TECHNIQUES DE NUMRATION DES LYMPHOCYTES T CD4 INFORMATION TECHNIQUE

ORGANISATION MONDIALE DE LA SANT

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NUMRATION DES LYMPHO CYTES T CD4 POUR LE VIH/SIDA La rcente implantation de traitements antirtroviraux (ARV) abordables et gnriques dans les rgions ressources limites fut une tape importante dans la lutte contre le VIH/SIDA. A la fin de lanne 2003, seulement 400 000 personnes vivant dans les rgions les plus touches par lpidmie du VIH avaient bnfici des ARV. Lobjectif de lOMS est doffrir les ARV 3 millions de personnes dici la fin de 2005 en ciblant les pays les plus affects par lpidmie du VIH et dont les ressources sont limites. Cette situation exige de toute urgence une mobilisation mondiale dans le but dacclrer laccessibilit aux traitements et aux soins lis au HIV. Pour y arriver, il faut que les traitements et les outils de suivi en laboratoire soient accessibles. La numration des lymphocytes T CD4 dans le sang priphrique est un outil de laboratoire essentiel au suivi des patients infects par le VIH. Les lymphocytes T CD4, aussi appels T auxiliaire T helper , coordonnent la rponse immunitaire le mcanisme de dfense de lorganisme contre les microorganismes et certaines formes de cancer. Ce sont les cellules cibles du VIH. Linfection par le VIH dtruit les cellules T CD4, affaiblissant progressivement le systme immunitaire menant ultimement au syndrome dimmunodficience acquise . Le taux de CD4 est un paramtre essentiel au suivi de linfection au HIV De trs faibles taux de CD4 indiquent un stade avanc de la maladie et une immunodficience du mcanisme de dfense. Chez les patients infects par le VIH, la surveillance du taux de lymphocytes T CD4 du sang priphrique permet : Dvaluer le degr de dtrioration immunitaire et la rapidit de la progression vers le stade SIDA ; De dfinir, laide des manifestations cliniques, le moment propice de linitiation de la thrapie antirtrovirale; Denvisager la mise en route de traitements prventifs des infections opportunistes; et Dvaluer lefficacit thrapeutique

Chez les sujets adultes, on mesure le taux absolu de lymphocytes T CD4 alors que chez les jeunes enfants et les nourrissons la proportion de lymphocytes T CD4 (pourcentage par rapport aux lymphocytes totaux) est plus instructive.

Diffrentes techniques de numration des lymphocytes T CD4 Actuellement, on trouve deux catgories de techniques de numration CD4 : mthodes manuelles et automatises. Les mthodes automatises comprennent la cytomtrie en flux et les cytomtres spcialiss. Les mthodes manuelles regroupent les essais qui ncessitent lutilisation du microscope ou du lecteur ELISA. De nouvelles mthodes bases sur microrseau (micro-array) ou sur bandelettes ractives (dipstick) sont prsentement en dveloppement et seront probablement commercialises dans quelques annes. Un des dfis li aux techniques alternatives est de bien diffrencier les lymphocytes T CD4 des monocytes qui possdent aussi en surface une molcule de CD4. Lincapacit distinguer ces deux populations

cellulaires contribuerait surestimer le taux de CD4, influant sur laccessibilit au traitement de ceux qui peuvent en avoir besoin. Mthodes automatises Cytomtrie en flux En raison de la justesse, de la prcision et de la reproductibilit de cette mthode, la cytomtrie en flux est considre comme la mthode de rfrence pour la mesure des taux de lymphocytes T CD4. Bien que les instruments du commerce proposs par diffrents fabricants soient coteux ($US 20-95 000) cette technologie permet danalyser rapidement un grand nombre dchantillons tout en offrant une grande polyvalence dutilisations dans le domaine biomdical, la numration des CD4 nest quune utilisation parmi tant dautres. La numration des CD4 par cytomtrie en flux est relativement complexe, techniquement exigeante et coteuse. Cependant, de nouvelles techniques de traitement des chantillons ont rendu lutilisation de la cytomtrie en flux possible pour les milieux ressources limites. Toutefois, la rentabilit de cette technologie demeure troitement lie un entretien soutenu. De plus, il est essentiel que les oprateurs de cytomtres en flux soient qualifis dans tous les aspects techniques et biologiques de la numration CD4. Bien que le cot des instruments constitue un frein lutilisation rpandue de cette technique, la venue prochaine dinstruments portatifs simples peut modifier cette situation. La cytomtrie en flux prsente plusieurs options pour la numration de lymphocytes T CD4 absolue (Tableau 1). Dans les essais double plateforme, le taux absolu de CD4 est obtenu en combinant le pourcentage de lymphocytes T CD4 du cytomtre en flux la mesure de lymphocytes totaux de lanalyseur hmatologique. Dans les essais simple plateforme, on utilise uniquement le cytomtre en flux pour mesurer la fois les valeurs relatives et absolues des lymphocytes T CD4. Il y a prsentement deux techniques simple plateforme : les instruments de type volumtrique et lutilisation de microfluorosphres. La complexit de la numration de CD4 par cytomtrie en flux varie selon quon utlilise un panel constitu dun seul tube ou de six, chacun pouvant contenir entre un et quatre ractifs (anticorps monoclonaux). Plusieurs facteurs peuvent influencer la slection de la mthode approprie : lge du patient, les exigences du clinicien, le dlai entre le prlvement et son arrive au laboratoire, le choix de la plateforme (simple ou double).

Les cytomtres spcialiss Les cytomtres spcialiss sont des systmes conus exclusivement pour une seule application soit la numration des lymphocytes T CD4 et CD8, et ce, sans laide des analyseurs hmatologiques (Tableau 2). Ces instrument sont plus faciles utiliser et moins chers que les cytomtres classiques. Cependant, ils noffrent aucune flexibilit dans les analyses ou le choix des ractifs. Leurs cots dopration peuvent tre levs et la quantit dchantillons qui peut tre analyse dans une journe est plus faible. Le FACSCount (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, .-U.), un systme tabli selon le principe de la

cytomtrie en flux, est prsentement le seul cytomtre spcialis qui a t valu et qui est largement rpandu. Depuis peu, diffrents appareils spcialiss qui ne fonctionnent pas tous selon les principes de la cytomtrie ont fait leur apparition sur le march alors que dautres seront bientt commercialiss. Mthodes manuelles Les mthodes prsentement disponibles utilisent la microscopie optique ou fluorescence. De plus, elles requirent dautres quipements tels que les centrifugeuses et les dispositifs magntiques. Ces tests sont conus pour rpondre aux exigences des laboratoires qui ont peu de ressources et qui ont une trs faible quantit dchantillons traiter. Toutefois, leurs cots dopration ne sont pas toujours infrieurs aux mthodes automatises. Le tableau 2 met en vidence la performance de deux mthodes prsentement sur le march. Ces mthodes sont Cyto-Spheres (Coulter Corporation, .-U.) et Dynabeads (Dynal AS, Norvge). Dautres mthodes telles que Capcellia (Bio-Rad, .-U.), OPTI-CIM (CIMA, Cuba), TRAxELISA (Innogenetics, Belgique), Zymmune (Zynaxis Inc., .-U.) et le dosage de la phosphatase immunoalcaline ne sont plus commercialises et/ou sont obsoltes.

Rsum En rsum, les technologies couramment offertes pour la numration des lymphocytes T CD4 reposent sur des principes distincts et des caractristiques oprationnelles diffrentes. Les facteurs qui devraient guider un laboratoire dans le choix dune technologie approprie sont la porte de lanalyse (routine vs recherche), le groupe dge des patients (le pourcentage des CD4 requis en pdiatrie), la quantit dchantillons traiter et les ressources disponibles (financires, humaines et infrastructure).

Tableau 1. La cytomtrie en flux pour la numration des lymphocytes T CD4 Paramtre Fabricants Plateforme doublea Principe Volumtriqueb
Partec GmbH (Munster, Allemagne)d Becton Dickinson (CA, .-U.) Coulter Corporation (FL, .-U.) 20-95 000 3-11 Sang total Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Rapport CD4/CD8 Cellules B et NK possible Jusqu 200 Prcision du pipettage non requise Analyse un seul tube possible sans problme de CQ EQE disponible Analyseur hmatologique requis Sujet aux erreurs de transcription ou de calcul chantillons frais requis pour la numration absolue Partec GmbH (Munster, Allemagne)d Guava Technologies (CA, .-U.)

Plateforme simple Principe Microfluorosphresc

Becton Dickinson (CA, .-U.) Coulter Corporation (FL, .-U.)

Cot de linstrument ($US) Cot des ractifs/test ($US) chantillon Rsultats

20-70 000 2-10 Sang total Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Rapport CD4/CD8 Cellules B et NK possible Jusqu 50 Microfluorosphres ou analyseur hmatologique non requis Protocoles pour lanalyse dchantillons>24hres disponible EQE disponible Prcision du pipettage requise Le CQ interne du pipettage requiert deux tubes Instruments nont pas encore t valus dans une tude multicentrique indpendante

20-95 000 8-25 Sang total Taux absolu de CD4 Taux absolu de CD8 CD4% et CD8% rapport lymphocytaire Rapport CD4/CD8 Cellules B et NK possible Jusqu 200 Analyseur hmatologique non requis Protocoles pour lanalyse dchantillons>24hres disponible EQE disponible Prcision et exactitude du pipettage requis Le CQ interne du pipettage requiert deux tubes Microfluorosphres sont coteuses et doivent tre manipules avec soin

chantillons traits /jour Avantages

Dsavantages

Cellules B et NK sous-populations lymphocytaires; CQ Contrle de la qualit; EQE Programme externe dvaluation de la qualit
Les cytomtres des trois fabricants peuvent utiliser cette plateforme pour mesurer les valeurs absolues puisque les rsultats sont le produit du cytomtre et de lanalyseur hmatologique. Les instruments volumtriques sont conus pour mesurer le volume de lchantillon et valuer directement le taux absolu sans lanalyseur hmatologique ou les microfluorosphres. c Cette plateforme est compatible avec les cytomtres des trois fabricants. d Les instruments de ce fabricant, incluant CyFlow, nont pas encore t valus en tant que plateforme volumtrique de numration de CD4 dans une tude multicentrique indpendante.
a b

Tableau 2. Mthodes manuelles et spcialises pour la numration des lymphocytes T CD4 TECHNOLOGIES SPCIALISES FACSCount CyFlow Counter Fabricant Instrument Mode dopration Systme de dtection chantillon Rsultats Corrlation avec la cytomtrie en fluxa (valeur r ) Cot de linstrument ($US) Cot des ractifs /test ($US) Avantages
Becton Dickinson (CA, .-U.) Compteur conu pour la numration CD4 Cytomtrie en flux Partec GmbH (Munster, Allemagne) Compteur conu pour la numration CD4 Cytomtrie en flux

TECHNIQUES MANUELLES Cyto-Spheres Dynabeads

Coulter Corporation (FL, .-U.) Haemocytomtre Microscope optique Observation directe des lymphocytes rosetts par les microsphres Microsphres de latex conjugues AcM anti-CD4 Sang total Taux absolu de CD4 Dynal AS (Oslo, Norvge) Dispositif magntique Haemocytomtre, Microscope optique ou fluorescence Observation directe des lymphocytes immunocapturs Microsphres magntiques conjugues aux AcM CD4 et CD8 Sang total Taux absolu de CD4 et CD8 Rapport CD4/CD8 0.94 and 0.96 (plusieurs tudes internationales) 2-10 000b 3-5 Simple et rapide Taux absolu de CD4 et CD8

Fluorochromes conjugus aux AcM anti-CD3, CD4 et CD8 Sang total Taux absolu de CD4 et CD8 Rapport CD4/CD8 %CD4 et %CD8 par rapport aux T 0.93-0.98 (plusieurs tudes internationales) 25 000 6-20 Automatisation, peu dtapes, moins sujet lerreur humaine Taux absolu de CD4 et CD8 Rsultats obtenus rapidement EQE disponible Cot des ractifs lev Limit 12 chantillons la fois %CD4 lymphocytaire non disponible

Fluorochrome conjugu AcM anti-CD4 Sang total Taux absolu de CD4

096-0.97 (quelques tudes) 20 000 2 Cot des ractifs abordable Rsultats obtenus rapidement EQE disponible

0.67-0.93 (plusieurs tudes internationales) 2000 4-8 Simple et rapide

Dsavantages

%CD4 par rapport aux lymphocytes non disponible Instrument non valu dans une tude multicentrique indpendante

Limit 10 chantillons la fois Mthode de comptage subjective %CD4 lymphocytaire et taux de CD8 non disponible EQE non disponible

Limit 6 chantillons la fois Mthode de comptage subjective %CD4 lymphocytaire non disponible EQE non disponible

AMc anticorps monoclonal ; EQE Programme externe dvaluation de la qualit

L analyse de la corrlation issue de la rgression linaire est inapproprie ltude comparative de mthodologies. La mthode approprie est lanalyse de la concordance. Malheureusement, les tudes publies ne font pas usage de cette mthode pour lvaluation comparative la cytomtrie en flux. Cest pourquoi nous rapportons seulement les valeurs r b Selon quun microscope optique ou fluorescence a t utilis. c Trs prochainement, le cot des ractifs pourrait chuter de faon substantielle.
a