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Mecanismos:

As enzimas so catalisadores muito poderosos devido a sua especificidade de ligao com o substrato e a organizao otimizada dos grupos catalticos. Mecanismos de Catlise: 1. Catlise cido-base geral: - Formao de intermedirios carregados instveis que tendem a se degradar no reagentes, impossibilitando a reao - A estabilizao ocorre por transferncia de H+ de um substrato ou desses intermedirios para um substrato, formando uma espcie mais estvel (ES) que facilita a converso em P ( energia livre) - Aceptores/doadores de H+: cidos e bases fracas, R dos AA - Catlise A-B especfica: gua, OH-, H3O+ so receptores/doadores (apenas quando o reagentes no se querbrar antes de a gua doar/receber H +) - Ex: mutarrotao da glicose e RNAse A 2. Catlise covalente: - Formao de uma ligao covalente transitria entre a enzima e o substrato - Na presena de um catalisador covalente, o caminho da reao muda e a catlise apenas ocorre se o novo caminho tiver uma Ea menor do que a da -catalisada. - As novas etapas devem ser mais rpidas do que a reao -catalisada catalisador covalente - Ocorre regenerao da enzima posteriormente - Agentes nucleoflicos: cadeias laterais, grupos funcionais de cofatores - Etapas:

- Coenzimas nuclefilos e eletrfilos: tiamina-pirofosfato e piridoxal fosfato - Ex (catlise): reao da quimiotripsina e descarboxilao do acetoacetato 3. Catlise por ons metlicos: - Metais tanto ligados s enzimas quanto ao substrato - 1/3 das enzimas necessitam de metais para a sua atividade - Metaloenzimas: contm metais (geralmente de transio) fortemente ligados - Enzimas ativadas por metais: ligam metais (geralmente alcalinos e alcalinos terrosos) em soluo - Metais ligados a enzimas ou em soluo podem participar da reao atravs de interaes inicas metal enzima substrato - Os ons metlicos participam da reao (1)ligando-se ao substrato e orientando o

stio ativos, (2)estabilizando eletrostaticamente o ES e (3)mediando as reaes de oxidorreduo 4. Catlise eletrosttica: - A distribuio de cargas ao redor do stio ativo estabiliza o ES - A distribuio de cargas pode servir para guiar o substrato para os stios de Ligao - A catlise semelhante a por on metlico 5. Efeito de proximidade e orientao: - O stio cataltico permite a proximidade entre os substratos e a correta orientao espacial dos grupos reagentes, o que reduz a entropia 6. Lig. Preferancial ao ES *: - O ES liga-se enzima com afinidade maior que os S ou P correspondentes - o principal mecanismo de catlise - O substrato se liga ao stio ativo e sofre uma toro at atingir a geometria do ES - Anlogos do ES so potentes inibidores enzimticos

Cintica qumica:
- A velocidade das reaes varia diretamente com a [R]s - A determinao da velocidade da reao e como ela alterada pelas condies experimentais permite estudar o mecanismo de uma reao Perfil/comportamento de uma reao: Estado estacionrio de Briggs-Haldane

- estado estacionrio porque o [ES] permanece constante o que produzido consumido - Se a [S] maior do que a [E] a o [ES] permanece const. - Admite a formao de 2 complexos de trasio: ES e EP - [E] tambm constante - [Et] = [E] + [ES] (em qualquer parte da reao) - Estado pr-estacionrio o perodo onde a [ES] se estabelece - Estado estacionrio quando o [ES] constante (a V0 medida nesse estado) - O grfico representa uma reao completa

Concentrao X velocidade: - A [S] afeta a velocidade da reao - A formao do complexo ES uma etapa necessria para a catlise - Michaelis-Menten postulam que a enzima combina-se reversivelmente com o seu S (formando o ES numa reao rpida) e o ES quebra para formar Elivre + P (etapa lenta; reao limitante)

- A velocidade global proporcional [ES] E (enzima) livre; reao de 1 ordem E complexada (ES); atinge velocidade mxima; enzima saturada; reao de ordem zero - A velocidade mxima ocorre quando quase toda a enzima estiver presente como complexo ES e a [E] desprezvel - Aps o rompimento do ES dando P, a enzima fica livre para catalisar a reao de mais um S - saturao enzimtica plat - Equao de Michaelis-Menten: - a equao da velocidade da reao - Define a relao quantitativa entre Vmx, V0 e [S] inicial Breve explicao da frmula de M-M: No incio da reao, em que V0 = K2[ES], a [P] desprezvel o que permite ignorar a reao de k -2 (P S). Ento, a formao e quebra de ES so determinados respectivamente pelas reaes de k1 (formao) e k2 + k -1 (quebra). Considerando que [Et] representa a concentrao total da enzima (E livre + E ligada) e que as velocidades de formao e quebra de ES so dadas por 1 parte do grfico [S] 2 parte do grfico [S]

devemos igualar essas velocidades e chegaremos frmula onde (k -1 + k2)/k1 definido como constante de Michaelis (Km). Porm, como a velocidade mxima ocorre quando a enzima est saturada, ou seja, [ES] = [Et], ento podemos substituir k2[Et] por Vmx , e para chegar frmula final, basta substituir o [ES] na V0 = K2[ES]

Velocidade inicial X [S]: - Quando temos [S] , Km se torna muito maior do que a [S] do denominador, tornando este desprezvel no clculo. Ento, nessas condies, podemos simplificar a frmula para V0 = Vmx[S]/Km (linear) - Em alta [S], [S] fica muito maior que Km, e este torna-se desprezvel e a equao fica simplificada a V0 = Vmx (consistente com o plat observado em [S] elevada).

Anlise dos dados cinticos: Equao de Lineweaver-Burk: duplo-recproco uma converso da frmula de Michaelis-Menten - Vantagens: Facilita a determinao de Vmx mais acurada (s pode ser vista aproximadamente nos grficos V0 X S) e possibilita a verificao dos mecanismos de reao e inibio enzimtica - Desvantagens: Ocorre um acmulo de pontos da reta prximo 1/V0 e os pequenos erros na determinao da velocidade resultam em grandes erros na determinao de parmetros cinticos por esse mtodo

A faixa de [S] deve ser prxima de Km: - [S] muito alta reta ficar horizontal (denom.) - [S] muito baixa reta interceptar os eixos muito prximo da origem

Grfico de Hanes-Woolf: - Multiplica-se ambos os lados da equao de Lineweaver-Burk po [S]

- [S] muito baixa comparada ao Km reta quase horizontal - [S] muito alta comparada ao Km reta interceptar os eixos muito prximo da origem

Equao integrada de Michaelis-Menten: - Utilizada quando a V0 difcil de medir - Consegue-se medir a [S] em diferentes tempos da reao

Equao de Woolf-Augustinsson-Hofstee: - Divide-se a equao de Michaelis-Menten por [S]

- [S] muito baixa comparada ao Km reta quase vertical - [S] muito alta em relao ao Km reta quase horizontal

Equao de Eadie-Scatchard (Eadie Hofstee):

Parmetros cinticos: - So usados para comparar as atividades enzimticas - O Km pode variar muito de enzima para enzima e entre diferentes substratos para a enzima - Um grande nmero de enzimas segue a cintica de Michaelis-Menten (exceto as enzimas reguladoras) - Todas as enzimas que possuem uma dependncia hiperblica de V0 sobre [S] seguem a cintica de M-M - Km e Vmx podem ser obtidos experimentalmente atravs dos grficos de Michaelis-Menten ou Duplos recprocos - Km usado (muitas vezes inadequadamente) como indicao de afinidade da enzima pelo seu substrato - O verdadeiro significado de Km depende de certos mecanismos de reaes, tais como o n e as velocidades relativas das etapas. Quando temos 2 etapas:

- k2 = etapa limitante - Quando k2<<<k-1 , ento km fica reduzido a k-1/k1 que definido como a
constante de dissociao, Kd, do compelxo ES. Nessas condies Km representa a afinidade da enzima pelo substrato, entretanto esta situao no se aplica para a maioria das enzimas. Quando k2>>>k-1 , km = k2/k1 Quando k2 e k-1 so comparveis, ento km dado pela frmula Mas km no pode ser considerado uma medida de afinidade enzima-substrato A Vmx tambm varia muito entre enzimas diferentes Quando h apenas 2 etapas de M-M, ento Vmx = k2[Et], onde k2 = etapa limitante da reao Kcat = uma constante de velocidade que descreve a etapa limitante de qualquer reao catalisada por enzimas na saturao; de 1 ordem; chamada tambm de nmero de renovao; equivale ao n de molculas de S convertidas em P por unidade de tempo por uma molcula de enzima quando a enzima estiver saturada com o substrato. Kcat = Vmx/[Et] Equao de Michaelis-Menten c/ kcat

Comparao eficincia X mecanismos: - Os parmetros cinticos kcat e km so teis para estudar e comparar as enzimas quanto ao ambiente celular, a [ S ] normalmente encontrada in vivo, a qumica da reao e a eficincia cintica. Entretanto isso possvel apenas se essas constantes forem avaliadas juntas. - Km de uma enzima tende a ser similar concentrao do substrato presente na clula - A relao kcat/km = constante de especificidade a constante de velocidade para a converso de E + S em E + P; essa a melhor forma de comparar a eficincia cataltica - Existe um limite superior para kcat/km imposto pela velocidade com que E e S podem se difundir em solues aquosas => 108 a 109 M-1s-1 (faixa de perfeio cataltica) Reaes com dois ou mais substratos: - Ex: hexoquinase - A hexoquinase tem um km prprio pra cada um dos seus substratos - As reaes com dois substratos geralmente envolvem a transferncia de um tomo de um grupo funcional de um substrato para o outro - Os substratos podem se ligar simultaneamente enzima, formando um complexo no covalente ternrio. Nesses casos, preciso que todos os S se liguem para a reao ocorrer (reaes seqenciais) - Os substratos podem se ligar segundo uma sequncia aleatria ou ordenada (ligao do 1 S p formar stio ativo do 2 S) - Para no haver o complexo ternrio, o P formado 1 deve se dissociar antes que o 2 S se ligue (mecanismo de pingue-pongue ou de deslocamento duplo) mecanismo em que 1 ou mais P so liberados antes que todos os S tenham sido adicionados

* Transferases e oxidorredutases reaes de bissubstrato

Modulao da atividade enzimtica: - Fatores: pH: - Cadeias laterais de AA podem atuar como A ou B fracas com funes crticas na manuteno da ionizao e estrutura protica - O pKa da R de um resduo pode ser fortemente elterado para pHs distantes do AA original, dependendo das cargas dos resduos vizinho - As enzimas tem um pH ideal no qual a atividade cataltica mxima - O pH timo geralmente reflete o ambiente em que a enzima encontrada Temperatura: - T vel. das reaes; energia vibracional dos S e colises efetivas entre EeS - T desnaturao (perda de estrutura 2 e 3) - A ligao ao S protege as enzimas contra a desnaturao por calor - escolhida uma T pouco abaixo da tima (no pico) [S]: - A fase linear (1 parte do grfico) da cintica de 1 ordem ocorre em tempo muito curto e no influenciada por inativao enzimtica. Nessa etapa, no h reverso da reao, no h inibio pelo produto e nem saturao da enzima - Quando h excesso de substrato h saturao da enzima, [Et] = [ES] Ed a velocidade mxima (2 parte do grfico) Quantidade de enzima: - escolhido uma quantidade de enzima na parte ascendente da curva Tempo de incubao: - escolhido um tempo na parte ascendente - Tempo de congelamento tambm afeta a atividade da enzima - (-70C) suficiente para preservar atividade por algumas semanas

Ensaios enzimticos:
Quando no podemos determinar a concentrao de uma enzima devemos diferenciar as enzimas por sua atividade - Os problemas em determinar a atividade de preparaes enzimticas que (1)no se conhece a estrutura completa, e consequentemente, o peso molecular da maioria das enzimas, (2) molculas distintas podem exercer efeitos semmelhantes e (3)pode haver enzimas inativas que o contedo protico na preparao - Para que a valiao seja eficiente, o procedimento deve ser reprodutvel - Deve saber qual o substrato natural da enzima Montagem do ensaio: Escolha do substrato: - pode ser natural ou no - deve garantir a reprodutibilidade do mtodo Concentrao do S: - Excesso de S em relao enzima de forma que o estado estacionrio se forme

- Algumas enzimas so inibidas pelo excesso de S ou P - As determinaes devem ser feitas nos instantes iniciais, onde a velocidade de E + P ES pode ser desprezada e a [ES] produzido imediatamente consumido - Deve-se trabalhar com valores intermedirios de k m Tempo de reao: - Deve-se ter formado quantidade mensurvel de P ou ter sido consumido S - Taxa de formao de P deve ser constante durante toda a determinao pH: - o pH controlado garante que o centro ativo fique no estado ionizado correto - pH timo necessrio - pH mantido constante durante a reao por um tampo Temperatura: - T taxa de reao - A reao dever apresentar uma temperatura tima - elevadas T = inativao devido a falta de estabilidade Inibidores: - Modulao positiva interao modulador com a enzima favorece a reao - Modulao negativa interao // // envenena // * inibio por excesso de substrato inibio acompetiva