CROMATOGRAFIA LQUIDA EM COLUNA E EM CAMADA FINA

1. O QUE CROMATOGRAFIA A palavra cromatografia foi utilizada pela primeira vez em 1903 por Michael Tswett, um botnico russo, para descrever a separao de pigmentos de plantas e zonas de cores distintas. A palavra vem do grego: KROMATOS (cor) + GRAPHOS (escrita). Tswett usou um tubo de vidro preenchido com uma substncia slida (carbonato de clcio) e passou atravs do tubo extratos de plantas, observando a formao de zonas verdes e amarelas. A partir da, o uso da cromatografia se tornou popular como um mtodo de identificao e de separao de substncias coloridas. Atualmente, o mtodo aplica-se tambm a substncias incolores, mas o nome original foi mantido. Para compreender o processo envolvido na cromatografia, necessrio que se saiba o que fase. A palavra fase derivada do grego e significa aparncia. Se um sistema totalmente uniforme, tanto na constituio qumica quanto no estado fsico, ele dito homogneo e constitudo de uma nica fase. Um sistema constitudo de duas ou mais fases chamado heterogneo. Em todas as tcnicas cromatogrficas esto envolvidas duas fases, sendo que uma se locomove atravs de uma outra. Essas fases recebem os nomes de fase estacionria e fase mvel. A fase estacionria formada de um material escolhido para reter de forma diferenciada os componentes da amostra que se deseja separar. A fase mvel o material que se desloca pela fase estacionria, arrastando os componentes da amostra. Aps transitar pela fase estacionria, por um percurso de distncia adequadamente escolhida, os componentes da amostra se separam e so assinalados pelo sistema detector na seqncia: do primeiro componente menos retido, ao ltimo componente mais retido pela fase estacionria. Dependendo do tipo de material utilizado na constituio dessas fases, as tcnicas recebem nomes especficos. Temos, assim, a cromatografia lquida em coluna, a cromatografia lquida em camada fina (ou camada delgada) e a cromatografia gasosa.

2. Cromatografia Lquida em Coluna O conceito de cromatografia lquida abrange uma diversidade de tcnicas de separao onde a fase mvel formada por um lquido. A cromatografia lquida em coluna clssica caracteriza-se pelo uso de colunas de vidro com dimetros relativamente grandes, recheadas pela fase estacionria finamente dividida, com a fase mvel percolando as colunas pela ao da gravidade. Em geral, essas separaes so lentas e o exame das fraes recuperadas pode ser tedioso. Porm, a partir de 1969, com o desenvolvimento da cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE, ou no ingls, HLPC), a cromatografia lquida atingiu grande xito, comparada cromatografia gasosa, graas s seguintes caractersticas: 1. Grande poder de resoluo 2. Maior velocidade de separao 3. Monitorao contnua do efluente da coluna 4. Medio quantitativa exata 5. Anlises repetitivas e reprodutivas com a mesma coluna 6. Automao do processo analtico e do tratamento de dados A cromatografia lquida de alta eficincia , em alguns aspectos, mais verstil do que a cromatografia de gs, pois (a) no est limitada a amostras volteis e termicamente estveis e (b) mais ampla a escolha das fases mvel e estacionria. 3. Tipos de Cromatografia Lquida So quatro os tipos principais de cromatografia lquida que merecem discusso: 3.1. Cromatografia lquido-slido (CLS) tambm conhecida por cromatografia de adsoro, baseia-se nas interaes do soluto com os centros ativos de um adsorvente slido, finamente dividido, usado como fase estacionria. Utiliza-se como material adsorvente slidos ativos com grande rea superficial, como a alumina, o carvo ou a slica-gel (esta, a mais utilizada). Obs: adsorventes muito ativos podem provocar uma adsoro irreversvel do soluto; a slicagel, que ligeiramente cida, pode reter fortemente compostos bsicos, enquanto a alumina (sem lavagem cida) bsica e no deve ser empregada na cromatografia de compostos sensveis s bases.

O papel do solvente na CLS fundamental, pois as molculas da fase mvel (solvente) competem pelos stios de adsoro polar com as molculas do soluto. Quanto mais forte for a interao entre a fase mvel e a fase estacionria, mais fraca ser a adsoro do soluto, e vice-versa. Em geral, os compostos mais bem separados pela CLS so os solveis em solventes orgnicos e no-iongenos. Os compostos solveis em gua e no-iongenos so mais bem separados mediante a cromatografia com fases invertidas ou a cromatografia com fase ligada. 3.2. Cromatografia lquido-lquido (de partio) (CLL) semelhante, em princpio, extrao por solvente, e baseia-se na distribuio das molculas do soluto entre duas fases lquidas imiscveis, de acordo com as solubilidades relativas. O meio de separao constitudo por um suporte inerte que retm uma fase lquida (a fase estacionria), e a separao se faz mediante a passagem da fase mvel sobre a estacionria. Esta pode estar na forma de uma coluna recheada, ou de uma camada fina sobre o vidro ou de uma tira de papel. CLL normal: a fase estacionria polar e a fase mvel apolar. Neste caso, a ordem de eluio1 dos solutos est baseada no princpio de os solutos apolares preferirem a fase mvel e serem eludos primeiramente, enquanto os solutos polares preferem a fase estacionria e so eludos posteriormente. CLL com fases invertidas: neste caso, a fase estacionria apolar e a fase mvel polar. A ordem de eluio , comumente, a ordem inversa da que se observa na CLL normal. Este um modo popular de operao em virtude da sua versatilidade e abrangncia; a quase universal aplicao da cromatografia com fases invertidas se deve a que quase todas as molculas orgnicas tm regies hidrofbicas nas suas estruturas e por isso podem interagir com a fase estacionria apolar. As fases estacionria e mvel na CLL so escolhidas para serem to pouco solvel uma na outra quanto possvel, porm a solubilidade, embora pequena, da fase estacionria na mvel pode provocar a lenta remoo da primeira medida que a fase mvel flui sobre o suporte da coluna. Por isso, a fase mvel deve ser pr-saturada pela fase estacionria antes de entrar na coluna. Consegue-se esse efeito mediante uma pr-coluna de saturao colocada antes da coluna cromatogrfica. medida que a fase mvel passa pela pr-coluna, fica saturada pela fase estacionria, antes de entrar na coluna cromatogrfica.
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Eluio: dessoro provocada por um fluxo de lquido ou de gs atravs de um absorvente.

Fases estacionria e mvel tpicas na cromatografia normal e com fases invertida Fases estacionrias Cromatografia normal , -oxidipropanonitrila Carbowax (400, 600, 700, etc.) Glicis (etileno, dietileno) Cianoetilsilicone Fases mveis Hidrocarbonetos saturados, p. ex. hexano, heptano; solventes aromticos, p. ex. benzeno, xileno; hidrocarbonetos saturados com at 10% de dioxana, metanol, etanol, clorofrmio, cloreto de metileno (diclorometano). Cromatografia com fases invertidas Esqualeno Zipax-HPC Cianoetilsilicone 3.3. Cromatografia com fase ligada Para superar alguns problemas da CLL convencional, como a perda da fase estacionria que est sobre o material do suporte, pode-se ligar quimicamente esta fase quele material. Esta forma de cromatografia lquida, na qual fases monomricas e polimricas ligam-se a uma grande diversidade de material de suporte, denominada cromatografia com fase ligada. 3.4. Cromatografia por permeao de gel (de excluso) esse tipo de cromatografia lquida permite a separao das substncias em virtude dos respectivos tamanhos e formas moleculares. A fase estacionria da cromatografia por permeao de gel constituda por materiais porosos com os tamanhos dos poros estreitamente controlados; o mecanismo primrio da reteno das molculas do soluto o da diferena da penetrao (ou da permeao) de cada molcula do soluto no interior das partculas do gel. As molculas que forem muito grandes sero efetivamente excludas de certas aberturas da rede do gel e passaro pela coluna principalmente atravs do volume lquido intersticial. AS molculas menores podem entrar no interior das partculas do gel, de acordo com os respectivos tamanhos e com a distribuio dos tamanhos dos poros que lhes so oferecidos, e so retidas com maior intensidade. As extensas aplicaes analticas da cromatografia por permeao de gel cobrem materiais orgnicos e inorgnicos. Embora sejam muitas as aplicaes deste tipo de tcnica a molculas inorgnicas e orgnicas simples, a tcnica foi principalmente aplicada a estudos de molculas bioqumicas complexas ou de molculas com elevada polimerizao. Misturas de gua e lcool; acetonitrila e misturas de acetonitrila e gua.

Obs: Cromatografia lquida de alta eficincia (CLAE) Como discutido inicialmente, a cromatografia lquida s passou a ter o mesmo xito da cromatografia em fase gasosa devido ao desenvolvimento da tcnica da CLAE. Este processo utiliza uma presso alta para forar a passagem do solvente pelas colunas contendo partculas muito finas que proporcionam separaes muito eficientes. Escolha do mtodo de separao: Para escolher o tipo de coluna mais apropriado, o analista precisa deter um certo conhecimento das caractersticas fsicas da amostra e tambm o tipo de informao que se quer na anlise. Na figura a seguir est um diagrama que proporciona um guia geral para a escolha do mtodo cromatogrfico para a separao de compostos de peso molecular menor que 2000; para amostras mais pesadas, o mtodo de escolha ser a cromatografia por permeao de gel. No entanto, a previso do sistema cromatogrfico apropriado para uma dada amostra no feita com certeza, e deve ser, usualmente, confirmada pela experincia. Com uma amostra complexa nenhum mtodo nico completamente adequado para a separao, e possvel que seja necessria uma combinao de tcnicas diferentes.

4. Equipamento para a Cromatografia Lquida de Alta Eficincia No diagrama a seguir esto ilustradas as caractersticas essenciais da cromatografia lquida moderna; correspondem aos seguintes componentes:

1. Sistema de injeo do solvente, que inclui bomba, controles de presso e de vazo, e filtro no lado da entrada; 2. Sistema de injeo da amostra; 3. A coluna; 4. O detector; 5. Registrador em carta de fita bobinada; 6. Dispositivo de tratamento de dados e controle por microprocessador.

a. Bomba de alta presso: seu desempenho afeta diretamente o tempo de reteno, a reprodutividade e a sensibilidade do detector.Dados tcnicos podem ser obtidos em livros ou em manuais. A injeo da fase mvel na coluna deve ser constante, reprodutvel e isenta de pulsos. b. Sistema de injeo da amostra: a introduo da amostra, em geral, se faz de uma entre as duas maneiras seguintes por meio de uma seringa de injeo ou por meio de uma vlvula de amostragem. c. A coluna: as colunas que se usam mais comumente so feitas em tubo de ao inoxidvel polido, com calibre de preciso; as dimenses tpicas so o comprimento de 10 a 30 cm e o dimetro interno de 4 ou 5 mm. A fase estacionria, ou recheio, sustentada em cada extremidade por fritas delgadas de ao inoxidvel, com dimetro dos poros de 2 m ou menos. Os recheios usados na CLAE moderna so constitudos por partculas pequenas, rgidas, com uma distribuio granulomtrica estreita. Podemos dividir, convenientemente, os tipos de recheio nas trs categorias gerais seguintes:

(a) Grnulos porosos, polimricos, baseados em copolmeros de estireno-divinilbenzeno. So usados na troca de ons e na cromatografia por permeao de gel. So substitudos em muitas aplicaes analticas, por recheios com base na slica, mais eficientes e mecanicamente mais estveis. (b) Grnulos de camada porosa (dimetro de 30 a 55 m) constitudos por uma delgada camada externa (1 a 3 m) de slica ou de slica modificada ou de outro material, e por um ncleo esfrico interno (por exemplo, prolas de vidro). Estes recheios de tipo peculiar ainda so usados em algumas aplicaes de troca de ons, mas a sua utilizao geral da CLAE decresceu com o desenvolvimento de recheios microparticulados totalmente porosos. (c) As partculas de slica totalmente porosas (dimetro menor que 10 m, com estreita distribuio granulomtrica) constituem, nos dias de hoje, os recheios de coluna mais importantes existentes no comrcio para a CLAE analtica. Em comparao com os grnulos de camada porosa, as partculas de slica totalmente porosas proporcionam considervel melhoria da eficincia da coluna, da capacidade de analisar amostras e da velocidade de anlise. O procedimento para rechear uma coluna depende principalmente da resistncia mecnica do recheio e das dimenses das partculas. As partculas com dimetros maiores que 20 m podem usualmente ser colocadas a seco, enquanto partculas com dimetros menores que 20 m so colocadas mediante tcnicas de recheio em suspenso; nesta tcnica, as partculas so suspensas num solvente apropriado e a suspenso introduzida sob presso na coluna (ou ento, comprar uma coluna j preenchida, no comrcio). A vida til de uma coluna pode ser prolongada pela colocao de uma coluna de guarda. uma pequena coluna que fica entre o injetor e a coluna da CLAE a fim de proteger esta ltima de danificaes, ou da perda de eficincia provocada por material particulado ou por substncias fortemente adsorvidas nas amostras ou nos solventes. Pode ser usada tambm para saturar o solvente de eluio pela fase estacionria solvel. d. Detectores: monitoram a fase mvel medida que eflui da coluna. Podem ser divididos em: (a) Detectores de propriedades macroscpicas: medem a diferena entre uma propriedade fsica do soluto na fase mvel e a mesma propriedade na fase mvel pura; por exemplo, o ndice de refrao ou a condutividade. (b) Detectores de propriedades de soluto: respondem a uma propriedade fsica ou qumica especfica do soluto e idealmente so independentes da fase mvel. So detectores espectrofotomtricos, de fluorescncia ou eletroqumicos.

 Caractersticas de um detector 1. Alta sensibilidade; 2. Resposta linear (intervalo de concentrao no qual sua resposta diretamente proporcional concentrao do soluto); 3. Tipo de resposta (se o detector responde a todos os constituintes da amostra universal ou responde apenas a certos componentes seletivo).
Tipo de detector Resposta Concentrao (g . mL-1) Intervalo de linearidade* Amperomtrico Seletivo 10-10 104 - 105 -7 Condutimtrico Seletivo 10 103 104 -12 Fluorescncia Seletivo 10 103 104 Absoro no UV/visvel Seletivo 10-8 104 - 105 -6 ndice de refrao Universal 10 103 104 * o intervalo dentro do qual a resposta essencialmente linear est expresso por um fator pelo qual a concentrao mais baixa deve ser multiplicada a fim de se obter a concentrao mais elevada.

Principais tipos de detectores: Detectores de ndice de refrao: baseia-se na modificao do ndice de refrao do eluente da coluna em relao fase mvel pura. Apresentam muitas desvantagens no tm sensibilidade alta, no so apropriados para a eluio com gradiente e exigem estreito controle da temperatura ( 0,001C) para operar com a sensibilidade mais elevada possvel. Detectores de ultravioleta: so os mais usados na CLAE. Esto baseados no princpio da absoro de luz UV ou de luz visvel, quando o efluente da coluna passa por uma pequena clula de escoamento mantida no feixe de radiao. So caracterizados por uma sensibilidade elevada (o limite de deteco cerca de 1 . 10-9 g . ml-1) e, em virtude se ser um detector de propriedade do soluto, relativamente insensvel a variaes da temperatura ou da vazo. Detectores de fluorescncia: permitem a deteco de compostos (solutos) fluorescentes presentes na fase mvel pela passagem do efluente da coluna atravs de uma clula irradiada por luz ultravioleta e pela medida da radiao de fluorescncia assim induzida. Embora apenas uma pequena proporo de compostos orgnicos e inorgnicos seja naturalmente fluorescente, muitos compostos com atividade biolgica e contaminantes ambientais so fluorescentes, e este fato, em conjunto com a alta sensibilidade dos detectores, explica seu uso generalizado. Detectores eletroqumicos: referem-se a detectores amperomtricos ou detectores coulomtricos, que medem a corrente associada oxidao ou reduo de solutos.