Cincia e Tecnologia de Alimentos Print version ISSN 0101-2061 Cinc. Tecnol. Aliment. vol.19 n.3 Campinas Sept./Dec.

1999

http://dx.doi.org/10.1590/S0101-20611999000300001 Ocorrncia de resduos de dietilestilbestrol e zeranol em fgado de bovinos abatidos no Brasil1 Olga Maria Chaves CARDOSO2, Tefilo Jos Pimentel SILVA3,*, Wagner Luiz Moreira SANTOS4, Jorge Luiz PESQUERO5 RESUMO

O uso de substncias anabolizantes, de natureza hormonal ou no, muito difundida na pecuria de corte dos pases maiores produtores de carne bovina (EUA, Austrlia, Argentina, Canad, etc.). Dentre estas destacam-se o banido dietilestilbestrol (DES) e o controlado zeranol, que aumentam o ganho de peso vivo, o peso da carcaa, a eficincia alimentar e o percentual de carne. O uso porm, pode ocasionar a presena de resduos nos tecidos e rgos dos animais que so utilizados como alimento. A presena de resduos representa um perigo potencial para a sade humana, o que levou vrios pases, inclusive o Brasil, a proibirem a utilizao destes produtos. O objetivo do presente trabalho foi o de verificar, se a carne colhida no perodo de julho de 1993 a novembro de 1994, em matadouros frigorficos pertencentes a Lista Geral dos Exportadores, atende a legislao vigente quanto ao uso destes anabolizantes. Para isto, foram analisadas por radioimunoensaio, 416 amostras de fgado para pesquisa de DES e 385 para zeranol. Observou-se que o DES no foi detectado em nenhuma das amostras (p > 0,05), enquanto que o zeranol foi detectado em duas (p < 0,05). A presena do zeranol nestas amostras foi confirmada por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (p < 0,05). A recuperao mdia obtida na fase extrativa (3H-DES) foi de 62,6 5,7% , enquanto que na fase extrativa + radioimunoensaio (DES), esta recuperao foi de 83,8 16,8%. Quanto ao zeranol as recuperaes mdias obtidas foram de 63,0 5,8% na fase extrativa (3H-zeranol) e 94,8 13,8% na fase extrativa + radioimunoensaio (zeranol). Concluiu-se portanto, que a carne bovina brasileira atende a legislao vigente quanto a ausncia de resduos de DES, no entanto, contraria quanto ao zeranol, pois foi confirmada uma freqncia de 0,52% de amostras positivas.

Palavras-chave: anabolizantes, carne bovina, resduos, monitoramento, radioimunoensaio, espectrometria de massa.

1 INTRODUO No mundo atual a alimentao humana constitui uma das principais questes dos sistemas de produo. O aumento exponencial da populao tem impulsionado o desenvolvimento de sistemas cada vez mais sofisticados de produo de alimentos, com a utilizao de novos mtodos e produtos qumicos, dentre eles as substncias anabolizantes de natureza hormonal ou no, como promotores de crescimento de animais para produo de carne. Destacam-se nesta classe os xenobiticos dietilestilbestrol (DES), que so proibidos mundialmente [8]; e zeranol, que tambm proibido no Brasil [4], mas que de uso controlado em muitos outros pases [7, 8, 10, 12]. Estes produtos aumentam o ganho de peso vivo, o peso da carcaa, a eficincia alimentar e o percentual de carne em determinadas espcies. Vrios pases tm restrio ao seu uso devido ao perigo potencial para a sade humana e a deficincia de metodologias analticas suficientemente sensveis para a deteco dos resduos em carne para o consumo humano [21]. Diferentemente, outros pases em que o zeranol est liberado [7, 12, 18], consideram que a substncia no possui ao prejudicial sade e que passvel de uma avaliao segura dos resduos na carcaa e nos rgos dos animais tratados [8]. Estudos epidemiolgicos realizados nos Estados Unidos demonstraram o aparecimento de tumores vaginais em filhas de pacientes que utilizaram DES como antiabortivo [2]. De acordo com o 32o Informe do Comit Mixto do Codex Alimentarius/FAO/WHO [8] a ingesto de alimentos contaminados pode levar ao aparecimento de distrbios endcrinos tais como, induo de puberdade precoce em crianas, avanos na idade ssea com repercusses negativas no crescimento, modificaes de caracteres sexuais, entre outros. Segundo ROSA & DODE [18] a via de administrao mais utilizada em bovinos o implante em parte no comestvel da carcaa como por exemplo, a orelha. A administrao oral ou injeo de suspenso oleosa ou cristalina aumentam a possibilidade de abusos e a ocorrncia de resduos em tecidos comestveis que podem acarretar problemas de sade pblica. O zeranol obtido da zearalanona elaborada pela Gibberella zeae e no estruturalmente um esteride. Tem atividade estrognica e anablica, sendo que, a maior parte da substncia administrada oralmente absorvida. Sua eliminao espcie dependente, sendo excretada como substncia livre e conjugada, e como zearaleanona livre e conjugada. Os mesmos metablitos aparecem na blis. A maior parte do zeranol administrado oralmente desaparece praticamente de todos os tecidos em 24 horas, exceto do fgado e dos rins, sendo que aos 45 dias, os valores encontrados nestes tecidos so inferiores a 2 partes por bilho (ppb = nanograma/grama = ng/g). No existe acumulao nos rgos, e, ainda desconhecida a proporo de metablitos livres ou conjugados e sua natureza exata [17]. O dietilestilbestrol um estilbeno que possui uma atividade estrognica dez vezes mais potente que o estrgeno natural, 17b estradiol. Estudos radiomtricos realizados com novilhos implantados com 14C-DES estabeleceram que o fgado e o rim so os tecidos de mximo acmulo, encontrando-se os resduos principalmente em forma conjugada como dietilestilbestrol monoglicurondeo, mantendo-se o nvel dos resduos em fgado abaixo de 0,5 partes por bilho (ppb) durante os 120 dias posteriores ao implante [13]. Evidncias de que o DES

administrado via oral era absorvido e no destrudo prontamente pelo fgado influenciou na deciso de banir o uso desta substncia em animais destinados a alimento no incio dos anos 70 [22]. No Brasil, segundo TEIXEIRA [20] a proibio ao uso de anabolizantes para qualquer finalidade teve incio em 1961 at que, em 1972 o seu uso foi permitido para fins teraputicos e sob prescrio veterinria. Em 1986 foi facultado o registro de produtos destinados ao aumento de peso de bovinos, ficando proibida a formulao e o emprgo base de estilbenos (DES) para fins anabolizantes e/ou uso teraputico. No mesmo ano foi revogada esta deciso, sendo liberado o uso de anabolizantes somente para fins teraputicos e sob prescrio veterinria. Atualmente vlida a Portaria Ministerial no 51 que probe a produo, importao, comercializao e o uso de produtos para fins de crescimento e ganho de peso dos animais de abate. Para os compostos no esteridais com atividade anabolizante, a proibio se estende, inclusive, para fins teraputicos. Segundo PALERMO NETO [16], o que se constata, a exemplo do que ocorreu em outros pases, que essa proibio s fez piorar a situao, pois estimulou o contrabando desses agentes e seu uso descontrolado, aumentando os riscos sade pblica. O controle de resduos de anabolizantes vem sendo efetuado pelo Ministrio da Agricultura e do Abastecimento (M.A.) desde 1984 [20]. A cromatografia gasosa foi inicialmente utilizada como metodologia analtica, sendo posteriormente substituda por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa e atualmente os resduos de DES e zeranol so analisados por radioimunoensaio e confirmados por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa. No Brasil, o limite de tolerncia para os resduos de DES e zeranol zero, j que o uso proibido [4], entretanto, no existem trabalhos cientficos que abordem a situao nacional, quanto a ocorrncia destes resduos. S mais recentemente que o M.A. publicou em Dirio Oficial resultados de levantamento realizado no ano de 1995 [5], tornando-os disponveis comunidade acadmica e aos consumidores. Considerando todos estes aspectos, o presente trabalho foi desenvolvido com o objetivo de verificar se a carne inspecionada no Brasil atende a legislao vigente, do ponto de vista da presena dos anabolizantes DES e zeranol; e oferecer comunidade informaes sobre este relevante problema de sade pblica.

2 MATERIAL E MTODOS As anlises de DES e zeranol foram desenvolvidas nos Laboratrios de Referncia Animal de Pedro Leopoldo e Campinas, pertencentes rede de laboratrios do Ministrio da Agricultura e do Abastecimento (M.A.).

2.1 Mtodo de amostragem A pesquisa foi realizada em fgado de bovinos provenientes de frigorficos controlados pelo Servio de Inspeo Federal includos na Lista Geral de Frigorficos Exportadores e a amostragem baseada no modelo estatstico recomendado pelo Codex Alimentarius [8]. As amostras foram colhidas, a partir de sorteio realizado de modo aleatrio pelo M.A. de acordo com o Programa de Controle de Resduos Biolgicos em Carnes PCRBC [4]. Como a populao de interesse so milhares de animais, para que se tivesse 95% de probabilidade de detectar violao, caso ela ocorresse em 1% ou mais da populao, o evento deveria ser pesquisado em 300 animais desta categoria no perodo de um ano. Assim, no perodo de julho de 1993 a novembro de 1994 foram colhidas 416 amostras de fgado para pesquisa de DES e zeranol. As amostras foram colhidas logo aps o abate, imediatamente congeladas, enviadas ao laboratrio congeladas, onde foram mantidas a -20 C at a anlise.

2.2 Anlises laboratoriais As metodologias utilizadas foram radioimunoensaio (RIE) para triagem [23] e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa (CG-EM) para confirmao, segundo os mtodos oficiais do M.A. [6]. O processo de extrao e purificao que precedeu a quantificao foi baseado no mtodo oficial do Instituto Nacional de Tecnologia de Alimentos (INTA) do Ministrio da Agricultura da Argentina [1]. O radioimunoensaio foi realizado com uso de kit - Rhode Islands Labs. [23] que contm DES e zeranol marcados com trtio, padres de DES e anticorpos anti-DES e antizeranol. Todas as drogas e solventes utilizados foram grau para anlise (P.A.) e o ter etlico, livre de perxidos, foi bidestilado em coluna de vidro.

2.2.1 - Procedimento para triagem de DES e zeranol por radioimunoensaio As amostras de fgado (2,5g) foram analisadas pelo mtodo esquematizado na Figura 1 que compreende as seguintes etapas: extrao das substncias livres e conjugadas, a partir do tecido, com metanol, hidrlise enzimtica, purificao por sucessivas parties lquido-lquido, e da soluo final de 0,75mL, uma alquota de 0,15mL foi usada para determinao da recuperao mdia (contador de cintilao lquida) e duas alquotas de 0,30mL foram quantificadas por radioimunoanlise, sendo uma para pesquisa de DES e a outra para pesquisa de zeranol, de acordo com as metodologias oficiais recomendadas [1, 6, 23]. Assim, 416 alquotas de 0,30mL foram quantificadas por radioimunoensaio para pesquisa de DES e as outras 416 alquotas de 30mL destinadas a pesquisa de zeranol resultaram na quantificao de 385 amostras, isto devido s perdas de amostras durante a corrida analtica (quebra de tubo ou outro motivo).

O radioimunoensaio baseado numa reao onde o antgeno radioativo e o no radioativo (presente na amostra que est sendo analisada), competem para reagir com o anticorpo. A separao do antgeno livre do antgeno conjugado com o anticorpo realizada por adsoro do antgeno livre (radioativo e no radioativo) em suspenso de carvo ativado, que centrifugada sendo o precipitado descartado e o sobrenadante levado para leitura em contador de cintilao lquida. A quantificao por radioimunoensaio foi efetuada atravs da extrapolao das contagens obtidas nas amostras atravs de uma curva de calibrao, onde, quantidades fixas e limitadas de antgeno radioativo e anticorpo e quantidades crescentes de antgeno no radioativo foram utilizadas. A curva foi formada por sete pontos de calibrao, em duplicata, nas concentraes de 15,6; 31,2; 62,5; 125; 250; 500 e 1000 picogramas (pg)/0,1mL de tampo fosfato 0,01M salina pH 7,4 contendo 0,1% de gelatina. A concentrao final de DES e zeranol foi obtida aps a correo do valor extrapolado de cada amostra na curva de calibrao, considerando-se a recuperao obtida pela amostra atravs das etapas de extrao e purificao. Os clculos foram elaborados atravs de planilha eletrnica (Quatro-Pro).

2.2.2 - Confirmao de DES e zeranol por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa O mtodo ilustrado na Figura 2 consiste na extrao com acetonitrila do DES e zeranol, purificao lquido-lquido de trs fases, purificao em fase slida e anlise por cromatografia capilar a gs acoplada a detector seletivo de massas (CG/EM) para identificao e quantificao [6].

2.3 Controle de qualidade e critrios de aceitabilidade das anlises Em cada grupo de amostras analisadas foram feitos os seguintes tipos de amostras controle, todas em duplicata: branco de reativos, testemunha, testemunha fortificada in vitro com 200pg/g, denominada fortificado e testemunha fortificada in vitro com concentrao desconhecida para o analista, denominada controle de qualidade. Com exceo da amostra branco de reativos, s restantes foram adicionados 0,1mL de soluo de anabolizante tritiado (~2500cpm) no comeo da extrao, com o qual, medindo a radioatividade remanescente a uma alquota do extrato final, se determinou a recuperao obtida pela amostra atravs das etapas de extrao e purificao, conforme a metodologia oficial recomendada [6].

2.4 Anlise estatstica Para a caracterizao da ocorrncia de resduos de determinada varivel (resduos de DES e zeranol) em carnes obtidas de frigorficos da Lista Geral dos Exportadores do Brasil, a qual ocorreu "x" vezes num total de "n" amostras, a ocorrncia p = x/n teve como intervalo de confiana p 1,96 p(1-p)/n para a definio de seus limites de confiana [19].

3 RESULTADOS E DISCUSSO 3.1 Anlises de triagem e confirmao de DES No perodo de julho de 1993 a novembro de 1994 foram analisadas 416 (quatrocentas e dezesseis) amostras de fgado bovino para pesquisa de DES e os resultados obtidos nas anlises por radioimunoensaio, assim como o total de anlises por unidades da federao brasileira so apresentados nas Tabela 1.

Conforme pode-se observar na Tabela 1, das 416 amostras analisadas para DES por radioimunoensaio, 407 foram consideradas negativas determinando uma frequncia de 97,84%, enquanto que nove amostras apresentaram resultados positivos, representando a frequncia de 2,16%. Estas nove amostras positivas pela anlise por radioimunoensaio foram ento submetidas anlise de confirmao por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa sendo que todas estas amostras resultaram negativas ao teste de confirmao, determinando assim uma frequncia de 0% de resultados positivos. Resultados falsos positivos podem ocorrer normalmente em amostras de animais no tratados em funo das impurezas ainda presentes no extrato final depois da purificao do tecido, que interferem na radioimunoanlise, ou ainda, pelo uso de anticorpos policlonais que podem apresentar reaes cruzadas com metablitos da substncia em pesquisa [13, 14].

Resultados semelhantes foram relatados por TEIXEIRA [19] que no identificou nenhuma amostra positiva no perodo de 1986 a 1987, utilizando o mesmo processo de colheita de amostras, porm usando a cromatografia gasosa como metodologia analtica e os relatados por Cunha (Antnio Cavalcante Cunha - Coordenao Geral de Laboratrios do M.A. - Braslia - comunicao pessoal) sobre as aes do PCRBC no perodo de 1992 a 1993 (RIE + CG - EM). Os resultados encontrados neste trabalho confirmam que os bovinos abatidos nos frigorficos da Lista Geral dos Exportadores, inspecionados pelo Servio de Inspeo Federal, atendem a legislao vigente do ponto de vista do uso do anabolizante DES, de acordo com o plano de amostragem estabelecido pelo governo brasileiro [3]. Estes resultados evidenciam a reduo da ocorrncia de amostras positivas, uma vez que em 1990 foram relatados sete resultados positivos em 300 amostras analisadas por cromatografia gasosa (Antnio Cavalcante Cunha - Coordenao Geral de Laboratrios do M.A. - Braslia - comunicao pessoal). E mais recentemente os dados da Portaria no 110/96 [5] vieram corroborar essa reduo, uma vez que no controle do PCRBC/M.A. executado em 1995 (RIE + CG - EM), em 301 amostras de fgado bovino, no foi encontrado violao pelo uso de DES no rebanho brasileiro. Resultados semelhantes foram encontrados em outros pases. JANSEN & STEPHANY [10] em um estudo inicial de investigao da utilizao de DES na Holanda, observaram a frequncia de 0,043% em 4558 amostras analisadas no perodo de agosto de 1981 a abril de 1983 e em estudo posterior JANSEN et al. [11] no detectaram nenhuma amostra positiva. CORDLE [7] relata que em programa de monitoramento, realizado nos Estados Unidos no foi encontrado nenhum resduo de DES em 1200 amostras testadas no ano de 1983. A controvrsia sobre o uso de anabolizantes em produo animal comeou h mais de 20 anos, quando o DES teve seu uso banido como promotor de crescimento em bovinos devido o uso clnico deste composto em mulheres, ter sido associado com cncer vaginal de suas filhas. Esta controvrsia teve continuidade com a Comunidade Econmica Europia (CEE) banindo o uso de todas as substncias anablicas hormonais para animais destinados produo de alimentos [22]. Apesar de tudo, o DES ainda continuou sendo utilizado para fins teraputicos e o que se constatou foi que essa proibio estimulou o contrabando desta substncia. De acordo com a literatura consultada o DES no tem sido utilizado nos pases, onde existe a liberao dos anabolizantes considerados seguros devido associao com cncer, mas tambm em funo das penalidades sofridas pelos produtores. Portanto, fica evidente que os estilbenos por possuirem propriedades oncognicas relatadas em diferentes espcies animais, e, em diferentes tecidos, no devem ser administrados como anabolizantes na pecuria de corte.

3.2 Anlises de triagem e de confirmao de zeranol A Tabela 2 mostra os resultados obtidos para as anlises de zeranol por unidades da federao brasileira, onde, das 385 amostras analisadas, 325 foram consideradas negativas resultando numa freqncia de 84,42% e 60 foram positivas, com a freqncia de 15,58% pela anlise por radioimunoensaio. As 60 amostras positivas pelo mtodo de triagem foram submetidas anlise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa, das quais duas foram confirmadas como positivas para o resduo de zeranol, com a freqncia de 0,52%.

As outras 58 amostras que no tiveram seus resultados confirmados como positivos, foram consideradas como sendo falso-positivas pela anlise por radioimunoensaio. A maior quantidade de resultados falso-positivos ocorre com o zeranol o qual produzido, a partir de uma micotoxina, comumente encontrada em gros e nas pastagens. Assim, os anticorpos utilizados para o radioimunoensaio podem reagir com essas micotoxinas dando resultados falso-positivos [14]. Os dados obtidos pelo M.A. em 1990 (CG) e em 1993 (RIE + CG - EM) concordam com estes resultados, uma vez que foram confirmadas uma e duas violaes de amostras de fgado com zeranol, nos respectivos anos. Dados mais recentes do PCRBC/M.A. [5] demonstram que das 301 amostras de fgados de bovinos analisadas (RIE + CG - EM) em 1995 resultou em 01 (uma) violao (0,33%) sobre o uso de zeranol na pecuria de corte nacional. Estes resultados evidenciam o uso de zeranol, ainda que muito discreto, em bovinos abatidos nos frigorficos da Lista Geral dos Exportadores, controlados pelo Servio de Inspeo Federal de acordo com o plano de amostragem estabelecido [3], contrariando a legislao vigente no pas, que proibe o uso desta substncia. Resultados similares foram descritos em outros pases. GRANGER & CRUZ [9] no perodo de junho a novembro de 1989 realizaram um estudo em Portugal onde foram efetuadas 563 dosagens, das quais foram confirmadas seis amostras com resduos de zeranol (RIE + CG - EM). MADDOX [15] encontrou uma frequncia de 6% de

novilhos e novilhas tratados com zeranol (CG), conforme trabalho realizado no perodo de 1984 a 1985 na Esccia e norte da Inglaterra. Diferentemente, dos resultados relatados por Cunha* no ocorreu nenhum registro de amostras positivas (CG) no perodo de 1991 a 1992. Da mesma forma, em estudos realizados na Holanda por JANSEN et al. [11] no perodo de outubro de 1983 a janeiro de 1985, no foram identificados resduos de zeranol (HPLC), no total de 573 amostras analisadas e tambm MADDOX [15] no detectou resduos de zeranol (RIE + CG EM) em novilhos na Esccia e norte da Inglaterra no perodo de 1986 a 1987. De acordo com a literatura consultada o zeranol tem sido utilizado nos pases onde existe a liberao do uso de anabolizantes [7, 12, 18], uma vez que no possui propriedades genotxicas ou carcinognicas e permite uma estimativa segura dos valores de resduos controlados na carcaa e nos rgos dos animais tratados [8]. Entretanto, a legislao brasileira probe o uso de zeranol na pecuria nacional [4] principalmente em funo das exigncias dos pases importadores da Unio Europia.

3.3 Aceitabilidade das anlises A porcentagem de recuperao aceitvel para a anlise de DES e zeranol por radioimunoensaio abrange a faixa de 50 a 120% e o coeficiente de correlao ( r ) deve ser pelo menos igual a 0,985. O coeficiente de correlao mdio obtido neste experimento foi igual a 0,9960. O limite de deteco estabelecido foi de 160 partes por trilho (ppt = picograma/grama = pg/g) e o limite de determinao 200 ppt. A Tabela 3 mostra os dados obtidos para a recuperao mdia das amostras fortificadas com 3H-DES e das amostras fortificadas com DES padro.

As recuperaes foram consideradas satisfatrias considerando-se os resultados obtidos por LONGHI et al. [13] quando efetuou um estudo da curva de acumulao-eliminao de DES em fgado e plasma de novilhos implantados, utilizando a mesma metodologia analtica. Os resultados obtidos nas amostras de controle de qualidade, que so analisadas em paralelo com as amostras de rotina, so fatores importantes na rejeio de uma corrida analtica. Nestas amostras, analisado o erro em relao ao valor real, ou seja, o

coeficiente de variao, que pode ser at de 45% devido ao nvel de resduo pesquisado. S foram consideradas as anlises que tiveram os resultados satisfatrios. A Tabela 4 mostra os dados obtidos para a recuperao mdia das amostras fortificadas com 3H-zeranol e das amostras fortificadas com zeranol padro.

Resultados semelhantes foram obtidos por LONGHI et al. [14] quando determinou os nveis de resduos de zeranol e seus metablitos em fgado, rins e msculo de bovinos. Neste estudo foi demonstrado que os tecidos de acumulao so o fgado e os rins, sendo o fgado o tecido de mximo acmulo. Os resduos de zeranol foram quantificados aos 148 dias aps o ltimo tratamento e em nenhum dos 20 animais tratados foi possvel detectar resduos em msculo.

4 CONCLUSES O fgado bovino colhido nos matadouros frigorficos inspecionados pelo Servio de Inspeo Federal (SIF), participantes da Lista Geral dos Exportadores, no perodo de julho de 1993 a novembro de 1994 no apresentou resduos do anabolizante DES, o que implicaria na ausncia do resduo de DES em carne bovina oriunda destes estabelecimentos. Foi verificada uma freqncia de 0,52% (02 em 385 amostras) de resduos de zeranol no fgado bovino colhido nos mesmos matadouros frigorficos, o que contraria a legislao brasileira vigente. Considerando-se a importncia do tema novos trabalhos so recomendveis, uma vez que a maioria dos abates de bovinos efetuados no Brasil no so controlados pelo Servio de Inspeo Federal. Sugere-se assim, reproduzir este tipo de trabalho nos bovinos abatidos sob inspeo estadual e municipal. Alm disso, novas metodologias alternativas deveriam ser pesquisadas visando ao aprimoramento destas tcnicas analticas.