y determinacin del ttulo de stocks de bacterifagos a travs de la formacin de placas de lisis. Microorganismos a utilizar: - Bacterifagos T4 - Escherichia coli Desarrollo experimental: Preparacin de stocks de los bacterifagos T4 - Inocular dos cultivos en fase exponencial de Escherichia coli ccda uno con una suspensin del bacterifago T4 a una multiplicidad de infeccin de 0,1. - Incubar a 37 C con agitacin durante dos a cuatro horas. - Centrfugar a 10.000 rpm durante aproximadamente 15 minutos a 4 C, para eliminar en el pellet los restos celulares y cosechar el sobrenadante en otro tubo. - Filtrar el sobrenadante por una membrana de nitrocelulosa de 0,45 de tamao de poro. - Controlar la ausencia total de bacterias en los stocks mediante plaqueo de una alcuota en agar LB. Titulacin de los stocks 1- Se preparan 12 placas de Petri conteniendo agar LB. Se dejan solidificar y se secan en estufa. 2- Se preparan diluciones seriadas decimales de los stocks de T4 y M13 en caldo LB(10-1 a 10-6). 3- Se dispone de tubos de hemlisis conteniendo 3 ml de agar LB blando (0,7% de agar), los cuales son mantenidos en un bao termostatizado a una temperatura de 45-50 C, sin dejar que solidifiquen. 4- Se inoculan 6 tubos conteniendo agar blando con 0,1 ml de un cultivo de Escherichia coli en crecimiento exponencial, que se corresponda con el tubo 1 de la escala de Mc Farland. Seguidamente, cada tubo se inocula con 0,1 ml de las diluciones 10-4, 10-5 y 10-6 de los fagos T4 y M13, se agita vigorosamente y la mezcla correspondiente a cada dilucin se vierte (por duplicado) sobre una placa conteniendo agar LB, la cual se mueve en forma circular para esparcir completamente el agar blando. 5- Las placas se incuban durante 48 hs. a 37 C. 6- Al cabo de dicho lapso, se observan las placas de lisis correspondientes a los bacteriofagos T4 y a M13. Se eligen aquellas placas en las cuales se puedan contar alrededor de 100 placas de lisis y se calcula el ttulo de cada stock como: Ttulo viral = promedio del nmero de placas de lisis (UFP/ml) volumen de inculo x dilucin Bibliografa Adams, M. H. Bacteriophages. Editorial Interscience N Y, 1959

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T.P. N 11 ANTIBITICOS A) PRODUCCION DE ANTIBIOTICOS A PARTIR DE Streptomyces sp. AISLADOS DE UNA MUESTRA DE SUELO INTRODUCCIN La bsqueda de microorganismos productores de nuevos antibiticos utilizados en diversos mbitos (agricultura, veterinaria y la industria farmacutica) ha sido y contina siendo intensa debido, principalmente, al fenmeno de resistencia a los antibiticos. Una gran cantidad de bacterias pertenecientes al Phylum Actinobacteria (actinomycetes) tienen la capacidad de sintetizar diferentes metabolitos secundarios biolgicamente activos: antibiticos, herbicidas, pesticidas, antiparasitarios y enzimas que son utilizadas para el tratamiento de desechos. En particular, los antibiticos resultan de gran importancia teraputica y comercial. Los actinomycetes constituyen un grupo ampliamente distribuido en la naturaleza. Semejantes a los hongos en su estructura filamentosa ramificada, estas bacterias son Gram positivas, aerbicas, mesfilas, morfolgicamente irregulares. Alrededor del 80% de los aislamientos del suelo pertenecen al Gnero Streptomyces; se encuentran en concentraciones viables de 106-107 por gramo de tierra. Diversas especies de Streptomyces producen geosminas responsables del olor caracterstico de la tierra frtil. Su aislamiento es relativamente sencillo pues son nutricionalmente muy verstiles: utilizan almidn, asparragina o malato clcico como fuente de carbono y casena no digerida o nitrato potsico como fuente de nitrgeno. Producen esporas, denominadas conidios, por tabicacin. Se han obtenido ms de 50 antibiticos diferentes a partir de especies de Streptomyces, incluyendo la estreptomicina, la neomicina, el cloranfenicol y las tetraciclinas. Objetivo: Obtener colonias de Streptomyces sp. productoras de antibiticos a partir de muestras de suelo. Desarrollo experimental 1) Preparar 3 placas de Petri con AS. Dejar solidificar y secar bien en estufa a 37 C. 2) Mezclar 1 gr. de tierra en 100 ml de agua destilada en un frasco estril (un frasco por cada 4 alumnos). Agitar vigorosamente durante 5 min.. Tomar 0,2 ml de dicha suspensin y diluirla en 1,8 ml de solucin fisiolgica estril en un tubo de hemlisis. Homogeneizar en agitador de tubos. Repetir la dilucin 3) Sembrar 0,2 ml con rastrillo de cada dilucin en placas de Petri con un inculo proveniente de la suspensin original y con otros dos inculos proveniente de la suspensin diluida. 4) Sembrar placas con S. aureofaciens y/o S. Venezuelae Estas bacterias son productoras de clortetraciclina y cloranfenicol, respectivamente. 5) Incubar a temperatura ambiente durante 5 das. 2do. da 1) Observar el desarrollo de colonias en las placas estriadas el 1er. da y describir su aspecto macroscpico. Las colonias de Streptomyces son pequeas, de consistencia firme y adheridas fuertemente al sustrato solidificado, de aspecto granuloso y pulverulento, generalmente pigmentadas (blanco, amarillo, rojo). Identificar una colonia aislada, realizar una tincin de Gram y observar al microscopio. 2) Preparar una suspensin de un microoganismo sensible (E.coli) colocando varias colonias en un tubo de hemlisis conteniendo 1 ml de solucin fisiolgica estril. Homogeneizar en agitador de tubos. Agregar 4.ml de agar AS blando. Conservar a 40C.

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3) Volcar con cuidado la suspensin de agar blando con las bacterias sensibles sobre las placas de Petri que tienen las colonias provenientes de las muestras de tierra, y las que tienen colonias de S. aureofaciens y/o S. venezuelae. 4) Dejar secar las placas durante 5 min. e incubar durante 24 hs. a a 37 C . 3er. da Observar los halos de inhibicin del crecimiento de B. subtilis y E. coli en las placas con AN controles debidos a la produccin de antibiticos de S. aureofaciens y/o S. venezuelae, y compararlos con los obtenidos a partir de los aislamientos de tierra. Bibliografa Madigan M.T., Martinko J.M. and Parker J. Biologa de los microorganismos, 10 Edicin, pp 415, 721-722, 2004. Seeley H.W., Vandemark P.J. and Lee J.J. Microbes in action (A laboratory manual of microbiology) 4th edition, pp. 173-176, 1991. http://www.accessexcelence.org/AE/AEC/AEF/1995/goudie_soil.html http://www-micro.msb.le.ac.uk/video/Streptomyces.html Purification and structure elucidation of antifungal and antibacterial activities of a newly isolated Streptomyces sp. Strain US80. Fourati-Ben Fguira L., Fotso S., Ben Ameur-Mehdi R., Mellouli L and Laatsch H. Research in Microbiology 156: 341-347, 2005. Plasticity of the Streptomyces genome-evolution and engineering of new antibiotics. Hranueli D., Cullum J., Basrak B., Goldstein P. and Long P.F. Current Nedical Chemistry 12: 1697-1704, 2005.

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T.P. N 12 DETERMINACIN DE LA SUSCEPTIBILIDAD A LOS ANTIBITICOS INTRODUCCIN El uso y abuso de los antibiticos en las terapias contra infecciones de origen bacteriano, conlleva a la seleccin de cepas bacterianas resistente. La diseminacin de estas resistencias a otras cepas de la misma o diferente especie se ve facilitada cuando los marcadores de resistencia (genes) se encuentran en elementos genticos mviles como son plsmidos y/o transposones La susceptibilidad de los microorganismos a los antibiticos se determina mediante tcnicas basadas en la dilucin o difusin del antibitico en un medio de cultivo donde desarrolla el microorganismo en estudio. Las tcnicas de dilucin en caldo y agar son utilizadas para medir la actividad de un agente antimicrobiano frente a una cepa bacteriana y permiten determinar la concentracin inhibitoria mnima (CIM) que es la menor concentracin de antimicrobiano capaz de inhibir el crecimiento bacteriano. La CIM indica la concentracin de antimicrobiano que se necesita para matar o inhibir el crecimiento del microorganismo analizado y permite valorar comparativamente la potencia de los antimicrobianos. La reproducibilidad de estas pruebas es de 1 dilucin y para evitar una gran variabilidad stas deben ser estandarizadas y controladas muy cuidadosamente. Los mtodos estandarizados se detallan ampliamente en el NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Para el caso de las tcnicas que se basan en la difusin del antibitico, el mtodo universalmente utilizado es el de Bauer y Kirby comnmente llamado antibiograma. Este mtodo consiste bsicamente en un disco de papel embebido en el antibitico que es colocado sobre un medio de cultivo slido inoculado con el microorganismo a ensayar; luego de 18 a 24 horas de incubacin se mide el halo de inhibicin del crecimiento bacteriano que produce el antibitico al difundir desde el disco de papel que lo contiene, radialmente hacia el medio de cultivo donde esta creciendo el microorganismo. El dimetro del halo de inhibicin del crecimiento en un antibiograma y el valor de la CIM para un determinado antibitico son un criterio de referencia experimental para determinar si un microorganismo es resistente o sensible a ese antibitico. Otro novedoso mtodo es el EtestTM , que permite la determinacin de la (CIM) . El EtestTM es una tira plstica que contiene un gradiente continuo de un antibitico, la tcnica combina el fenmeno de difusin con el de dilucin del antibitico para determinar la CIM para un dado microorganismo. Este mtodo, como veremos en el trabajo prctico, es mucho ms certero que el antibiograma y ms rpido y preciso que la tcnica de dilucin para obtener la CIM, que usualmente se realiza en varios pasos de dilucin y cultivo lo cual requiere disponer de mucho material estril para una sola determinacin. Materiales Cultivo exponencial de la cepa bacteriana a analizar. Agar Mller Hinton Cajas de Petri estriles Rastrillo (alcohol 70% para esterilizarlo) Ansa Pipetas de 1 ml y 10 ml estriles Solucin fisiolgica estril Solucin de hipoclorito al 5% para descarte de material contaminado. Tubos de ensayo estriles Hispos estriles

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Escala de McFarland Discos de antibiograma Tiras de EtestTM para distintos antibiticos Estufa a 37 C Desarrollo del trabajo prctico Determinacin de la CIM por dilucin en caldo 1. Se realizan diluciones al medio decrecientes del o los antibiticos en tubos conteniendo 1 ml de caldo Mueller-Hinton 2. Se siembra 1ml de una suspencin bacteriana de aproximadamente 10 5 bacterias por ml que equivale a una dilucin 1/500 del tubo 1 de la escala de Mc Farland. 3. Se realiza un control de crecimiento inoculando un caldo sin antibitico y un control negativo con caldo sin inocular. 4. Se incuban todos los tubos a 37 C durante 24 horas. Luego se observa turbidez indicativa del desarrollo bacteriano. 5. Se determina la CIM como aquella concentracin del antibitico contenida en el tubo que posee la mayor dilucin del mismo en la que se detecta falta de turbidez. La mnima concentracin que inhibe el crecimiento bacteriano. Bibliografa Bauer, A., Kirby, W., Sherris, J., Turk, M. American Journal of Clinical Pathology, 45: 493-496, 1986. Davis, D. B., Dulbecco, R., Eisen, H., Ginsberg, H., Tratado de Microbiologa. captulo 7 Salvat Editores, Tercera edicin, 1984.

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T.P. N 13 TCNICA DE INMUNODIFUSIN RADIAL PARA LA DETERMINACIN DE INMUNOGLOBULINAS Y OTRAS PROTENAS EN LQUIDOS BIOLGICOS Introduccin La inmunodifusin radial en placa de agarosa conteniendo antisueros especficos constituye un excelente recurso diagnstico para la determinacin cuantitativa de protenas de lquidos biolgicos. El procedimiento consiste en una inmunoprecipitacin en agarosa entre un antgeno a cuantificar y su anticuerpo homlogo. Se realiza incorporando uniformemente uno de los dos reactivos inmunes (generalmente el anticuerpo) en un gel de agarosa y luego introduciendo el otro reactivo en pocillos excavados en el mismo gel. El antgeno difunde radialmente en el gel que contiene el anticuerpo y se forma un disco o anillo de precipitacin visible en un punto que depende de la relacin estequiomtrica antgeno-anticuerpo. A medida que el antgeno difunde desde el pocillo hacia el gel, el anillo se redisuelve y reaparece a una distancia mayor del pocillo. Este aumento en el dimetro de precipitacin contina hasta que antgeno y anticuerpo reaccionan completamente. Mientras que el precipitado se est expandiendo (16 a 20 horas) la relacin entre el dimetro del anillo y el logaritmo de la concentracin de antgeno es aproximadamente lineal. Al completarse la reaccin, la relacin entre el dimetro al cuadrado y la concentracin es lineal. Equipamiento necesario para el desarrollo de la tcnica * Inmunoplacas para 12 determinaciones * Micropipetas que permitan medir 5 l con precisin * Sueros testigos con 3 niveles de la protena a determinar * Regla de lectura que permita leer con una precisin de 0,1 mm Desarrollo de la reaccin 1- Abrir la placa para permitir que se evapore el exceso de humedad, si lo hubiera 2- Sembrar 5 l de muestra o control utilizando micropipetas de precisin. 3- Incubar en posicin invertida en cmara hmeda el tiempo indicado en la tabla que acompaa cada placa (48 horas a temperatura ambiente) Lectura de los resultados El punto final de la difusin esta indicado por la aparicin de un anillo de bordes netos. El mismo se alcanza una vez cumplido el tiempo de incubacin. A partir de ese momento puede efectuarse la lectura, ya que el halo no aumentar de tamao. El clculo de los resultados se realiza con alguno de los siguientes mtodos: A) Determinacin de rutina: Utilizando tabla de valores. a) Medir los halos con una precisin de 0,1 mm. b) Interpolar el dato anterior en la tabla de valores que acompaa a cada placa. B) Determinacin de alta precisin: Trazando curva de calibracin. a) Las tres primeras posiciones de cada placa se utilizan para sembrar los sueros controles. b) Medir los dimetros de los halos con una precisin de 0,1 mm. c) Graficar las concentraciones de los sueros de referencia versus el dimetro al cuadrado de los halos de precipitacin. d) Trazar la recta que mejor una los tres puntos. e) Interpolar el valor de la muestra desconocida. C) Determinacin de rpida orientacin: Mtodo cintico de lectura rpida.

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a) Tomar la lectura entre 16 y 20 horas de incubacin con una diferencia mxima de 30 minutos respecto al suero de referencia. Medir los dimetros con una precisin de 0,1 mm. b) Graficar los dimetros de los sueros de referencia versus el logaritmo de sus respectivas concentraciones. c) Trazar la recta que mejor una los tres puntos. d) Interpolar el valor de la muestra desconocida. e) No es necesario trazar una curva cada vez que se procesa una nueva muestra. Sin embargo, debe efectuarse la lectura en el mismo tiempo en que se leyeron los sueros de referencia. Si se efecta una nueva siembra, con ms de una semana de diferencia respecto a la calibracin, es recomendable introducir un testigo en cada corrida. NOTA: La tabla de valores se confecciona sobre un gran nmero de placas de cada lote utilizando un programa estadstico por computacin para trazar la mejor recta. Solo es vlida para el nmero de lote indicado. Variaciones en los parmetros del ensayo, como volumen de muestra, temperatura, tiempo de incubacin y utilizacin de la placa una vez abierta por un lapso superior a 1 mes pueden producir dimetros no concordantes con los especificados en la tabla. Es recomendable incluir sueros controles para trazar una curva de calibracin. Errores factibles en la utilizacin de la tcnica 1- Debe tenerse precaucin al sembrar, evitando derramar muestra fuera del pocillo, romper los bordes del mismo o introducir burbujas de aire. En caso que esto ocurra, sembrar un nuevo pocillo. 2- Si una vez abierta la placa se observan signos de deshidratacin o deterioro en el gel, debe ser desechada. 3- Deben evitarse las variaciones brscas de temperatura, ya que afectan la velocidad de difusin y, por lo tanto, los dimetros de precipitacin. 4- Las placas no deben ser congeladas. Si esto ocurriera, deben ser descartadas. Evaluacin de los resultados Es recomendable que cada laboratorio establezca sus propios valores de referencia. Los rangos que aqu se dan corresponden a pacientes ambulatorios presuntamente sanos. Inmunoglobulina G: Adultos: 600-1650 mg/dl Nios: 560-1500 mg/dl Inmunoglobulina A: Adultos: 90-400 mg/dl Nios: 100-210 mg/dl Inmunoglobulina M: Adultos: 75-300 mg/dl Nios: 40-200 mg/dl Inmunoglobulina D: 100 UI/ml C3: 80-160 mg/dl C4: 20-40 mg/dl Bibliografa Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology. Volume 1 Immunochemistry. Blackwell Scientific Publications. Fourth Edition. 1986. Margni, R. A., Inmunologa e Inmunoqumica. Editorial Mdica Panamericana. Quinta Edicin. 1996 T.P.N 13

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T.P. N 14 REACCIN DE AGLUTINACIN Cuando un anticuerpo especfico es puesto en contacto con un antgeno, si ste es particulado (por ejemplo un glbulo rojo, una bacteria o cualquier otra clula), las partculas se aglutinan formando una malla visible. Esta reaccin se conoce con el nombre de aglutinacin. Los principios que regulan la aglutinacin son los mismos que en la precipitacin. La ocurrencia de uno u otro fenmeno depende del tipo de antgeno involucrado (soluble o particulado). La reaccin de aglutinacin se usa para identificar un antgeno particulado, el cual va a reaccionar con un inmunosuero especfico o para determinar el ttulo aglutinante de un suero inmune. Para titular un antisuero se mezcla una cantidad constante de la suspensin antignica con diluciones crecientes del suero a examinar y se determina su ttulo como la inversa de la mxima dilucin capaz de dar una aglutinacin positiva. El ttulo depende de la tcnica utilizada y deben estandarizarse distintos factores tales como concentracin de la suspensin antignica, temperatura, concentracin salina en el medio y tiempo de reaccin, para que los resultados sean comparables. Objetivo: Titular anticuerpos en suero utilizando la tcnica de aglutinacin directa Materiales: - PBS pH 7,2 - microplacas de 96 pocillos con fondo en "U". - micropipetas y tips. - suspensiones homogneas de Salmonella newport y Salmonella oranienburg crecidas en caldo nutritivo y diluidas hasta ajustar la concentracin tomando como referencia el tubo 1 de la escala de Mac Farland (3 x 108 bacterias / ml aproximadamente). Estas suspensiones bacterianas representan el antgeno flagelar llamado antgeno H (Suspensin H). - suspensiones homogneas de Salmonella newport y Salmonella oranienburg crecidas en agar nutritivo y diluidas de igual forma que las crecidas en medio lquido. Estas suspensiones bacterianas representan el antgeno somtico llamado antgeno O o endotoxina de naturaleza glucolipdica (Suspensin O). S. oraniemburg (estructura antignica= 6,7:m,t) y S. newport (6,8:e.h:1,2) y los antisueros O6,8; He,h y Hm,t (antisuero anti O preparado en conejo inmunizado con antgeno O purificado). Procedimiento: 1.- Se colocan 50 l de PBS en cada uno de los 12 pocillos de una hilera de una microplaca de 96 pocillos con fondo en "U". 2.- Se colocan 50 l del suero anti H a titular en el primer pocillo de la hilera. 3.- Se realizan diluciones seriadas al medio de dicho antisuero. Para ello se homogeniza el contenido del primer pocillo y se trasvasan 50 l de la mezcla al segundo pocillo. Se repite el procedimiento a lo largo de toda la hilera. 4.- Se trasvasan 25 l de cada pocillo al pocillo correspondiente de la siguiente hilera. 5.- A cada pocillo de la primera hilera, se agregan 75 l de la suspensin antignica H. 6.- A cada pocillo de la segunda hilera, se agregan 75 l de la suspensin antignica O. 7.- Se repite idntico procedimiento con el suero anti O. 8.- En todos los casos se homogeniza y se incuba a 37 C durante 2 hs. 9.- Se realiza una primera lectura de los resultados, anotando la mayor dilucin del antisuero que produce aglutinacin.

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10.- Se incuba durante toda la noche a 4 C y luego se realiza una segunda lectura, verificando el ttulo definitivo. 11.- Como controles se utilizan sueros normales de conejos obtenidos con anterioridad a la inoculacin de los distintos antgenos. Bibliografa Weir, D. M., Handbook of Experimental Immunology. Volume 1 Immunochemistry. Blackwell Scientific Publications. Fourth Edition. 1986. Margni, R. A., Inmunologa e Inmunoqumica. Editorial Mdica Panamericana. Quinta Edicin. 1996

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Gua para la confeccin de informe

TURNO TP: ........ GRUPO N: .......... INTEGRANTES:................................ ................................. ................................. INFORME TRABAJO PRACTICO N .... TITULO: .................................................................................................. OBJETIVOS:.......................................................................................................................................... ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ........................................................................................................... RESULTADOS OBTENIDOS: (se pueden utilizar tablas y/o grficos que expresen los resultados en forma concreta, sin detalles de los mtodos utilizados que figuran en la gua de TP). ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ..................................................................................

CONCLUSIONES: (comente brevemente las conclusiones obtenidas a partir del anlisis de los resultados) ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ................................................................................................................................................................ ..................................................................................

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APNDICE
MEDIOS DE CULTIVO CALDO NUTRITIVO Extracto de carne..................................... 3,0 g. Peptona de carne...................................... 5,0 g. Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt. pH = 7,0 0,2

CALDO MAC CONKEY Peptona de casena................................ 20,0 g. Lactosa................................................. 10,0 g. Bilis de Buey desecada............................ 5,0 g. Prpura de Bromocresol....................... 0,01 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,1 0,1

CALDO CEREBRO-CORAZN Infusin de cerebro............................... 12,5 g. Infusion de corazn................................ 5,0 g. Proteosa-peptona.................................. 10,0 g. D(+) glucosa........................................... 2,0 g. Cloruro de sodio..................................... 5,0 g. Di-sodio hidrgeno fosfato..................... 2,5 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,4 0,2

CALDO TIOGLICOLATO Peptona de casena............................... 15,0 g. Extracto de levadura.............................. 5,0 g. D (+) glucosa......................................... 5,5 g. L (+) cistena.......................................... 0,5 g. Cloruro de sodio.................................... 2,5 g. Sodio tioglicolato................................... 0,5 g. Resazurina sdica............................... 0,001 g. Agua destilada c.s.p. ................................. 1 lt. pH = 7,1 0,1

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CALDO M9 (2X) NH4Cl.................................................... 1,0 g. Na2 HPO4.............................................. 6,0 g. KH2PO4................................................. 3,0 g. Cloruro de sodio.................................... 0,5 g. Glicerol o asparragina............................ 5,0 g. Agua destilada c.s.p. ................................ 1 lt. Agregar en fro Sulfato de magnesio 1N.......................... 1 ml. Cloruro de Calcio 0,01 M...................... 10 ml (autoclavados aparte)

CALDO MRS (segn DE MAN, ROGOSA Y SHARPE) Peptona universal....................................... 10,0 g. Extracto de carne......................................... 5,0 g. Extracto de Levadura................................... 5,0 g. D (+) glucosa............................................. 20,0 g. Di-potasio hidrgeno fosfato........................ 2,0 g. Tween 80..................................................... 1,0 g. Di-amonio hidrgeno citrato........................ 2,0 g. Acetato de sodio.......................................... 5,0 g. Sulfato de magnesio..................................... 0,1 g. Sulfato de Manganeso................................ 0,05 g. Agua destilada c.s.p. .......................................1 lt. pH = 6,5 0,1 CALDO LB Triptona de soya..........................................10,0 g. Extracto de levadura......................................5,0 g. Cloruro de sodio..........................................10,0 g. Agua destilada c.s.p. ........................................1 lt. pH = 7,5 0,1 CALDO CITRATO DE KOSER Sodio y amonio hidrogenofosfato.................. 1,5 g. Sulfato de magnesio...................................... 0,2 g. Potasio hidrgenofosfato............................... 1,0 g. Citrato de Sodio............................................ 3,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 6,7 0,1

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AGAR NUTRITIVO Extracto de carne..................................... 3,0 g. Peptona de carne...................................... 5,0 g. Agar....................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. .................................. 1 lt. AGAR CETRIMIDA Peptona de gelatina....................................................... 20,0 g. Cloruro de Magnesio...................................................... 1,4 g. Sulfato de potasio......................................................... 10,0 g. N-cetil-N,N,N-trimetilamoniobromuro (cetrimida).......... 0,3 g. Agar............................................................................. 13,6 g. Agua destilada c.s.p. ..........................................................1 lt. pH = 7,2 0,2 Aditivo: glicerina 10 ml AGAR MOSSEL Peptona de carne.............................................. 10,0 g. Extracto de carne............................................... 1,0 g. D (-) manita.................................................... 10,0 g. Cloruro de sodio.............................................. 10,0 g. Rojo de fenol................................................. 0,025 g. Agar................................................................ 12,0 g. Agua destilada c.s.p. ......................................... 0,9 lt. ADITIVOS: Luego de autoclavar, agregar 100 ml. de una emulsin de yema de huevo al 50 % y 0,1/0,01 g. de Polimixina B. EMULSIN DE YEMA DE HUEVO: Huevos de gallina frescos se lavan durante varias horas en etanol al 70 %. Luego se flamean y se abren aspticamente. Bajo condiciones de esterilidad, se separan las yemas de las claras. Se mezclan homogeneamente 50 ml. de yema de huevo con 50 ml. de solucin fisiolgica estril, utilizando un homogeneizador de pequea velocidad de rotacin (para evitar formacin de espuma). POLIMIXINA B: Solucin estril (por filtracin). AGAR EMB (LEVINE) Peptona de carne............................................ 10,0 g. Di-potasio hidrgeno fosfato............................ 2,0 g. Lactosa.......................................................... 10,0 g. Eosina yellow................................................... 0,4 g. Azul de metileno........................................... 0,065 g. Agar............................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt. pH = 7,0 0,2

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AGAR MAC CONKEY Peptona de casena.......................................... 17,0 g. Peptona de carne............................................... 3,0 g. Cloruro de sodio............................................... 5,0 g. Lactosa........................................................... 10,0 g. Sales biliares..................................................... 1,5 g. Rojo neutro.................................................... 0,03 g. Cristal violeta............................................... 0,001 g. Agar.............................................................. 13,5 g. Agua destilada c.s.p. .......................................... 1 lt. pH = 7,1 0,1 AGAR MANITA SAL COMN ROJO DE FENOL Peptona de carne........................................... 10,0 g. Extracto de carne............................................ 1,0 g. Cloruro de sodio........................................... 75,0 g. D (-) manita.................................................. 10,0 g. Rojo de fenol.............................................. 0,025 g. Agar............................................................. 12,0 g. Agua destilada c.s.p. ......................................... 1 lt. pH = 7,4 0,1 AGAR ALMIDON Extracto de carne.......................................... 3,0 g. Peptona......................................................... 5,0 g. Almidn soluble............................................ 2,0 g. Agar........................................................... 25,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 7,2 0,1 AGAR LECHE Triptona5 g Extracto de levadura.. 2,5g Glucosa 1g Agar. 15g Leche descremada 10%........................... 20 ml Agua destilada ..980 ml AGAR YEMA DE HUEVO Triptona 5 g Extracto de levadura. 2,5 g Glucosa. 1 g Agar..15 g Solucin de yema de huevo 5% ..100 ml Agua destilada .900 ml

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Solucin de yema de huevo 5%: Lavar huevos de gallina frescos durante 30 minutos en etanol 70%. Luego se abren aspticamente. Bajo condiciones de esterilidad se separan las claras de las yemas. Se mezclan homogneamente 5 ml de yemas de huevo con 95 ml de sc. fisiolgica estril. AGAR HIERRO DE KLIGLER Extracto de carne.......................................... 3,0 g. Extracto de levadura..................................... 3,0 g. Peptona....................................................... 15,0 g. Proteosa peptona........................................... 5,0 g. Lactosa....................................................... 10,0 g. Dextrosa(glucosa)......................................... 1,0 g. Sulfato ferroso.............................................. 0,2 g. Cloruro de sodio........................................... 5,0 g. Tiosulfato de sodio....................................... 0,3 g. Rojo fenol..................................................0,024 g. Agar...............................................................12 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 7,4 AGAR ROGOSA Peptona de casena...................................... 10,0 g. Extracto de levadura..................................... 5,0 g. D (+) glucosa.............................................. 20,0 g. Potasio di-hidrgeno fosfato......................... 6,0 g. Citrato de amonio......................................... 2,0 g. Polioxietilen sorbitan monoleato................... 1,0 g. Acetato de sodio......................................... 15,0 g. Sulfato de magnesio.................................. 0,575 g. Hierro II sulfato........................................ 0,034 g. Sulfato de manganeso................................. 0,12 g. Agar........................................................... 15,0 g. Agua destilada c.s.p. ....................................... 1 lt. pH = 5,5 0,1

AGAR SELECTIVO PARA ACTINOMYCETES (AS) Caseinato de Na 2 g/l Almidn 5 g/l K2HPO4 0,5 g/l MgSO4 0,2 g/l FeCl3 0,01 g/l Agar-agar 15 g/l Agua destilada 1000 ml pH 7 Preparar 1000 ml y fraccionar en frascos de a 150 ml cada uno.

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AGAR MUELLER-HINTON Infusin de carne..........................................5,0 g. Caseina hidrolizada.....................................17,5 g. Almidn........................................................1,5 g. Agar............................................................12,5 g. pH = 7,4 0,2 COLORANTE ESCALA de pH 4,4 6,0 6,8 8,0 6,8 8,4 7,2 8,8 6,0 7,6 5,2 6,8 8,3 - 10,0 3,8 - 5,4 COLOR cido - Alcalino Rojo Rojo - Amarillo - Amarillo

ROJO DE METILO ROJO NEUTRO ROJO FENOL ROJO CRESOL AZUL CON BROMO TIMOL PRPURA CON BROMO CRESOL FENOLFTALEINA VERDE CON BROMO CRESOL

Amarillo - Rojo Amarillo - Rojo Amarillo - Azul Amarillo - Prpura Incoloro - Rojo Amarillo - Azul

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Problemas
ESTERILIZACIN 1) Qu consideraciones debe tener en cuenta para cargar el autoclave con material a esterilizar? 2) Qu mtodo utilizara para esterilizar cada uno de los siguientes materiales y soluciones? Placas de Petri descartables, material de ciruga, ropa de cama hospitalaria, solucin fisiolgica, suero fetal bovino, vitaminas, antibiticos, etanol, glicerol. 3) Una solucin salina se fraccion en partes iguales en dos frascos A y B. La fraccin A se esteriliz en autoclave en una atmsfera conteniendo 100% de vapor; la fraccin B se esteriliz tambin en autoclave pero en una atmsfera que contena 60% de vapor y 40% de aire, durante el mismo tiempo. Cul de los dos procedimientos asegura la eliminacin total de esporas? Por qu? 4) Qu caractersticas de un material o sustancia deben tenerse en cuenta para la eleccin de un mtodo de esterilizacin? 5) Por qu se requiere mayor tiempo de esterilizacin en horno que en autoclave ?. Cul es el agente esterilizante en cada caso? 6) Cmo decontaminara un erlenmeyer de vidrio donde fue crecido un cultivo de Bacillus cereus y uno utilizado para crecer Escherichia coli ? 7) Un tubo conteniendo medio M9 + 0,5 % de glucosa fue autoclavado y posteriormente incubado a 37 C durante 72 horas. Al cabo de dicho tiempo se detect crecimiento de microorganismos. a) Qu parmetros debera controlar para que el proceso de esterilizacin se lleve a cabo de manera adecuada? b) Una vez solucionado el inconveniente, Cmo determinara si dicho medio est efectivamente estril? 8) Cmo realizara un control de esterilizacin y un control de esterilidad ? 9) Ud. dispone en su laboratorio de un mechero, autoclave, una solucin de etanol 70 %, un horno y una lmpara de UV y necesita preparar y esterilizar los siguientes medios de cultivo: Caldo M9, agar nutritivo y agar Mossel con yema de huevo y polimixina B. Adems necesita esterilizar una membrana de nitrocelulosa de 0,2 m, placas de petri de vidrio, el rastrillo y el ansa. a) Indique que mtodo de esterilizacin y/o desinfeccin de los que se dispone en su laboratorio utilizara para cada uno de los materiales mencionados. b) Necesita disponer de algn otro mtodo de esterilizacin? Por qu?

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DIVERSIDAD MICROBIOLGICA 1) Qu tipos de bacterias se encuentran asociadas con las zonas de color prpura y verde de la columna de Winogradsky? 2) En qu zona de la columna esperara encontrar un anaerobio estricto? 3) Describa una sucesin microbiana en la columna de Winogradsky 4) Qu gradientes se forman en la columna de Winogradsky? Qu elementos se utilizan en el laboratorio para garantizar la formacin de los mismos? 5) a) Indique que funcin cumplen cada uno de los elementos agregados en la columna de Winogradsky. b) Ubique en relacin al gradiente de SH2 a los siguientes microorganismos: bacterias reductoras de sulfato, bacterias verdes del azufre, bacterias prpuras del azufre, cianobacterias, diatomeas. c) En base a que otro/s parmetro/s ambientales podra ubicarlas. Justifique en todos los casos. 6) A partir de libros de texto, citas bibliogrficas o bsquedas a travs de internet, recabar ms informacin sobre el metabolismo y los requerimientos de oxgeno de los organismos que pueden estar presentes en la columna de Winogradsky. Muchos de estos microorganismos se mencionan ms abajo. Utilizando la informacin obtenida, dibujar una columna de Winogradsky y ubicar los microorganismos en el lugar apropiado. Thiobacillus sp., Clostridium sp., Algae, Desulfovibrio sp., Cyanobacteria, Chromatium sp., Rhodospirillum sp., Chlorobium sp. 7) Los siguientes 4 tipos metablicos se encuentran presentes en la columna de Winogradsky: fotoauttrofos, fotohetertrofos, quimiolitoauttrofos y quimioorganohetertrofos. a) Mencione un ejemplo de cada uno de estos microorganismos que pueda ser encontrado en una columna de Winogradsky tpica.
En base a los ejemplos por usted seleccionados seale: b) Qu microorganismos participan en el ciclo del azufre y qu transformaciones realizan de ese compuesto. c) Ubique espacialmente c/u de los microoganismos seleccionados en funcin del gradiente de O2.

TINCIONES 1) En qu consiste una tincin diferencial? Para qu se emplea? 2) Qu sucede si a un cultivo envejecido de Bacillus sp. se le realiza una tincin de Gram? 3) Cmo espera observar las bacterias luego de la tincin de Gram si se olvida de realizar el paso de decoloracin? 4) Qu suceder si no se calienta en presencia del colorante en las tinciones de cido resistencia y esporas? 5) Podra utilizar un colorante bsico como primer colorante en la tincin de esporas?

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6) Por qu no se tien las clulas alcohol -cido resistentes por la coloracin de Gram? 7) Qu caractersticas debe tener un colorante para ser empleado en una tincin negativa? 8) Las tinciones de Gram, esporas y Ziehl Neelsen permiten determinar diferencias estructurales en clulas de distintos gneros. Cules son esas diferencias y cul es el paso de cada coloracin que las pone en evidencia? Qu tipos de colorantes se utilizan en cada caso? 9) Bacillus subtilis presenta color violeta al microscopio ptico luego de una tincin de Gram y color rosado al efectuarse una coloracin de esporas. Por qu motivo el cristal violeta en el primer caso y la safranina en el segundo tien la bacteria de esa manera? 10) Indique cul o cules de las tinciones realizadas en los trabajos prcticos ponen en evidencia diferencias estructurales de la pared bacteriana. Explique brevemente. 11) Diga si las siguientes afirmaciones son verdaderas o falsas y justifique su respuesta. a) En una tincin negativa los colorantes utilizados tienen afinidad slo por la pared bacteriana. b) En la tincin de esporas el verde de malaquita no tie el citoplasma celular porque es removido por los solventes orgnicos que se utilizan en el paso de decoloracin. c) Las clulas Gram negativas no se tien con cristal violeta porque el mordiente no puede atravesar la pared de peptidoglicano. d) El calentamiento en la coloracin de cido resistencia permite que la fucsina fenolada se combine con el cido miclico presente en la pared bacteriana. 12) Se dispone de un kit de Gram y un frasco de verde de malaquita. Con estos colorantes podra realizar una tincin para determinar la ubicacin de las esporas en una especie de Bacillus que se quiere identificar? Explique. RECUENTO DE BACTERIAS 1) Se dispone de 6 ml de un cultivo bacteriano con 8,4 x 108 UFC/ml. Qu diluciones debera realizar para contar aproximadamente 40 colonias por placa, si se siembra 0,1 ml de dicha dilucin? 2) Partiendo de un cultivo bacteriano que tiene 4 x 108 UFC/ml : Cmo procedera para obtener 80 colonias en una placa de agar nutritivo? Indique los volmenes a utilizar. 3) Qu dilucin debera realizar para obtener 2 ml de una suspensin de bacterias que contenga 2 x 105 UFC totales, si parte de un cultivo que contiene 2 x 109 UFC/ml ? 4) Un cultivo bacteriano se diluye 1/4. A partir de esa dilucin se realizan diluciones seriadas al dcimo. Se siembra 0,1 ml de cada dilucin en placas de agar nutritivo por triplicado obtenindose los siguientes resultados: Dilucin Nmero de colonias

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Placa 1 10-4 10-5 10-6 621 64 5

Placa 2 546 56 9

Placa 3 356 68 4

Qu dilucin elegira para calcular las UFC del cultivo original? Justifique su eleccin. 5) Un cultivo bacteriano de 10 ml tiene un recuento de 250 UFC cuando se plaquea 0,1 ml de la dilucin 10-4. Si 2 ml de ese cultivo se inoculan en 100 ml de medio fresco para realizar una curva de crecimiento: Cul es la concentracin bacteriana inicial? Qu diluciones realizara del mismo para contar 100 colonias si sembrara 0,1 ml ? 6) Un fabricante de yogurt afirma que sus productos contienen 4 x 106 bacterias lcticas viables / ml. Qu mtodo de recuento utilizara para corroborar ese nmero ? Describa el protocolo, condiciones y materiales que utilizara para realizar dicha determinacin. 7) Enumere las ventajas y desventajas de los siguientes mtodos de recuento de bacterias: i) turbidez, ii) recuento en placa, iii) conteo directo al microscopio. 8) Para un cultivo exponencial de Escherichia coli se realiza una curva de calibracin de recuento en placa vs. turbidez (D.O. leda a 600 nm). A partir de la misma se establece una relacin UFC/ml por unidad de D.O. de 4. 107 a) Qu ventajas tiene realizar una curva de calibracin de recuento vs. turbidez? b) Qu diluciones debera realizar para contar 100 colonias en una placa de agar nutritivo sembrada con 0,1 ml de un nuevo cultivo de E. coli con una D.O. de 0.5. 9) Un investigador dispone de una curva de calibracin de DO vs UFC/ml para E. coli en caldo nutritivo. Podra utilizar la misma curva para un cultivo de: Bacillus megaterium y otro de Micrococcus luteus ? Justifique su respuesta. 10) Un cultivo de Klebsiella pneumoniae en fase exponencial tiene una DO = 0,2 medida a 600 nm. Al realizar un recuento en placa se contaron 40 colonias al sembrar 0,2 ml de la dilucin 4 del cultivo original. a) Calcular las UFC/ml b) Calcular las UFC totales si el volumen del cultivo original es de 3 ml. c) Qu diluciones debera realizar a partir del mismo cultivo de Klebsiella pneumoniae cuando alcanza una DO = 0,5 para contar en una placa 100 colonias. d) En un cultivo exponencial de Baccillus megaterium que tiene una DO = 0,5 esperara obtener ms o menos UFC/ml que en el cultivo de Klebsiella pneumoniae que tiene igual DO? Por qu?

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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS 1) Qu tipos de medios son el agar manitol salado y el agar Mossel? Para qu sirven cada uno de sus constituyentes? Podra reemplazar el manitol por otro azucar y el rojo fenol por rojo neutro? 2) Disee un medio que le permita diferenciar microorganismos Gram negativos que degradan la maltosa con produccin de cido de los que no lo hacen. 3) Discuta las siguientes afirmaciones: a- Para determinar la carga bacteriana de una muestra debe realizarse un enriquecimiento previo. b- Un enriquecimiento selectivo se realiza en medio lquido pues hay libre competencia por los nutrientes. c- El paso de aislamiento selectivo y/o diferencial puede hacerse en medio lquido. d- La premisa fundamental en un protocolo de aislamiento es conseguir un cultivo puro. 4) La composicin del caldo nutritivo es: extracto de carne y peptona en agua a pH 7. La composicin del caldo Mc Conkey es: peptona, lactosa, sales biliares, prpura de bromocresol y cloruro de sodio en agua a pH 7. Cul es la funcin de cada uno de los componentes en cada medio? 5) Los principales componentes del agar Rogosa utilizado en el aislamiento de Lactobacillus son: glucosa, extracto de levadura, extracto de carne, peptonas, acetato de sodio, tween 80 (pH 5,5). Explique cul es la funcin de cada uno de ellos y por qu la incubacin se realiz en anaerobiosis. 6) Discuta los siguientes enunciados y justifique: a) Cualquiera de los siguientes medios podra ser utilizado para diferenciar aquellos microorganismos capaces de fermentar la lactosa: Medio 1 Peptona de carne Lactosa Rojo fenol Agua Agar ---Medio 2 Peptona de carne Extracto de carne Lactosa Rojo fenol Agua ---Medio 3 Cloruro de amonio Lactosa Rojo fenol Agua Agar ---Medio 4 Cloruro de amonio Lactosa Glucosa Rojo fenol Agua Agar

b) Especies del gnero Bacillus pueden ser aisladas en placas de agar Mc Conkey. 7) En el estudio de la esporulacin de Bacillus cereus, cuya espora es oval y central, se observaron al microscopio bacilos con esporas terminales caractersticas de Bacillus subtilis. Disee un medio de cultivo que le permita diferenciar ambos microorganismos.

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PRUEBAS BIOQUIMICAS 1) Diga si es verdadero o falso a) En el agar EMB y en el agar Fe de Kligler se pueden diferenciar microorganismos que realizan fermentacin cido-mixta de aquellos que realizan fermentacin butilengliclica. b) Las pruebas bioqumicas Rojo de Metilo y Voges-Proskauer, pueden realizarse en cualquiera de los siguientes medios: i) Extracto de carne, peptona de carne, agua. ii) Peptona, glucosa, buffer fosfato, agua. 2) Qu resultados espera obtener en las pruebas bioqumicas de agar hierro de Kligler y oxido/fermentacin de lactosa como nica fuente de carbono, para microorganismos con las siguientes caractersticas metablicas? a) Aerobio estricto que no utiliza la lactosa como fuente de carbono b) Aerobio facultativo que no utiliza la lactosa como fuente de carbono c) Aerobio facultativo que utiliza la lactosa como fuente de carbono 3) Qu tipo de metabolismo y qu productos se ponen en evidencia al realizar las pruebas de Rojo de Metilo y Voges-Proskahuer? Qu precauciones debera tener para la correcta interpretacin de ambas pruebas? 4) A partir de una muestra de agua del Ro de la Plata, se obtienen cultivos puros de 5 microorganismos (A, B, C, D, E) A cada uno de ellos se le realizan las pruebas de agar hierro de Kligler, Rojo de Metilo y Voges Proskahuer, obtenindose los siguientes resultados: Kligler Ac/Ac con gas Alc/SC sin gas Alc/Ac sin gas Alc/Ac con gas Ac/Ac con gas Rojo de Metilo + + Voges Proskahuer + +

A B C D E

A partir de los resultados obtenidos: a) Qu caractersticas metablicas puede inferir para cada uno de los microorganismos aislados? b) De qu otra forma podra determinar la capacidad de utilizar la lactosa por parte de los cinco microorganismos?

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5) Discuta las siguientes afirmaciones; a) El color rojo de las colonias en agar McConkey se debe a los productos cidos generados por la fermentacin de la lactosa. b) Los resultados de las pruebas de Rojo de Metilo y Voges Proskauer a diferencia de la prueba de agar hierro Kligler son independientes del tiempo de lectura. c) La aparicin de un producto coloreado en la primera parte de la prueba de reduccin del nitrato se considera positiva. 6) En una placa sembrada a partir de un cultivo de E. coli se observa una presunta contaminacin con Pseudomonas aeruginosa. Indique por lo menos 3 pruebas bioqumicas y los resultados esperados de las mismas que le permitiran comprobar que se trata de estos dos microorganismos. 7) A partir de una muestra de agua se realiza un cultivo de enriquecimiento en caldo Mac Conkey, el cual es sembrado en placas de agar EMB-Levine , obtenindose los siguientes resultados: .- Colonias transparentes. .- Colonias con centro pardo-grisceo sin brillo metlico. .- Colonias con brillo verde metlico. a) Sobre la base del aspecto macroscpico de las colonias qu componentes del medio de cultivo utilizan los microorganismos para su crecimiento? Explique. b) En caso de que posean un metabolismo fermentativo, podra inferir que tipo de fermentacin realizan y a qu colonias corresponden los microorganismos con esas caractersticas? Explique. c) Qu pruebas bioqumicas empleara para verificar el tipo de fermentacin, qu colonias utilizara y cul sera el resultado de dichas pruebas en cada caso? d) Qu caractersticas deberan tener los microorganismos aislados para poder ser identificados empleando un test multiprueba API 20 E.

RASTREO DE ACTIVIDADES ENZIMTICAS a) Las enzimas responsables de las hidrlisis de los sustratos ensayados en el TP 7 son exo o endocelulares? Justifique b) Puede el mtodo ensayado dar resultados cuantitativos? Qu debe tener en cuenta? c) Puede Ud sugerir un ensayo para evaluar la hidrlisis de gelatina como sustrato proteico en placa d) Qu otras actividades enzimticas podra ensayar en placa como mtodo de rastreo?

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AGUAS 1) En un laboratorio un tcnico realiza el anlisis de una muestra de agua debiendo informar el NMP de coliformes totales/100 ml. y NMP de coliformes no fecales/100 ml. Para ello el tcnico us el mtodo de Wilson pero se olvid de realizar la siembra en caldo Citrato. Sin embargo, de acuerdo a los resultados que obtuvo decidi que no era necesario repetir el ensayo. Los resultados fueron:

Diluciones de la muestra Tubos sembrados Positivos en McConkey 37C Positivos en McConkey 44C Volumen sembrado (ml.)

TC 3 3 3 1

-1 3 3 3 1

-2 2 2 2 1

-3 2 0 0 1

-4 2 0 0 1

a) Qu opina de la decisin del tcnico? b) Qu podra informar Ud. a partir de estos resultados?

2) Con el objeto de investigar una eventual contaminacin de las aguas de un afluente del Riachuelo, se tom una muestra y se procedi a analizarla. El protocolo y los resultados fueron los siguientes:

N de tubos sembrados 3 3 3 3 3 3 3

Vol. (ml.) 10 1 1 1 10 1 1

Dil.

Numero de tubos positivos Caldo Brila 37 C 3 3 3 1 1 0 0 Fluorescencia + 3 3 2 1 1 0 0 Citrato 37 C 3 2 1 0 0 0 0

100 100 10-1 10-2 10-3 10-3 10-4

Calcular el N ms probable (NMP) de coliformes totales, fecales y no fecales/100 ml.

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3) Se realiza un anlisis de aguas empleando caldo Brila Fluorocult, obtenindose los siguientes resultados: N de tubos sembrados 3 3 3 3 3 3 3 Vol. (ml.) 0,01 1 0,1 1 0,01 1 0,01 Dil. Nmero de tubos positivos Caldo Brila 37 C 3 3 3 3 2 1 1 Fluoresce ncia + 3 3 2 3 2 1 1 Citrato 37 C 2 3 1 2 0 0 0

10-1 10-2 10-3 10-3 10-3 10-6 10-4

Calcular el NMP de coliformes totales, fecales y no fecales/100ml. 4) Se realiza un anlisis de agua por el mtodo de Wilson obtenindose los siguientes resultados: N de tubos sembrados 3 3 2 2 1 1 Vol. (ml.) 10 1 1 1 1 1 Dil. N de tubos positivos Mc Conkey 37C 3 3 2 0 1 0 Mc Conkey 44C 3 3 1 0 0 0 Citrato 2 1 0 0 1 0

100 100 10-1 10-2 10-3 10-4

Calcular el nmero ms probable de coliformes totales, fecales y no fecales en 100 ml de agua.

5) Una muestra de agua se analiza para comprobar potabilidad por el mtodo de Nmero ms probable y se obtienen los siguientes resultados: N Tubos 3 3 2 2 1 1 Vol (ml) 10 1 0,1 1 1 1 Diluc. 10 0 10 0 10 0 10 2 10 3 10 -4 Brila 37 C 3 3 2 0 1 0 N Tubos Positivos Fluoresc. Pos. Citrato 37 C 3 2 3 1 1 0 0 0 0 1 0 0

Calcular el nmero ms probable de coliformes totales, fecales y no fecales en 100ml de agua

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FAGOS 1) Cul es el ttulo de un stock de fagos a partir del cual se cuentan 38 placas de lisis en la dilucin 10-5? Volumen de inculo 0,1 ml. 2) Si un lisado de ttulo 5 x 108 UFP/ml se utiliz para infectar a una m.i = 20 Qu cantidad de bacterias fueron necesarias para la infeccin? 3) Se dispone de 5 ml de un stock de fago T4 para titular, el cual es diluido 1 : 5 . A partir de esta dilucin se realizan diluciones seriadas al dcimo (10-1 a 10-8) y se siembran 0,2 ml en agar blando, por duplicado. Los resultados obtenidos fueron: Dilucin 10-5 10-6 10-7 10-8 Nmero de placas de lisis 520-480 60-54 3-6 0-1

a) Calcule el ttulo del stock de fago. Qu esperara observar en las placas correspondientes a diluciones menores que 10-5? b) Qu diluciones hara a partir del cultivo original para obtener 35 placas de lisis en una placa de Petri? 4) Se preparan dos lisados del fago virulento P1. Del primero se obtienen 20 ml que se titulan en placa con un recuento de 50 playas de lisis en la dilucin 10-6. Del segundo se obtienen 2.5 ml que se diluyen al medio con solucin fisiolgica y se titula en placa con un recuento de 200 playas de lisis en la dilucin 10-6. Cul de los dos lisados tiene mayor nmero de UFP totales? (Volumen de inculo = 0,1 ml). Si es necesario infectar a una m.i. = 5 Qu cantidad de bacterias utilizara para cada uno de los lisados? (Considere volumen de inculo = 0,1 ml para fagos y bacterias). 5) Se prepara un nuevo stock de fagos utilizando un cultivo bacteriano susceptible cuyo recuento en placa es de 108 UFC/ml y un viejo stock cuyo ttulo es 1010 UFP/ml, de manera de aumentar el ttulo. Protocolo: Volumen de cultivo bacteriano infectado: 10 ml. Inculo del viejo stock: 0.1 ml de una dilucin 10 1. Tiempo de incubacin a 37 C: 5 horas. El lisado obtenido es centrifugado y filtrado. a) Qu rango de 3 diluciones debera plaquear para poder verificar que el ttulo aumento un orden? b) Qu multiplicidad de infeccin utiliz al preparar el stock? 6) Se dispone de un stock de fagos con un ttulo de 106 UFP/ml. Se desea preparar un nuevo stock de mayor ttulo teniendo en cuenta que cada bacteria sensible produce 300 fagos. Para ello se cuenta con un cultivo de bacterias en fase exponencial con 5x109 bacterias/ml. La preparacin

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de dicho stock se realiza mezclando 1 ml del stock original con 1 ml de la dilucin del cultivo bacteriano que garantice un fago por bacteria (mi = multiplicidad de infeccin = 1). a) Qu diluciones tendra que realizar para obtener una mi = 1? Indique los volmenes. b) Qu diluciones del nuevo stock de fagos hara para determinar el ttulo viral? Indique los volmenes.
ANTIBIOTICOS 1) Disee un protocolo para determinar la concentracin inhibitoria mnima de un antibitico para un determinado microorganismo. Este protocolo es aplicable en el caso de un bacteriosttico, un bactericida ltico y un bactericida no ltico ? 2) Para obtener un cesped de un microorganismo se siembra con hisopo una placa conteniendo: agar, glucosa, NH4Cl, MgSO4, K2HPO4 y se aplican distintos discos de papel embebidos con diferentes cantidades de un determinado antibitico. Luego de 48 horas de incubacin se observa un halo de inhibicin alrededor del disco que contiene 5 g de antibitico. Cuando se hace lo mismo pero utilizando un medio que contiene agar, triptona y extracto de levadura, se observa un halo de inhibicin del mismo tamao que el anterior recin alrededor del papel que contiene 50 g del antibitico. Discuta las posibles explicaciones para estos resultados. 3) Disee un protocolo experimental para comprobar que una bacteria A libera al medio un compuesto con actividad antibitica. Cmo determinara si dicho compuesto es bactericida o bacteriosttico ? 4) Se dispone de dos cultivos bacterianos: uno en estado de crecimiento estacionario y otro en estado de crecimiento exponencial. Si se agrega la misma concentracin de penicilina en ambos cultivos Qu resultados esperara obtener? Grafique y explique. 5) Se inoculan caldos nutritivos con Staphylococcus aureus y se incuban a 37 C, tomando alcuotas a distintos tiempos para medir nmero de clulas viables y D.O. A los 120 minutos (fase log) se agregan a cada cultivo diferentes agentes: a) penicilina, b) cloranfenicol, c) solucin fisiolgica. A los 240 minutos, los cultivos se centrifugan a baja velocidad, se resuspenden en un volumen igual de medio fresco y se contina la incubacin. Esquematice las curvas de crecimiento esperadas en cada caso (nmero de clulas viables y D. O.). Justifique. 6) Qu efecto espera obtener si se agrega en forma combinada un bacteriosttico y un antibitico de accin sobre sntesis de pared a un cultivo bacteriano en crecimiento exponencial ?

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7) En un antibiograma, una cepa de E. coli presenta un halo de inhibicin 3 veces mayor para el antibitico A que para el antibitico B. Qu conclusin se puede extraer de esta prueba ? Justifique. 8) Se dispone de tres sustancias obtenidas por sntesis qumica con presunta actividad antimicrobiana para bacterias gram negativas. a) Cmo determinara cual de las tres presenta mayor actividad? b) Qu parmetros debera tener en cuenta en el ensayo experimental? c) Cmo determinara su mecanismo de accin? 9) a) A qu se debe la aparicin de colonias dentro de la zona de inhibicin del crecimiento en un ensayo de concentracin inhibitoria mnima? b) Qu resultados esperara obtener al comprobar la CIM de las bacterias que forman estas colonias en relacin a las que crecen por fuera del halo de inhibicin? Cmo la calculara? Nota: Ud. esta trabajando con un cultivo puro 10) Debido al recorte presupuestario, la Ctedra de Microbiologa no pudo comprar las tiras de E-Test Penicilina para la determinacin de la CIM (concentracin inhibitoria mnima). Qu metodologa alternativa podra emplear para calcularla? Explique detalladamente el mtodo por Ud. propuesto. Nota: Se dispone de todo el material de laboratorio necesario. 11) Un antibitico A que acta por unin reversible a la subunidad menor del ribosoma bacteriano se modifica qumicamente obtenindose una serie de compuestos distintos: B, C y D. Al realizar una prueba de sensibilidad en agar para un determinado microorganismo se obtuvieron los siguientes dimetros (d en mm) en los halos de inhibicin: dA 25, dB 6, dC 30 y dD 6. a) Qu conclusiones se pueden obtener a partir de estos resultados? Justifique. b) Cmo comprobara que C tiene ms actividad que A? Explique brevemente. Al determinar el mecanismo de accin de C se obtuvieron las siguientes curvas de DO600 nm (---) y log UFC/ml () en funcin del tiempo: c) Qu tipo de actividad presenta C? Justifique brevemente. d) Cambi respecto de A? Explique. Nota: la flecha indica el tiempo de agregado de C.

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INMUNOLOGA 1) Indique: a) Cmo procedera para verificar la efectividad del proceso de purificacin de un antgeno bacteriano soluble? b) Cmo procedera para cuantificar un antgeno bacteriano soluble utilizando una tcnica inmunolgica? 2) Un paciente con Salmonellosis concurre a un laboratorio A y le informan que el ttulo de anticuerpos en el suero es de 64 usando la tcnica de aglutinacin con una suspensin de Salmonella typhi como Ag. Asustado el paciente concurre a otro laboratorio B ese mismo da donde le informan que el ttulo es 256 usando tambin Salmonella typhi como Ag. para la reaccin de aglutinacin. El paciente est desconcertado. Qu explicacin le dara a Ud. a este paciente? 3) A partir de un suero humano se desea purificar la albmina. Dicho suero es sometido a tres pasos de purificacin sucesivos. Cmo determinara la concentracin de albmina despus de cada paso de purificacin? Nota: Ud. dispone de: antisuero anti humano total, antisuero monoespecfico anti albmina humana, albmina humana purificada de origen comercial de concentracin conocida, agar, solucin fisiolgica, material de vidrio y micropipetas. 4) Se inmuniza un conejo con una suspensin de Salmonella typhi. a) Cmo estudiara la cintica de aparicin de anticuerpos sricos anti-flagelos a fin de determinar el momento en que se obtiene el pico mximo de la respuesta inmune? b) Qu indicara la obtencin de 6 bandas de precipitacin en una inmunodifusin unidimensional doble cuando se enfrenta un lisado de S. typhi con el suero inmune obtenido? c) Qu tcnica empleara para saber si S. typhi comparte determinantes antignicos con S.newport? Describa brevemente la tcnica elegida usando como control suero normal. d) Cmo determinara la concentracin del antgeno flagelar presente en varios lisados de S. typhi obtenidos por distintos mtodos? Describa brevemente la tcnica que empleara. 5) Qu metodologa empleara para: a) Detectar anticuerpos anti una protena soluble de pneumococos en el suero de un cobayo inmunizado con dicha bacteria. Enumere y d el fundamento de las tcnicas que conoce para dicho fin. b) Determinar la concentracin de IgE humana en muestras obtenidas de pacientes alrgicos. D el fundamento del mtodo elegido y esquematice el protocolo de trabajo. 7) Se inyectan 2 conejos con Salmonella newport siguiendo distintos esquemas de inmunizacin. Luego de la ltima inoculacin se sangran los animales y se obtienen los sueros.

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Cmo determinara cul de los dos animales alcanzo el ttulo ms elevado de anticuerpos anti Salmonella newport? Describa brevemente la tcnica empleada y cmo expresara los resultados. 8) En el estante de una congeladora del laboratorio de Microbiologa se encontraron 2 tubos rotulados de la siguiente manera: Suero anti Salmonella N 1 y Suero anti Salmonella N 2. a) Sabiendo que all se trabaja con 2 especies de dicha bacteria: Salmonella schottmulleri y Salmonella typhi, Podra Ud. determinar que especie de Salmonella se emple para obtener cada antisuero? Qu tcnica empleara? Explquela brevemente. Describa los resultados que le permitiran identificar ambos antisueros. Nota: Las bacterias presentan los siguientes antgenos Salmonella schottmulleri: Antgeno O (determinantes antignicos 1, 4, 5 y 12). Salmonella typhi: Antgeno O (determinantes antignicos 9 y 12) y Antgeno Vi. b) Cmo determinara cual de los 2 antisueros tiene mayor ttulo aglutinante? Qu tcnica empleara? Explique brevemente. c) Si los antisueros fueron hechos en conejo, Cmo determinara la concentracin de IgG en cada suero? Explique la tcnica.

PROBLEMAS COMBINADOS PROBLEMA 1 Se desea estudiar la efectividad de un mtodo de irradiacin para esterilizar arroz. Para ello se dispone de tres muestras de arroz esterilizadas en autoclave (5 g/ 8,5 ml), de 10 ml de un cultivo de E. coli con un recuento de 50 UFC cuando se plaquean 0,1 ml de la dilucin 10-6 y de 5 ml de una suspensin de esporas de B. cereus de 4x107 esporas/ml. Cada una de las muestras de arroz esterilizadas se inocul con 1 ml del cultivo de E. coli y con 0,5 ml de la suspensin de esporas y se someti a una dosis diferente de radiacin. Al cabo de los respectivos tratamientos se cuantific en cada muestra el nmero de UFC totales de E. coli y de B. cereus sobrevivientes obtenindose los siguientes resultados: Tratamiento E. coli B. cereus ND= no detectable. 1 2,5x104 2,5x104 2 ND 2x102 3 ND ND

a) Discuta sobre la efectividad de cada uno de los tratamientos como mtodo de esterilizacin. b) Cul es la carga bacteriana total con que se inocul cada muestra antes de someterlas a la radiacin? c) Describa el protocolo para hacer los recuentos de los sobrevivientes justificando los pasos que realizara. Indique volmenes, diluciones, medios de cultivo empleados con la funcin de sus constituyentes. d) Ud. dispone de una cuarta muestra de arroz esterilizada en el autoclave simultneamente con las otras tres muestras. Qu tipo de control le realizara previamente a dicha muestra para garantizar que los sobrevivientes de las otras muestras provienen de la inoculacin artificial?

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PROBLEMA 2 Se sembraron en agar Mossel sin polimixina B los siguientes microorganismos: Cepas patrn de ensayo Bacillus cereus Bacillus cereus variedad mycoides Bacillus subtilis Escherichia coli Pseudomonas aeruginosa Proteus mirabilis Staphylococcus aureus Color del medio rosadas rosadas amarillas rosadas rosadas rosadas amarillas Precipitado + + +

a) Cul es la fuente de carbono que permite el crecimiento de cada uno de los microorganismos en este medio? Cul es la relacin con el color de las mismas? b) Qu paso realizado en el aislamiento del TP para Bacillus disminuye la aparicin de la flora acompaante en este medio sin polimixina? PROBLEMA 3 A partir de una muestra de agua del lago de Palermo se prepar una dilucin 10-2 y se sembr por rastrillado 0,1 ml de dicha dilucin en tres placas con los siguientes medios: Agar nutritivo Agar Mac Conkey Agar Cetrimida

62 colonias

38 colonias

5 colonias

a) Indique cmo esterilizara dichos medios. Explicar a qu se deben las diferencias observadas en el n de colonias que aparecen en cada medio considerando que se inocul la misma cantidad de muestra en cada uno. b) Describa todos los tipos de morfologa de colonias que podran encontrarse en la placa con agar Mac Conkey explicando a qu se deben las diferencias. c) Describa un protocolo para cuantificar el nmero de esporas presentes en 10 ml de la muestra de agua.

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MICROBIOLOGA E INMUNOLOGA
DEPARTAMENTO DE QUMICA BIOLGICA FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES UNIVERSIDAD DE BUENOS AIRES

TRANSPARENCIAS
TRABAJOS PRCTICOS 2010