BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Dalam melakukan diagnosa Mikrobiologi sterilisasi sangat diutamakan
baik alat maupun medianya. Suatu alat dikatakan steril apabila alat atau bahan
bebas dari mikroba baik dalam bentuk vegetative maupun spora. Untuk itu
sebagai pemula dalam Mikrobiologi sangat perlu mengenal teknik sterilisasi,
pembuatan media serta teknik penanaman (Dwidjoseputro, 1994).
Secara umum sterilisasi merupakan proses pemusnahan kehidupan
khususnya mikroba dalam suatu wadah ataupun peralatan laboratorium.
Sterilisasi dalam Mikrobiologi adalah suatu proses untuk mematikan semua
mikroorgansime yang terdapat pada atau didalam suatu benda. Ada tiga cara
utama yang umum dipakai dalam sterilisasi yaitu penggunaan panas,
penggunaan bahan kimia, dan penyaringan (filtrasi). Apabila panas
digunakan bersama-sama dengan uap air maka disebut sterilisasi basah, bila
tanpa kelembaban maka disebut sterilisasi kering (Dwidjoseputro, 1994).
Untuk membutuhkan dan mengembangbiakkan mikroba diperlukan
suatu substrat yang disebut medium. Sedangkan medium itu sendiri sebelum
digunakaan harus dalam keadaan steril artinya tidak ditumbuhi oleh mikroba
lain yang tidak diharapkan agar mikroba dapat tumbuh dan berkembangbiak
dengan baik di dalam medium, maka diperlukan syarat tertentu yang
diantaranya bahwa didalam medium harus terkandung semua unsur hara yang
diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembangan mikroba kemudian
susunan makanannya, tekanan osmosis, derajat, keasaman (pH), dan
temperatur (Hadietomo, 1990).  
Dalam bidang penelitian mikroorganisme ini, tentunya menggunakan
teknik atau cara-cara khusus untuk mempelajarinya dan bekerja pada skala
laboratorium untuk meneliti mikroorganisme ini baik sifat dan
karakteristiknya, tentu diperlukan pula tentang bagamana caranya
menumbuhkan suatu mikroba ke dalam suatu media, karena kita tahu bahwa
 beragamnya persyaratan tumbuh mikroba, maka harus dimengerti jenis-jenis
nutrient yang disyaratkan oleh mikroba dan juga macam lingkungan fisik
yang menyediakan kondisi yang optimum bagi pertumbuhannya. Mikroba
amat beragam, baik dalam persyaratan nutrient maupun fisiknya. Jadi, media
yang digunakan harus mengandung komponen-komponen yang dibutuhkan
oleh mikroba tersebut (Hadietomo, 1990).
Untuk mengenal lebih jauh tentang penyiapan medium untuk suatu
mikroba, maka diadakanlah praktikum ini, dimana dalam praktikum ini
praktikan diwajibkan mampu mengetahui cara-caranya mulai dari awal
sampai akhir melalui bimbingan dari kakak asisten.

1.2 Tujuan
Adapun tujuan yang ingin dicapai oleh praktikan dalam praktikum kali
ini yaitu:
1. Mengetahui cara pembuatan media dan membedakan berbagai media
pertumbuhan mikroba.
2. Mengetahui cara dan macam-macam sterilisasi.
 BAB II
TINJAUAN PUSTAKA
2.1 Medium
Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan
(nutrien) yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan
mikroorganisme. Mikroorganisme juga merupakan mahluk hidup, untuk
memeliharanya dibutuhkan medium yang harus mengandung semua zat yang
diperlukan untuk pertumbuhannya, yaitu antara lain senyawa-senyawa
organik (protein, karbohidrat, lemak, mineral, dan vitamin). Medium
digunakan untuk melihat gerakan dari suatu gerakan mikroorganisme apakah
bersifat motil atau nonmotil, medium ini ditambahkan bahan pemadat 50%
(Hadietomo, 1990).
Mikroorganisme dapat menggunakan makanan dalam bentuk padat dan
dapat pula yang hanya menggunakan bahan-bahan dalam bentuk cairan atau
larutan. Mikroorganisme yang menggunakan makanannya dalam bentuk
padat tergolong tipe holozoik. Mikroorganisme yang dapat menggunakan
makanannya dalam bentuk cairan atau larutan disebut holofitik. Ada beberapa
mikroorganisme yang dapat menggunakan makanannya dalam bentuk
padatan, tetapi makanan tersebut sebelumnya harus dicerna, di luar sel
dengan bantuan enzim ekstraseluler (Anonim, 2009).
Peran utama nutrien adalah sebagai sumber energi, bahan pembangun
sel, dan sebagai aseptor elektron dalam reaksi bioenergetik (reaksi yang
menghasilkan energi). Oleh karenanya bahan makanan yang diperlukan
terdiri dari air, sumber energi, sumber karbon, sumber aseptor elektron,
sumber mineral, faktor pertumbuhan, dan nitrogen. Selain itu, secara umum
nutrien dalam media pembenihan harus mengandung seluruh elemen yang
penting untuk sintesis biologik oranisme baru (Hadietomo, 1990).
Tiap sel harus mensintesis sendiri konstituen tubuhnya dari zat-zat
sederhana yang ditemukan dalam lingkungannya. Kebanyakan dari zat-zat ini
berupa makanan dalam bentuk suspensi atau larutan yang ditemukan dalam
air laut, sungai, danau, air selokan, atau bahan-bahan organik lain yang
mengalami penguraian, dan sebagainya. Sifat kimia dan fisika dari habitat ini
menentukan jenis organisme yang dapat tumbuh atau hidup di lingkungan itu
(Irianto, 2006).
Menurut Pelgzar (1996), klasifikasi medium berdasarkan fungsinya
digolongkan menjadi 7 golongan, yaitu:
1. Medium umum, media yang ditambahkan bahan-bahan yang
bertujuan menstimulasi pertumbuhan mikroba secara umum.
Contoh Nutrient Agar (NA) untuk menstimulasi pertumbuhan
bakteri, Potato Dextrose Agar (PDA) untuk menstimulir
pertumbuhan fungi.
2. Medium khusus, merupakan medium untuk menentukan tipe
pertumbuhan mikroba dan  kemampuannya untuk mengadakan
perubahan-perubahan kimia tertentu misalnya, medium tetes tebu
untuk Saccharomyces cerevisiae.
3. Media diperkaya (enrichment media), media yang ditambahkan
bahan-bahan tertentu untuk menstimulasi pertumbuhan mikroba
yang diinginkan. Hal ini dilakukan untuk menstimulasi
pertumbuhan mikroba yang jumlahnya sedikit dalam suatu
campuran berbagai mikroba, contoh Chocolate media dan Yeast-
Extract-poptasium Nitrat Agar.
4. Media selektif, merupakan media yang ditambahkan bahan-bahan
tertentu yang akan menghambat pertumbuhan mikroba yang tidak
diinginkan yang ada dalam suatu spesimen. Inhibitor yang
digunakan berupa antibiotik, garam dan bahan-bahan kimia
lainnya.
5. Media diferensial, merupakan media yang ditambahkan bahan-
bahan kimia atau reagensia tertentu yang menyebabkan mikroba
yang tumbuh memperlihatkan perubahan-perubahan spesifik
sehingga dapat dibedakan dengan jenis lainnya.
6. Medium penguji (assay medium), yaitu medium dengan susunan
tertentu yang digunakan untuk pengujian senyawa-senyawa tertentu
 dengan bantuan bakteri misalnya medium untuk menguji vitamin-
vitamin, antibiotika dan lain-lain.
7. Medium perhitungan jumlah mikroba yaitu medium spesifik yang
digunakan untuk menghitung jumlah mikroba dalam suatu bahan,
misalnya medium untuk menghitung jumlah bakteri E.coli air
sumur.

2.2 Sterilisasi
Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme
yang hidup. Adanya pertumbuhan mikro menyatakan bahwa pertambahan
bakteri masih berlangsung dan tak sempurnanya proses sterilisasi. Jika proses
sterilisasi berlangsung sempurna, maka spora bakteri yang merupakan bentuk
paling resikan dari kehidupan mikroba tak akan terlihat lagi. Sterilisasi
merupakan metode praktis yang dirancang untuk membersihkan dari
mikroorganisme, atau sengaja untuk menghambat pertumbuhannya.
Mikroorganisme sangat berbeda, dalam kelemahannya terdapat berbagai
macam agen antimikroba (Suriawiria, 2005).
Cara kerja sterilisasi ialah cara kerja agar terhindar dari kontaminasi,
cara steril ini digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan preparat.
Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara: (Anonim, 2009)
1. Fisik yang dibagi menjadi beberapa bagian:
a. Dengan hot air sterilisation oven, bahan dari gelas di bungkus dengan
aluminium foil, dengan suhu 170°-250°C selama 2 jam.
b. Panas basah dengan tekanan suhu 121°C selama 15 menit. Alat yang
digunakan adalah autoclave.
c. Pressure cooker, panaskan air mendidih, biarkan klep uap terbuka
agar keluar uap kemudian klep uap ditutup, lihat suhu dan tekanan,
bila suhu telah 121°C dengan tekanan 1,5 atm, dijaga konstan selama
15 menit. Kemudian buka klep uap hingga tercapai tekanan nol, dan
setelah suhu mencapai suhu kamar, alat dan bahan dikeluarkan.
2. Kimia, dengan menggunakan zat-zat kimia seperti desinfektan, antiseptik.
3. Radiasi dengan sinar ultra violet, biasanya digunakan pada ruangan dan
alat – alat plastik.
4. Filter dengan membran filter dan vacum pump.
Alat-alat yang dipakai ketika penanaman, harus dalam keadaan steril.
Alat-alat logam dan gelas dapat disterilkan dalam autoklaf. Alat tanam
seperti: pinset dan gunting dapat juga disterilkan dengan pembakaran atau
dengan pemanasan dalam bacticinerator (Irianto, 2006).
Sterilisasi dengan panas adalah unit operasi dimana bahan dipanaskan
dengan suhu yang cukup tinggi dan waktu yang cukup lama untuk merusak
mikroba dan aktivitas enzim. Sebagai hasilnya, bahan yang disterilkan akan
memiliki daya simpan lebih dari enam bulan pada suhu ruang. Contoh proses
sterilisasi adalah produk olahan dalam kaleng seperti kornet, sarden dan
sebagainya (Irianto, 2006).
 BAB III
METODOLOGI PRAKTIKUM

3.1 Waktu dan Tempat

Praktikum Mikrobiologi dengan judul Sterilisasi dan Pembuatan Media
dilaksanakan pada hari Senin, tanggal 18 November 2013, pada pukul 13.20 WIB
hingga selesai. Praktikum ini bertempat di Laboratorium Biologi Institut Agama
Islam Negeri Raden Fatah Palembang.

3.2 Alat dan Bahan

3.2.1 Alat
Alat yang digunakan yaitu:
1. Timbangan Analitik
2. Gelas Ukur
3. Erlenmeyer
4. Tabung Reaksi
5. Kaca Pengaduk
6. Autoklaf

3.2.2 Bahan
Bahan yang digunakan yaitu:
1. Aquades
2. Kapas
3. Aluminium Foil
4. Alkohol
5. Kentang 200 gram
6. Dektrosa/gula
7. Agar-agar
8. Kompor Gas/Listrik
3.3 Cara Kerja
Pembuatan Media
1. Membuat media umum/konvesional untuk pertumbuhan bakteri (Nutrient
Agar):
Beef extract (ekstrak daging) .................................................10 g
Pepton .......................................................................................10 g
Agar-agar ................................................................................15 g
Aquades ..............................................................................100 ml
Catatan: ekstrak daging bila tidak tersedia dapat dibuat sendiri, dengan
cara sebagai berikut:
1. Buat ekstrak daging (daging 0.5 kg direbus dalam air 1000 ml hingga
volume air menjadi setengah atau direbus selama 1-2 jam.
2. Saring ekstrak daging dengan kertas saring, kemudian tambahkan
aquades hingga volume menjadi 1000 ml.
3. Masukkan pepton dan agar-agar, lalu diaduk sampai homogen.
4. Biarkan diatas api sampai hampir mendidih
5. Masukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 5 ml untuk agar miring,
dan disimpan dalam erlenmeyer
6. Semua tabung dan erlenmeyer yang berisi medium ditutup dengan
kapas dan aluminium foil.
7. Sterilkan dengan autoklaf.
8. Setelah disterilkan tabung reaksi yang berisi 5 ml dimiringkan untuk
media agar miring dan di erlenmeyer disimpan dalam inkubator/water
bath.

2. Membuat media umum untuk jamur (Potato Dectrosa Agar)

Kentang ...............................................................................200 gr
Dektrosa/gula ..........................................................................10 gr
Agar-agar ...............................................................................15 gr
Aquades ............................................................................1000 ml
 Cara Kerja:
1. Bersihkan kentang lalu dipotong kecil-kecil. Kemudian dimasak dalam
500 ml aquades. Biarkan mendidih selama 1 jam, jaga volume agar
tetap.
2. Saring ekstrak kentang, ambil fitratnya.
3. Tambahkan dektrosa/gula sambil dipanaskan dengan menggunakan api
sedang.
4. Tambahkan agar-agar, panaskan dan aduk hingga homogen. Setelah
mendidih diangkat dan dimasukkan ke dalam botol/erlenmeyer.
5. Tutup dengan kapas dan aluminium foil, kemudian sterilisasi dengan
autoklaf.

Sterilisasi Fisika (Autoklaf)

1. Sebelum dihidupkan periksa alat Autoclave-Pressure Steam Sterilizers,
sudah bersih atau belum.
2. Isi air dalam alat sebatas saringan.
3. Masukkan bahan-bahan yang akan di sterilisasi, sebelumnya diberi
indikator tanda sudah steril atau belum dengan autoclave tape.
4. Tutup covernya dengan mencocokkan dengan tanda kuncinya.
5. Rapatkan kunci-kunci secara diagonal sampai rapat betul. Posisi alat pada
high.
6. Tekan Power/ON dengan menutup katup agar uap air tidak keluar.
7. Bila tekanan sudah sampai pada tanda 15 (tekanan sudah mencapai 121°
C) atau caution.
8. Tekan timer selama 15 menit.
9. Bila sudah 15 menit, maka katup dibuka. Bersamaan dengan itu matikan
power.
10. Bila alat sudah dalam posisi 0, maka buka katup. Biarkan alat dingin
dahulu.
11. Buka metal to metal secara diagonal.
 Ambil hasil sterilan, lihat indikator autoclave tape-nya.

Sterilisasi cara Kimia

1. Sebelum membuka ruangan atau bagian steril di dalam
tabung/cawan/erlenmeyer sebaiknya bagian mulut (bagian yang
memungkinkan kontaminan masuk) dibakar/dilewatkan api terlebih
dahulu.
2. Pinset, batang L, dll dapat disemprot dengan alkohol terlebih dahulu lalu
dibakar.
3. Ujung jarum inokulum yang sudah dipijarkan harus ditunggu dingin
dahulu atau dapat ditempelkan tutup cawan bagian dalam untuk
mempercepat transfer panas yang terjadi.
4. Usahakan bagian alat yang diharapkan dalam kondisi steril didekatkan ke
bagian api.
5. Jika kerja di safety cabinet tidak perlu memakai pembakar bunsen tetapi
jika diluar safety cabinet maka semakin banyak sumber api semakin
terjamin kondisi aseptisnya.
 BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Hasil
Hasil akhir dari proses sterilisasi sesuai dengan petunjuk praktikum
yang kita dapatkan setelah menginkubasi alat dan bahan ke dalam autoklaf
pada suhu 121℃ selama 15 menit, alat dan bahan tersebut menjadi steril
(matinya mikroorganisme yang terdapat pada alat dan bahan).

Pengamatan Pengamatan
Nama
Fungsi Sebelum Sesudah
Medium
Pengadukan Pengadukan

Sebagai tempat Warnanya Kuning keruh,

PDA pembiakan bening, agak dan sedikit
mikroba keruh, cair kental

4.2 Pembahasan
Medium merupakan bahan yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme di atas atau di dalamnya, medium tersebut harus memenuhi
syarat-syarat, antara lain adalah harus mengandung semua zat hara yang
mudah digunakan oleh mikroba, harus mempunyai tekanan osmosis, tegangan
permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba yang akan
ditumbuhkan, tidak mengandung zat-zat yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba, harus berada dalam keadaan steril sebelum digunakan,
agar mikroba yang di tumbuhkan dapat tumbuh dengan baik (Hadioetomo,
1993). Percobaan kali ini yaitu pembuatan medium NA dan PDA.
 NA (nutrient agar) digunakan sebagai media pertumbuhan bakteri.
Pembuatan medium percobaan ini dengan menggunakan NA (nutrient agar),
dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu dengan cara menimbang bahan
yang akan digunakan kedalam neraca analitik sesuai dengan jumlah yang
diperlukan kemudian memasukkan bahan kedalam erlenmeyer 250 ml,
dimana bahan tersebut adalah aquades 250 ml, NA 3,75 dan agar 7 gram
setelah itu dipanaskan diatas hot plate 440oC di ikuti oleh pengadukan dengan
menggunakan magnetic stirrer, tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini
adalah untuk menghomogenkan NA dengan aquades, dimana dengan
pemanasan dapat mempercepat pelarutan dari NA dan aquades. Setelah
dipanaskan beberapa menit larutan berubah warna dari keruh menjadi kuning
kecoklatan hal ini menandakan larutan telah homogen. Kemudian
dimasukkan kedalam autoklaf dengan mulut erlenmeyer disumbat dengan
kapas dan dilapisi kertas aluminium diluarnya. Tujuan dari penutupan ini agar
meminimalkan kontaminasi. Pembuatan NA berdasarkan konsistennya
termasuk medium padat dan menurut kegunaannya termasuk medium umum.
PDA (Potato Dextrose Agar) digunakan untuk menumbuhkan fungi
atau jamur. Pembuatan medium pada percobaan ini dengan menggunakan
PDA (Potato Dextrose Agar) dimana dalam pembuatannya terlebih dahulu
dengan cara memasukkan 200 ml aquades dan 50 ml ekstrak kentang, 3,75
deglucose dan 7 gr agar kemudian dipanaskan diatas hot plate 440 oC diikuti
oleh pengadukan dengan tujuan dari pemanasan dan pengadukan ini untuk
menghomogenkan PDA dengan aquades, dan pemanasan bertujuan
mempercepat pelarutan dari PDA. Setelah dipanaskan beberapa menit larutan
berubah warna dari keruh menjadi kuning tua, hal ini menunjukkan larutan
telah homogen. Setelah itu dimasukkan kedalam autoklaf tetapi sebelum
dimasukkan mulut erlenmeyer ditutup dengan kapas dan kemudian dibungkus
dengan kertas, hal ini bertujuan agar meminimalkan kontaminasi. PDA
termasuk medium nonsintetik karena termasuk medium padat sedangkan
menurut fungsinya termasuk medium umum.
 Autoklaf adalah alat yang digunakan untuk sterilisasi. Autoklaf
termasuk dalam teknik sterilisasi secara fisika dengan prinsip arus uap dan
tekanan. Alat ini sering digunakan dalam teknik pensterilan karena tingkat
koefisien dan sifat alat yang tidak merusak kandungan dalam media
pertumbuhan yang dipakai yaitu NA, PDA, MEA dan LB (Suriawiria, 2005).
Sterilisasi yang dilakukan bertujuan untuk menghindari kontaminasi,
yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan. Sterilisasi merupakan
suatu proses (kimia dan fisika) yang membunuh semua bentuk hidup terutama
mikroorganisme (Suriawiria, 2005). Sterilisasi yang digunakan dalam
percobaan ini adalah secara fisika yaitu menggunakan panas, dimana panas
yang digunakan adalah bersama uap air yang biasanya disebut sterilisasi
basah.
 BAB V
PENUTUP

5.1 Kesimpulan
Sterilisasi merupakan proses untuk mematikan semua mikroorganisme
yang hidup. Cara kerja sterilisasi ialah cara kerja agar terhindar dari
kontaminasi, cara steril ini digunakan pada pembuatan media, dan pembuatan
preparat. Sterilisasi dapat dilakukan dengan cara fisik, kimia, radiasi dan
filter. Medium adalah substansi yang terdiri atas campuran zat-zat makanan
(nutrien) yang dipergunakan untuk pemeliharaan dan pertumbuhan
mikroorganisme.

5.2 Saran
Sebaiknya pada saat praktikum praktikan sudah bisa menguasai teknk-
teknik atau cara kerja dari praktikum yang akan dilaksanakan sehingga tidak
akan terjadi kekeliruan yang bisa menghambat jalannya praktikum.
 DAFTAR PUSTAKA

Anonim. 2009. Petunjuk Praktikum Mikrobiologi. Universitas Indonesia: Jakarta.

Dwidjoseputro, D. 1994. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan: Jakarta.
Hadioetomo, R. 1993. Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium Mikrobiologi.
Gramedia: Jakarta.
Irianto, Koes. 2006. Mikrobiologi Jilid 1. Yrama Widya: Bandung.
Pelgzar & Reid. 1958. Mycrobiology. Mc Graw-Hill Compan: Tokyo.
Suriawiria, U. 2005. Mikrobiologi Dasar. Papas Sinar Sinanti: Jakarta.