Alim. Nutr., Araraquara v.20, n.3, p. 491-497, jul./set.

2009

ISSN 0103-4235

HIDROFOBICIDADE DE RIBOTIPOS DE BACILLUS CEREUS ISOLADOS DE INDSTRIA DE LATICNIOS

Emiliane Andrade ARAJO* Patrcia Campos BERNARDES* Nlio Jos de ANDRADE** Patrcia rica FERNANDES*** Joo Paulo Natalino de S****

RESUMO: A contaminao de superfcies por microrganismos deterioradores e patognicos causa de preocupao na indstria de alimentos. Desenvolvimento de biolmes em ambientes de processamento de alimentos resulta na deteriorao do produto e em possveis riscos para a sade pblica, alm de criar srios problemas nas operaes de processamento do uido. A adeso da bactria superfcie um dos primeiros passos para a formao do biolme e propriedades fsico-qumicas da interface bacteriana inuenciam o processo de adeso microbiana e, consequentemente, os procedimentos operacionais de higienizao. A estrutura do biolme e as caractersticas siolgicas do microrganismo podem conferir resistncia aos agentes antimicrobianos, como por exemplo, aos sanitizantes usados no procedimento de higienizao. Dentre os fatores que inuenciam o processo de adeso, as caractersticas de hidrofobicidade do microrganismo e da superfcie apresentam grande importncia nos mecanismos de adeso. As tcnicas da medio do ngulo de contato e da coluna de interao hidrofbica, para determinao da hidrofobicidade de superfcies de ribotipos de Bacillus cereus isolados de indstria de laticnios, foram avaliadas. Observou-se que as quatro superfcies dos ribotipos avaliados apresentaram a mesma classicao quanto hidrofobicidade tanto pela medida do ngulo de contato com a gua quanto pela determinao da energia livre de interao hidrofbica (GsasTOT). Trs ribotipos foram considerados hidroflicos e um hidrofbico. J a tcnica da coluna de interao hidrofbica no mostrou diferena (p>0,05) no percentual de clulas retidas na coluna, sugerindo que as superfcies dos ribotipos apresentam as mesmas caractersticas quanto hidrofobicidade. Os resultados indicam que a tcnica da medio do ngulo de contato a mais indicada para avaliar a hidrofobicidade de superfcies celulares. A determinao da hidrofobicidade da superfcie celular relevante, uma vez que quando se conhece tambm a hidrofobicidade da superfcie de processamento possvel predizer se a adeso bacteriana termodinamicamente favorvel, a m de adotar mtodos ecientes para reduzir a contaminao de B.cereus e conseqente adeso e formao de biolmes.

PALAVRAS-CHAVE: Bacillus cereus; hidrofobicidade; ngulo de contato; coluna de interao hidrofbica. INTRODUO Entre as espcies do gnero Bacillus, uma das mais importantes para a indstria de laticnios B. cereus, tendo em vista sua capacidade de produzir toxinas, que causam as doenas nas formas emticas e diarricas no homem e seu potencial deteriorador sobre os alimentos pela produo de proteases e fosfolipases extracelulares termorresistentes, que resultam na coagulao doce e no sabor amargo do leite e produtos lcteos. 7, 13 Bacillus cereus um patgeno alimentar, com morfologia de bastonetes grandes, formador de esporo, Grampositivo e aerbio facultativo. Cresce numa faixa de 4C a 55C, sendo de 30C a 40C o intervalo timo de crescimento de acordo com a estirpe. 9 A recontaminao do leite pasteurizado, segundo Aantrekker et al.,1 pode ocorrer por diferentes rotas. As bactrias aderem a superfcies de equipamentos, podendo formar biolmes. Dessa forma, esse grupo de bactrias aderido se torna mais resistente limpeza, desinfeco e remoo, podendo recontaminar o alimento processado. Os bioaerossis, caracterizados por microrganismos suspensos no ar, representam outra rota de contaminao ps-processamento de alimentos. A limpeza e a sanitizao dos equipamentos e utenslios so, sem dvida, operaes fundamentais no controle sanitrio na indstria de alimentos. Entretanto, freqentemente so negligenciadas ou realizadas de forma inadequada. Uma higienizao inadequada de superfcies na linha de produo em laticnios pode levar ao depsito de microrganismos e sua aderncia, com conseqente formao de biolmes18 que a agregao de clulas microbianas, que crescem e se multiplicam em uma superfcie, sendo promovida por substncias polimricas extracelulares produzidas pelos prprios microrganismos.8

* Programa de Ps-Graduao em Cincia e Tecnologia de Alimentos Curso de Mestrado Universidade Federal de Viosa UFV 36570-000 Viosa MG Brasil. E-mail: paticbernardes@yahoo.com.br. ** Departamento de Tecnologia de Alimentos UFV-36570-000 Viosa MG Brasil. *** Curso de Graduao em Cincia e Tecnologia de Laticnios UFV 36570-000 Viosa MG Brasil. **** Estudante Curso de Graduao em Cincia e Tecnologia de Laticnios UFV 36570-000 Viosa MG Brasil.

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Vrios mecanismos para adeso bacteriana em diferentes superfcies de contato tm sido propostos. 26,27 A teoria, descrita por Marshall et al.,12 arma que a adeso em superfcies slidas um processo que acontece em duas etapas. A primeira reversvel, pois o microrganismo est fracamente aderido superfcie atravs de foras de van der Waals e interaes eletrostticas, propiciando fcil remoo da clula bacteriana. J a segunda irreversvel, uma vez que o tempo de aderncia envolve adeso fsica da clula superfcie pela matriz do glicoclix que o material extracelular de natureza polissacardica ou protica produzido pelo microrganismo. O glicoclix auxilia na formao do biolme, sendo produzido somente aps a adeso supercial, fornecendo condies para adeso do peptideoglicano das bactrias Gram-positivas e a parte externa da membrana externa das Gram-negativas de natureza, principalmente, lipoprotica. Propriedades fsico-qumicas das superfcies usadas na indstria de alimentos inuenciam na adeso bacteriana, bem como as propriedades fsico-qumicas dos microrganismos. 14 Linhagens bacterianas com diferentes propriedades de superfcie celular mostram diferentes cinticas de adeso e interaes por superfcies. 6 Dentre os fatores fsico-qumicos que inuenciam no processo de adeso, o parmetro hidrofobicidade apresenta relevncia nos mecanismos de adeso superfcie. A hidrofobicidade de um dado material expressa como a energia livre de interao entre dois entes fsicos imersos na gua. Quando a energia livre de interao hidrofbica entre as molculas imersas em gua atrativa, ou seja, o valor de GSWSTOT negativo, signica que as molculas do slido tm maior interao entre si do que pela gua. Assim, uma superfcie hidrofbica apresenta valores de GSWSTOT negativos. Quando a energia livre global da interao entre as molculas de um slido imerso em gua sucientemente repulsiva, ou seja, o valor de GSWSTOT positivo, a superfcie considerada hidroflica. 24 A determinao da energia livre de interao pode ser obtida pelo mtodo de medida do ngulo de contato formado por uma gota sssil de um lquido. Se o lquido for a gua, o ngulo formado ser relacionado a hidrofobicidade da superfcie. O ngulo de contato formado por uma gota de um lquido sobre uma superfcie slida (Figura 1) o ngulo entre um plano tangente a uma gota e a superfcie onde o lquido se encontra depositado. Segundo van Oss & Giese, 24 as medidas do ngulo de contato entre uma gota de um lquido sobre uma superfcie indicam que esta ltima hidroflica, se forem inferiores a 50. ngulos superiores a esse valor indicam uma superfcie hidrofbica.

Outros mtodos tambm so usados para determinar a hidrofobicidade, destacando-se a adeso microbiana a hidrocarbonetos, coluna de interao hidrofbica, a adeso a superfcies hidrofbicas, agregao por adio de sais, partio hidrofbica num sistema aquoso bifsico e a medida do ngulo de contato. 5, 21 A coluna de interao hidrofbica (CIH) tambm pode ser utilizada em pesquisa como mtodo qualitativo de hidrofobicidade. A coluna hidrofbica usada como ferramenta para separao de biomolculas. Esta separao baseada na hidrofobicidade do meio, na natureza e composio da amostra e na prevalncia e distribuio de resduos de aminocidos expostos na superfcie. A ligao de solutos biolgicos na coluna de interao hidrofbica promovida pela presena de altas concentraes de sais anti-caotrpicos, como sulfato de amnio e sulfato de sdio (GE Healthcare ). A determinao de hidrofobicidade de superfcies uma medida importante, pois se duas superfcies forem hidrofbicas, a adeso pode ser termodinamicamente favorvel, visto que ser mais fcil remover a gua presente entre as duas superfcies para a adeso ocorrer. A adeso de um microrganismo a uma superfcie slida em soluo aquosa s se estabelece se o lme de gua que reveste as duas superfcies for removido. Portanto, a interface bactria/lquido e a interface superfcie de adeso/lquido ter que ser substituda pela interface bactria/superfcie de adeso. Entretanto, deve ser enfatizado que a adeso entre uma superfcie hidrofbica e uma hidroflica ou duas superfcies hidroflicas tambm pode ocorrer. Sabe-se que B.cereus um contaminante comumente encontrado na indstria de laticnios, deste modo conhecer sua hidrofobicidade necessrio a m de adotar mtodos ecientes para a preveno ou reduo da adeso deste microrganismo e conseqente formao de biolmes na superfcie de processamento de alimentos. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo avaliar a hidrofobicidade de quatro estirpes de Bacillus cereus, trs isoladas de leite pasteurizado e uma isolada da superfcie da mquina de envase de leite pasteurizado, utilizando o mtodo da medida do ngulo de contato e coluna de interao hidrofbica. MATERIAL E MTODOS Microrganismos Estudados Os microrganismos estudados foram quatro estirpes de Bacillus cereus, uma isolada da superfcie de ao inoxidvel da mquina de envase de leite pasteurizado (Ribo 1 222-173-S4), denominada de A6 e trs isoladas de lei-

FIGURA 1 ngulo de contato () entre uma gota lquida e uma superfcie plana e horizontal. 22

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te pasteurizado (Ribo 1 222-173-S1, Ribo 1 222-173-S2, Ribo 1 222-174-S3) denominadas de L1, L3 e L12 identicadas por ribotipagem como pertencentes a 4 ribogrupos diferentes.18 Suspenso de Clulas Vegetativas A partir de cultura pura de B. cereus mantida temperatura de -80C em tubo Eppendorf contendo caldo de infuso corao crebro (BHI Merck, Sao Paulo, Brazil) e glicerol (80:20), preparou-se suspenses contendo cerca de 107 UFC.mL-1. Para o uso nos experimentos, suspenso de clulas vegetativas foram produzidas em duas repicagens consecutivas em caldo BHI, por incubao a 32oC/24 horas. O nmero de microrganismos nas suspenses foi determinado por plaqueamento em gar para contagem padro (PCA, Merck) por meio da tcnica spread plate e incubao por 32C/24 horas. Determinao da Tenso Interfacial e da Hidrofobicidade das Estirpes de B. cereus pela tcnica de medio do ngulo de contato Medida do ngulo de contato Determinaram-se os ngulos de contato com gua, formamida e -bromonaftaleno para as estirpes avaliadas utilizando-se o equipamento Gonimetro (Kruss, Germany). Realizou-se a medio do ngulo de contato de uma gota de 2,0 L a cada segundo durante trinta segundos consecutivos para todos os lquidos e estirpes avaliadas. As medidas foram realizadas temperatura ambiente. Foram feitas trs repeties para cada liquido em cada estirpe. Para a medio do ngulo de contato da superfcie das clulas de B. cereus, realizaram-se as medidas sobre uma camada de clulas vegetativas usando o mtodo de gotas descrito por Busscher et al.4 Primeiramente, as estirpes de B. cereus foram ativadas duas vezes em caldo BHI com a nalidade de obter-se uma suspenso de 30 mL da cultura ativa com aproximadamente 107 UFC.mL-1. Posteriormente a suspenso foi centrifugada a 12.000 g por 10 minutos, sendo em seguida lavada por trs vezes em tampo fosfato salino (PBS) 0,1 M. A massa celular foi ressuspendida neste mesmo tampo sendo depositada sobre um ltro de membrana de acetato celulose de 0,45 m de poro e 47mm de dimetro por ltrao usando presso negativa. Adicionaram-se 30 mL de gua ultra-pura no momento da ltrao.

Para padronizar o contedo de umidade, os ltros foram transferidos para Placas de Petri contendo 1% de gar (p/v) e 10% de glicerol (v/v). As membranas foram cortadas em trs partes para a determinao do ngulo de contato com os trs lquidos de polaridade diferente. O critrio primrio de avaliao qualitativa da hidrofobicidade permite avaliar o carter hidrofbico ou hidroflico de uma superfcie por meio do valor do ngulo de contato da superfcie formado com a gua (W). 2 Energia livre de interao hidrofbica A hidrofobicidade calculada utilizando os componentes da tenso interfacial das superfcies interatuantes (Equao 1). 23
(1 cos )
1

2(

LW s

LW l

) Equao 1

Em que l a tenso interfacial total do lquido; l LW a tenso interfacial das foras de interaes de Lifshitz-van der Waals; l + a tenso interfacial do componente aceptor de eltrons do componente cido-base e l a tenso interfacial do componente doador de eltrons do componente cido-base. Sendo s e l superfcie e lquido, respectivamente. Para se determinar as trs componentes da tenso interfacial das superfcies das estirpes foi necessrio determinar o ngulo de contato formado por trs lquidos de polaridades diferentes, cujas componentes da tenso interfacial so conhecidos (Tabela 1). A tenso interfacial total, s tot, de acordo com van Oss & Giese 23 resulta da soma de duas componentes (s LW e s AB), ou seja: a) s LW = 11,1 (1+cosB)2 b) s AB = 2 (s+ x s- )1/2 c) s tot = s LW + s AB
LW

Equao 2 Equao 3 Equao 4

Em que s tot a tenso interfacial total da superfcie; s a tenso interfacial das foras de interaes de Lifshitz-van der Waals; s AB a componente polar da interao de cido base de Lewis; s+ a tenso interfacial do componente aceptor de eltrons da componente cido-base; s a tenso interfacial da componente doador de eltrons da componente cido-base e B o ngulo de contato formado com -bromonaftaleno. A energia livre global de interao GswsTOT entre as molculas da superfcie (s) imersa em gua (w) calculada pelo somatrio das componentes apolar e polar da energia livre de interao, GswsLW e GswsAB respectivamente.

Tabela 1 Componentes da tenso de interfacial de lquidos a 25oC. Lquido -bromonaftaleno gua Formamida l 44,4 72,8 58,0
Tot

Tenso interfacial ( mJ.m-2) l LW l+ 44,4 0,0 21,8 25,5 39,0 2,28

l0,0 25,5 39,6

l Tot refere-se a a tenso interfacial total do lquido; l LW refere-se tenso interfacial das foras de interaoes de Lifshitz-van der Waals; l +refere-se tenso interfacial do componente aceptor de eltrons do componente cido-base; l - refere-se tenso interfacial do componente doador de eltrons do componente cido-base.

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tot G sws

LW Gsws

AB G sws

Equao 5
LW w

LW Gsws
AB Gsws

2x
4
s s

LW s

Equao 6 Equao 7

w w

w s

Aps toda a anlise, a coluna foi regenerada, com a passagem de 5 mL de tampo elution; 4 mL de hidrxido de sdio 1,0 M; 3 mL de gua ultra pura; 5 mL de lcool etlico a 70%, nessa ordem, velocidade de 1 mL por minuto. Assim regeneradas, as colunas foram guardadas fechadas, em recipiente esterilizado, sob refrigerao (4C), para utilizao posterior. Anlise dos Resultados O experimento foi conduzido com trs repeties, em delineamento inteiramente casualizado para as anlises do nmero de clulas aderidas na coluna de interao hidrofbica. Os resultados foram submetidos anlise de varincia, com auxlio do programa Statitical Analysis System (SAS), verso 9.1. RESULTADOS E DISCUSSO Medio dos ngulos de Contato Observando-se os valores dos ngulos de contato para as diferentes estirpes de B.cereus (Tabela 2) vericouse que houve diferena quanto hidrofobicidade. A estirpe L3 foi hidrofbica, por apresentar ngulo de contato com a gua superior a 50 enquanto as demais estirpes foram consideradas hidroflicas, pois apresentaram ngulo de contato com a gua inferior a 50. Os resultados deste experimento so similares queles encontrados por Van der Mei et al.,21 no que refere a ampla variao da medida do ngulo de contato formados com a gua e a formamida e a pequena variao dessas medidas para o componente apolar, o -bromonaftaleno. Van der Mei et al.21estudaram 142 isolados de vrias espcies baseados na medida do ngulo de contato e vericaram que os ngulos formados com a gua e formamida so os principais discriminatrios entre estirpes e espcies. Os microrganismos podem apresentar variaes na hidrofobicidade, dependendo das condies de cultivo. A hidrofobicidade de bactrias Gram-negativas aumenta quando diminui a quantidade de gua no meio porque a membrana externa tem grande quantidade de lipdios e pouco peptideoglicano. A hidrofobicidade a propriedade termodinmica mais facilmente inuenciada pela quantidade de gua do meio. J as bactrias Gram-positivas so menos afetadas pela modicao da quantidade de gua

Determinao da Hidrofobicidade das Estirpes de B.cereus por coluna de interao hidrofbica A hidrofobicidade das estirpes de B.cereus tambm foi determinada por coluna de interao hidrofbica (GE healthcare ). Suspenses contendo cerca de 107 clulas/mL de cada estirpe de B.cereus foram analisadas com o uso da coluna Hiscreen Butyl/FF (tamanho da coluna: 5 x 1 mL). A metodologia seguida foi sugerida pelo fabricante: i) as estirpes foram previamente ativadas por transferncia para caldo BHI, a 32C, por 24 horas e posteriormente por mais 24 horas; ii) 1 mL de cada cultura foi transferido para tubos ependorff e centrifugados a 6000 rpm por cinco minutos; iii) o sobrenadante foi descartado e foi ento adicionado 1 mL de soluo salina 0,85% ao decantado para nova centrifugao, sendo este procedimento repetido por trs vezes; iv) a massa celular foi resuspendida com 1 mL de soluo salina 0,85% e a partir da, foram feitas diluies decimais em gua peptonada a 0,1% para a semeadura em superfcie em placas contendo gar PCA para contagem da populao inicial de clulas; v) a coluna de interao hidrofbica foi puricada, por injeo de 5 mL de tampo starter, 5 mL de tampo elution e 5 mL de tampo starter novamente, nessa ordem, na velocidade de 1 mL por minuto, este procedimento foi repetido entre cada amostra analisada; vi) 1 mL da massa celular retirada do tubo ependorff foi aplicada na coluna, na velocidade de 1 mL por minuto; viii) o material extrado da coluna foi coletado em ependorff e novamente foram realizadas diluies decimais em gua peptonada a 0,1% para a semeadura em superfcie em placas contendo gar PCA para contagem da populao nal de clulas, a m de saber o nmero de clulas retidas na coluna. A porcentagem de clulas retidas foi calculada com base na diferena entre a contagem inicial e nal de clulas. O tampo starter utilizado foi preparado com 1,5 M de sulfato de amnio e 50 mM de fosfato de sdio, pH 7,0. E o tampo elution era composto de 50 mM de fosfato de sdio, pH7,0. Estes tampes foram utilizados para puricao da resina entre a passagem das amostras

Tabela 2 ngulos de contato com a gua, formamida e -bromonaftaleno e energia livre de interao hidrofbica das superfcies de diferentes ribotipos de Bacillus cereus. B. cereus A6 B. cereus L1 B. cereus L3 B. cereus L12 A 24,52 + 0,56 27,98 + 0,72 78,73 + 0,36 25,41 + 0,24 F 15,37 + 0,34 25,31 + 0,51 58,01 + 0,60 40,22 + 0,38 B 45,17 + 0,47 44,23 + 0,63 42,05 + 1,23 43,98 + 0,77 Gbab TOT(mJ/m2) 19,8300 23,5028 -67,6360 116,5772

(A) refere-se ao ngulo de contato medido com a gua; (F) refere-se ao ngulo de contato medido com a formamida; (B) referese ao ngulo de contato medido com o alfa-bromonaftaleno; (Gbab TOT) refere-se energia livre de interao hidrofbica.

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do meio, devido a grande teor de peptideoglicano em suas membranas e menor quantidade de lipdeos. 19 Os resultados encontrados neste trabalho corroboram os encontrados na literatura, em que se percebe que uma grande variao na hidrofobicidade pode ser observada entre gneros de bactrias e estirpes da mesma espcie. Teixeira et al. 20 mediram os ngulos de contato com gua, formamida e di-iodometano de vrias estirpes das seguintes espcies; Pseudomonas aeruginosa, Lactobacillus lactis lactis, Staphylococcus sciuri e Enterococcus faecalis. Estes autores vericaram que todas as estirpes de Lactobacillus lactis lactis bem como de Enterococcus faecalis so hidrofbicas. J as estirpes de Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus sciuri apresentaram maior variao dentro da mesma espcie, sendo algumas consideradas hidrofbicas e outras hidroflicas. Entre as estirpes analisadas de P. aeruginosa, uma estirpe apresentou o valor de 23,1 para o ngulo de contato com a gua, sendo esta considerada hidroflica, enquanto outra estirpe obteve ngulo de 102, sendo considerada hidrofbica. Tambm, Flint et al.8 quando determinaram a hidrofobicidade de 12 estirpes de estreptococcus observaram que estes tinham diferentes nveis de hidrofobicidade. Energia Livre de Interao Hidrofbica Os resultados da energia livre de interao hidrofbica (GbabTOT) foram obtidos aplicando nas equaes de Van Oss23 os valores dos ngulos de contato determinados com a gua, formamida e alfa-bromonaftaleno. A estirpe B. cereus L3 apresentou valor negativo para energia livre de interao hidrofbica (GbabTOT = -67,6360) sendo, portanto considerada hidrofbica, assim como no resultado do ngulo de contato formado com a gua. A estirpe B cereus L12 foi a mais hidroflica (Tabela 2) entre as estirpes estudadas, pois possui valor de GbabTOT mais positivo (GbabTOT = 116,5772). A classicao de hidrofobicidade das estirpes de B.cereus avaliadas pelos valores de GbabTOT coincidiu com a hidrofobicidade dessas superfcies celulares determinadas pela medio do ngulo de contato com a gua. Lindsay et al.10 estudaram a hidrofobicidade de quatro isolados de Bacillus (B. subtilis 115, B. pumilus 122, B. licheniformis 137 e B. cereus 144) previamente isolados de soluo de lavagem alcalina de limpeza CIP. Todos os isolados exibiram baixa propriedade hidrofbica em todos

os valores de pH testados (faixa de pH de 4,5 a 10). Relatos anteriores sugerem que adeso de clulas bacterianas em superfcies pode ser aumentada quando as clulas so hidrofbicas. Entretanto, importante ressaltar que a adeso inuenciada por outros fatores alm da hidrofobicidade caractersticos das duas superfcies interatuantes, como carga eltrica, rugosidade da superfcie de processamento e os fatores microbiolgicos. Wiencek et al.25 avaliaram a hidrofobicidade de algumas espcies de Bacillus, dentre elas de B. cereus T obtida da NCSU (North Carolina State University) pelo mtodo de adeso bacteriana hidrocarboneto. Os autores obtiveram percentual de 3% de hidrofobicidade das clulas vegetativas de B. cereus aps partio com 0.1, 0.2, 0.6 e 1.0 ml de hexadecano, demonstrando assim a caracterstica hidroflica da superfcie celular. Coluna de Interao Hidrofbica Avaliando o nmero de clulas das diferentes estirpes retidas na coluna de interao hidrofbica (Tabela 3), vericou-se que no houve diferena signicativa entre as estirpes estudadas. Sabe-se que a reteno altamente facilitada quando as duas superfcies interatuantes so hidrofbicas. 11 Neste caso as superfcies que interagiram foram a resina hidrofbica e as clulas das estirpes avaliadas. Um alto grau de hidrolicidade signica um baixo grau de hidrofobicidade. Assim quando a estirpe altamente hidroflica signica que ela pouco hidrofbica resultando numa menor reteno na coluna de interao hidrofbica. 3 Ronner et al.17 avaliaram a adeso de esporos de cinco diferentes espcies de Bacillus em superfcie slidas. A hidrofobicidade da superfcie do esporo foi medida pela coluna de interao hidrofbica (HIC). Grande variao na hidrofobicidade foi encontrada entre os esporos de diferentes espcies testadas. Os resultados permitiram dividir os esporos em trs grupos, sendo o primeiro grupo dos mais hidrofbicos: B.cereus (entre 40% e 50% de adeso na coluna). O segundo grupo incluiu os esporos de B. licheniformis e B. polymyxa (entre 1% e 20% de adeso). O terceiro grupo de baixa hidrofobicidade engloba os esporos de B. subtilis e B. stearothermophilus (entre 0% e 5% de adeso). O nvel de adeso dos esporos foi consistente com os resultados obtidos usando a HIC. Os esporos mais hidrofbicos aderiram melhor nas superfcies hidrofbicas.

Tabela 3 - Valores mdios da porcentagem de clulas aderidas de diferentes estirpes de B. cereus na coluna de interao hidrofbica. Estirpes B. cereus L3 B. cereus A6 B. cereus L1 B. cereus L12 Porcentagens de clulas aderidas na coluna de interao hidrofbica* 34,60 a 33,00 a 32,00 a 26,30 a

Mdias seguidas pela mesma letra no diferem entre si pelo teste Tukey (p>0,05). * mdia de trs repeties.

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A coluna de interao hidrofbica no foi capaz de diferenciar a estirpe B. cereus L3 das demais como observado pela tcnica do ngulo de contato, na qual esta foi considerada hidrofbica e as demais hidroflicas. importante ressaltar que no se pode fazer generalizaes em relao hidrofobicidade de uma determinada espcie. As estirpes ou espcies existentes no podem ser classicadas sempre como hidroflicas ou hidrofbicas. A anlise de hidrofobicidade no permite um grupamento das estirpes ou espcies de acordo com sua taxonomia microbiolgica. Alguns fatores so capazes de inuenciar a hidrofobicidade celular, como a fase em que o microrganismo se encontra, a presena dos apndices celulares, as substncias polimricas excretadas e a composio do meio de crescimento. Evidncias sugerem, por exemplo, que a presena de LPS na superfcie celular de Gram-negativos tende tornar a clula bacteriana mais hidroflica e a perda de LPS da superfcie celular torna a superfcie mais hidrofbica. J foi relatado que a reduo nos nveis de oxignio do meio, induz modicao estrutural no LPS de algumas bactrias resultando em aumento da hidrofobicidade da clula. Isto indica que a bactria capaz de sentir as mudanas no ambiente externo e alterar as caractersticas da superfcie celular como a hidrofobicidade. 15 Peng et al.16 estudaram a habilidade de B. cereus em aderir em cupons de ao inoxidvel durante seu crescimento em caldo DTSB (Diluted tryptic soy broth). O nmero de clulas que aderiram superfcie aumentou quando a cultura alcanou o nal da fase log e entrou na fase estacionria. Observaram tambm que a hidrofobicidade das clulas vegetativas de B. cereus no nal da fase estacionria foi maior que das fases estacionria e log. A adeso de clulas vegetativas de B. cereus na superfcie de ao inoxidvel correlacionou positivamente com a hidrofobicidade da superfcie celular (R=0,979). Neste estudo, pode-se dizer que a hidrofobicidade foi o principal fator que inuenciou a adeso de B.cereus ao ao inoxidvel. A superfcie celular da estirpe B.cereus L3 foi a considerada hidrofbica pela medida do ngulo de contato com a gua e na avaliao do GsasTOT. No houve diferena (p>0,05) na porcentagem de reteno de clulas na coluna de interao hidrofbica entre as estirpes estudadas. Neste estudo, a medida do ngulo de contato, foi melhor para estimar a hidrofobicidade da superfcie celular de uma dada bactria. No houve similaridade entre os resultados quando se comparou a hidrofobicidade das estirpes de B.cereus pela medida do ngulo de contato e a porcentagem de clulas retidas na coluna de interao hidrofbica. A adeso da bactria superfcie um dos primeiros passos para a formao do biolme. Com a determinao da hidrofobicidade possvel predizer se a adeso termodinamicamente favorvel ou no. Assim, com base nestes resultados, o responsvel na indstria de alimentos deve adotar procedimento de higienizao eciente para reduzir

a contaminao de B. cereus e dicultar a adeso bacteriana e conseqente formao de biolme na superfcie de processamento de alimentos, reduzindo desta maneira as possveis conseqncias indesejveis do biolme tanto para a indstria como para o consumidor. ARAJO, E. A.; BERNARDES, P. C.; ANDRADE, N. J.; FERNANDES, P. E.; S, J. P. N. Hydrophobicity of ribotypes Bacillus cereus isolates from dairy plants. Alim. Nutr., Araraquara, v. 20, n. 3, p. 491-497, jul./set. 2009. ABSTRACT: The adhesion bacterian on surface is one of the rst steps to the formation of biolms. Physicalchemical properties of the bacterial interface affect the microbial adhesion process on the food processing contact surfaces and the cleaning and sanitizing procedures. Among the physico-chemical factors, the hydrophobicity parameter has great importance in the mechanisms of adhesion on surface.The techniques of contact angle measurements and of hydrophobic interaction column were evaluated for determination of surfaces hydrophobicity of ribotypes Bacillus cereus isolates from dairy plants. It was observed that the four surfaces of ribotypes showed similar hydrophobicities by the measurements of contact angle with water and by determination of free energy of hydrophobic interaction (GsasTOT). The method of hydrophobic interaction column did not show difference (p>0,05) on the percentage of cells adhered on the hydrophobic column, suggesting that the surfaces showed the same characteristics for hydrophobicity. The results showed that the method of contact angle is the more appropriated to evaluate the hydrophobicity of cell surfaces. The determination of cell surface hydrophobicity is important because when you know also the hydrophobicity of the surface processing is possible to predict the bacterial adherence is thermodynamically favorable in order to have efcient methods to reduce contamination of B.cereus and consequent adhesion and formation of biolms. KEYWORDS: Bacillus cereus; hydrophobicity; contact angle; hydrophobic interaction column. REFERNCIAS 1. AANTREKKER, E. D. et al. Quantifying recontamination through factory environments a review. Int. J. Food Microbiol., v. 80, n. 2, p. 117-130, 2003. 2. AZEREDO, J. Adeso de microrganismos e composio da matriz de bioagregados: desenvolvimento de tcnicas e estudo da inuncia de exopolmeros. 1998. 231 f. Tese (Doutorado em Engenharia Biolgica e Qumica) - Escola de Engenharia, Universidade do Minho, Braga, 1998.

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